БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 712-717

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

К ВОПРОСУ О РОЛИ ЭКТОНУКЛЕОТИДАЗ В СИНАПТИЧЕСКОЙ

ПЕРЕДАЧЕ. ТЕРМОЛАБИЛЬНОСТЬ МЕТАБОЛИЗМА АТФ

*Казанский государственный медицинский университет, ул. Бутлерова, 49, Казань, 420012, Россия

**Казанский федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420008, Россия

^#E-mail: khajrulli@yandex.ru

Поступила в редакцию 10.05.2023 г.

После доработки 23.05.2023 г.

Принята к публикации 21.06.2023 г.

АТФ как посредник в нервно-мышечном синапсе может высвобождаться путем квантовой и не-

квантовой секреции из мотонейронов центральной и периферической нервной системы вместе с

основным нейромедиатором - ацетилхолином. Последовательное гидролитическое дефосфорили-

рование АТФ до аденозина в синаптической щели - это каскад реакций, катализируемый эктонук-

леотидазами. Большой интерес представляет изучение вклада этих ферментов в сложный сигналь-

ный каскад, так как известно об их двойной функции - лимитирование действия АТФ как нейро-

медиатора и участие в образовании других нейромодуляторов (АДФ, АМФ и аденозина), причем

известно, что АТФ и ее метаболиты могут вызывать совершенно различные физиологические эф-

фекты. В работе определена активность эктонуклеатидаз в различных типах скелетных мышц, по-

казано, что она варьирует в пределах 5-7 МЕ. Понижение температуры до 22°С приводит к много-

кратному снижению энзиматического метаболизма АТФ в тканях скелетных мышц. Предполагает-

ся, что энзиматическое лимитирование АТФ и продукции ее метаболитов обеспечивает

стабилизацию эффективной холинергической нервно-мышечной передачи в норме и патологии.

Ключевые слова: нервно-мышечный синапс, эктонуклеотидазы, метаболизм АТФ, синаптическая сиг-

нализация.

DOI: 10.31857/S0006302923040105, EDN: KLIGJV

Известно, что наиболее эффективным из на-

трацию нуклеотидов, принадлежат к нескольким

тивных модуляторов синаптической передачи яв-

семействам, различающимся по происхождению

ляется котрансмиттер ацетилхолина - АТФ [1].

и механизму действия. Существует четыре семей-

Выделяясь вместе с основным медиатором, АТФ

ства нуклеотидаз: NTPDases (нуклеозидтрифос-

ингибирует дальнейший экзоцитоз ацетилхолина

фатдифосфогидролазы), NPPases (пирофосфо-

из терминали мотонейрона по принципу отрица-

гидролазы/фосфодиэстеразы), фосфатазы и

тельной обратной связи, формируемой при уча-

экто-5'-нуклеотидазы [6, 7].

стии пресинаптических Р2-рецепторов. Метабо-

Основными нуклеотидазами, участвующими в

литы АТФ, в первую очередь аденозин (посред-

процессе гидролиза пуринов, являются CD39 и

ством аденозиновых рецепторов), действуют по

CD73. Первый метаболизирует АТФ до АДФ, пи-

такому же принципу [2].

рофосфата и АМФ. Последний, в свою очередь,

Концентрация пуринов вне клетки зависит от

расщепляется до аденозина и фосфата с помощью

баланса между их высвобождением из клеток, по-

поверхностного фермента CD73 [4]. Таким обра-

глощением и внеклеточным метаболизмом [3].

зом, активность эктонуклеотидаз CD39 и CD73

После выхода АТФ во внеклеточное простран-

обеспечивает баланс АТФ и аденозина. Эти моле-

ство происходит дефосфорилирование данной

кулы экскретируются из клеток многих тканей и

молекулы различными сывороточными и мем-

органов: сердца, плаценты, легких, печени, ки-

бранными ферментами, например, эктонуклео-

шечника, мозга, почек и др. [4, 8].

