БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 770-779

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

ДИСФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ ОСТРОМ ПОРАЖЕНИИ ПОЧЕК

*Институт биофизики клетки - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», Институтская ул., 3, Пущино Московской области, 142290, Россия

**Пущинский государственный естественно-научный институт,

просп. Науки, 3, Пущино Московской области, 142290, Россия

^#E-mail: novoselov-vi@rambler.ru

Поступила в редакцию 23.01.2023 г.

После доработки 23.01.2023 г.

Принята к публикации 01.02.2023 г.

Острое поражение почек провоцирует нарушение функций печени, что является отягощающим

фактором для эффективного лечения. В настоящей работе в качестве модели было использовано

ишемически-реперфузионное поражение почек. Так как при этом основным поражающим факто-

ром является гиперпродукция активных форм кислорода, для предотвращения повреждения пече-

ни при поражении почек в работе использовали экзогенный фермент-антиоксидант пероксиредок-

син 6, который способен нейтрализовать гиперпродукцию широкого спектра активных форм кис-

лорода. Поражение почки было инициировано

45-минутной ишемией с одновременной

левосторонней нефрэктомией. Печень не подвергалась манипуляциям. Пероксиредоксин 6 вводи-

ли внутривенно за 15 мин до ишемии. Состояние печени оценивали через 2, 5 и 24 ч после реперфу-

зии почки методами гистологии и биохимии. Максимально признаки поражения печени выявлены

через 5 ч реперфузии почки. Использование пероксиредоксина 6 приводит к снижению выражен-

ности сосудистой реакции и лейкоцитарной инфильтрации в печени; уменьшению степени дистро-

фии и апоптоза гепатоцитов; отсутствию роста концентрации ТБК-реактивных продуктов и стаби-

лизации уровня цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 в печеночной ткани, а также к нормализации активности

внутриклеточных трансфераз в крови с началом реперфузии. Протекторный эффект пероксиредок-

сина 6 связан прежде всего с его антиоксидантными свойствами, которые позволяют нейтрализо-

вать гиперпродукцию активных форм кислорода уже в начальный период реперфузии почки, одна-

ко не стоит исключать вклад сигнально-регуляторной функции белка в его протекторный эффект.

Ключевые слова: пероксиредоксины, ишемически-реперфузионное поражение почки, активные формы

кислорода, печень.

DOI: 10.31857/S000630292304018X, EDN: KNAIRU

ишемическом поражении почек является наибо-

Острое поражение почек (ОПП) при ишемии-

лее социально значимой патологией в силу ее ши-

реперфузии (И-Р) характеризуется быстрым на-

рокой распространенности и провоцируемой ею

рушением функций почек различной степени вы-

высокой смертности [1, 2]. Вероятность леталь-

раженности. Главная опасность этой патологии

ного исхода при сочетанном остром почечно-пе-

заключается в ее влиянии на функцию отдален-

ченочном поражении в три раза выше, чем при

ных органов. ОПП может приводит к дисфунк-

изолированном остром печеночном поражении

ции легких, печени, сердца и мозга [1, 2]. В част-

[4]. Поражение печени наряду с поражением по-

ности, поражение печени и развитие острой по-

чек усложняет эффективное лечение, так как пе-

чечно-печеночной недостаточности является

чень играет важную роль в метаболизме лекарств

одной из наиболее распространенных форм по-

при критических состояниях [1, 3]. Точный меха-

лиорганной недостаточности [1-4]. Поврежде-

низм повреждения печени при почечной И-Р до

ние печени в послеоперационном периоде при

сих пор остается мало изученным. Тем не менее,

были предложены потенциальные пути, прово-

Сокращения: ОПП - острое поражение почек, И-Р - ише- цирующие это поражение, включающие актива-

мия-реперфузия, АФК - активные формы кислорода,

Prx6 - пероксиредоксин 6, АЛТ - аланинаминотрансфе-

цию воспалительного каскада и системных цито-

раза, АСТ - аспартатамино-трасфераза.

кинов, гиперпродукцию и транспорт активных

770

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

771

форм кислорода (АФК) и лейкоцитов в другие ор-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ганы и активацию проапоптотических путей [1-

Животные. В экспериментах были использова-

3, 5-8].

ны крысы-самцы линии Вистар массой 230 г, все-

го 30 особей.

