БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 730-735

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3.0

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТУРАЛЬНОГО

КАУЧУКА В РАСТЕНИЯХ Taraxacum kok-saghyz E. Rodin

МЕТОДОМ ЭПР СПИНОВОГО ЗОНДА

Ю.Ц. Мартиросян*^, **, М.В. Мотякин*^, ***, С.А. Гайдамака****, С.Д. Варфоломеев*^, ****

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334, Россия

**Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Тимирязевская ул., 42, Москва, 127550, Россия

***Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН,

ул. Косыгина, 4, Москва, 119991, Россия

****Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

Воробьевы горы, 1/11Б, Москва, 119991, Россия

^#Е-mail: levon-agro@mail.ru

Поступила в редакцию 16.01.2023 г.

После доработки 20.02.2023 г.

Принята к публикации 01.03.2023 г.

Предложен метод количественного анализа содержания натурального каучука в кок-сагызе Taraxa-

cum kok-saghyz E. Rodin по концентрации нитроксильного радикала ТЕМПО, адсорбированного в

образцах корня растения. Метод основан на сравнительном анализе интегральных интенсивностей

сигналов ЭПР в эталонном и диагностируемом образцах. Разработанный способ анализа позволяет

быстро и с хорошей точностью определять содержание каучука в тканях растений без его выделения

из каучук-содержащей биомассы.

Ключевые слова: ЭПР-спектроскопия, натуральный каучук, спиновый зонд ТЕМПО, аэропонный

фитотрон, кок-сагыз Taraxacum kok-saghyz E. Rodin.

DOI: 10.31857/S0006302923040130, EDN: KLNBLV

Натуральный каучук является стратегически

симальной интенсификации процесса роста

растений-каучуконосов, и в существенном уве-

важным сырьем во всем мире. Его мировое по-

личении выхода целевых продуктов. Ключевым

требление составляет почти 11 миллионов тонн в

направлением в решении проблем продуктивно-

год, и спрос быстро растет. В настоящее время до-

сти кок-сагыза являются генно-инженерные ра-

ля натурального каучука, применяемого в шин-

боты по модификации его генома с целью полу-

ной промышленности, составляет примерно 50%

чения растений достаточно высокой производи-

от всех используемых видов каучуков [1-3]. В

тельности по каучуку

[5]. Для ускорения

странах Юго-Восточной Азии - монополистов в

селекционных работ по отбору и размножению

производстве натурального каучука - существует

экземпляров с высокой скоростью биосинтеза и

реальная биологическая опасность поражения

накопления натурального каучука требуется ме-

пальмы гевеи, которая является единственным

тодика ускоренного анализа содержания каучука

промышленным источником натурального кау-

в корнях растений.

чука. В течение последних лет проводятся иссле-

дования по выращиванию альтернативных каучу-

Разработки методов качественного и количе-

коносов, в том числе кок-сагыза Taraxacum kok-

ственного анализа натурального каучука имеют

saghyz E. Rodin, в условиях умеренного климата

давнюю и обширную историю, обусловленную

[1, 4]. Однако развитие растений и скорость син-

огромным объемом его практического использо-

вания [6]. Наибольшее распространение получил

теза каучука в них происходит слишком медлен-

гравиметрический метод. Он состоит в экс-

но, чтобы производство было рентабельным. На-

тракции каучука из высушенных и диспергиро-

учно-техническая проблема заключается и в мак-

ванных частей растения-каучуконоса, выделения

Сокращение: ТЕМПО - 2,2,6,6- тетраметил-пиперидин-1-

каучука из экстракта и взвешивания его после

оксил.

сушки. Публикации на эту тему можно встретить

730

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТУРАЛЬНОГО КАУЧУКА

731

в 30-х годах XX века [7]. В последующие годы ме-

шенного корня

- места его биосинтеза и

тод был существенно усовершенствован [8-11].

накопления.

Очевидное достоинство гравиметрического мето-

да заключается в том, что он является абсолют-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ным методом. Cущественным недостатком этого

метода является длительное время анализа и не-

Растения кок-сагыза выращивали 70 суток в

обходимость иметь значительное количество ис-

условиях in vitro и 35 суток в аэропонном фито-

ходного материала. В последнее время для коли-

троне [20]. Образцы корней высушивали при

чественного анализа натурального каучука ин-

60°С в сушильном шкафу в течение 16 ч, после че-

тенсивно развивается метод инфракрасной

го измельчали на шаровой мельнице KM1 (MLW,

спектроскопии в ближнем ИК-диапазоне (рус-

ГДР) (3000 об/мин, масса шара 0.2 кг, прилагае-

ская аббревиатура БИК, английская - NIRS)

мая нагрузка 20-30 Н, регулировка нагрузки за

[12, 13]. Использование переносных БИК-спек-

счет подачи тока 173-272 мА) до получения ча-

трометров оказалось весьма продуктивным для

стиц размером примерно 20 мкм. Размер частиц

оценки качества каучуконосов при их выращива-

контролировали, просеивая их через сито 20 мкм.