тидазами [4].

Максимальная каталитическая активность

Активность этих ферментов обнаружена у всех

этих ферментов достигается при условии содер-

исследованных живых организмов: растений,

жания во внеклеточной среде двухвалентных

бактерий, животных и человека [5]. Все извест-

катионов, таких как кальций или магний, и ще-

ные эктоферменты, контролирующие концен-

лочного значения pH. Кроме того, они имеют вы-

712

К ВОПРОСУ О РОЛИ ЭКТОНУКЛЕОТИДАЗ

713

сокую чувствительность к изменениям темпера-

Исходя из современных представлений о вкла-

турных показателей: являясь по природе белка-

де пуринергической модуляции в процессы си-

ми, имеют склонность к денатурации и потере

наптической сигнализации большой интерес вы-

активности при повышении температуры выше

зывает вклад эктонуклеатидаз в пластичность

70°С. Скорость катализируемой ими реакции так

этой сложной, многомодальной системы. В связи

же напрямую зависит от температуры: при повы-

с этим целью настоящего исследования явилась

шении ее на 10°С реакция ускоряется в два-три

оценка уровня ферментативного гидролиза АТФ

раза, а при приближении к 0°С - замедляется до

в нервно-мышечных препаратах крыс при нор-

минимума. Таким образом, температурная среда

мальной и пониженной температуре.

влияет на следующие основные составляющие

ферментативной реакции: на белковую часть

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

фермента, на скорость образования фермент-

субстратного комплекса и на все этапы преобра-

Подготовительные процедуры. Исследования

зования субстрата [9, 10].

проводились на 15 лабораторных крысах линии

Wistar, самцах и самках массой 130-190 г, кото-

Поддержание температуры тела в определен-

рых содержали в группах по 5 особей, с водой и

ных значениях обеспечивает теплокровным жи-

кормом ad libitum.

вотным способность передвигаться, совершать

двигательную активность при широком диапазо-

Животных перед началом манипуляций нар-

не температурных различий окружающей среды

котизировали при помощи ингаляционной ане-

[11].

стезии раствором эфира. После наступления нар-

котического сна проводили декапитацию при по-

Известно, что при отсутствии значительных

мощи гильотины, обескровливание

колебаний температуры внутренних органов мле-

последовательное выделение мышц, используе-

копитающих, периферические отделы их тела мо-

мых при проведении исследований (m. diaphrag-

гут испытывать большие изменения в температу-

ma, m. soleus, m. EDL).

ре, в частности, снижение на 15°C у человека [12]!

Таким образом, периферические скелетные

Активность фермента эктонуклеотидазы опре-

мышцы теплокровных сохраняют способность к

деляется посредством инкубирования кусочков

сократительной активности даже при значитель-

мышечной ткани (m. soleus, m. EDL, m. diaphrag-

ном снижении их температуры [13].

ma) крыс с АТФ (субстрат реакции) в течение

определенного времени с дальнейшей оценкой

По современным представлениям сила, ско-

содержания субстрата и продуктов реакции

рость сокращения и расслабления скелетных

(АДФ, АМФ) в инкубате методом высокоэффек-

мышц теплокровных, как правило, увеличивают-

тивной жидкостной хроматографии.

ся с повышением температуры [14]. Это наблюда-

Перед получением материала готовили буфер-

лось, например, во время физических упражне-

ный раствор следующего состава (в мМ)

ний, когда температура скелетных мышц на пери-

HEPES - 10, NaCl - 135, KCl - 5, CaCl₂ - 2,

ферии тела человека увеличивалась на несколько

градусов по Цельсию [15, 16].

