БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 10, с. 1450 - 1459

УДК 578.23

ИЗМЕНЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ВИРУСОВ

ГРИППА ЧЕЛОВЕКА H3N2 В ХОДЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ЦИРКУЛЯЦИИ*

, А.Б. Тузиков³, А.А. Чинарев³,

Г.В. Пазынина³, Н.В. Бовин³

¹ ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки

иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН»,

108819 Москва, Россия; электронная почта: al.gambaryan@gmail.com

² Отделение по гриппу, Центры по контролю и профилактике

заболеваний, Атланта, GA 30333, США

³ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 03.04.2019

После доработки 05.06.2019

Принята к публикации 15.06.2019

Ранее было показано, что аминокислоты 155Thr, 158Glu и 228Ser гемагглютинина имеют решающее значе

ние для распознавания Neu5Gc. В данном исследовании показано, что способность связывать рецептор,

терминированный Neu5Gc, также может быть связана с аминокислотой 145: вирусы 1972-1999 гг. с Lys145

связывали Neu5Gc, тогда как вирусы с Asn145 не связывали. Спорадическое появление и исчезновение спо

собности связывать олигосахариды Neu5Gc, а также отсутствие остатков Neu5Gc в составе гликоконъюга

тов человека указывают на неадаптивную природу этого свойства. Ранее показано, что вирусы гриппа A

(H3N2) 1968-1989 гг., в отличие от вирусов H1N1, не различают Neu5Aca2 6Galβ1 4Glc (6'SL) и Neu5Aca2

6Galβ1 4GlcNAc (6'SLN). Вирусы H3N2, изолированные после 1993 г., наподобие вирусов H1N1, приобре

ли способность различать 6'SL и 6'SLN. Мы определили, что преимущественное сродство к 6'SLN постепен

но увеличивалась с 1992 по 2003 г. После 2003 г. вирусы утратили способность связывать ряд сиалозидов,

включая 6'SL, которые являлись хорошими рецепторами для более ранних вирусов H3N2, и только 6'SLN

сохранил высокое сродство к более поздним человеческим вирусам H3N2. Это свойство коррелирует с при

обретением новых сайтов гликозилирования в положениях 122, 133 и 144, а также с заменами Glu190Asp и

Gly225Asp в гемагглютинине. Эти же замены ответственны за рецепторный фенотип вирусов H1N1 челове

ка. Конвергентная эволюция рецепторной специфичности подтипов H1N1 и H3N2 указывает на то, что

6'SLN является оптимальным природным человеческим рецептором для вирусов гриппа.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гриппа, гемагглютинин, сиалосахариды, рецепторная специфичность, H3N2.

DOI: 10.1134/S0320972519100075

Вирусы гриппа являются РНК вирусами с

ных птиц иногда передаются другим диким и

негативной цепью и сегментированными гено

домашним животным. В редких случаях они

мами. Они содержат восемь сегментов РНК, ко

приспосабливаются к новым видам и образуют

торые кодируют от 10 до 11 белков. Вирусная

устойчивые специфические для хозяина линии.

частица содержит два основных гликопротеина

Считается, что все известные линии вирусов

оболочки: гемагглютинин (HA) и нейраминида

гриппа домашней птицы и млекопитающих,

зу (NA). Естественным резервуаром вирусов

включая людей, происходят от вирусов диких

гриппа являются дикие водные птицы, в кото

водных птиц [1].

рых циркулируют вирусы с 16 антигенными

Сиаловые кислоты являются минимально

подтипами HA и 9 подтипами NA. Вирусы вод необходимыми детерминантами клеточных ре

Принятые сокращения: PBS - фосфатно солевой буфер; BSA - бычий сывороточный альбумин; КЭ - куриные яй

ца с эмбрионом; HA - гемагглютинин; NA - нейраминидаза; РСУ - рецептор связывающий участок; Sia - сиаловая кис

лота (либо Neu5Ac, либо Neu5Gc); Glyc PAA - гликозилированный полиакриламид; Glyc PAA biot - биотинилирован

ный гликозилированный полиакриламид.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/

biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19 109, 26.08.2019.

** Адресат для корреспонденции.

1450

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА Н3N2

1451

цепторов для вирусов гриппа [2, 3]. Сиалилоли

па YDS, 6 STF и специфичным для свиней ре

госахаридные фрагменты гликопротеинов и

цептором Neu5Gc Tn [16].

гликолипидов на клеточной поверхности демон

Позже появилась замена Gly225Asp. Инте

стрируют значительное структурное разнооб

ресно отметить, что Asp190 и Asp225 консерва

разие, и структура углеводной цепочки может

тивны у вирусов H1N1 человека и ответственны

влиять на способность сиаловой кислоты слу

за узнавание рецептора Neu5Acα2-6Galβ1-

жить рецепторной детерминантой вируса грип

4GlcNAc. Было показано, что изоляты H3N2

па. Одной из основных характеристик рецеп

1998 и 1999 годов, в отличие от ранних изолятов,

торной специфичности вирусов гриппа являет

связывали 6'SLN с бóльшим сродством, чем 6'SL

ся способность различать дисахаридные мотивы

[17].

Neu5Acα2-3Gal и Neu5Acα2-6Gal [4, 5]. Виру

Вследствие реконструкции РСУ, адаптация

сы гриппа человека A и B с высоким сродством

вирусов к куриным эмбрионам стала проходить

связывают сахариды, терминированные

по новым схемам аминокислотного замещения

Neu5Acα2-6Gal, и не связывают Neu5Acα2-3Gal

[18]. Масштабный мутационный анализ RBS

терминированные рецепторы [6]. Напротив, ви

вирусов A/WSN/33 (H1N1) и A/Hong Kong/

русы гриппа А птиц, независимо от их субтипа,

1/1968 (H3N2) выявил множество компетент

не связывают Neu5Acα2-6Gal. Они имеют бо

ных по репликации мутантов, еще не обнару

лее высокое сродство к олигосахаридам, терми

женных в природе [19].