нии на грунте. Метод, однако, обладает невысо-

Экспериментальным путем установлено, что та-

кой точностью, что требует значительного коли-

кая степень дисперсности субстрата необходима

чества измерений (до сотни) для набора статисти-

и для полноты экстракции и для оптимальной ад-

ки и получения надежного результата. По этим

сорбции стабильного радикала на частицах корня

причинам для научных исследований, например,

кок-сагыза.

в генно-инженерной области, использование ме-

Для проведения гравиметрического анализа

тода ИК-спектроскопии встречает серьезные за-

каучук экстрагировали из диспергированного су-

труднения. К настоящему времени разработаны

хого корня. В качестве экстрагента использовали

спектроскопический метод в ближнем ИК-диа-

хлороформ. Экстракцию проводили в аппарате

пазоне и метод с использованием ЯМР-релаксо-

Сокслета в течение 3 ч при 60°С. Каучук высажи-

метра [14]. Однако они требуют значительного

вали из экстракта трехкратным избытком этило-

времени и объема исследуемого материала и от-

вого спирта, промывали водой, ацетонитрилом и

личаются большой трудоемкостью.

этиловым спиртом. Образцы доводили до посто-

янного веса в процессе сушки в течение суток при

Разработка достаточно быстрого способа

температуре 60°С.

определения содержания малых количеств каучу-

Процентное содержание каучука (W_кауч, %) в

ка непосредственно в корнях растения значи-

тельно упростила бы оценку эффективности раз-

сухом корне определяли по формуле

личных приемов по интенсификации роста и



общ



производительности растений по целевым про-



кауч



дуктам. Эта проблема может быть решена с помо-

аликв

кауч

=

×

100%,

щью метода ЭПР спинового зонда. Метод спино-



корня



вого зонда широко используется для исследова-









ния различных соединений [15-19]. Спектр ЭПР

где V_общ - общий объем сконцентрированного

нитроксильного радикала предоставляет инфор-

мацию о химических реакциях, локальной моле-

хлороформенного экстракта (мл), V_аликв - объем

кулярной подвижности, полярности, молекуляр-

аликвоты хлороформенного экстракта (мл),

ной организации исследуемой системы. В насто-

М_кауч - масса каучука в пробирке (г), М_корня - вес

ящей работе данный метод был использован для

образца сухого корня, взятого на экстракцию (г).

определения количества каучука в корнях кок-са-

Стабильный нитроксильный радикал 2,2,6,6-

гыза.

тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО) (Sig-

ma-Aldrich, США) использовали в качестве спи-

Цель настоящей работы - разработка метода

нового зонда. В ампулах для ЭПР-спектроскопии

количественного микроанализа каучука в корнях

кок-сагыза, выращенного in vitro и в фитотроне

взвешивали по 7 мг порошкообразного корня

кок-сагыза. ТЕМПО вводили из газовой фазы

аэропонной модификации [20]. В качестве репе-

при комнатной температуре. Для этого ампулы

ров для градуировки метода использовались об-

помещали в эксикатор объемом 200 мл, в котором

разцы корня кок-сагыза, в которых содержание

находилось примерно 7 мг ТЕМПО. Оптималь-

каучука было определено традиционным грави-

ное время экспозиции, обеспечивающее получе-

метрическим способом, - экстракцией из корня.

ние наиболее точных и хорошо воспроизводимых

Принципиальное отличие предложенного в на-

результатов, составляло 7 мин, при этом концен-

стоящей работе метода от гравиметрического за-

трация радикала ТЕМПО в образцах не превыша-

ключается в том, что разработанный способ ана-

лиза не требует выделения каучука из растения, а

ла 1·10^-5М. После введения радикала ампулы с

проводится непосредственно в образцах высу-

образцами запаивали.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

732

МАРТИРОСЯН и др.

