БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 705-711

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 57.577.352.38

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ОКСИДАТИВНОГО ГЕМОЛИЗА

ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АЗО- И ПЕРОКСИДНОГО

ИНИЦИАТОРА

*Федеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии РАН,

просп. Академика Семенова, 1, Черноголовка Московской области, 142432, Россия

**Факультет фундаментальной физико-химической инженерии Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, 1, Москва, 119991

^#E-mail: neshev@icp.ac.ru

Поступила в редакцию 26.12.2022 г.

После доработки 06.02.2023 г.

Принята к публикации 15.02.2023 г.

В широком диапазоне концентраций изучена кинетика оксидативного гемолиза 0.2%-й суспензии

эритроцитов мыши под действием радикалообразующих инициаторов 2,2'-азобис(2-амидинопро-

пан)дигидрохлорида и трет-бутилгидропероксида. Гемолиз эритроцитов протекал при активации

пероксидного окисления липидов в мембранах эритроцитов. При этом в случае трет-бутилгидропе-

роксида оксидативные процессы развивались также и в растворимой части клетки, приводя к обра-

зованию нерастворимых агрегатов гемоглобина. Период индукции гемолиза (время достижения

10%-го гемолиза) под действием 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида убывает обратно

пропорционально квадратному корню от концентрации инициатора, что согласуется с классиче-

ской теорией радикально-цепного окисления углеводородов. В случае трет-бутилгидропероксида

данная закономерность не соблюдается. В качестве инициатора пероксидного окисления липидов

в эритроцитарной модели тестирования природных и синтетических соединений на антиоксидант-

ную активность предпочтительнее использовать 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид.

Ключевые слова: эритроциты, гемоглобин, оксидативный гемолиз, пероксидное окисление липидов.

DOI: 10.31857/S0006302923040099, EDN: KLALFM

сидантную активность. Широкое распростране-

В рамках широкого исследовательского на-

правления, берущего свое начало с пионерских

ние получило использование для этой цели моде-

работ Б.Н. Тарусова и Н.М. Эмануэля в 50-х годах

ли индуцированного оксидативного гемолиза

прошлого века и получивших впоследствии ши-

эритроцитов [2]. В качестве индукторов гемолиза

рокое развитие в исследованиях Е.Б. Бурлаковой,

используют известные в химии полимеров азо- и

были заложены представления о фармакологиче-

пероксидные инициаторы радикальной полиме-

ских перспективах природных и синтетических

ризации [3]. При этом механизмы взаимодей-

ингибиторов пероксидного окисления липидов

ствия указанных инициаторов с эритроцитом как

(ПОЛ) - биоантиоксидантов [1]. Поиск и иссле-

сложной биологической системой клеточного

дование веществ, обладающих антиоксидантны-

уровня остаются до конца не изученными, что за-

ми свойствами, и последующая разработка на их

трудняет анализ результатов экспериментальных

основе фармакологических препаратов до насто-

исследований в данной области.

ящего времени продолжает оставаться одним из

базовых направлений химической биологии и ме-

Целью работы было изучение кинетических за-

дицинской химии. Это обусловливает актуаль-

кономерностей и физико-химических механизмов

ность и практическую значимость разработки

оксидативного гемолиза эритроцитов под действи-

биологических моделей, на которых осуществля-

ем инициаторов пероксидного окисления липи-

ется тестирование новых соединений на антиок-

дов, 2,2'-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлори-

да (ААРН), относящегося к классу азосоединений,

Сокращения: ПОЛ - пероксидное окисление липидов,

и трет-бутилгидропероксида (t-BuOOH) из клас-

ААРН

2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид,

t-BuOOH - трет-бутилгидропероксид.

са органических пероксидов.