нированным Neu5Acα2-3Gal, чем к свободной

Самые ранние вирусы человека H3N2 преи

нейраминовой кислоте (Neu5Ac), что свиде

мущественно связывали короткие разветвлен

тельствует о специфических взаимодействиях

ные сиалилированные гликаны, в то время как

между рецептор связывающим участком (РСУ)

более поздние вирусы связывали длинные поли

HA и галактозой, связанной с сиаловой кисло

лактозаминовые цепи, терминированные сиа

той 2-3 связью. Сравнение аминокислотных

ловой кислотой, и не связывали короткие сиа

последовательностей HA разных субтипов выя

лилированные гликаны [20]. Ранние человече

вило, что остатки в положениях 138, 190, 194,

ские вирусы H3N2 связывали широкий спектр

225, 226 и 228 консервативны в РСУ вирусов

аналогов человеческого рецептора, тогда как

гриппа субтипов H1-H12, выделенных из диких

изоляты 2006-2011 гг. преимущественно связы

уток. В H3 HA ранних вирусов H3N2 человека

вали удлиненные, разветвленные мультивалент

были заменены аминокислоты 226 и 228, а в H1

ные рецепторы. Эти рецепторы с удлиненными

HA вирусов H1N1 человека были заменены ами

ветвями имеют потенциал для увеличения срод

нокислоты 138, 190, 194 и 225 [7, 8].

ства за счет одновременного связывания с двумя

Человеческие штаммы H1N1 связывают

субъединицами одного тримера гемагглютини

Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc трисахарид (6'SLN)

на [21, 22].

с более высоким сродством, чем Neu5Acα2-

В данной работе мы исследовали рецептор

6Galβ1-4Glc (6'SL), в то время как ранние чело

связывающие свойства широкого набора виру

веческие вирусы H3N2 не различали эти две

сов гриппа H3N2 человека, выделенных с 1968

структуры [5, 8, 9, 10]. После 1992 г. вирусы че

по 2003 г.

ловеческого гриппа H3N2 приобрели новые

свойства; а именно, они утратили способность

расти в куриных эмбрионах (КЭ) и агглютини

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ровать эритроциты кур [11, 12, 13].

В течение 1993-2003 гг. в HA вирусов H3N2

Реактивы. 96 луночные планшеты фирмы

человека появились несколько аминокислотных

«Costar» (США), конъюгат стрептавидина с пе

замен в положениях, которые ранее были кон

роксидазой хрена и о фенилендиамин фирмы

сервативными и ответственными за связывание

«Boehringer Mannheim» (Германия). α Бензил

с рецептором. Так, была обнаружена замена

сиалозид (SBn) и 6'SLN (9 NAc) синтезированы

Glu190Asp [12]. Ile, а затем Val стали преоблада

как описано в [23, 24]. Синтез немеченых гли

ющим остатком в положении 226 H3 HA вместо

козилированных полиакриламидов (Glyc PAA)

Leu, типичного для HA более ранних изолятов

(30 кДа) и биотинилированных полимеров,

H3N2 человека [13-15]. Возникли новые потен

Glyc PAA biot (1000 кДа) были описаны в рабо

циальные сайты гликозилирования в 122, 133 и

тах [25, 26]. Структуры аналогов рецепторов и

144 положениях. Отбор антигенно отличных ва

их сокращенные наименования приведены в

риантов H3N2 может способствовать измене

табл. 1.

нию рецепторной специфичности. Замены ами

Вирусы были получены из коллекции Центра

нокислот 156, 158, 189 и 193 влияют на связыва

по контролю за заболеваниями (США). Вирусы

ние с минорными гликанами человеческого ти

культивировали 48 ч в клетках MDCK в среде

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1452

ГАМБАРЯН и др.

Таблица 1. Структура олигосахаридов, пришитых к полиакриламиду

Биотинилированные полимеры

Обозначения

Neu5Acα2 3Galβ1 4Glcβ PAA biot

3'SL

Neu5Acα2 6Galβ1 4Glcβ PAA biot

6'SL

Neu5Acα2 6Galβ1 4GlcNAcβ PAA biot

6'SLN

Neu5Gcα2 6Galβ1 4GlcNAcβ PAA biot

6`SLN(Gc)

Немеченые полимеры

Neu5Acα OCH2C6H4 PAA

SBn

Neu5Acα2 6Galβ1 4Glcβ PAA

6'SL

Neu5Acα2 6Galβ1 4GlcNAcβ PAA

6'SLN

(Neu5Acα2 62 6G* GN M)2 3,6 M GN GNβ PAA

YDS

Galβ1 3(Neu5Acα2 6)GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc PAA

LSTb

Neu5Acα2 6GalNAcα PAA

STn

Galβ1 3(Neu5Acα2 6)GalNAcα PAA

6STF

Neu5Acα2 6Galβ1 4 (6 O Su)GlcNAcβ PAA

Su 6`SLN

9 N Ac Neu5Acα2 6Galβ1 4GlcNAcβ PAA

6'SLN(9 NAc)

MEM при 37 °С и инактивировали 0,1% ным

бирования связывания фетуина как описано ра

глютаровым альдегидом. Культуральные жид

нее [27]. Анализ основан на конкуренции между

кости осветляли низкоскоростным центрифуги

исследуемым аналогом рецептора и стандарт

рованием, после чего вирусы собирали путем

ным препаратом меченного пероксидазой фету

высокоскоростного центрифугирования, ре

ина за центры связывания на иммобилизован

суспендировали в 0,1 М NaCl, 0,02 М Тris буфе

ном вирусе. Инкубацию проводили в течение 1 ч

ре (рН 7,2), который содержал 50% ный глице

при 4 °С в рабочем буфере. Данные были выра

рин. Хранили при -20 °С.

жены в терминах констант аффинности (K_aff),

Анализ прямого связывания с Glyc PAA biot

формально эквивалентных константам диссо

(1000 кДа) проводили как описано ранее [8].