Триггером в развитии всех патобиологических

Пероксиредоксин 6. Использовали рекомби-

процессов при остром поражении почек является

нантный человеческий Prx6, содержащий His-

гиперпродукция АФК [9], которые выступают

tag-домен. Белок был получен в лаборатории ме-

сигнальными молекулами, приводящими, в свою

ханизмов рецепции ИБК РАН. Пероксидазная

очередь, к активации воспалительных путей. Вос-

активность экзогенного белка составляла

паление вносит значительный вклад в дисфунк-

200 нмоль/мг/мин по H₂O₂ и 100 нмоль/мг/мин

цию печени и играет важную роль в патофизио-

по трет-бутилпероксиду. His-tag-домен не влия-

логии ОПП [6-8]. При ОПП признаки дисфунк-

ет на пероксидазную активность и субстратную

ции печени появляется на ранних стадиях

специфичность белка и выступает маркером для

повреждения почек - в первые часы реперфузии

экзогенного Prx6.

[3, 5, 6]. К основным источникам гиперпродук-

Модель ишемически-реперфузионного пораже-

ции АФК в печени относят лейкоцитарную

ния почки. Крыс наркотизировали внутривенным

НАД(Ф)Н-оксидазу, рост активности ксантиок-

введением 0.5 мл 3.5%-го Золетила 100 (Zoletil

сидазы и миелопероксидазы [10, 11]. Хотя АФК

100, Virbac Sante Animale, Франция). И-Р-пора-

необходимы для внутриклеточной передачи сиг-

жение почки проводили путем окклюзии правой

налов и иммунного ответа, их избыточное коли-

почечной ножки атравматичным зажимом в тече-

чество не может быть полностью устранено кле-

ние 45 мин с предварительной нефрэктомией ле-

точными антиоксидантами вследствие снижения

вой почки. Период реперфузии наступал после

активности ферментов эндогенной антиокси-

снятия зажима и составлял 2, 5 и 24 ч. Печень не

дантной системы в печени на фоне ОПП. В итоге

подвергали никаким манипуляциям. Для выявле-

ния эффектов Prx6 крысам через хвостовую вену

это приводит к развитию окислительного повре-

за 15 мин до ишемии вводили 2 мл физиологиче-

ждения клеток, разрушению органелл, клеточных

ского раствора, содержащего Prx6, из расчета

мембран и ядерной ДНК [3, 8, 11] Роль окисли-

10 мг/кг веса животного. Экспериментальные

тельного стресса в патофизиологии поражения

животные были разделены на четыре группы:

печени при ОПП подтверждается исследования-

группа № 1 - интактный контроль (n = 3); группа

ми, показывающими защитный эффект от при-

№ 2 - группа нефрэктомии (крысы только с пра-

менения антиоксидантных веществ, нейтрализу-

вой почкой, через 2, 5 и 24 ч после левосторонней

ющих АФК или реакции с их участием при И-Р

нефрэктомии) (n = 9); группа № 3 - ишемия-ре-

почек [3, 10-14]. Повреждение клеток происхо-

перфузия правой почки + левосторонняя нефр-

дит уже в начальный период реперфузии почки

эктомия (реперфузия 2, 5 и 24 ч) (n = 9); группа

[15], поэтому для успешной защиты необходимо

№ 4 - ишемия-реперфузия правой почки + лево-

блокировать раннюю стадию реперфузионного

сторонняя нефрэктомия + введение Prx6 перед

повреждения, приводящую к поражению тканей,

ишемией (реперфузия 2, 5 и 24 ч) (n = 9). Период

а именно стадию выработки активных форм кис-

ишемии в группах № 3 и № 4 составил 45 мин. По

окончанию периода реперфузии крыс выводили

лорода. Среди всех антиоксидантов ферменты се-

из эксперимента путем декапитации и использо-

мейства пероксиредоксинов способны нейтрали-

вали образцы печени для исследования.

зовать АФК при их минимальной концентрации

Гистологический анализ. Гистологический ана-

(5-200 мкМ) и предотвратить их гиперпродук-

лиз ткани печени проводили на парафиновых

цию в начальный момент их образования [16].

срезах ткани, с окраской гематоксилин-эозином

Среди представителей семейства следует выде-

(«Biovitrum», Россия). Микроскопический ана-

лить пероксиредоксин 6 (Prx6). Он обладает ши-

лиз проводили на микроскопе DM 6000 с цифро-

рокой субстратной специфичностью по отноше-

вой камерой DFC 490 (Leica, Германия).

нию к АФК, высокими показателями антиокси-

Иммуногистохимический анализ. Анализ про-

дантной активности при малых концентрациях

водили на парафиновых срезах печени. Для опре-

АФК, при которых другие ферменты антиокси-

деления распределения маркера апоптоза каспа-

данты малоэффективны, также обладает хорошей

зы-3 срезы инкубировали с первичными полик-

биодоступностью и способностью проникать в

лональными антителами кролика к каспазе-3

клетки [17, 18]. В рамках настоящего исследова-

(1 : 50) (ab52293, Abcam, Великобритания). Для

ния данные характеристики Prx6 послужили клю-

исследования распределения эндогенного Prx6

чевыми для его выбора в качестве потенциально-

срезы инкубировали с первичными поликлональ-

го протектора печеночной ткани при остром по-

ными антителами кролика к Prx6 (1 : 1000), анти-

ражении почки на фоне И-Р.