705

706

СОКОЛОВА и др.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ность контрольного образца (D₀) составляла ~0.8,

что соответствовало содержанию клеток 0.2% по

Получение эритроцитарной массы. В качестве

объему. Экспериментальные значения, характе-

источника крови были использованы мыши ли-

ризующие изменение степени гемолиза во време-

нии С 57 Bl/6f (возраст 3 месяца, масса 18-20 г),

ни, аппроксимировали в программе Origin сигмо-

полученные из питомника ФИЦ ПХФ и МХ РАН

идальной функцией Больцмана. В качестве коли-

(Черноголовка Московской обл., Россия). Забор

чественной характеристики гемолитической

крови проводили от предварительно наркотизи-

активности инициаторов ПОЛ использовали ве-

рованной эфиром мыши посредством ее декапи-

личину периода индукции гемолиза, которую

тации. В качестве антикоагулянта использовали

определяли графически по времени достижения

0.11 М раствор цитрата натрия. Кровь собирали в

10% гемолиза.

склянку, куда предварительно добавляли раствор

цитрата натрия, соблюдая соотношение цит-

Определение малонового диальдегида. Перок-

рат/кровь - 1 : 5.

сидное окисление липидов мембран эритроцитов

характеризовали по уровню образования малоно-

Кровь центрифугировали в течение 7 мин при

вого диальдегида по методу, описанному в работе

1500 g. Плазму декантировали. Осадок эритроци-

[5], с модификациями. К 2 мл суспензии эритро-

тов осторожно ресуспендировали в изотониче-

цитов 1.4%-го гематокрита добавляли 1 мл 30%

ском растворе NaCl (0.85% NaCl, содержащий

раствора трихлоруксусной кислоты. Затем цен-

5 мМ Na-фосфатного буфера, pH 7.4). Центрифу-

трифугировали при 6000 g в течение 30 мин. К

гирование повторяли троекратно. После каждого

2 мл супернатанта добавляли 0.5 мл раствора 0.8%

центрифугирования супернатант декантировали,

тиобарбитуровой кислоты в 0.05 М NaOH и инку-

осадок эритроцитов ресуспендировали в новой

бировали в течение 20 мин на кипящей водяной

порции изотонического раствора NaCl. Эритро-

бане. После инкубации образцы охлаждали про-

цитарную массу, полученную после последнего

точной водопроводной водой и определяли опти-

центрифугирования, хранили в холодильнике

ческую плотность при 532 нм.

при 4°C не более суток.

Определение нерастворимого гемоглобина. Ки-

Гемолиз эритроцитов. В гемолитических экспе-

нетику образования внутри эритроцитов нерас-

риментах использовали 0.2% (по объему) суспен-

творимого гемоглобина определяли в предвари-

зию эритроцитов в изотоническом растворе

тельно гемолизованных дистилированной водой

NaCl, которую получали путем разбавления эрит-

аликвотах суспензии эритроцитов по образова-

роцитарной массы непосредственно перед экспе-

нию рассеивающей мути при 525 нм - изобести-

риментом. Эксперимент проводили при 37°С в

ческой точке спектров основных молекулярных

пластиковой кювете объемом 3 мл при непрерыв-

форм гемоглобина (Hb, HbO₂, MetHb). Содержа-

ном слабом помешивании. За ходом гемолиза

эритроцитов следили по изменению оптической

ние нерастворимого гемоглобина (НГ) оценива-

плотности суспензии при длине волны 700 нм.

ли по относительному увеличению оптической

Указанная длина волны была выбрана за предела-

плотности гемолизата при 525 нм по формуле:

ми основной области электронного поглощения

ΔD

гемоглобина, в связи с чем ослабление светового

НГ

потока практически полностью связано с рассея-

нием света на эритроцитах. Высокий уровень раз-

где D и D₀ - оптические плотности гемолизата

бавления суспензии позволяет радикально

опытного и контрольного образца суспензии

уменьшить влияние эффекта многократного

эритроцитов. Экспериментальные значения

внутреннего отражения света на эритроцитах, это

ΔD/D₀ аппроксимировали сигмоидной функцией

позволяет получить взаимосвязь между степенью

Больцмана.

гемолиза и оптической плотностью суспензии в

удовлетворительном линейном приближении,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

что было продемонстрировано в работе [4]. Сте-

пень гемолиза суспензии (γ) определяли из соот-

ААРН в водной среде (рис. 1) подвергается мо-

ношения:

номолекулярному разложению с образованием

двух алкильных радикалов и выделением молеку-

-D

лярного азота. В кислородной среде алкильные

γ =

D -D

радикалы вступают в быструю реакцию с кисло-

H2O

родом с образованием пероксидных радикалов [6,

где D₀ и D - оптические плотности контрольного

7]. Последние способны атаковать двойные связи

и опытного образца, соответственно.