MgCl₂ - 2, глюкоза - 10, pH 7.4. Материал укла-

дывали в подготовленную емкость, далее иссека-

Вместе с тем в указанных работах не придава-

ли все остальные ткани, оставляя фрагмент мы-

лось особого значения типам исследованных ске-

шечной ткани с культей нерва массой 2-4 мг. По-

летных мышц. Не подлежит сомнению, что они,

лученные кусочки ткани помещали в ячеистую

различающиеся по самой своей функции - обес-

пластину, заполненную 300 мкл буфера, нагрето-

печивающие поддержание позы («медленные»

го до 37°С или 22°С. Встряхивали в течение 10 мин

мышцы) и выполняющие «тонкие» движения

для удаления поврежденных клеток и следов

(«быстрые» мышцы) - призваны по-разному реа-

нуклеотидов, далее удаляли буфер, оставляя

гировать на изменения температуры, что и на-

фрагменты ткани в лунках. После этого в 1-ую и

блюдается на практике [17].

3-ю вертикали добавляли по 300 мкл буфера,

Определенную сложность в исследования вно-

содержащего АТФ (300 мкМ). Как только 1-ая и

сит тот факт, что в физиологических условиях

3-я вертикали заполнялись, начинали добавлять

влияние АТФ и ее метаболитов в нервно-мышеч-

буферную жидкость во 2-ю вертикаль. По запол-

ном синапсе минимально, но становится более

нении всех 9 лунок встряхивали пластину в тече-

выраженным в некоторых патофизиологических

ние 10 мин при 37°С или 22°С. Далее для останов-

ситуациях, таких как стресс, гипогравитация,

ки реакции добавляли по 300 мкл 3%-й хлорной

травмы, ишемия или гипотермия [18, 19]. Кроме

кислоты. По завершении реакции инкуба-

того, существуют данные, демонстрирующие раз-

ционную жидкость центрифугировали при

нонаправленность действия АТФ в нервно-мы-

3000 об/мин в течение 5 мин, после этого надоса-

шечном синапсе разных типах двигательных еди-

дочную жидкость замораживали для последую-

ниц [20-22].

щего количественного определения АТФ мето-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

714

ХАЙРУЛЛИН и др.

дом высокоэффективной жидкостной хромато-

Статистическую обработку данных проводили

графии. После того, как инкубат помещали в

с помощью программы SPSS Statistics. Проверку

центрифугу, фрагменты ткани взвешивали.

соответствия полученных данных нормальному

распределению проводили с помощью критерия

Эксперименты проводили на хроматографе

Колмогорова. Рассчитывали средние арифмети-

производства Shimadzu (Япония), состоящем из

ческие анализируемых параметров и стандартную

спектрофотометрического детектора SPD-20A,

ошибку. Статистическую значимость наблюдае-

дегазатора DGU-20A3, насоса LC-20AD и термо-

мых изменений оценивали с помощью критерия

стата CTO-20A, с использованием программного

Стьюдента для независимых и попарно сопря-

обеспечения LC Solution. Для разделения нуклео-

женных выборок. Различия рассматривали как

тидов использовали колонку Supelco с длиной

значимые при p < 0.05.

15 см и внутренним диаметром 4.6 мм. Мобиль-

ная фаза состояла из 0.2 M KH₂PO₄ и 3%-го мета-

нола (pH 6.0), скорость тока 1.5 мл/мин, длина

РЕЗУЛЬТАТЫ

волны 210 нм и объем образца 20 мкл.

В норме активность эктонуклеатидаз в различ-

При данных условиях нуклеотиды появлялись

ных типах скелетных мышц примерно равна, ва-

в следующем порядке: АТФ, АДФ и АМФ. Пол-

рьируется в пределах 5-7 МЕ, что говорит о гомо-

ное разделение нуклеотидов происходило в тече-

генном энзиматическом метаболизме внеклеточ-

ние 5 мин.

ной АТФ в исследуемых тканях. При понижении

Определяли концентрацию АТФ путем срав-

температуры до 22°С наблюдается многократное,

нения уровня напряжения самой высокой точки с

неравномерное снижение энзиматического мета-

соответствующим уровнем напряжения у кон-

болизма АТФ в различных тканях (табл. 1).