тела были получены в лаборатории механизмов

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

772

ГОРДЕЕВА и др.

рецепции ИБК РАН. Для исследования распре-

дается слабовыраженная сосудистая реакция:

деления экзогенного Prx6-His-tag срезы инкуби-

расширение центральных вен и синусоидных ка-

ровали с первичными поликлональными антите-

пилляров в прицентральной зоне, мелкоочаговая

лами кролика к His-tag-домену (1 : 100) (ab9108,

инфильтрация лейкоцитов в зоне портальных

Abcam, Великобритания). Инкубацию с первич-

трактов (рис. 1б). Через 24 ч после нефрэктомии

ными антителами проводили в течение ночи при

такие изменения не были отмечены (рис. 1в). При

4°С. В качестве контрольного теста (для исключе-

реперфузии почки изменения в печени отмеча-

ния неспецифического окрашивания) использо-

ются через 2 ч: мелкоочаговое расширение сину-

вали негативный контроль, в котором исключали

соидных капилляров и сосудов портальных трак-

инкубацию с первичными антителами. Микро-

тов, инфильтрация лейкоцитов в перипорталь-

скопический анализ проводили на микроскопе

ной зоне (рис. 1г). Через 5 ч реперфузии почки в

DM 6000 с цифровой камерой DFC 490. Итого-

печени наблюдается развитие мелкоочаговой де-

вый уровень иммуноокрашивания независимо

струкции гепатоцитов в центрилобулярной зоне и

оценивали два эксперта.

выраженная сосудистая реакция: расширение

центральных вен и синусоидных капилляров,

Иммуноферментный анализ. Образцы печени

полнокровие центральных вен и сосудов порталь-

гомогенизировали и лизировали с 2 мМ фенил-

ных трактов, отек в перипортальной зоне с выра-

метилсульфонилфторида. Гомогенаты печени

женной очагово-диффузной лейкоцитарной ин-

центрифугировали, супернатант сорбировали на

фильтрацией (рис. 1д). Через 24 ч отмечается гид-

96-луночный планшет и инкубировали в течение

ропическая дистрофия и некроз гепатоцитов

30 мин при 37°С. Использовали моноклональные

центрилобулярной зоны, полнокровие централь-

мышиные антитела к цитокинам IL-6 (1 : 500)

ных вен, вен портальных трактов, а также мелко-

(10E5, Santa Cruz Biotechnology, США); и полик-

очаговое полнокровие и дилатация синусоидных

лональные кроличьи антитела к IL-10 (1 : 1000)

капилляров с эритростазами. Сосуды портальных

(Ab9969, Abcam, Великобритания). Инкубацию

трактов расширены, в строме ряда из них отмеча-

проводили в течение ночи при 4°С. Измеряли оп-

ется очаговая лейкоцитарная инфильтрация

тическую плотность при 450 нм на приборе Mul-

(рис. 1е). При использовании Prx6 дистрофиче-

tiskan (Labsystems Plus, Финляндия).

ские изменения гепатоцитов не отмечены. Через

Определение уровня ТБК-реактивных продук-

5 ч реперфузии почки в печени выявлена слабо-

тов в печени. К гомогенату ткани печени добавля-

выраженная сосудистая реакция и очагово-диф-

ли 1% H₃PO₄ и 0.8% водного раствора 2-тиобар-

фузная лейкоцитарная инфильтрации в порталь-

битуровой кислоты. Для экстракции продукта ре-

ной зоне (рис. 1з), с сохранением последней через

акции (окрашенного триметинового комплекса)

24 ч реперфузии (рис. 1и).

использовали н-бутанол. Оптическую плотность

При исследовании уровня маркера апоптоза

определяли при длине волны 535 нм.

каспазы-3 при поражении почки в паренхиме пе-

Биохимический анализ. Биохимический анализ

чени были отмечены очаги апоптоза в центрило-

крови включал в себя измерение активности пе-

булярной и портальной зонах максимально

ченочных ферментов - аланинаминотрасферазы

через 5 ч реперфузии почек (рис. 2г), со снижени-

(АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) на

ем очагов апоптоза через

24 ч реперфузии

биохимическом экспресс-анализаторе Reflotron

(рис. 2д). Напротив, при использовании Prx6 от-

Plus (Roche Diagnostics, Швейцария) в соответ-

мечено значительное снижение иммуносигнала

ствии с рекомендациями производителя.