- оп-

мембранных липидов в биологических субстра-

H2O

тах, что приводит к инициированию ПОЛ в мем-

тическая плотность образца в условиях полного

бране. Процесс разложения ААРН протекает с

лизиса всех эритроцитов дистиллированной во-

дой. Во всех экспериментах оптическая плот-

достаточной эффективностью уже при 35-40^○С.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ОКСИДАТИВНОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

707

Рис. 1. Схема разложения ААPH в водной среде.

Пероксидный инициатор, t-BuOOH, в отли-

вышающие время стабильности контрольной

чие от ААРН, не способен самопроизвольно рас-

суспензии эритроцитов. На рис. 2б показана вза-

падаться на радикалы при физиологических тем-

имосвязь периода индукции гемолиза с концен-

пературах. Однако благодаря высоколипофиль-

трацией ААРН. Если полагать, что гемолиз эрит-

ному третбутильному фрагменту t-BuOOH легко

роцита наступает при достижении некоторой по-

проникает через плазматическую мембрану

роговой концентрации продуктов ПОЛ в

внутрь клетки, запуская в ней каскад сложных ре-

мембране ([P]₀) и считать скорость окисления

акций с каталитическим участием гемоглобина. В

(W₀) постоянной, то значение пороговой концен-

ходе этих процессов образуются радикальные

трации продуктов окисления будет [P]₀ = W₀·I₁₀,

продукты, инициирующие оксидативное повре-

ждение клеточных структур [8].

откуда I₁₀ = [P]₀/W₀. Согласно теории радикаль-

но-цепного окисления углеводородов в отсут-

На рис. 2а показаны кинетические кривые ге-

ствие антиоксидантов скорость окисления W₀

молиза 0.2%-й суспензии эритроцитов мыши при

различных концентрациях ААРН в пределах кон-

должна быть пропорциональной корню квадрат-

ному из скорости инициирования. С учетом

центрационного диапазона 10^-3-10^-2 М. Ниж-

того, что распад ААРН происходит мономолеку-

ней границей исследованного диапазона концен-

лярно, скорость окисления можно считать при-

траций ААРН была концентрация 2·10^-3 М. Бо-

мерно равной концентрации инициатора, то есть

лее

низкие концентрации ААРН не

исследовались, так как им соответствовали слиш-

W₀ ~ С^0.5 и, соответственно, I₁₀ ~ C·I₁₀ ≈ С^-0.5. Та-

ком большие периоды индукции гемолиза, пре-

ким образом, взаимосвязь между периодом ин-

Рис. 2. (а) - Кинетика гемолиза эритроцитов под действием различных концентраций ААРН; (б) - взаимосвязь периода

индукции гемолиза с концентрацией ААРН.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

708

СОКОЛОВА и др.

Рис. 3. (а) - Кинетика гемолиза эритроцитов под действием различных концентраций t-BuOOH; (б) - взаимосвязь

периода индукции гемолиза с концентрацией t-BuOOH.

дукции гемолиза и концентрацией инициатора

тормозит гемолиз. Об этом свидетельствуют так-

должна описываться убывающей степенной

же результаты дополнительного анализа экспери-

ментальных результатов на рис. 3б, который фор-

функции вида I₁₀ = AC^-b, где b = -0,5. Программа

мально не связан с теорией радикально-цепного

Origin дает нам для экспериментальных значений

окисления. Значения периодов индукции гемо-

периодов индукции гемолиза на рис. 2, аппрок-

лиза на рис. 3б с высоким приближением (сред-

симирующую кривую, описываемую уравнением

няя ошибка аппроксимации - 1.44%) удается ап-

I₁₀ = 173·C^-0.5. Как мы видим, значение показате-

проксимировать биэкспоненциальной функцией

ля степени идеально совпадает с теоретически

-k

вида

Результат аппрокси-

ожидаемым значением. Таким образом, период

мации показан штрихпунктирной линией. Такой

индукции гемолиза убывает обратно пропорцио-

характер зависимости может указывать на воз-

нально корню квадратному от концентрации

можное присутствие в системе двух различных

ААРН.

