БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 640-645

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.322.4

СТРУКТУРА ЛЕД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА

ИЗ Myoxocephalus octodecemspinosus, ПОЛУЧЕННАЯ МЕТОДОМ

МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ И НА ОСНОВЕ

СПЕКТРОВ КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА

*Институт химической биологии и фундаментальной медицины,

пр-т Академика Лаврентьева, 8, Новосибирск, 630090, Россия

**Новосибирский национальный исследовательский государственный университет,

ул. Пирогова, 1, Новосибирск, 630090, Россия

^#E-mail: swb@niboch.nsc.ru

Поступила в редакцию 30.12.2022 г.

После доработки 27.01.2023 г.

Принята к публикации 15.02.2023 г.

Одна из стратегий, разработанных организмами для выживания в холодных экосистемах, где есть

риск замерзания - наработка белков, способных связывать лед. Эти белки обладают важной

способностью - связываться с поверхностью льда, влиять на его рост и предотвращать повреждение

и гибель клеток. Для понимания механизма взаимодействия таких белков со льдом, необходимо

знать их структуру. Данное исследование вносит вклад в изучение структурно-динамических

механизмов действия лед-связывающих белков, которые обеспечивают адаптацию организмов в

критических условиях. Изучение вклада белков, способных связывать лед, в адаптацию к холоду

открывает широкие возможности в решении ряда интересных задач медицины, включая разработку

эффективных клеточных и органных криопротекторов, а также долгосрочного хранения продуктов

питания без потери их потребительских свойств в пищевой промышленности.

Ключевые слова: лед-связывающие белки, белки-антифризы, молекулярная динамика, круговой дихроизм,

криопротекторы.

DOI: 10.31857/S0006302923040026, EDN: KJBZCU

связывающие белки предотвращают ассоциацию

Одна из стратегий, разработанных организма-

воды с зародышеобразователями льда и, как след-

ми для выживания в холодных экосистемах, где

ствие, образование кристаллов [1, 2].

есть риск замерзания - наработка белков, спо-

собных связывать лед. Лед-связывающие белки

Несмотря на то, что в последнее время в науч-

обладают уникальным свойством связываться с

ной литературе наблюдается повышенный инте-

поверхностью льда и, таким образом, контроли-

рес к лед-связывающим белкам [3, 4], структур-

руют его рост, тем самым помогая организмам из-

но-динамические механизмы действия этих бел-

бежать критических повреждений при пониже-

ков до сих пор не известны полностью.

нии температуры. Это свойство позволяет им

Способность лед-связывающих белков кон-

влиять на рост льда разными способами: форми-

тролировать рост льда может быть использована

ровать кристаллы льда определенной структуры,

при хранении продуктов питания, в сельскохо-

снижать температуру замерзания, препятствовать

зяйственном производстве и для криоконсерва-

рекристаллизации и подавлять активность заро-

ции клеток, тканей и органов в медицине.

дышеобразования льда. Зародышеобразование -

Первые лед-связывающие белки были описа-

это один из этапов формирования кристаллов

ны чуть больше 50 лет назад. Из сыворотки крови

льда, который инициируют инородные частицы

трех антарктических морских рыб был выделен

(зародышеобразователи льда, активаторы). Лед-

белок, вклад которого в понижение ее точки за-

мерзания составил 30% [5]. С тех пор исследова-

Сокpащение: MALDI-TOF - (matrix-assisted laser desorp-

тели обнаружили, что белки, способные связы-

tion/ionization time-of-flight) - матрично-активированная

вать лед, очень разнообразны, существенно отли-

лазерная деcорбционно/ионизационная времяпролетная

масс-спектрометрия.

чаются по размеру и структуре, кроме того, они и

640

СТРУКТУРА ЛЕД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА

641

по-разному функционируют [6-8]. Первыми бы-

Полученный гомогенат разделяли центрифуги-

ли охарактеризованы белки-антифризы, которые

рованием 20000 g в течении 1 ч.

подавляют рост льда [9]. Первоначально у рыб

Белок выделяли на хелатирующей колонке Hi-

было найдено три типа белка, но коллективом ав-

Trap-Chelating^TM (Cytiva, GE Healthcare Life Sci-

торов в 1996 г. из сыворотки крови Myoxocephalus

ences, США) с последующей дополнительной

octodecimspinosis (Longhorn sculpin) был выделен

очисткой ионообменной хроматографией на ко-

белок-антифриз, не похожий на ранее известные

лонке Q-Sepharose FF (Cytiva, GE Healthcare Life

классы [10]. Характеризация этого белка показа-

Sciences, США). Концентрацию гомогенного

ла, что, хотя он и является высокоспиральным по

препарата белка определяли спектрофотометри-

структуре, его молекулярная масса (12299 Да) на-

чески на приборе NanoDrop One^C (Thermo Scien-

много больше, чем у других представителей лед-

tific, США).