циации комплекса вирус/рецепторный аналог.

Планшеты покрывали очищенным вирусом

Константы рассчитывали по концентрациям ос

гриппа с титром

4-8 ед гемагглютинации

татков сиаловой кислоты в растворе.

(100 мкл/лунку) при 4 °С в течение 2 ч с после

Статистика. Расчет констант диссоциации и

дующим промыванием фосфатно солевым бу

величины стандартного отклонения определяли

фером (PBS). После этого добавляли в лунки по

с помощью программы «Excel».

100 мкл блокирующего раствора (PBS, с добав

лением 0,1% ного BSA), инкубировали 1 ч, а за

тем промывали холодным PBS, содержащим

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

0,05% ный Tween 20 (отмывочный раствор).

Glyc PAA biot титровали с двукратными разве

Изучали рецептор связывающие свойства

дениями на рабочем буфере (PBS с 0,01% ным

вирусов гриппа человека H3N2, выделенных и

Tween 20, 0,1% ным BSA и 1 мкМ ингибитора

пассированных в клетках MDCK или куриных

нейраминидазы, оселтамивир карбоксилата),

эмбрионах. Для более адекватного сравнения

добавляли в лунки по 50 мкл и инкубировали

адаптированные к КЭ вирусы в последнем пас

планшеты в течение 2 ч при 4 °С. Начальная

саже выращивали в клетках MDCK.

концентрация Glyc PAA biot составляла 0,5 мкМ

В первой серии экспериментов были ис

по сиаловой кислоте. Планшеты промывали хо

пользованы пять меченых аналогов рецепторов:

лодным отмывочным раствором и инкубирова

меченый пероксидазой фетуин и четыре био

ли со стрептавидин пероксидазой в рабочем бу

тин меченых зонда, Glyc PAA biot (1000 кДа),

фере при 4 °С в течение 1 ч. После промывки ак

(остаток Glyc = 3'SL, 6'SL, 6'SLN и 6'SLN (Gc))

тивность пероксидазы в лунках анализировали с

в тесте прямого связывания (формулы и молеку

использованием субстратного раствора о фени

лярные модели остатков приведены в табл. 1 и

лендиамина.

на рис. 1). Результаты анализа представлены в

Конкурентное связывание. Сродство вируса к

табл. 2. Для удобства чтения данные представле

Glyc PAA (30 кДа) определяли в реакции инги

ны в качественной форме: максимальное связы

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА Н3N2

1453

Рис. 1. Структура тестированных сиалосахаридов.

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

вание выражается тремя звездочками, в десять

2003 и A/New York/72/2003, утратившие SG144

раз слабее связывание - двумя звездочками,

вторично, частично связывали фетуин. Потеря

низкое связывание - одной звездочкой, а отсут

SG126 восстановливала способность связывать

ствие связывания - знаком минус.

фетуин на следовых уровнях. Следовательно,

Распознавание связи между сиаловой кисло>

изобилие новых сайтов гликозилирования (122,

той и галактозой (α2-3 против α2-6). В соответ

133 и 144) имеет решающее значение для неспо

ствии с ранее полученными данными [10, 17] ни

собности связывать фетуин.

один из вирусов, изолированных в культуре кле

Распознавание типа сиаловой кислоты (N>аце>

ток MDCK не связывался с 3'SL, в то время как

тилнейраминовая или N>гликолилнейраминовая).

все адаптированные к КЭ вирусы связывали его

Способность тестируемых H3N2 вирусов рас

несмотря на то, что они были выращены MDCK

познавать N гликолилнейраминовую кислоту

в последнем пассаже (табл. 2).

очень нерегулярна. Как ранние, так и поздние

Связывание вируса с фетуином. Фетуин явля

вирусы с Trp155, не связывают 6'SLN(Gc). Вирус

ется гликопротеином, который содержит в ос

A/Port Chalmers/73 связывал N ацетилнейрами

новном би и древовидные N гликаны, оканчи

новую и N гликолилнейраминовую кислоты с

вающиеся мотивами Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc и

одинаковым сродством, что хорошо согласуется

Siaα2-6Galβ1-4GlcNAc [28]. Все вирусы, выде

с работами Anders et al. и Suzuki, в которых по

ленные до 1999 г., и все адаптированные к КЭ

казано, что вирусы H3N2 с Tyr155 распознают

вирусы связывают фетуин с высоким сродством.

Neu5Gcα2-6Gal [29, 30]. Хорошо связывают

Большинство вирусов после 1999 г. утратили

6'SLN(Gc) также все вирусы 1990 х гг. с сочета

способность связывать фетуин; это свойство

нием Lys145 и His155. Штаммы с заменой

коррелирует с появлением новых сайтов глико

Lys145Asn 6'SLN(Gc) не связывают. Вирусы, вы

зилирования (SG) в 122, 133 и 144 м положени

деленные после 2002 г., не связывают Neu5Gc

ях. Вирусы Texas/41/99 и Alaska/37/99, в которых

рецептор даже при наличии Lys145 и His155.

отсутствовал SG122, и вирусы A/New York/68/

Возможно, это связано с дальнейшей пере

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1454

ГАМБАРЯН и др.