факторов, влияющих на гемолиз.

На рис. 3а показаны кинетические кривые ге-

молиза эритроцитов под действием различных

Хотя в целом оксидативные процессы в клетке

концентраций t-BuOOH. Как и в случае с ААРН,

могут затрагивать различные субстраты и проте-

гемолитическое действие t-BuOOH является кон-

кать по различным механизмам, их неизменной

центрационнозависимым. Аппроксимация экс-

составляющей является пероксидное окисление

периментальных значений I₁₀ степенной функ-

липидов мембран. В первую очередь это связано с

высокой чувствительностью липидного субстрата

цией вида I₁₀ = AC^-b (рис. 3б, сплошная линия)

к радикальной атаке, а также с цепным самопод-

дает значение b = -0.36, отклоняющееся от теоре-

держивающимся характером процесса ПОЛ. Об-

тически ожидаемого. Как мы видим, в этом слу-

щепризнанным химическим маркером, с помо-

чае убывание периода индукции гемолиза проис-

щью которого принято количественно характе-

ходит медленнее, приближаясь к обратно про-

ризовать уровень ПОЛ в биосубстратах, является

порциональной зависимости

от

корня

образующийся в ходе ПОЛ малоновый диальде-

кубического из концентрации инициатора.

гид. Уровень малонового диальдегида оценивали

по увеличению оптической плотности при

В целом сравнение графиков на рис. 2б и 3б

выявляет во втором случае характерный тренд к

532 нм. На рис. 4 показан прирост оптического

выходу зависимости на плато, что видно по от-

поглощения ΔА₅₃₂ в зависимости от концентра-

клонению двух последних точек от аппроксими-

ции ААРН (рис. 4а) и t-BuOOH (рис. 4б). Обра-

рующего графика. При этом как раз данным точ-

щает на себя внимание, что ААРН и t-BuOOH

кам соответствуют кинетические кривые, для ко-

действуют в разных концентрационных диапазо-

торых наблюдалась более ранняя остановка

нах, различающихся примерно на два порядка.

гемолиза, когда часть клеток в системе остава-

При этом в случае с ААРН нарастание уровня ма-

лись не разрушенными (рис 3а). Это может прямо

лонового диальдегида с ростом концентрации

указывать на возможное присутствие в системе c

идет практически линейно, тогда как в случае

t-BuOOH дополнительного фактора, который

t-BuOOH зависимость быстро выходит на стаци-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ОКСИДАТИВНОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

709

Рис. 4. Образование малонового диальдегида в суспензии эритроцитов под действием ААРН (а) и t-BuOOH (б).

Содержание эритроцитов - 1.4 об. %; время инкубации - 30 мин; t = 37°С.

онарный уровень. Последнее согласуется с имею-

образования которых свидетельствуют литера-

щимися литературными данными [8].

турные данные [8, 9]. Как видно из рисунка, под

действием t-BuOOH в системе наблюдается рез-

В то же время анализ содержимого раствори-

мой части клетки позволил обнаружить суще-

кое увеличение рассеивающих свет агрегатов ге-

моглобина.

ственное различие в действии ААРН и t-BuOOH.

На рис. 5 показано относительное увеличение оп-

Полученные нами результаты показывают,

тической плотности гемолизата эритроцитов при

что, хотя оба изученных инициатора способны

525 нм с ростом концентрации исследуемых ини-

активировать ПОЛ в мембранах эритроцитов, их

циаторов. Длина волны в 525 нм является изобес-

гемолитическое действие имеет существенные

тической точкой для спектров электронного по-

различия. Как показал проведенный выше ана-

глощения присутствующих в системе молекуляр-

лиз, в случае гемолиза эритроцитов под действи-

ных форм гемоглобина. По этой причине

ем ААРН период индукции гемолиза был обратно

увеличение оптической плотности в данной обла-

пропорционален квадратному корню из концен-

сти связано с появлением в системе рассеиваю-

трации ААРН. Это согласуется с положением

щих свет агрегатов гемоглобина, о возможности

классической теории радикально-цепного окис-

Рис. 5. Образование нерастворимых агрегатов гемоглобина под действием t-BuOOH и ААРН.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

710

СОКОЛОВА и др.