каспазы-3 в паренхиме печени (рис. 2е,ж).

Статистический анализ. Статистический ана-

В связи с тем, что для протекции печени от

лиз выполняли с использованием программы Sig-

И-Р-поражения почки будет использован экзо-

maPlot 11.0 Software (Systat Software Inc, США).

генный Prx6, введенный внутривенно перед И-Р-

Результаты выражали как среднее значение

поражением, было проведено иммуногистохими-

(М) ± стандартное отклонение (SD). Статистиче-

ческое исследование его распределения в печени.

скую значимость между отдельными экспери-

Так, при внутривенном введении экзогенный

ментальными группами определяли с помощью

Prx6 имеет внутрисосудистую локализацию в пе-

t-критерия Стьюдента, P < 0.05 принимали стати-

чени и отмечен сосудах портальной зоны. Напро-

стически достоверной.

тив, эндогенный Prx6 отмечен в цитоплазме и

мембране гепатоцитов (рис. 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологические изменения в печени при

Влияние экзогенного Prx6 на морфологию пече-

поражении почки отразились на изменении в ак-

ни при ренальной ишемии-реперфузии. Оценка

тивности печеночных ферментов в крови

морфологии печени показала, что нефрэктомия

(табл. 1). Нефрэктомия привела к росту активно-

не приводит к повреждению структур паренхи-

сти этих метаболитов в крови, особенно АСТ, от-

мы, однако через 5 ч после нефрэктомии наблю-

носительно контрольных значений. При ишемии

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

773

Рис. 1. Морфология печени при И-Р почки. (а)-(в) - Печень после нефрэктомии (группа № 2): (а) - через 2 ч, (б) - через

5 ч, (в) - через 24 ч; (г)-(е) - печень после И-Р почки (группа № 3): (г) - реперфузия 2 ч, (д) - реперфузия 5 ч, (е) -

реперфузия 24 ч; (ж)-(и) - печень после И-Р почки в условиях введения Prx6 (группа № 4): (ж) - реперфузия 2 ч, (з) -

реперфузия 5 ч, (и) - реперфузия 24 ч. Окраска гематоксилин-эозином.

почки через 5 ч реперфузии отмечено максималь-

оказывает влияния, его уровень не отличается от

ное увеличение активности печеночных метабо-

показателей при И-Р (рис. 4).

литов в крови: АЛТ в 1.6 раза, АСТ - в 2.0 раза от-

Степень перекисного окисления липидов в пе-

носительно показателей при нефрэктомии. Ис-

пользование Prx6 нормализует ситуацию с

чени при И-Р почки оценивали по изменению

концентрации ТБК-реактивных продуктов в пе-

активностью печеночных ферментов в крови: че-

рез 5 ч реперфузии почки эти метаболиты соот-

ченочной ткани. На рис. 5 показано, что концен-

ветствую показателям при нефрэктомии, однако

трация ТБК-реактивных продуктов в интактной

остаются выше контрольных значений.

печени находится на уровне 0.24 ± 0.05 нмоль/мг

белка. И-Р-поражение почек приводит к росту

Определение механизма гепатопротекторного

уровня перекисного окисления липидов в пече-

действия экзогенного Prx6 при ренальной ишемии-

ни, о чем свидетельствует увеличение концентра-

реперфузии. И-Р-поражение почек приводит к

ции ТБК-реактивных продуктов максимально в

росту концентрации интерлейкинов в ткани пе-

чени и их повышенному уровню в течение 24 ч.

10 раз через 5 ч реперфузии ишемизированной

Напротив, использование Prx6 не приводит к ро-

почки. Через 24 ч реперфузии отмечен резкий

сту концентрации провоспалительного цитокина

спад в концентрации ТБК-реактивных продуктов

ИЛ-6 в печени при И-Р почки, ее уровень не от-

в печени до уровня контрольных значений. Ис-

личается от контрольных значений в течение 5 ч

пользование Prx6 не приводит к росту концентра-

реперфузии. Рост уровня ИЛ-6 в 2.0 раза отмечен

ции ТБК-реактивных продуктов в печени в тече-

через 24 ч реперфузии, тем не менее, он в 1.3 раза

ние всего периода реперфузии ишемизированной

ниже показателя при И-Р. Для противовоспали-

почки. Их концентрация остается на уровне кон-

тельного цитокина ИЛ-10 использование Prx6 не

трольных значений (рис. 5).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

774

ГОРДЕЕВА и др.