трольного образца. Для нахождения активности

Оценка температурной зависимости Р2-опосре-

эктонуклеатидаз использовали формулу:

дованных эффектов и эктонуклеатидазной актив-

ности. В данном случае температурный коэффи-

(ν

-ν

ATФопыт

)

= ATФконтроль

циент Q₁₀ - это величина, равная отношению

эффективности биохимических реакций, сопря-

где А - активность фермента в МЕ, ν_{ATФконтроль} -

женных с механической активностью мышц при

количество АТФ в контроле, ν_ATФопыт - количе-

повышенной на 10°С температурой окружающей

среды к первоначальному значению эффектив-

ство АТФ в опыте, t - время эксперимента в мин.,

ности.

N - масса ткани в мг.

Температурный коэффициент Q₁₀ для экто-

Расчет температурного коэффициента Q₁₀. Из

нуклеотидаз для камбаловидной мышцы соста-

уравнения Вант-Гоффа температурный коэффи-

вил 3.774 ± 0.490, для длинного разгибателя паль-

циент универсально для любого диапазона темпе-

цев - 4.014 ± 0.521, для диафрагмы - 2.246 ± 0.291.

ратур вычисляется по формуле:









R



T

−T



ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

=



Ранее нами было описано температурозависи-



R1

мое действие АТФ на функциональное состояние

где R_n - сила сокращения при температуре Т_n.

скелетной мышцы [20-22]. Так сопоставляя дан-

Мы в своих экспериментах для расчета Q₁₀ ис-

ные коэффициентов термолабильности энзима-

пользовали отношение активности эктонуклеа-

тических систем и показателей термочувстви-

тидаз при температурах 22°С и 37°С.

тельности нервно-мышечных соединений, следу-

Таблица 1. Активность эктонуклеотидаз (в МЕ)

37°C

22°C

m. diaphragma

6.001 ± 1.140 (n = 12)

1.793 ± 0.340* (n = 11)

m. soleus

6.578 ± 1.249 (n = 10)

0.906 ± 0.172* (n = 10)

m. EDL

5.318 ± 1.010 (n = 12)

0.668 ± 0.126* (n = 12)

Примечание. * - Достоверное отличие от контроля при 37°C, р < 0.05.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

К ВОПРОСУ О РОЛИ ЭКТОНУКЛЕОТИДАЗ

715

Рис. 1. Нервно-мышечный синапс: А₁ - аденозиновый рецептор, Р₂- пуриновый рецептор, АТФ - аденозинтрифосфат,

АДФ - аденозиндифосфат, АМФ - аденозинмонофосфат, Аdo - аденозин, АCh - ацетилхолин, 1 - экто-АТФазы

(CD39) и экто-аденилаткиназа (ADK), 2 - экто-АТФазы (CD39), 3 - экто-5'-нуклеотидаза (CD73).

ет отметить разнонаправленность в их динамике.