Таблица 2. Связывание вирусов с сиалогликоконьюгатами

Позиция в HA

Сиалогликоконьюгаты

Вирусы

Фет

122

133

144

145

155

190

225

3'SL

6'SL

6'SLN

6'SLN (Gc)

Aichi/2/68

Ser

Thr

Glu

Gly

+++

USSR/039/68

Ser

Thr

Glu

Gly

+++

Canada/228/68

Ser

Thr

Glu

Gly

+++

Taiwan/1/69

Ser

Thr

Glu

Gly

+++

Canada/2/70

Ser

Thr

Glu

Gly

+++

Port Chalmers/1/73

Ser

Tyr

Glu

Gly

+++

Seoul/23/91

Lys

His

Glu

Gly

+++

Seoul/46/91

Lys

His

Glu

Gly

+++

Kasauli/149/92

Lys

His

Glu

Gly

+++

Umea/01/92

Lys

His

Glu

Gly

+++

Umea/02/92

Lys

His

Glu

Gly

+++

Indonesia/3946/92

Lys

His

Glu

Gly

+++

Qingdao/53/92

Asn

His

Glu

Gly

+++

Russia/125/93

Lys

His

Glu

Gly

+++

Stockholm/1/93

Asn

His

Asp

Gly

+++

Georgia/3/93

Asn

His

Asp

Gly

+++

New York/3/93

Asn

His

Asp

Gly

+++

Wyoming/1/93

Asn

His

Asp

Gly

+++

Washington/26/93

Asn

His

Asp

Gly

+++

Hong Kong/1/94

Lys

His

Asp

Gly

+++

Hong Kong/55/94

Lys

His

Asp

Gly

+++

Wuhan/359/95

Lys

His

Asp

Gly

+++

Spain/351/95

Lys

His

Asp

Gly

+++

Changwon/9/95

Asn

His

Asp

Gly

+++

Canada/17/96

Asn

His

Asp

Gly

+++

Texas/41/99

Lys

His

Asp

Gly

+++

Alaska/37/99

Lys

His

Asp

Gly

+++

Egypt/8811/99

Lys

His

Asp

Gly

+++

California/32/99

Lys

His

Asp

Gly

+++

Fujian/411/2002

Lys

Thr

Asp

+++

England/01/21/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Wisconsin/32/2003

Gln

Thr

Asp

+++

Hong Kong/797/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Nebraska/6/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Texas/33/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Texas/39/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Texas/40/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Texas/42/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Wyoming/3e/2003

Lys

Thr

Asp

+++

Chile/8266e/2003

Lys

Thr

Asp

+++

New York/16/2003

Lys

Thr

Asp

+++

New York/68/2003

Lys

His

Asp

+++

New York/72/2003

Lys

His

Asp

Gly

+++

New York/74/2003

Lys

Thr

Asp

–

+++

стройкой РСУ, включающей замены аминокис

вые признаки увеличения сродства к 6'SLN по

лот 190, 225 и 226.

сравнению с 6'SL наблюдались у вирусов 1993 г.,

Распознавание 6'SL vs 6'SLN. Способность

в которых Glu заменил Asp в положении 190

различать 6'SLN и 6'SL изменялась у вирусов че

(табл. 3). Эта тенденция усилилась после появ

ловека H3N2 с 1968 по 2003 гг. Вирусы, выделен

ления новых сайтов гликозилирования (табл. 2).

ные с 1968 по 1992 г., связывают эти соединения

Вирусы с SG144 и с заменой Gly225/Asp утрати

с одинаковым сродством. У вирусов H3N2, вы

ли способность связывать 6'SL, тем не менее

деленных после 1993 г., сродство 6'SLN выше,

сродство к 6'SLN оставалась высоким.

чем 6'SL. После 2002 г. вирусы, как правило,

Рецепторная специфичность вирусов к Sia(2-6)>

полностью теряли способность связывать 6'SL.

концевым рецепторам с различными сахаридными

A/New York/68/2003 and A/New York/72/2003 без

корами. Рецептор связывающий фенотип виру

SG144 являются исключениями из этого прави

сов H3N2 человека тестировали с использова

ла; они связывают 6'SL на низком уровне. Пер

нием Neu5Acα2-6Gal терминированных ре

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА Н3N2

1455

Таблица 3. Сродство (K_aff, μM) вирусов к сиалогликоконьюгатам*

Позиция в НА

Сиалогликоконьюгаты

Вирусы

190

225

226

SBn

6'SL

6'SLN

STn

LSTb

YDS

Aichi/2/68

Glu

Gly

Leu

USSR/039/68

Glu

Gly

Leu

Canada/228/68

Glu

Gly

Leu

Taiwan/1/69

Glu

Gly

Leu

Canada/2/70

Glu

Gly

Leu

Port Chalmers/1/73

Glu

Gly

Leu

100

Seoul/23/91

Glu

Gly

Leu

Seoul/46/91

Glu

Gly

Leu

100

Kasauli/149/92

Glu

Gly

Leu

Umea/01/92

Glu

Gly

Leu

0,3

Umea/02/92

Glu

Gly

Leu

0,3

Indonesia/3946/92

Glu

Gly

Leu

0,3

Qingdao/53/92

Glu

Gly

Leu

Stockholm/1/93

Asp

Gly

Leu

0,3

0,2

Wyoming/1/93

Asp

Gly

Leu

0,2

0,1

0.2

0,2

Hong Kong/55/94

Asp

Gly

Leu

0,2

0,5

0,2

0,5

Spain/351/95

Asp

Gly

Leu

0,2

0,1

0,2

Wuhan/359/95

Asp

Gly

Ile

0,4

Texas/41/99

Asp

Gly

Val

0,1

Alaska/37/99

Asp

Gly

Val

0,1

100

New York/72/2003

Asp

Gly

Val

0,1

100

Wyoming/3/2003

Asp

Ile

>50

Texas/33/2003

Asp

Val

>50

0,5

New York/68/2003

Asp

Ile

>50

0,5

* Значения K_aff формально эквивалентны константам диссоциации комплексов вирусов с рецепторными аналогами. Чем

выше значения K_aff, тем ниже сродство. Приводятся данные, усредненные из трех экспериментов. Стандартные ошибки

не превышали 60% средних значений.

цепторов с различным строением предлежащей

нием фрагмента Galb с фрагментом аминокис

цепочки (табл. 1, рис. 1). α Бензилсиалозид

лотной цепи 222-226 в RBS.