связывающих белков [10].

Характеризация белка. Белок был охарактери-

Последовательность белка-антифриза из сы-

зован методом масс-спектрометрии с лазерной

воротки крови Myoxocephalus octodecimspinosis со-

десорбционной ионизацией в присутствии мат-

стоит из 108 (соответствует дикому типу белка) и

рицы (MALDI-TOF). Для анализа проводили

128 аминокислотных остатков (соответствует

гель-электрофорез в 18%-м полиакриламидном

полноразмерному белку) [10, 11]. В организме

геле, белковые пятна вырезали из геля и расщеп-

Longhorn sculpin сначала синтезируется белок-

ляли трипсином согласно методике, описанной в

предшественник, а затем происходит расщепле-

работах [14, 15]. Регистрацию масс-спектров осу-

ние. Последовательность из

20 аминокислот

ществляли на MALDI-TOF-масс-спектрометре

MKFSLVATIVLLALAQGSFA, вероятно, является

Autoflex Speed (Bruker, Германия), снабженном

сигнальной последовательностью для секреции, а

азотным лазером (337 нм) (VSL-337 ND, Laser

сам пептид - сильно гидрофобный [12].

Science, США), с продолжительностью импульса

В данной работе приведен оптимизированный

1-5 нс. В качестве матрицы был использован на-

метод выделения, очистки и характеризации ре-

сыщенный раствор α-циано-4-гидрокоричной

комбинантного белка из Myoxocephalus octodecim-

кислоты в смеси ацетонитрила и 0.1%-й трифтор-

spinosis (Long4) полноразмерной формы, а также с

уксусной кислоты (1 : 2). К 1 мкл реакционной

помощью методов кругового дихроизма и моле-

смеси, содержащей гидролизованный белок, до-

кулярно-динамического моделирования описана

бавляли 1 мкл 0.2%-й трифторуксусной кислоты

его вторичная структура в комплексе со льдом.

и 1 мкл матрицы, затем 1 мкл конечной смеси на-

носили на мишень для MALDI масс-спектромет-

рии, мишень высушивали на воздухе. Калибровка

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

MALDI-спектров была проведена с использова-

нием Peptide calibration standart (Bruker Daltonic,

Объектом исследования являлся лед-связыва-

Германия).

ющий белок из рыбы Longhorn sculpin (Myoxo-

Круговой дихроизм. Спектры кругового дихро-

cephalus octodecemspinosus). Плазмида со встроен-

изма регистрировали при комнатной (25°С) и по-

ным геном, кодирующим лед-связывающие бел-

ниженной (1.5°С) температуре с использованием

ки и содержащим N-концевую метку His₆ и сайт

спектрополяриметра J-600 (Jasco, Япония) в

расщепления протеазы TEV (MENLYFQS), была

кювете с оптическим путем 1 см в диапазоне длин

получена от ООО «Евроген» (Россия).

волн 200-240 нм с шагом 1 нм, используя раствор

Получение белка. Плазмиду, содержащую це-

рекомбинантного белка в концентрации

0.03 мг/мл в 20 мМ натрий-фосфатном буфере

левой ген белка Long4, трансформировали в хи-

мически компетентные клетки BL21 E. coli по

(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH

7.4), содержащем

стандартному протоколу, описанному в работе

100 мМ NaCl.

[13]. Культуру клеток с векторной конструкцией

Молекулярное моделирование. Для получения

выращивали в среде для роста бактерий Luria

трехмерной структуры белка Long4 использовали

Broth c 50 мкг/мл канамицина при 37°С. При до-

моделирование по гомологии с помощью веб-

стижении OD₆₀₀ значения 0.5 температуру пони-

серверов AlphaFold [16] и SWISS-MODEL [17].

жали до 15°С и инкубировали 1 ч (90 об/мин).