ления органических субстратов. Молекулярной

седними молекулами гемоглобина с образовани-

основой гемолиза в данном случае является раз-

ем нерастворимых агрегатов, которые мы

вивающийся в мембране процесс ПОЛ.

наблюдаем в эксперименте. Снижающаяся при

Иначе обстоит дело в случае t-BuOOH. Его

этом концентрация растворимого гемоглобина

действие на эритроцит, как свидетельствуют ли-

может приводить к уменьшению осмотического

давления внутри клетки, что будет снижать ско-

тературные данные, включает ряд различных ме-

рость поступления воды в клетку. Последнее мо-

ханизмов [10,11]. Центральной реакцией является

жет быть причиной наблюдаемого в наших экспе-

взаимодействие трет-бутилгидропероксида с

двухвалентным железом оксигемоглобина, с об-

риментах торможения процесса гемолиза.

разованием алкоксильного радикала и метгемо-

Полученные в данной работе результаты со-

глобина. Эта реакция аналогична реакции Фен-

гласуются с представлением, что в случае с ААРН

тона:

основной радикальной формой является образу-

ющийся при разложении ААРН в водной среде

[HbFe²⁺]O₂ + t-BuOOH →

пероксидный радикал, который атакует клетку

(1)

снаружи. При этом развивающийся процесс ПОЛ

→ HbFe³⁺ + t-BuO^• + OH^- + O₂

ограничивается областью эритроцитарной мем-

По мере накопления трехвалентного железа на

браны. В то же время под действием t-BuOOH,

гемоглобине оно может вступать во взаимодей-

помимо процесса ПОЛ в мембране, оксидатив-

ствие с новой молекулой t-BuOOH:

ные процессы развиваются также в растворимой

части клетки. Это не кажется удивительным, так

t-BuOOH + HbFe³⁺ →

как сам процесс образования радикальных форм

(2)

→ t-BuOH + порфирин^+•-Fe^IV+=O

связан с гемоглобином, т. е. происходит внутри

клетки. В соответствии с этим чисто физически

В этой реакции происходит двухэлектронное

очередность взаимодействия радикалов с суб-

восстановление гидропероксида в спирт с обра-

стратами в эритроците оказывается обратной:

зованием высокореакционной формы гемогло-

вначале модификации подвергается внутрикле-

бина - оксоферрила (со степенью окисления же-

точное содержимое и только вслед за этим насту-

леза +4). Эта реакция является проявлением пе-

пает очередь мембраны. Это делает систему более

роксидазной активности гемоглобина

[12].

сложной. Так, в случае с t-BuOOH снижение кон-

Образующаяся в ней структура, катион-радикал

центрации растворимого гемоглобина приводит к

оксоферрил-порфирина, аналогична соедине-

появлению дополнительного фактора, влияюще-

нию I в классическом цикле пероксидазы. Поми-

го на осмотическое равновесие клетки, что при-

мо сверхокисленного гемового железа она имеет

водит к торможению процесса гемолиза. В связи

неспаренный электрон на периферии порфири-

с этим ААРН выглядит более предпочтительно в

нового цикла. Помимо запуска цепного процесса

качестве инициатора ПОЛ в эритроцитарной мо-

ПОЛ липидов, эта реакционноспособная молеку-

дели тестирования природных и синтетических

ла может отрывать водород от второй молекулы t-

соединений на антиоксидантную активность.

BuOOH с образованием пероксидного радикала:

t-BuOOH + порфирин^•+- Fe^IV+=O →

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

(3)

→ порфирин Fe^IV+=O + t-BuOO^•

Работа выполнена в рамках Государственного

Таким образом, в системе образуются по край-

задания (Регистрационный

№ АААА-А19-

ней мере два типа радикалов, происходящих из

119071890015-6).

трет-бутилгидропероксида: алкоксильный ра-

дикал - t-BuO• (1) и пероксидный радикал -

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

t-BuOO• (3), которые способны индуцировать

ПОЛ в мембране. Плюс к этому образуется кати-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

он-радикал оксоферрил-порфирина (2), который

интересов.

способен сам по себе индуцировать ПОЛ [13].