(SBn) и 6'SLN (9 NAc) синтезированы; осталь

Все протестированные вирусы показали вы

ные сиалосахариды встречаются в природных

сокое сродство к 6'SLN. Сродство к 6'SLN со

гликопротеинах или гликолипидах и были вы

держащему двухантенному олигосахариду YDS

делены из биологического сырья. Для конкурен

было ниже, чем к 6'SLN. Разница увеличивается

тного анализа были использованы немеченые

с годом изоляции и может быть объяснена сте

сиалогликополимеры с низкой мол. массой

рическим перекрыванием второй антенны YDS

(30 кДа) [25]. В табл. 3 приводятся значения K_aff,

с углеводными фрагментами HA вблизи RBS.

формально эквивалентные константам диссо

Результаты конкурентного анализа совпадают с

циации рецепторных аналогов к вирусам. Все

результатами анализа прямого связывания.

вирусы, связывались с 6'SLN и 6 O Su 6'SLN с

Вирусы, изолированные до 1999 г., имели

одинаковым сродством, и ни один из протести

почти равное сродство к 6'SL и 6'SLN, тогда как

рованных вирусов не связывал с 6'SLN (9 NAc)

после 1999 г. сродство вирусов к 6'SL понижено,

и 6 STF. Поэтому данные для 6 O Su 6'SLN,

вплоть до полного отсутствия связывания.

6'SLN (9 NAc) и 6 STF в таблице не приводятся.

Сродство к STn и LSTb было одинаковым для

Равное сродство к 6'SLN и его сульфатиро

всех протестированных вирусов. Оно был очень

ванному аналогу 6 O Su 6'SLN неудивительно,

низким для вирусов с 1968 по 1992 г. (вплоть до

поскольку сульфогруппа, присоединенная к O 6

вируса Umea/02/92). Вирусы Qingdao/53/92,

N ацетилглюкозамина, направлена из рецептор

Stockholm/1/93, Wyoming/1/93, Spain/351/95

связывающего участка в воду. Также неудиви

связывают STn и LSTb почти так же хорошо, как

тельно отсутствие связывания с 6'SLN (9 NAc),

6'SLN. Все эти вирусы имеют замену

поскольку 9 NAc группа стерически не поме

Glu 190Asp. У вируса Wuhan/359/95 (с заменой

щается между C 9 Neu5Ac и поверхностью ре

Leu 226Ile) сродство к этим олигосахаридам

цептор связывающего кармана в области 183,

резко понижено. Более поздние вирусы, с Ile

190 и 228 аминокислот [3]. Отсутствие связыва

или Val226, а также SG133 и SG144, практически

ния с 6 STF может быть объяснено перекрыва

не связывали STn и LSTb.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1456

ГАМБАРЯН и др.

Ранее было показано, что бензилсиалозид

сиаловой кислоты не могла дать вирусу избира

(табл. 1) хорошо ингибирует связывание виру

тельное преимущество. Спорадическое появле

сов H3N2 человека с природными рецепторами

ние этой способности, по видимому, является

[31, 32]. Действительно, для всех протестиро

случайным результатом аминокислотных замен

ванных вирусов, кроме трех (три последних

в гипервариабельных областях антигенных сай

пункта, табл. 3), сродство к SBn равно сродству

тов.

к 6'SLN. В то же время три вируса с заменой

Gly225Asp в HA, а именно Wyoming/3/2003,

Ранние вирусы H3N2 человека не были

Texas/33/2003 и NewYork/68/2003 утратили

адаптированы к определенному сиалилолигоса

сродство к SBn и 6'SL. Вероятно, объемный гид

хариду в респираторном эпителии человека.

рофильный Asp полностью нарушает гидрофоб

Первоначальные замены в HA: Gln226Leu и

ное взаимодействие бензильного кольца с

Gly228Ser обеспечивают взаимодействия с ме

Val226.

тиленовой группой галактозы, смежной с 2 6Sia.

Миметики рецепторов общей структуры

Neu5Acα OCH2 R, содержащие гидрофобный

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

агликон, такие как бензилсиалозид и даже α ме

тилсиалозид, имеют хорошее сродство к ранним

В данной работе была рассмотрена эволю

вирусам H3N2 [31]. Если асиаловая часть анало

ция рецепторной специфичности вирусов H3N2

га углеводного рецептора стерически не препят

человека 1968-2003 гг. в контексте замен амино

ствовала связыванию, различные соединения с

кислот в РСУ и строения рецепторных сиалоса

2-6 связанной сиаловой кислотой обладали

харидных цепочек. Две замены Gln226Leu и

практически равным сродством к вирусам [9,

Gly228Ser отличают HA ранних вирусов челове

31]. По мере появления в человеческой популя

ка от консенсусной последовательности вирусов

ции иммунной прослойки к H3N2 вирусам, у

гриппа птиц. Эти замены повысили сродство

вирусов возникли новые сайты гликозилирова

вируса к Neu5Acα2 6Gal и снизили сродство к

ния в HA в положениях 126 и 246, что снижало

Neu5Acα2-3Gal, но предпочтение первого ва

нейтрализующее действие антител. Но при этом

рианта не было абсолютным - сродство к неза

некоторые природные рецепторы могли стано

якоренному 3'SL было всего в 5 раз ниже, чем к

вится недоступными для вируса. Так, способ

6'SL [31, 32]. Комплекс концевого рецептора

ность связываться с ганглиозидами GM3 и 3 SPG

Neu5Acα2 3Gal с HA вируса Aichi/2/68 был ус

снижалась с приобретением сайтов гликозили

пешно закристаллизован и получена полная

рования в положении 126 и исчезала с приобре

трехмерная структура этого комплекса [33].

тением 246SG [7].

Ранние вирусы человека H3N2 связывались с

Когда аминокислота Glu190, консерватив

ганглиозидами, терминированными Neu5Acα2-

ная для вирусов гриппа птиц, была заменена на

3Gal; эта способность впоследствии уменьши

Asp, вирусам стали доступны по меньшей мере

лась и была полностью утеряна [7].