нальных систем, свидетельствуют о том, что либо

Вероятно, снижение активности эктонуклеоти-

указанные системы вовсе не принимают участия

даз в синаптической щели приводит к снижению

в механизме передачи синаптического сигнала,

метаболизма внеклеточной АТФ и, соответствен-

либо могут принимать, но при условии компенса-

но, к повышению ее количества. Учитывая зави-

ции обычной температурной зависимостью со-

симость физиологических эффектов АТФ от ее

пряженных с ними процессов, т.е. таких процес-

концентрации [23], можно было бы предполо-

сов, интенсивность которых с ростом температу-

жить их равноэффективное усиление в условиях

ры уменьшается и, наоборот, с уменьшением

понижения температуры, однако мы наблюдаем

температуры возрастает. Причем обратная темпе-

смешанную картину. «Быстрая» (m. EDL) и «мед-

ратурная зависимость этих процессов должна

ленная» (m. soleus) мышцы, имея разнонаправ-

полностью компенсировать обычную темпера-

ленный вектор изменений, одинаково демон-

турную зависимость и перекомпенсировать ее

стрируют прирост эффективности в соответству-

при изменении температуры. Таким образом,

ющем векторе, в противовес им дыхательная

мышца стабилизируется и в меньшей степени ре-

можно считать, что и медленная, и быстрая мыш-

агирует на температурные изменения в присут-

цы одинаково чувствительны к изменению тем-

ствии АТФ. Значения температурного коэффи-

пературы окружающей среды, но реакция на та-

циента Q₁₀ менее единицы, обычно характерные

кие изменения у них разнонаправленная, в отли-

для интенсивных физиологических процессов,

чие от диафрагмы, имеющей наименьшее

протекающих с участием ферментативных и ка-

значение коэффициента термолабильности.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

716

ХАЙРУЛЛИН и др.

Вероятнее всего ключевую роль в адаптации к

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

изменению температуры играют не только экто-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

нуклеатидазы, но и другие участники пуринерги-

интересов.

ческой сигнальной цепи - АДФ, АМФ и аде-

нозин.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Путем регуляции уровня АТФ и его производ-

ных в межклеточном пространстве эктонуклеоти-

Проведенные эксперименты полностью соот-

ветствуют действующим национальным и между-

дазы контролируют активность различных под-

народным нормам в области этики.

типов пуринорецепторов и тем самым участвуют

в регуляции сократимости мышц (рис. 1).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В некоторых тканях метаболизм внеклеточных

нуклеотидов регулирует рецепторную функцию,

A. U. Ziganshin, A. E. Khairullin, C. H. V. Hoyle, and

а в других может преимущественно служить в ка-

S. N. Grishin, Int. J. Mol. Sci., 21, 1 (2020).

честве «спасения» пуринов или даже - как в ки-

R. A. Giniatullin and E. M. Sokolova, Br. J. Pharma-

шечнике - обеспечивать функцию питания и

col., 124 (4), 839 (1998).

всасывания микроэлементов. Также имеются и

S. R. Nelson, A. Li, S. Beck-Previs, et al., Biophys. J.,

растворимые виды эктонуклеатидаз, что позволя-

119, 1050 (2020).

ет им диффундировать в ткани и клетки и перено-

A. S. Golovkin, M. K. Serebryakova, E. V. Zhiduleva,

ситься жидкостями организма.

et al., Translat. Medicine, 4, 46 (2017).

K. Losenkova, M. Paul, H. Irjala, et al., Methods Mol.

Данные ферменты в первую очередь важны

Biol., 2041, 107 (2020).

для клеток, секретирующих АТФ такие как пу-

N. Zimmermann, P. R. Nacke, J. Neumann, et al., J.

ринэргические нейроны, тромбоциты и эндоте-

Cardiovasc. Pharmacol., 35 (6), 881 (2000).

лиальные клетки или клетки, которые активиру-

M. Minor, K. P. Alcedo, R. A. Battaglia, and

ются АТФ, например, гладкомышечные клетки

N. T. Snider, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 317 (6)

[8]. Однако нельзя недооценивать и их вклад в ре-

1079 (2019).

гуляцию функции скелетных мышц. Исходя из

G. Burnstock, Drug Dev. Res., 28, 195 (1993).

результатов настоящего исследования, именно

C. Held and G. Sadowski, Annu. Rev. Chem. Biomol.

активность нуклеотидаз обслуживает особенно-

Eng., 7, 395 (2016).

сти функционирования различных типов двига-

10.

D. J. Taylor, N. P. O. Green, and G. W. Stout, Biologi-

тельных единиц млекопитающих.

cal Science (Cambridge University Press, 1997).

11.

R. S. James, J. Comp. Physiol. B, 183 (6), 723 (2013).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

12.

K. W. Ranatunga, Exp. Physiol., 83 (3), 371 (1998).

13.

A. E. Khairullin, A. U. Ziganshin, and S. N. Grishin,

Мы предполагаем, что роль энзиматического

Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. A: Membrane and

лимитирования АТФ и продукция ее метаболи-

Cell Biology, 11 (1), 1 (2017).