же, именно этот синглет накладывается на цен-

тральную компоненту ЭПР-сигнала нитроксиль-

ного радикала и не позволяет проводить анализ

по интегральной интенсивности всего спектра.

Спектр ЭПР ТЕМПО в кок-сагызе представ-

лен на рис. 1 (спектр 1). Аналогичные спектры

были зарегистрированы для нитроксильного ра-

дикала, введенного в эластомеры [15]. На рис. 1

также представлен спектр ТЕМПО в натуральном

каучуке (спектр 2). Времена корреляции враще-

ния ТЕМПО и его изотропные константы сверх-

тонкого взаимодействия в кок-сагызе составляют

τ = 3.0·10^-10 с и a_N = 15.5 Гс, в натуральном каучу-

ке τ = 2.0·10^-10 с и a_N = 15.4 Гс. Спектр ЭПР нит-

роксильного радикала в инулине - втором основ-

ном компоненте растения - представляет собой

Рис. 1. Спектры ЭПР нитроксильного радикала в

широкий синглет (рис. 1, спектр 3). Очевидно,

кок-сагызе (спектр 1), в натуральном каучуке (спектр

что ТЕМПО не распределяется в среде инулина.

2) и инулине (спектр 3). Температура 20°С.

Широкий синглет возникает вследствие высоких

локальных концентраций радикала на поверхно-

сти этого соединения.

Спектры ЭПР ТЕМПО регистрировали на

спектрометре EMX (Bruker, Германия) в Центре

Близость величин основных параметров нит-

роксильных радикалов (время корреляции и кон-

коллективного пользования «Новые материалы и

технологии» ИБХФ РАН. Значение микроволно-

станта сверхтонкого взаимодействия и отсутствие

вой мощности в резонаторе составляло 2 мВт, ам-

триплета в инулине дает возможность предпола-

плитуда модуляции - 0.5 Гс. Для определения

гать, что в кок-сагызе ТЕМПО локализуется ис-

магнитно-резонансных параметров спектров

ключительно в каучуковых доменах, и таким об-

разом позволяет их обнаружить. Факт избира-

ЭПР использовали программы WINEPR и SIM-

PHONIA (Bruker, Германия). Время корреляции

тельной сорбции радикала ТЕМПО на частицах

вращения τ зонда рассчитывали по следующей

каучука подтверждается еще и тем, что после уда-

формуле [16]:

ления каучука из образца биомассы экстракцией

неполярным растворителем в оставшемся мате-

-10





риале триплетные спектры ЭПР вновь введенно-

τ=

6.65×10

ΔH

−1









го ТЕМПО не регистрируются.

Используя данную особенность локализации

где ΔН⁺ - ширина низкопольной компоненты

нитроксильного радикала в кок-сагызе, мы пред-

спектра, I⁺/I^- - отношение интенсивностей низ-

лагаем метод анализа количественного содержа-

копольной и высокопольной компонент соответ-

ния каучука в этом растении: чем больше каучу-

ственно. Ширину линии и константы сверхтон-

ковых областей содержит образец, тем больше

кого взаимодействия определяли непосредствен-

мест для локализации нитроксильного радикала,

но из спектров ЭПР радикала.

тем выше его концентрация в образце и, соответ-

Для получения корректных результатов в каж-

ственно, тем больше интенсивность сигнала

дом эксперименте насыщение радикалом

ЭПР. В данном рассмотрении предположено, что

ТЕМПО анализируемых образцов и эталонов

распределение каучуковых доменов на поверхно-

проводили одновременно в одних и тех же усло-

сти точно такое же, как и в объеме образца.

виях, а спектры ЭПР всех образцов записывали с

Для проверки предложенного метода анализа

одинаковыми параметрами.

были выполнены несколько серий эксперимен-

тов с разным содержанием каучука в образцах. В

качестве иллюстрации на рис. 2 сопоставлены

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

спектры ЭПР ТЕМПО в образцах, полученных из

Прежде всего отметим, что исследованные об-

высушенной измельченной ткани корня расте-

разцы корней кок-сагыза содержат собственный

ния кок-сагыз в двух сериях «А» и «В». Серии вы-

нативный сигнал ЭПР: синглет с g-фактором

полнены в разное время и с разным шагом по

2.0044 ± 0.0001 и шириной линии ΔH = 7.0 ± 0.5 Гс.

процентному содержанию каучука в образцах.