два новых природных сиалосахара (STn и LSTb).

По данным Anders и Suzuki, способность

Вирусы с Asp190 и Leu226 связывают их с высо

распознавать форму Neu5Gc нейраминовой

ким сродством. После замены Leu226Ile/Val эта

кислоты зависит от аминокислот в положениях

способность была потеряна. Поскольку амино

155, 158 и 228 [29, 30]. В нашем исследовании

кислоты 190 и 225 тесно контактируют с конце

способность связываться с Neu5Gc рецептором

вой частью рецептора - сиаловой кислотой и

для вирусов 1992-1999 гг. коррелировала с па

прилегающей областью галактозы, они не могли

рой аминокислот 145 и 155: вирусы с Lys145 и

напрямую влиять на удаленные остатки моноса

His155 связывали Neu5Gc рецептор, в то время

харидов. Вероятно, замены в этих положениях

как вирусы с Asn145, His155 и Lys145, Thr155 не

слегка разворачивают сиаловую кислоту, что

связывали (табл. 2). Предполагаемое располо

приводит к более или менее успешному распо

жение Lys145 относительно N гликолильной

ложению STn и LSTb в РСУ.

группы N гликолилнейраминовой кислоты по

Одновременно с тем, что STn и LSTb стано

казано на рис. 2. По видимому, аминогруппа

вятся доступными для вируса, 6'SLN становится

Lys145 была способна образовывать водородную

рецептором с наибольшим сродством, и даль

связь с N гликолильной группой.

нейшая эволюция усилила эту тенденцию.

Нерегулярное появление и исчезновение

Сродство к STn, LSTb и 6'SL исчезало один за

сродства к Neu5Gc фрагменту указывает на не

другим, а сродство к 6'SLN оставалось высоким.

адаптивный характер этого свойства. Neu5Gc

После замены Gly225Asp первоначальный меха

фрагмент отсутствует на клетках человека; сле

низм распознавания рецепторов (посредством

довательно, способность связывать эту форму

гидрофобного взаимодействия 226 аминокисло

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА Н3N2

1457

Рис. 2. Предполагаемое расположение Lys145 в сайте связывания рецептора H3 HA. Помечены Trp153, Lys145 и N глико

лильная группа сиаловой кислоты (SA). Lys145 вместо Ser145 и N гликолильная группа вместо N ацетильной были встро

ены в модель с помощью программного обеспечения DS ViewerPro 5.0, Accelrys Inc., с использованием трехмерной моде

ли Х 31 HA в комплексе с пентасахаридом LSTc [33].

С цветным вариантом рис. 2 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals/

journal/biokhsm/

ты с метиленовой группой галактозы) был утра

низм ответственен за дискриминационное свя

чен, а РСУ вирусов подвергся глубокой рекон

зывание 6'SL/6'SLN для вирусов H3N2. Такая

струкции. Вместо Leu226 и Ser228 в РСУ виру

конвергентная эволюция рецепторной специ

сов H3N2 после 2003 г. мы обнаруживаем

фичности подтипов H1N1 и H3N2 предполагает,

Asp190, Asp225, Val226 и Ser228, которые отлича

что 6'SLN является оптимальным природным

ют эти вирусы от вирусов гриппа птиц.

человеческим рецептором для вирусов гриппа.

Таким образом, в ходе эволюции вирусов

H3N2 и H1N1 человека их рецепторный фено

Финансирование. Работа выполнена при под

тип становился все более похожим, и аминокис

держке РФФИ (гранты 02 04 48109, 01 04 49300

лотный состав РСУ стал ближе, чем в начале

и 14 04 00547 и 17 04 00148) и МНТЦ (грант 5

циркуляции вирусов H3N2. Вирусы человека

2464).

H1N1 и H3N2 2003-2009 гг. имеют множество

Благодарности. С глубоким прискорбием со

сайтов гликозилирования в верхней части HA и

общаем, что наш коллега Александр Климов

Asp в положениях 190 и 225; и те, и другие раз

скончался.

личают 6'SL и 6'SLN. Ранее была показана роль

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

Asp190 и Asp225 в селективном сродстве вирусов

сутствии конфликта интересов.

H1N1 к 6'SLN [10]. Кристаллографический ана

Соблюдение этических норм. Данная статья

лиз молекулы H1 HA выявил водородные связи

не содержит исследований, в которых в качестве

между Asp190 и азотом группы GlcNAc 3 в мо

объектов использовали людей или животных.

лекуле 6'SLN [34]. Вероятно, подобный же меха

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1458

ГАМБАРЯН и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers,

15.

Bush, R.M., Bender, C.A., Subbarao, K., Cox, N.J., and

T.M., and Kawaoka, Y. (1992) Evolution and ecology of

Fitch, W.M. (1999) Predicting the evolution of human

influenza A viruses, Microbiol. Rev., 56, 152-179.

influenza A, Science, 286, 1921-1925, PMID: 10583948.

Paulson, J.C. (1985) Interactions of animal viruses with

16.

Wang, X., Ilyushina, N.A., Lugovtsev, V.Y., Bovin, N.V.,

cell surface receptors, in The receptors. Vol. 2 (Conn, M.,

Couzens, L.K., Gao, J., Donnelly, R.P., Eichelberger, M.C.,

ed.), pp. 131-219. Academic Press, Orlando, FL.

and Wan, H. (2017) Amino acids in hemagglutinin anti

Wiley, D.C., and Skehel, J.J. (1987) The structure and

genic site B determine antigenic and receptor binding dif

function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of

ferences between A(H3N2)v and ancestral seasonal H3N2

influenza virus, Ann. Rev. Biochem., 56, 365-394, doi: 10.

influenza viruses, J. Virol., 91, doi: 10.1128/JVI.01512 16.

1146/annurev.bi.56.070187.002053.

17.