Рис. 2. Локализация каспазы-3 в печени при И-Р почки: (а) - интактная печень, положительный контроль; (б) -

интактная печень, отрицательный контроль; (в)-(д) - печень после И-Р почки (группа № 3); (е)-(з) - печень после И-Р

почки в условиях введения Prx6 (группа № 4); (в) и (е) - реперфузия 2 ч, (г) и (ж) - реперфузия 5 ч, (д) и (з) - реперфузия

24 ч; Поликлональные антитела против каспазы-3.

ОБСУЖДЕНИЕ

ток и нейтрофилов в интерстиций печени, уве-

личения экспрессии фактора адгезии мРНК

ОПП - совокупность механизмов, связанных

ICAM-1 и экспрессии фермента спермин/спер-

с повреждением ренальных структур и приводя-

мидин-N1-ацетилтрансферазы, активность кото-

щих к дисфункции органа, в результате наруше-

рого повышается на ранних стадиях повреждения

ния процессов клубочковой фильтрации и экс-

печени, роста активности источников АФК -

креции, с последующими нарушениями систем-

ксантиноксидазы, миелопероксидазы, НАДФ-

ного гомеостаза. Смертность от ОПП составляет

11% и возрастает до 45-60%, если оно сопровож-

оксидазы, циклоксигеназы, NO и активации

проапоптических путей [1-3, 5-8, 10, 11]. Среди

дается дисфункцией других органов [19]. Распро-

страненным и опасным осложнением при ОПП

механизмов повреждения печени при ОПП также

является дисфункция печени, которое в 80-90%

выделяют развитие метаболического ацидоза

случаев приводит к летальному исходу [1-4]. Точ-

[20], аккумуляцию индоксилсульфата, который

ные механизмы поражения печени при ОПП по-

активизирует НАДФ-оксидазу [21], повышение

ка неизвестны. Предполагается, что поражение

концентрации мочевины, снижение синтеза ар-

может происходить посредством индукции вос-

гинина и нарушение орнитинового цикла в пече-

паления за счет роста уровня провоспалительных

ни [22], гиперфосфатемию [23]. Тем не менее,

факторов, инфильтрации цитотоксических Т-кле-

исследователи указывают, что среди всех меха-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

775

Рис. 3. Локализация эндогенного и экзогенного Prx6 в печени. (а) - Эндогенный Prx6, положительный контроль; (б) -

отрицательный контроль; кроличьи антитела против Prx 6. (в) - Экзогенный Prx6-His-tag, положительный контроль;

(г) – отрицательный контроль; кроличьи антитела против His-tag.

низмов поражения печени при ОПП первосте-

В связи с ключевой ролью нарушения окисли-

пенную роль играет гиперпродукция АФК и

тельного гомеостаза при ОПП для предупрежде-

окислительный стресс на фоне снижения резер-

ния дисфункции печени используют вещества,

вов эндогенной антиоксидантной системы [3, 8,

нейтрализующие АФК или реакции с их участием

10-14].

при И-Р почек [3, 10-14]. Например, описано

Таблица 1. Активность печеночных ферментов в крови после И-Р почки

Время, ч

Нефрэктомия

И-Р

И-Р + Prx6

Аланинаминотрансфераза, Ед/л

71 ± 6

65 ± 2

61 ± 8

70 ± 10

111 ± 11*

68 ± 6#

52 ± 8

72 ± 7*

79 ± 8

Аспартатаминотрансфераза, Ед/л

275 ± 35

343 ± 100

225 ± 18

382 ± 60

819 ± 89*

518 ± 155^#

270 ± 13

258 ± 70

252 ± 24

Примечание. Установлены статистически значимые отличия между группами: * - p < 0.05 относительно групп нефрэктомии

в пределах одного времени реперфузии, ^# - p < 0.05 относительно групп ишемия-реперфузия в пределах одного времени

реперфузии. В крови интактных крыс активность АЛТ - 42 Ед/л, АСТ - 96 Ед/л.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

776

ГОРДЕЕВА и др.

Рис. 4. Уровень интерлейкинов в печени при И-Р почки: (а) - Ab IL-6 (1 : 500) (Santa Cruz Biotechnology); (б) - Ab IL-10

(1 : 1000) (Abcam). Установлены статистически значимые отличия между группами: *p < 0.05. Относительные значения,

контроль принят за единицу, N = 9 для каждой группы.

применение наноантиоксидантов, которые ус-

Этот аспект требует использования антиокси-

пешно используются при И-Р почек [24, 25]. Од-

дантных протекторов, которые способны защи-

нако при выборе потенциальных антиоксидант-

тить клетки уже с началом реперфузии в началь-

ных протекторов необходимо учитывать тот факт,

ный момент образования АФК и предотвратить

что опасность реперфузионного поражения за-

тем самым развитие окислительного поражения и

гибели клеток. Среди таких протекторов можно

ключается в молниеносности нарушения окисли-

выделить ферменты-антиоксиданты семейства

тельно-восстановительного гомеостаза, когда

пероксиредоксинов, которые проявляют антиок-

концентрации АФК растут, а системы их элими-

сидантную активность при минимальной кон-

нации еще не активированы, что обуславливает

центрации АФК от 1 мкМ [16].