тов, обеспечивает стабилизацию эффективной

14.

J. A. Rall and R. C. Woledge, Am. J. Physiol., 259 (2),

холинергической нервно-мышечной передачи в

197 (1990).

норме и патологии. Так, представленные в дан-

15.

G. P. Kenny, F. D. Reardon, W. Zaleski, et al., J. Appl.

ной статье результаты экспериментов показали,

Physiol., 94 (6), 2350 (2003).

что известные изменения синаптической эффек-

16.

P. Yaicharoen, K. Wallman, A. Morton, and D. Bishop,

тивности опосредуются в том числе подстройкой

J. Sci. Med. Sport, 15 (5), 451 (2012).

функционирования эктонуклеотидаз синаптиче-

17.

S. Racinais and J. Oksa, Scand J. Med. Sci. Sports, 20

ской щели.

(3), 1 (2010).

18.

A. Ziganshin, R. Kamaliev, A. Gabdrakhmanov, et al.,

Int. J. Pharmacol., 14 (8), 1198 (2018).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

19.

A. E. Khairullin, A. Y. Teplov, S. N. Grishin, et al.,

Biophysics, 64 (5), 812 (2019).

Работа выполнена при финансовой поддержке

20. A. U. Ziganshin, A. E. Khairullin, B. A. Ziganshin,

Казанского государственного медицинского уни-

et al., Muscle and Nerve, 55, 417 (2017).

верситета Минздрава России на проведение на-

учных исследований в рамках Программы разви-

21. A. U. Ziganshin, A. E. Khairullin, A. Y. Teplov, et al.,

Muscle and Nerve, 59 (4), 509 (2019).

тия Университета (грант 2/22-5), а также в рамках

программы «Стратегическое академическое ли-

22. A. E. Khairullin, A. U. Ziganshin, and S. N. Grishin,

дерство Казанского федерального университета»

Biophysics, 65 (5), 858 (2020).

(ПРИОРИТЕТ-2030).

23. W. M. Fu and M. M. Poo, Neuron, 6 (5), 837 (1991).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

К ВОПРОСУ О РОЛИ ЭКТОНУКЛЕОТИДАЗ

717

Revisiting the Role of Ectonucleotidases in Synaptic Transmission.

Thermal Sensitivities of ATP-Producing Metabolic Pathways

A.E. Khairullin*^, **, D.V. Efimova*, D.V. Ivanova*, S.N. Grishin*, and A.U. Ziganshin*

*Kazan State Medical University, ul. Butlerova 49, Kazan, 420012 Russia

**Kazan Federal University, Kremlevskaya ul. 18, Kazan, 420008 Russia

The release of ATP as an intermediate at the neuromuscular junction, and acetylcholine, the chief neu-

rotransmitter, may take place by mechanisms responsible for quantal and non-quantal secretion from the

motor neurons of the central and peripheral nervous system. The dephosphorylation pathway of ATP that is

completed by the hydrolysis of AMP to adenosine in the synaptic cleft is a cascade of reactions catalyzed by

ectonucleotidases. These enzymes are of enormous interest, the research in this field is necessary to clarify

their role in a complex signaling cascade, since it is known that they have dual functions: ectonucleotidases

limit the action of ATP as a neurotransmitter and participate in the formation of other neuromodulators

(ADP, AMP and adenosine). In addition, ATP and its metabolites can cause completely different physiolog-

ical effects. The activity of ectonucleatidases in different types of skeletal muscles was determined, it varies

within 5-7 IU. A decrease in temperature to 22°C leads to a multiple decrease in the enzymatic regeneration

of ATP in skeletal muscle tissues. It is assumed that enzymatic limitation of ATP and the production of its

metabolites ensures stabilization of effective cholinergic neuromuscular transmission in norm and pathology.

Keywords: neuromuscular junction, ectonucleotidase, ATP-producing metabolic pathways, synaptic signaling

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023