Mochalova, L., Gambaryan, A., Romanova, J., Tuzikov, A.,

Rogers, G.N., and D’Souza, B.L., (1989) Receptor bind

Chinarev, A., Katinger, D., Katinger, H., Egorov, A., and

ing properties of human and animal H1 influenza virus iso

Bovin, N. (2003) Receptor binding properties of modern

lates, Virology, 173, 317-322.

human influenza viruses primarily isolated in Vero and

Connor, R.J., Kawaoka, Y., Webster R.G., and Paulson, J.C.

MDCK cells and chicken embryonated eggs, Virology, 313,

(1994) Receptor specificity in human, avian, and equine

473-480.

H2 and H3 influenza virus isolates, Virology, 205, 17-23,

18.

Stevens, J, Chen, L.M., Carney, P.J., Garten, R., Foust, A.,

doi: 10.1006/viro.1994.1615.

Le, J., Pokorny, B.A., Manojkumar, R., Silverman, J.,

Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B., Piskarev, V.E.,

Devis, R., Rhea, K., Xu, X., Bucher, D.J., Paulson, J.C.,

Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Robertson, J.S., Bovin, N.V.,

Cox, N.J., Klimov, A., and Donis, R.O. (2010) Receptor

and Matrosovich, M.N. (1997) Specification of receptor

specificity of influenza A H3N2 viruses isolated in mam

binding phenotypes of influenza virus isolates from differ

malian cells and embryonated chicken eggs, J. Virol., 84,

ent hosts using synthetic sialylglycopolymers: non egg

8287-8299, doi: 10.1128/JVI.00058 10.

adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B

19.

Wu, N.C., Xie, J., Zheng, T., Nycholat, C.M., Grande, G.,

viruses share a common high binding affinity for

Paulson, J.C., Lerner, R.A., and Wilson, I.A.

(2017)

6’ sialylN (acetyllactosamine), Virology, 232, 345-350,

Diversity of functionally permissive sequences in the recep

doi: 10.1006/viro.1997.8572.

tor binding site of influenza hemagglutinin, Cell Host

Matrosovich, M.N., Gambaryan, A.S., Teneberg, S.,

Microbe, 21, 742-753, doi: 10.1016/j.chom.2017.05.011.

Piskarev, V.E., Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Robertson, J.S.,

20.

Gulati, S., Smith, D.F., Cummings, R.D., Couch, R.B.,

and Karlsson, K.A. (1997) Avian influenza A viruses differ

Griesemer, S.B., St George, K., Webster, R.G., and Air, G.M.

from human viruses by recognition of sialyloligosaccha

(2013) Human H3N2 influenza viruses isolated from 1968

rides and gangliosides and by a higher conservation of the

to 2012 show varying preference for receptor substructures

HA receptor binding site, Virology,

233,

224-234,

with no apparent consequences for disease or spread, PLoS

doi: 10.1006/viro.1997.8580.

One, 8, 66325, doi: 10.1371/journal.pone.0066325.

Matrosovich, M., Tuzikov, A., Bovin, N., Gambaryan, A.,

21.

Yang, H., Carney, P.J., Chang, J.C., Guo, Z., Villanueva, J.M.,

Klimov, A., Castrucci, M.R., Donatelli, I., and Kawaoka, Y.

and Stevens, J. (2015) Structure and receptor binding pref

(2000) Early alterations of the receptor binding properties

erences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglu

of H1, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins

tinins, Virology, 477, 18-31, doi: 10.1016/j.virol.2014.

after their introduction into mammals, J. Virol., 74,

12.024.

8502-8512, doi: 10.1128/JVI.74.18.8502 8512.2000.

22.

Peng, W., de Vries, R.P., Grant, O.C., Thompson, A.J.,

Gambaryan, A.S., Piskarev, V.E., Yamskov, I.A.,

McBride, R., Tsogtbaatar, B., Lee, P.S., Razi, N., Wilson, I.A.,

Sakharov, A.M., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Nifant’ev, N.E.,

Woods, R.J., and Paulson, J.C. (2017) Recent H3N2 virus

and Matrosovich, M.N. (1995) Human influenza virus recog

es have evolved specificity for extended, branched human

nition of sialyloligosaccharides, FEBS Lett., 366, 57-60.

type receptors, conferring potential for increased avidity,

10.

Gambaryan, A.S., Robertson, J.S., and Matrosovich, M.N.

Cell Host Microbe, 21, 23-34, doi: 10.1016/j.chom.

(1999) Effects of egg adaptation on the receptor binding

2016.11.004.

properties of human influenza A and B viruses, Virology,

23.

Bovin, N.V., Korchagina, E.Yu., Zemlyanukhina, T.V.,

258, 232-239, doi: 10.1006/viro.1999.9732.

Byramova, N.E., Galanina, O.E., Zemlyakov, A.E.,

11.

Grassauer, A., Egorov, A.Y., Ferko, B., Romanova, J.,

Ivanov, A.E., Zubov, V.P., and Mochalova, L.V. (1993)

Katinger, H., and Muster, T. (1998) A host restriction

Synthesis of polymeric neoglycoconjugates based on N sub

based selection system for influenza haemagglutinin trans

stituted polyacrylamides, Glycoconj. J., 10, 142-151.

fectant viruses, J. Gen. Virol., 79, 1405-1409, doi: 10.1099/

24.

Shilova, N.V., Galanina, O.E., Pochechueva, T.V.,

0022 1317 79 6 1405.

Chinarev, A.A., Kadykov, V.A., Tuzikov, A.B., and Bovin, N.V.

12.

Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., and

(2005) High molecular weight neoglycoconjugates for solid

Nakajima, K. (2000) Change in receptor binding specifici

phase assays, Glycoconj. J., 22, 43-51, doi: 10.1007/

ty of recent human influenza A viruses (H3N2): a single

s10719 005 0280 y.

amino acid change in hemagglutinin altered its recognition

25.

Gambaryan, A.S., and Matrosovich, M.N. (1992) A solid

of sialyloligosaccharides, Virology,

278,

587-596,

phase enzyme linked assay for influenza virus receptor

doi: 10.1006/viro.2000.0679.

binding activity, J. Virol. Methods, 39, 111-123.