Последний способен также к окислительному

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

взаимодействию с полипептидными цепями со-

седних молекул гемоглобина, в результате кото-

Все применимые международные, националь-

рого неспаренный электрон переходит с порфи-

ные и институциональные принципы ухода и ис-

ринового цикла на боковые фрагменты амино-

пользования животных при выполнении работы

кислот, приводя к образованию долгоживущих

были соблюдены.

радикалов на полипептидных цепях гемоглобина,

регистрируемых методом ЭПР [14]. Можно ожи-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

дать, что результатом рекомбинации этих радика-

лов может быть возникновение сшивок между со-

1. Е. Б. Бурлакова, Успехи химии, 44 (10), 1871 (1975).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМЫ ОКСИДАТИВНОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

711

2. О. Г. Шевченко и Л. Н. Шишкина, Успехи соврем.

9. R. J. Trotta, S. G. Sullivan, and A. Stern, Biochem. J.,

биологии, 134 (2), 133 (2014).

204, 405 (1982).

3. Ю. Д. Семчиков, Высокомолекулярные соединения

10. А. В. Доманский, Е. А. Лапшина, И. Б. Заводник,

(Издательский центр «Академия», М., 2010).

Биохимия, 70 (7), 922 (2005).

4. J. D. Young, L. G. Leong, M. A. DiNome, and

11. J. Van der Zee, D. P. Barr, and R. P. Mason, Free Rad-

Z. A. Сohn, Anal. Biochem., 154 (2), 649 (1986).

ic. Biol. Med., 20 (2), 199 (1996).

5. J. Stocks and T. L. Dormandy. Br. J. Haematol., 20, 95

12. A. I. Alayash and M. T. Wilson, Front. Mol. Biosci., 9,

(1971).

910795 (2022).

6. R. U. R. Wahl, L. Zeng, S. A. Madison, et al., J. Chem.

Soc., Perkin Trans. 2, 2009 (1998).

13. О. В. Космачевская и А. Ф. Топунов. Прикл. биох.

7. C. López-Alarcón, E. Fuentes-Lemus, J. D. Figueroa,

микробиол., 45 (6), 627 (2009).

et al., Free Rad. Biol. Med., 160, 78 (2020).

14. D. A. Svistunenko, R. P. Patel, S. V. Voloshchenko,

8. B. Deuticke, K. B. Heller, and C. W. Haest, Biochim.

and M. T. Wilson, J. Biol. Chem., 272 (11), 7114

Biophys Acta, 854, 169 (1986).

(1997).

Kinetics and Mechanisms of Oxidative Hemolysis of Erythrocytes in the Presence

of Azo- and Peroxide Initiator

Е.М. Sokolova*, N.A. Dubenskaia**, B.L. Psikha*, and N.I. Neshev*

*Federal Research Center of Problems of Chemical Physics and Medicinal Chemistry, Russian Academy of Sciences,

prosp. Akademika Semenova 1, Chernogolovka, Moscow Region, 142432 Russia

**Faculty of Fundamental Physical and Chemical Engineering, Lomonosov Moscow State University,

Leninskiye Gory, 1, Moscow, 119991 Russia

The kinetics of oxidative hemolysis of a 0.2% suspension of mouse erythrocytes in the presence of radical-

forming initiators, 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride and tert-butyl hydroperoxide, was stud-

ied over a wide range of concentrations. Hemolysis of erythrocytes proceeded with the activation of lipid per-

oxidation in erythrocyte membranes. In the case of tert-butyl hydroperoxide, oxidative processes also devel-

oped in the soluble part of the cell, leading to the formation of insoluble hemoglobin aggregates. An induction

period of hemolysis (the time period required to reach 10% hemolysis) in the presence of 2,2'-azobis(2-amid-

inopropane) dihydrochloride decreases inversely proportional to the square root of the initiator concentra-

tion, that is in accord with the classical theory of radical chain oxidation of hydrocarbons. In the case of tert-

butyl hydroperoxide, this association was not found. The use of 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochlo-

ride as a lipid peroxidation initiator is preferred in the erythrocyte model for testing natural and synthetic

compounds for antioxidant activity.

Keywords: erythrocytes, hemoglobin, oxidative hemolysis, lipid peroxidation

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023