повреждение клеток уже в начальный период ре-

перфузии [16]. Следует отметить, что активация

В настоящей работе для предупреждения дис-

ферментов антиоксидантного ответа (GPx1-8,

функции печени при ОПП был использован

GST) происходит при концентрации АФК

представитель семейства пероксиредоксинов -

200 мкМ и выше, когда уже инициирован окис-

экзогенный рекомбинантный Prx6 и изучен его

лительный стресс и происходит гибель клеток.

гепатопротекторный эффект в начальный репер-

Рис. 5. Концентрация ТБК-реактивных продуктов в печени при И-Р почки. Установлены статистически значимые

отличия между группами: *p < 0.05. Абсолютные значения, N = 9 для каждой группы.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

777

фузионный период после ишемии почки. ОПП

ных ферментов в крови прямо указывает на по-

было инициировано ренальной И-Р с одновре-

вреждение клеток печени [1]. Пик активности

менной левосторонней нефрэктомией у крыс.

ферментов был зафиксирован через 5 ч реперфу-

Было показано, что только нефрэктомия одной

зии. Аналогичная картина описана в работе [3] -

почки не приводила к изменениям в печени, за

И-Р почки в печени приводит к цитоплазматиче-

исключением сосудистой реакции, которая носи-

ским дегенеративным изменениям гепатоцитов,

ла временный характер и пропадала через 24 ч

апоптозу, некрозу, повышению сосудистой про-

нефрэктомии, что связано с оперативным вмеша-

ницаемости и лейкоцитарной инфильтрации.

тельством. Напротив, ОПП вызванное И-Р почки

Таким образом, ОПП, вызванное И-Р почки,

и нефрэктомией второй почки, приводило к по-

приводит к активации окислительного стресса и

вреждению печени, которое развивалось с нача-

воспалительного ответа в печени, повышению

лом реперфузионного периода. Через 2 ч репер-

инфильтрации лейкоцитов в интерстиций пече-

фузии в печени был зафиксирован значительный

ни, к гистопатологическим повреждениям гепа-

рост ТБК-реактивных продуктов, который до-

тоцитов и сосудов, к росту активности АСТ и АЛТ

стигал максимума через 5 ч, что указывает на раз-

в крови, а в итоге - к дисфункции печени. Пик

витие перекисного окисления липидов под дей-

патологических изменений наблюдался через 5 ч

ствием АФК. Источником гиперпродукции АФК

реперфузии почки с тенденцией к уменьшению с

в печени служат лейкоциты, которые были акти-

увеличением времени реперфузии, что может го-

вированы кислородными радикалами при репер-

ворить о включении компенсаторно-приспосо-

фузии почки. Активированные лейкоциты и мак-

бительных резервов организма в стрессовой ситу-

рофаги служат не только источниками АФК, но и

ации. Тем не менее, в ранний реперфузионный

цитокинов. На фоне гиперпродукции АФК на-

период происходит поражение не только ишеми-

блюдался рост концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 в

зированного органа, но и удаленных органов, что

ткани печени и их повышенный уровень в тече-

в итоге может привести к недостатку эндогенных

ние 24 ч. Печеночные ИЛ-6 и ИЛ-10 вместе с дру-

резервов адаптации и привести к критическим

гими цитокинами (фактор некроза опухолей α,

изменениям в системах организма.

ИЛ-17А, MCP-1) связаны с воспалительными из-

Использование экзогенного Prx6 изменяет ха-

менениями в печени [3, 5, 8]. ИЛ-6 является глав-

рактер развития патологических изменений как в

ным цитокином в реакции печени на воспаление,

почке, так и в печени. Следует подчеркнуть, что

он стимулирует синтез компонентов острофазо-

при внутривенном введении Prx6 до ишемии поч-

вого ответа, активирует пролиферацию и диффе-

ки последний проникает как в ткани почки, так и

ренцировку В- и Т-клеток. В пользу участия вос-

в ткани печени, причем в печени экзогенный Prx6

палительных процессов в развитии дисфункции

обнаружен в сосудах портальной и центральной

печени указывает тот факт, что мыши дикого ти-

зон, что позволяет ему оказывать свой протектор-

па, получавшие цитокин-нейтрализующие анти-

ный эффект в этих местах. Таким образом, в

тела, и мыши с нокаутом по фактору некроза опу-

обоих органах происходит усиление антиокси-

холей α и ИЛ-6 имеют менее тяжелое поврежде-

дантного статуса. В почке отмечено снижение ин-

ние печени вследствие ишемического ОПП [5].