13.

Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra J.C.,

26.

Hayase, T., Rice, K.G., Dziegielewska, K.M., Kuhlen

and van der Werf, S. (2001) Hemagglutinin residues of

schmidt, M., Reilly, T., and Lee, Y.C. (1992) Comparison

recent human A (H3N2) influenza viruses that contribute

of N glycosides of fetuins from different species and human

to the inability to agglutinate chicken erythrocytes,

alpha2 HS glycoprotein, Biochemistry, 31, 4915-4921.

Virology, 289, 74-85, doi: 10.1006/viro.2001.1121.

27.

Anders, E.M., Scalzo, A.A., Rogers, G.N., and White, D.O.

14.

Fitch, W.M., Bush, R.M., Bender, C.A., and Cox, N.J.

(1986) Relationship between mitogenic activity of influen

(1997) Long term trends in the evolution of H(3) HA1

za viruses and the receptor binding specificity of their

human influenza type A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,

hemagglutinin molecules, J. Virol., 60, 476-482.

7712-7718, doi: 10.1073/pnas.94.15.7712.

28.

Suzuki, Y. (2001) Host mediated variation and receptor

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА Н3N2

1459

binding specificity of influenza viruses, Adv. Exp. Med.

thetic and natural sialosides. Virology, 196, 111-121,

Biol., 491, 445-451.

doi: 10.1006/viro.1993.1459.

29. Byramova, N.E., Tuzikov, A.B., and Bovin, N.V. (1992)

32. Pritchett, T.J., Brossmer, R., Rose, U., and Paulson, J.C.

A simple procedure for the synthesis of the methyl and

(1987) Recognition of monovalent sialosides by influenza

benzyl glycosides of Neu5Ac and

4 epi Neu5Ac,

virus H3 hemagglutinin, Virology, 160, 502-506.

Carbohydr. Res., 237, 161-175, doi: 10.1016/S0008 6215

33. Eisen, M.B., Sabesan, S., Skehel, J.J., and Wiley, D.C.

(92)84240 S.

(1997) Binding of the influenza A virus to cell surface

30. Matrosovich, M.N., Mochalova, L.V., Marinina, V.P.,

receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosac

Byramova, N.E., and Bovin, N.V. (1990) Synthetic poly

chride complexes determined by X ray crystallography,

meric sialoside inhibitors of influenza virus receptor binding

Virology, 232, 19-31, doi: 10.1006/viro.1997.8526.

activity, FEBS Lett., 272, 209-212.

34. Gamblin, S.J, Haire, L.F, Russell, R.J, Stevens, D.J, Xiao, B.,

31. Matrosovich, M.N., Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B.,

Ha, Y., Vasisht, N., Steinhauer, D.A., Daniels, R.S., Elliot, A.,

Byramova, N.E., Mochalova, L.V., Golbraikh, A.A.,

Wiley, D.C., and Skehel, J.J. (2004) The structure and

Shenderovich, M.D., Finne, J., and Bovin, N.V. (1993)

receptor binding properties of the 1918 influenza hemag

Probing of the receptor binding sites of the H1 and H3

glutinin, Science,

303,

1838-1842, doi:

10.1126/

influenza A and influenza B virus hemagglutinins by syn

science.1093155.

CHANGES IN THE RECEPTOR BINDING PROPERTIES OF H3N2

VIRUSES IN PROLONGED CIRCULATION IN HUMANS

A. S. Gambaryan¹*, A. Balish², A. I. Klimov², A. B. Tuzikov³,

A. A. Chinarev³, G. V. Pazynina³, and N. V. Bovin³

¹ Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development

of ImmuneKandKBiological Products, Russian Academy of Sciences,

108819 Moscow, Russia; EKmail: al.gambaryan@gmail.com

² Influenza Branch, Centers for Disease Control and Prevention,

Atlanta, GA 30333, USA

³ Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,

Russian Academy of Sciences, 117997 Moscow, Russia

Received April 3, 2019

Revised June 5, 2019

Accepted June 15, 2019

It was previously shown that amino acids 155Thr, 158Glu, and 228Ser of H3N2 virus hemagglutinin (HA) are crucial

for recognition of Neu5Gc. In this study, we have shown that the ability of the virus to bind the Neu5Gc terminated

receptor can also depend on the amino acid 145 of HA: virus isolates of 1972-1999 with Lys145 in HA could bind to

the receptor, whereas those with Asn145 could not. Sporadic appearance and disappearance of the ability to bind

Neu5Gc terminated oligosaccharides as well as the absence of Neu5Gc residues in human glycoconjugates indicate

the non adaptive nature of this property. It was previously shown that the H3N2 virus isolates of 1968-1989, unlike

H1N1 viruses, do not distinguish between Neu5Acα2 6Galβ1 4Glc (6'SL) and Neu5Acα2 6Galβ1 4GlcNAc

(6′SLN). The H3N2 viruses isolated after 1993 have acquired an ability to distinguish between 6′SL and 6′SLN, sim

ilar to H1N1 viruses. We determined that predominant affinity of H3N2 viruses for 6′SLN gradually increased from

1992 to 2003. After 2003, H3N2 viruses lost an ability to bind a number of sialosides including 6′SL that were good

receptors for the earlier H3N2 isolates, and only 6′SLN retains high affinity for the later human H3N2 isolates. This

property correlates with acquisition of new glycosylation sites at positions 122, 133 and 144 as well as with Glu190Asp

and Gly225Asp replacements in HA. These replacements are also responsible for the receptor binding phenotype of

human H1N1 viruses. Convergent evolution of receptor specificity of the H1N1 and H3N2 subtypes indicates that

6'SLN is an optimal natural human receptor for influenza viruses.

Keywords: influenza virus, hemagglutinin, sialooligosaccharides, receptor specificity, H3N2

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019