Данный сигнал обусловлен, по-видимому, ради-

Процентное содержание каучука было определе-

калами, возникающими в растениях в результате

но с помощью экстракции органическими рас-

биохимических реакций. Как будет показано ни-

творителями (гравиметрический метод).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТУРАЛЬНОГО КАУЧУКА

733

Рис. 2. Спектры ЭПР нитроксильного радикала ТЕМРО, введенного в серии «А» и «В» образцов кок-сагыза с различным

содержанием натурального каучука. Цифрами указано процентное содержание каучука в образце, определенное

гравиметрическим способом.

Спектры на рис. 2 представлены в одинаковом

(серия «В»). На рис. 2 в серии «В» низкопольные

масштабе для сравнения. Отметим, что время

компоненты спектров обведены пунктиром. В ка-

корреляции вращения нитроксильного радикала

честве сравнительного параметра была выбрана

во всех исследованных образцах кок-сагыза оди-

ее интегральная интенсивность I_In:

наково. Как видно из этих спектров, большему

процентному содержанию каучука соответствуют

I_In = I·ΔН²,

более интенсивные спектры.

где I - интенсивность низкопольной компо-

Для количественного определения содержа-

ненты спектра, ΔН - ее ширина.

ния каучука в образцах кок-сагыза использовали

низкопольную компоненту спектра ТЕМПО, по-

Содержание каучука определяли, сравнивая

скольку на нее не накладываются дополнитель-

величины интегральной интенсивности низко-

ные нативные сигналы, заметно искажающие

польной компоненты сигнала ЭПР ТЕМПО в

спектр при малых концентрациях каучука

анализируемом образце и в эталоне. В табл. 1

Таблица 1. Процентное содержание каучука в образцах кок-сагыза, определенное гравиметрическим методом и

методом спинового зонда по интенсивности сигнала

№

Каучук, %

Интенсивность I_In,

Каучук, %

oбразца

(гравиметрический метод)

усл. ед.

(ЭПР-метод)

Серия А

4.3

3900

3.5

7.2

7700

6.8

17.5

20100

17.5*

Серия В

1.3

4746

1.4

2.8

9327

2.7

16846

* - Процентное содержание каучука, относительно которого рассчитывались значения в других образцах в ЭПР методе.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

734

МАРТИРОСЯН и др.

и чувствительность предложенного метода коли-

чественного анализа натурального каучука. Так,

если в сухом корне концентрация натурального

каучука составляет 1%, то в 7 мг корня будет со-

держаться 0.07 мг каучука. Таким образом, даже

такое малое количество каучука может быть опре-

делено предлагаемым методом.

ВЫВОДЫ

Предложен метод количественного анализа

натурального каучука без его экстрагирования из

образца Taraxacum kok-saghyz L. E. Rodin по инте-

гральной интенсивности сигнала ЭПР нитрок-

сильного радикала ТЕМПО, адсорбированного

на частицах высушенных корней растения. Ис-

пользование данного метода позволяет ускорить

работы по отбору и размножению экземпляров с

Рис. 3. Зависимость интегральной интенсивности сиг-

высокой скоростью биосинтеза и накопления на-

нала ЭПР ТЕМПО от количества натурального каучу-

турального каучука.

ка в образцах объединенной («A» + «B») серии.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

представлены результаты расчета, а также показа-

Исследования выполнены при финансовой

но изменение интегральной интенсивности в

поддержке Российского фонда фундаментальных

спектрах ЭПР ТЕМПО для двух серий при изме-

исследований, проект № 20-316-90032\20.

нении концентрации каучука в образце.

В каждой из представленных серий измерения

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

проводили в одном цикле работы, но показания

самих серий снимали в разных соответствующих

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

циклах. Следует отметить, что одинаковым коли-

интересов.

чествам каучука в разных сериях соответствуют

различные интенсивности. Это объясняется тем,

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

что концентрация адсорбированных нитроксиль-

ных радикалов в образцах зависит от многих па-

Настоящая статья не содержит описания ис-

раметров, в частности, от давления паров нитрок-

следований с участием людей и животных в каче-

сильного радикала и времени их нахождения в

стве объектов.

эксикаторе. Даже небольшие изменения в дан-

ных параметрах сказываются на интенсивности

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ЭПР-линий. Поскольку внутри серий отношение

интенсивность/масса каучука сохраняется посто-

1. Salehi M., et al., Industrial Crops and Products, 170,

янной, то результаты измерения интенсивностей

113667 (2021).

в обеих сериях могут быть приведены к единому

2. А. Ю. Америк и др., С.-х. биология, 57 (1), 3 (2022).