тенсивности окислительного стресса и нормали-

Первыми с избытком АФК и воспалительными

зация профиля экспрессии маркерных генов

компонентами встречаются сосуды, что приводит

антиоксидантного ответа, что приводит к сохра-

к их изменениям. При реперфузии почки в пече-

нению функциональной активности почки [26].

ни отмечалась выраженная сосудистая реакция -

В печени также отмечено отсутствие роста кон-

дилатация, полнокровие и отек в портальной и

центрации ТБК-реактивных продуктов в печени,

центральной зонах - в местах повышенной ин-

что указывает на предотвращение перекисного

фильтрации лейкоцитов. В этих зонах через 5 ч

окисления липидов. Такой эффект объясняется

реперфузии были обнаружены очаги деструкции

мощными антиоксидантными свойствами Prx6,

и апоптоза гепатоцитов, а через 24 ч - гидропиче-

которые позволяют ему нейтрализовать гипер-

ская дистрофия и некроз. Отмечается, что И-Р

продукцию кислородных радикалов в начальный

почки увеличивает экспрессию молекул ICAM-1

момент их образования [15, 16, 26].

на мембране эндотелия, которые обеспечивают

На фоне снижения интенсивности окисли-

адгезию лейкоцитов к сосудам, что приводит к

тельного стресса в печени был отмечен также рост

активации, а затем к дисфункции эндотелия [7].

провоспалительного цитокина ИЛ-10, однако не

Поражение гепатоцитов приводило к росту ак-

зафиксировано увеличение концентрации для

тивности в крови внутриклеточных печеночных

воспалительного цитокина ИЛ-6 и выраженной

ферментов АЛТ и АСТ. Рост активности печеноч-

лейкоцитарной инфильтрации в портальной и

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

778

ГОРДЕЕВА и др.

центральной зоне, что может указывать на умень-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

шение индукции воспаления. В то же время в

K. Lane, J. J. Dixon, I. MacPhee, et al., Nephrol. Dial.

этих зонах наблюдалась слабовыраженная сосу-

Transplant., 28 (17), 1634 (2013).

дистая реакция: наблюдается снижение деструк-

M. E. Grams and H. Rabb, Kidney Int., 81 (10), 942

ции гепатоцитов, их апоптоза и некроза в пери-

(2012).

портальной и прицентральной зонах печени. В

совокупности снижение поражения печеночной

F. Golab, M. Kadkhodaee, M. Zahmatkesh, et al., Kid-

ткани приводит к снижению активности в крови

ney Int., 8, 783 (2009).

внутриклеточных ферментов печени АЛТ и АСТ,

А. Ю. Николаев, Эффективная фармакотерапия,

что прямо указывает на уменьшение поражения

44, 22 (2013).

гепатоцитов.

S. W. Park, S. W. C. Chen, M. Kim, et al., Lab. Invest.,

Стоит предположить, что снижение пораже-

91, 63 (2011).

ния клеток печени обусловлено не только анти-

Y. Shang, S. M. Hewage, Ch. U. B. Wijerathne, et al.,

оксидантным протекторным действием экзоген-

Front. Med. (Lausanne) 7, 201 (2020).

ного Prx6 но и его сигнально-регуляторной

J. V. Bonventre and A. Zuk, Kidney Int., 66, 480

функцией. Так, было показано, что в почке экзо-

(2004).

генный Prx6 приводит к нормализации профиля

M. Serteser, T. Koken, A. Kahraman, et al., FACS J.

экспрессии маркерных генов иммунного ответа

Surg. Res., 107, 234 (2002).

[26]. С этой позиции не стоит исключать влияние

Prx6 на снижение экспрессии молекул ICAM-1 в

E. Y. Plotnikov, A. V. Kazachenko, M. Y. Vyssokikh,

печени и таким образом на предотвращение дис-

et al., Kidney Int., 72 (12), 1493 (2007).

функции эндотелия.

10.

E. Fadillioglu, Z. Kurcer, H. Parlakpinar, et al., Arch.

Pharm. Res., 31 (6), 705 (2008).

Таким образом, использование Prx6 в услови-

ях окислительного стресса, вызванного И-Р-по-

11.

M. H. Emre, H. Erdogan, and E. Fadillioglu, Gen.

ражением почки способствует коррекции окис-

Physiol. Biophys., 25, 195 (2006).

лительно-восстановительного баланса и обрыву

12.