Моделирование молекулярной динамики про-

Экспрессию белка индуцировали добавлением

странственной структуры белка осуществляли с

изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до ко-

использованием программного обеспечения

нечной концентрации 1 мМ и культивированием

Amber20 [18] с ускоренным кодом для GPU [19,

в течение 18 ч при 15°С (220 об/мин). Клетки ли-

20] и силовыми полями ff14SB для белка и TIP5P

зировали с помощью ультразвукового гомогени-

[21] для льда и растворителя. Для генерации льда

затора клеток Sonopuls HD 4100 (Bandelin Elec-

использовали GenIce2 [22] и модель воды tip5p.

tronic GmbH & Co. KG, Германия), проводя на

Молекулярную динамику проводили для белка и

льду 16 циклов обработки ультразвуком по 15 с.

его комплекса со льдом в явной модели раствори-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

642

ОЛЕЙНИК и др.

Рис. 1. (а) - Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка Long4. Выделены следующие фрагменты

последовательности: His-tag, сайт расщепления протеазы TEV, сигнальная последовательность и линкер между His-tag и

сайтом расщепления протеазы TEV. (б) - Электрофоретический контроль гомогенности препарата белка Long4:

дорожка 1 - белок Long4 с молекулярной массой 17.5 кДа (масса белка приведена с His-tag и сайтом расщепления

протеазы TEV); дорожка 2 - белковые маркеры молекулярной массы.

теля в течение 50 нс. Системы состояли из белка

электрофореза в 18%-м полиакриламидном геле

(128 аминокислот), поверхности льда (8320 моле-

(рис. 1б).

кул), 9841 молекул воды в модели белка и 18844 -

Характеризацию проводили методом MALDI

в системе со льдом. Системы сначала минимизи-

масс-спектрометрии. Для анализа использовали

ровали в неявной модели растворителя для релак-

наиболее распространенный вариант «Bottom-

сации молекулы белка. Затем белок, лед и ком-

up» - анализ соединений пептидной структуры

плекс растворяли в tip5p-воде. Полученные си-

[25]. Вырезанное из геля белковое пятно расщеп-

стемы минимизировали в две стадии, на первой -

ляли трипсином по пептидным связям, образо-

релаксировали молекулы растворителя, удержи-

ванным карбоксильными группами лизина и ар-

вая белок и лед, на второй - релаксации подвер-

гинина. После ферментативного расщепления

гали всю систему. Далее проводили постепенное

полученную смесь пептидов очищали от низко-

нагревание до 269 К. Дополнительно для белка

молекулярных примесей на ZipTip C₁₈и анализи-

проводили нагревание до 300 К. Молекулярную

ровали на MALDI-TOF масс-спектрометре Auto-

динамику проводили при установленных темпе-

flex Speed (Bruker, Германия).

ратурах (269 К для всех систем и 300 К дополни-

Идентификацию белка проводили по полу-

тельно для белка в растворителе) в течение 50 нс.

ченным массам пептидов в Mascot по базе данных

Анализ полученных траекторий проводили с по-

Swiss-Prot с допуском 0.3 Да. Типичный масс-

мощью Chimera 1.16.1 [23] и CPPTRAJ [24].

спектр MALDI-TOF трипсинового гидролизата

Long4 представлен на рис. 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После проведения поиска в системе белков

Mascot c допуском 0.3 Да полученный белок был

Характеризация белка. В ходе разработанной и

идентифицирован как белок-антифриз из Myoxo-

оптимизированной методики получен гомоген-

cephalus octodecemspinosus (Longhorn sculpin). Бы-

ный полноразмерный белок Long4 (рис. 1а). Го-

ли найдены пептиды, суммарно соответствующие

могенность белка подтверждали методом гель-

55% последовательности белка.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

СТРУКТУРА ЛЕД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА

643

Рис. 2. Масс-спектр MALDI-TOF трипсинового гидролизата белка Long4. На рисунке приведены массы характерных

пептидов.

Определение структуры белка Long4. Вторич-

жанием α-спиралей, при понижении температу-

ную структуру белка изучали методом спектро-

ры вклад α-спиралей в структуру белка увеличи-

скопии кругового дихроизма. Спектры кругового

вается. Вероятно, при понижении температуры

дихроизма представлены на рис. 3. Эксперимен-

α-спирали способствуют увеличению поверхно-

тальные данные обрабатывали на сайте Di-

сти соприкосновения со льдом. Это согласуется и

chroWeb (DichroWeb job submission form

с данными полученными разными коллективами

(bbk.ac.uk)). Спектр кругового дихроизма при

авторов [10, 11]. Белок Long4 на N-конце содер-

комнатной температуре представляет собой кри-

жит пироглутамильную группу и имеет высокое

вую, характерную для белков с невысоким содер-

(17%) содержание глутамина, он сильно спирале-

Рис. 3. Спектры кругового дихроизма при различных температурах: (а) - 25°С, (б) - 1.5°С. Квадраты - кривая,

построенная по экспериментальным данным, кружки - кривая построена после обработки экспериментальных

значений на сайте DichroWeb. Символ на кривой обозначает шаг длин волн.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

644

ОЛЕЙНИК и др.