масштабу (рис. 3). Интенсивность серии «A» была

3. Б. Р. Кулуев, Р. Р. Гарафутдинов, И. В. Максимов

приведена к масштабу серии «B» с использовани-

и др., Биомика, 2015, Том 7, № 4, С. 224-283.

ем вычисленного коэффициента k = 2.86 (отно-

4. Goodyear to develop domestic source of natural rubber,

шение угловых коэффициентов линейных зави-

https://www.prnewswire.com/news-releases/good-

year-to-develop-domestic-source-of-natural-rubber-

симостей серий «А» и «В»).

301519783.html

На рис. 3 показана зависимость приведенной

5. A. Y. Amerik, et al., Rus. J. Plant Physiol., 68 (1), 31

интенсивности сигнала ЭПР от количества кау-

(2021).

чука в образцах для обеих серий. Как видно из ри-

6. M. Salehi, et al., Industrial Crops and Products, 178,

сунка, интегральная интенсивность прямо про-

114562 (2022).

порциональна количеству каучука, по крайней

7. А. А. Прокофьев, Анализ каучуконосных растений,

мере до 17.5%, т.е. в тех пределах, в которых он со-

под ред. А. А. Ничипоровича (Всесоюз. науч.-иссл.

держался в исследованных образцах кок-сагыза.

ин-т каучука и гуттаперчи, Глав. ред. хим. лит-ры,

Расчет среднеквадратичного отклонения в пред-

Москва, 1936), т. 1.

ставленной зависимости дает величину 0.01 мг.

8. L. T. Black, et al., Rubber Chemistry and Technology,

Это означает, что ширина доверительного интер-

56 (2), 367 (1983).

вала

95% надежности результатов составляет

9. M. E. Salvucci, T. A. Coffelt, and K. Cornish, Industri-

±0.02 мг. Отметим достаточно хорошую точность

al Crops and Products, 30 (1), 9 (2009).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТУРАЛЬНОГО КАУЧУКА

735

10. C. H. Pearson, K. Cornish, and D. J. Rath, Industrial

15. А. М. Вассерман и А. Л. Коварский, Спиновые мет-

crops and products, 43, 506 (2013).

ки и зонды в физикохимии полимеров (Наука, М.,

1986).

11. S. Azadi, et al., Physiol. Mol. Biol. Plants, 26 (10) 2047

16. А. Н. Тихонов, Соросовский образоват. журн.,

(2020).

№ 1, 8 (1998).

12. K. Cornish, M. D. Myers, and S. S. Kelley, Industrial

17. I. I. Barashkova, et al., Appl. Magn. Resonance, 46

Crops and Products, 19 (3), 283 (2004).

(12), 1421 (2015).

13. M. Taurines, et al., Industrial Crops and Products, 134,

18. M. A. Uddin, et al., J. Polymer Sci., 58 (14), 1924

177 (2019).

(2020).

14. M. C. Davis and Y. Huang, Methods for quantifying rub-

19. В. В. Птушенко, Природа, № 6, 53 (2011).

ber content in a plant with NMR: пат. 10578567 США

20. Ю. Ц. Мартиросян и др., Аэропонный фитотрон.

(2020).

Патент № RU 196013 U1 (2020).

Quantitative Determination of Natural Rubber Content

of Taraxacum kok-saghyz E. Rodin Plants Using Spin Probe Method

of Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

L.Yu. Martirosyan*^, **, V.M. Goldberg*, I.I. Barashkova**, V.V. Kasparov*, Yu.Ts. Martirosyan*^, **,

M.V. Motyakin*^, ***, S.N. Gaydamaka****, and S.D. Varfolomeev*^, ****

*Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia

**All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Timiryazevskaya ul. 42, Moscow, 127550 Russia

***Semenov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Sciences,

ul. Kosygina 4, Moscow, 119991 Russia

****Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, Vorobyovy Gory 1/11B, Moscow, 119991 Russia

The paper presents a method to carry out a quantitative analysis of the content of natural rubber of Taraxacum

kok-saghyz E. Rodin by measuring adsorption of the nitroxide radical TEMPO in root preparations of the said

plant. The method is based on a comparison between the integrated intensity of an EPR signal of interest and

a standard. The developed method of analysis makes it possible to quickly and with good accuracy determine

the content of rubber of plant tissues without its extraction from rubber-containing biomass.

Keywords: EPR spectroscopy, natural rubber, spin probe TEMPO, aeroponic phytotron, Taraxacum kok-saghyz

E. Rodin

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023