А. Е. Гордеева, Э. А. Курганова и В. И. Новоселов,

каскада повреждений уже с началом реперфузии

Биофизика, 66 (5) 985 (2021).

почки, что, в свою очередь, предотвращает разви-

13.

Z.-Y. Fu, Z.-J. Wu, J.-H. Zheng, et al., Drug Design

тие дисфункции печени при остром поражении

Dev. Therapy, 14, 175 (2020).

почек.

14.

J. Kaur, T. Kaur, et al., Drug Dev. Res., 82, 412 (2021).

15.

М. Г. Шарапов, А. Е. Гордеева и др., Биофизика,

БЛАГОДАРНОСТИ

62, 1208 (2017).

Микрофотографии, представленные в публи-

16.

М. Г. Шарапов, Е. Е. Фесенко, В. И. Новоселов,

кации, были получены с использованием обору-

Биофизика, 63, 734 (2018).

дования Сектора оптической микроскопии и

17.

Y. Manevich, T. Shuvaeva, et al., Arch. Biochem. Bio-

спектрофотомерии ЦКП ФИЦ ПНЦБИ РАН.

phys., 485, 139 (2009).

18.

M. G. Sharapov, P. V. Glushkova, et al. Arch. Biochem.

Biophys., 702, 108830 (2021).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

19.

R. L. Metha, J. Bouchard, et al., Intensive Care Med.,

Работа выполнена при финансовой поддержке

37, 241 (2011).

Российского научного фонда (проект № 23-24-

20. Ostermann and R. W. Chang, Crit. Care, 13, 142

00041).

(2009).

21. T. Shoji, A. Wada, K. Inoue, et al., Nephron, 105, 99

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(2007).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

22. N. Salem, E. A. Salem, A. M. Maarouf, et al., Ren.

интересов.

Fail., 32 (8), 959 (2010).

23. A. Baquerizo, D. Anselmo, and C. Shackleton, Trans-

plantation, 75 (12) 2007 (2003).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

24. Z. T. Rosenkrans, T. Sun, D. Jiang, et al., Adv. Sci., 7,

Работа с лабораторными животными проводи-

2000420 (2020).

лась в соответствии с положениями Европейской

25. K. Minami, S. Bae, H. Uehara, et al. Am. J. Transpl.,

конвенции о защите позвоночных животных, ис-

20, 1527 (2020).

пользуемых для эксперимента и других научных

целей. Основным документом, регламентирую-

26. R. G. Goncharov, K. A. Rogov, A. A. Temnov, et al.,

щим проведение настоящего исследования, явля-

Cell Tissue Res., 378 (2), 319 (2019).

лось «Руководство по работе с лабораторными

27. X. Wang, S. A. Phelan, K. Forsman-Semb, et al., J. Bi-

животными ИБК PАН» № 57 от 30.12.2011 г.

ol. Chem., 278, 25179 (2003).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА 6 ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

779

Use of Peroxiredoxin 6 to Prevent Liver Dysfunction in Acute Kidney Injury

A.E. Gordeeva*, E.A. Kurganova**, and V.I. Novoselov*

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Pushchino State Natural Science Institute, prosp. Nauki 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

Acute kidney injury causes deterioration of liver function, that is a confounding factor affecting treatment

outcomes. In this work, renal ischemia reperfusion injury was used as a model. Taking into account that hy-

perproduction of reactive oxygen species is the major risk factor for kidney damage, the exogenous antioxi-

dant enzyme peroxiredoxin 6, able to neutralize reactive oxygen species, has been used to prevent liver dam-

age when kidneys are damaged. Kidney injury was initiated by a 45-minute ischemia simultaneously with a

left-sided donor nephrectomy without manipulations of the liver. Peroxiredoxin 6 was administered intrave-

nously 15 minutes before ischemia. The functional state of the liver was assessed after 2, 5 and 24 hours of

reperfusion using histological and biochemical analysis. The signs of liver damage were detected in the best

possible way after 5 hours of kidney reperfusion. It was found that peroxiredoxin 6 helps reduce the severity

of the vascular reaction and leukocyte infiltration in the liver; lower the level of dystrophy and apoptosis of

hepatocytes; keep the concentration of TBA-reactive products even and stabilize the level of cytokines, IL-6

and IL-10, in the liver tissue, as well as normalize the activity of intracellular transferases in the blood at the

onset of reperfusion. The protective effect of peroxiredoxin 6 is associated primarily with its antioxidant prop-

erties, due to which hyperproduction of reactive oxygen species can be neutralized in the early phase of kidney

reperfusion, but the signal-regulatory function of the protein can also contribute to a protective role perox-

iredoxin 6.

Keywords: peroxiredoxins, renal ischemia reperfusion injury, reactive oxygen species, liver

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023