Рис. 4. Модель связывания белка с поверхностью льда 1h. Размеры кристалла льда указаны в ангстремах.

видный [10, 11]. Спектры кругового дихроизма и

чение среднеквадратичного отклонения для бел-

конформационный анализ, основанный на дан-

ковой молекулы достигает 8 Å благодаря неструк-

ных о последовательности, показали, что этот бе-

турированным областям, а отклонения во вто-

лок имеет четыре спирали и, вероятно, складыва-

ричных структурах, взаимодействующих с

ется в пучок [10, 26].

поверхностью льда, колеблется в районе 2 Å. По-

Компьютерное моделирование. Одним из под-

казано, что с поверхностью льда образуют водо-

ходов, позволяющих предложить конформаци-

родные связи (рис. 4) Thr, Asn, Asp, Gln и Glu в

онные изменения, происходящие при пони-

различных позициях, находящиеся на расстоя-

жении температуры, являются методы компью-

нии 15-20 Å друг от друга, что согласуется с лите-

терного моделирования. Белок Long4 из

ратурными данными [29]. На малых временах ви-

Myoxocephalus octodecemspinosus на сегодняшний

димого эффекта на стабилизацию/дестабилиза-

день не имеет структуры в базе данных PDB. Мо-

цию структуры льда не обнаружено.

делированием по гомологии с помощью веб-сер-

веров AlphaFold [16] и SWISS-MODEL [17] в на-

стоящей работе получены структуры белка Long4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Структуры использовали для проведения молеку-

лярной динамики в неявной модели растворителя

В данном исследовании оптимизирован метод

в силовом поле ff14SB [27]. Белок флуктуировал

выделения и очистки рекомбинантного белка

на протяжении всех 50 нс молекулярной динами-

Long4, белок охарактеризован методом масс-

ки. Из литературных данных известно, что наибо-

спектрометрического анализа. Методом кругово-

лее близкими к реальным температурам плавле-

ния обладают модели воды tip4p/ice и tip5p [28]. В

го дихроизма показано, что структура молекулы

данной работе была использована модель tip5p.

белка Long4 может быть представлена нескольки-

Изучаемые системы содержали белок в явной мо-

ми структурными типами: α-спиралями и не-

дели растворителя и комплекс «белок-лед». Си-

структурированными элементами. При этом

стемы на протяжении всей динамики оставались

вклад α-спиралей в структуру белка увеличивает-

стабильными. Анализ полученных траекторий

ся при понижении температуры. Полученные

показал, что среднеквадратичное отклонение для

данные согласуются со структурой, полученной

белка в явном растворителе при 269 К достигало

методами компьютерного моделирования. Пока-

~25 Å, хотя альфа-спирали оставались довольно

зано, что в процессе динамики аминокислотные

стабильными и значение среднеквадратичного

остатки Thr, Asn, Asp, Gln и Glu образуют водо-

отклонения для данных структур находилось в

области 5 Å. Комплекс белка со льдом, в свою

родные связи с поверхностью льда, что стабили-

очередь, проявляет большую стабильность и зна-

зирует структуру белка при 269 К.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

СТРУКТУРА ЛЕД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА

645

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

11. W. K. Low, Q. Lin, C. Stathakis, et al., J. Biol. Chem.,

276 (15), 11582 (2001).

Исследование выполнено при финансовой

12. Z. Zhao, G. Deng, Q. Lui, and R. A. Laursen, Bio-

поддержке Российского научного фонда в рамках

chim. Biophys. Acta - Prot. Structure and Mol. Enzy-

проекта № 23-24-00256.

mol., 1382 (2), 177 (1998).

13. A. Y. Chang, V. W. Chau, J. A. Landas, and Y. Pang,

JEMI-methods, 1, 22 (2017).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

14. ProteaseMAX(TM) Surfactant, Trypsin Enhancer Tech-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

nical Bulletin TB373 (Promega Corporation, 2015).

интересов.

15. A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, and M. Mann,

Anal. Chem., 68 (5), 850 (1996).

16. J. Jumper, R. Evans, A. Pritzel, et al., Nature, 596

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

(7873), 583 (2021).

Настоящая работа не содержит исследований с

17. A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, et al., Nucl. Ac-

использованием людей и животных в качестве

ids Res., 46 (W1), W296 (2018).

объектов.

18. D. Case, K. Belfon, S. Ben-Shalom, et al., Amber20

(University of California, San Francisco, 2020).

19. A. W. Götz, M. J. Williamson, D. Xu, et al., J. Chem.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Theory Comput., 8 (5), 1542 (2012).

1. H. Kawahara, in Psychrophiles: From Biodiversity to

20. R. Salomon-Ferrer, A. W. Götz, D. Poole, et al., J.

Biotechnology, Ed. by R. Margesin (Springer Interna-

Chem. Theory Comput., 9 (9), 3878 (2013).

tional Publishing, Cham, 2017), PP. 237-257.

21. Y. Khalak, B. Baumeier, and M. Karttunen, J. Chem.

2. J. S. H. Lorv, D. R. Rose, and B. R. Glick, Scientifica

Phys., 149 (22), 224507 (2018).

(Cairo), 2014, 976895 (2014).

22. M. Matsumoto, T. Yagasaki, and H. Tanaka, J. Com-

3. M. Bar Dolev, I. Braslavsky, and P. L. Davies, Annu.

put. Chem., 39 (1), 61 (2018).

Rev. Biochem., 85, 515 (2016).

23. E. F. Pettersen, T. D. Goddard, and C. C. Huang, J.

4. A. Białkowska, E. Majewska, A. Olczak, and

Comput. Chem., 25 (13), 1605 (2004).

A. Twarda-Clapa, Biomolecules, 10 (2), 274 (2020).

24. D. R. Roe and T. E. Cheatham, J. Chem. Theory Com-

5. A. L. DeVries and D. E. Wohlschlag, Science, 163

put., 9 (7), 3084 (2013).

(3871), 1073 (1969).

25. B. Bogdanov and R. D. Smith, Mass Spectrom. Rev.,

6. C.-H. C. Cheng, Curr. Opin. Genetics & Develop-

24 (2), 168 (2005).

ment, 8 (6), 715 (1998).

26. G. Deng and R. A. Laursen, Biochim. Biophys. Acta,

7. C. Deng, C.-H. C. Cheng, H. Ye, et al., Proc. Natl.

1388 (2), 305 (1998).

Acad. Sci. USA, 107 (50), 21593 (2010).

8. D. Doucet, V. K. Walker, and W. Qin, Cell. Mol. Life

27. C. Tian, K. Kasavajhala, K. A. A. Belfon, et al., J.

Sci., 66 (8), 1404 (2009).

Chem. Theory Comput., 16 (1), 528 (2020).

9. M. Bredow, V. K. Walker, Ice-Binding Proteins in

28. C. Vega, E. Sanz, and J. L. F. Abascal, J. Chem. Phys.,

Plants. Front Plant Sci 8, S. 2153 (2017).

122 (11), 114507 (2005).

10. G. Deng, D. W. Andrews, and R. A. Laursen, FEBS

29. A. S. Oude Vrielink, A. Aloi, L. L. C. Olijve, and

Lett., 402, 17 (1997).

I. K. Voets, Biointerphases, 11 (1), 18906 (2016).

Structure of an Ice-Binding Protein from Myoxocephalus octodecemspinosus

Determined by Molecular Dynamics and Based on Circular Dichroism Spectra

G.A. Oleinik*, P. Zhdanova*, V.V. Koval*^, **, A.A. Chernonosov*, and S.V. Baranova*

*Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, prosp. Akademika Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090 Russia

**Novosibirsk State University, ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090 Russia

One of the survival strategies evolved by the organisms living in cold ecosystems is production of ice-binding

proteins. An important feature of these proteins is to bind to the surface of ice, keep the ice from growing and

prevent cells from damage and death. To understand the mechanism underlying interaction between ice-

binding proteins and ice, it is necessary to know the structure of these extraordinary proteins. This study con-

tributes towards information on the structural and dynamic mechanisms of ice-binding proteins that ensure

the adaptation of organisms to extreme conditions. Research on the mechanisms by which ice-binding pro-

teins develop adaptation to cold opens up great opportunities in solving a wide range of interesting problems

in medicine, such as the development of effective cryoprotectants for cells and organs, as well as in the food

industry, such as long-term food storage without losing nutritional quality at the consumer level.

Keywords: ice-binding proteins, antifreeze proteins, molecular dynamics, circular dichroism, cryoprotectants

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023