БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 10, с. 1511 - 1518

УДК 577.175.72

ПОВЫШЕННАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ

К ДЕЙСТВИЮ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА 1

У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 го ТИПА*

Institute for the Application of Nuclear Energy (INEP), University of Belgrade,

11080 Belgrade, Serbia; E mail: nikolag@inep.co.rs

Поступила в редакцию 03.04.2019

После доработки 08.06.2019

Принята к публикации 24.06.2019

Для сахарного диабета характерно усиление процесса активации тромбоцитов. Этот феномен обусловлен

действием многих факторов, в том числе изменениями уровня экспрессии мембранных белков. Целью

настоящей работы было изучение чувствительности тромбоцитов человека к действию системы инсулино$

подобного фактора роста (IGF) у больных со слабо контролируемым диабетом 2$го типа (DM2). Для про$

ведения анализа связывания лиганда и определения уровня экспрессии рецептора инсулиноподобного

фактора роста 1 (IGF$1R) и рецептора инсулина (IR) с помощью метода вестерн$блоттинга использовали

IGF$1, радиоактивно меченый ¹²⁵I. Агрегацию тромбоцитов в присутствии IGF$1 оценивали с помощью

метода оценки агрегации тромбоцитов в планшетах (plate aggregometry assay). В результате проведенной ра$

боты было показано увеличение количества связанного с тромбоцитами IGF$1 и повышение уровня

экспрессии IGF$1R в тромбоцитах, полученных от больных сахарным диабетом 2$го типа по сравнению с

тромбоцитами здоровых людей. Связывание инсулина и уровень экспрессии инсулинового рецептора, в

общем, были ниже в группе с сахарным диабетом 2$го типа. Однако эти различия не были статистически

достоверными. Усиление процесса активации тромбоцитов, индуцированного тромбином, под влиянием

IGF$1 было обнаружено в обеих группах, но этот эффект был более выражен у больных сахарным диабе$

том 2$го типа. Начальная скорость активации тромбоцитов в присутствии IGF$1 положительно коррели$

ровала с концентрацией гликированного гемоглобина (HbA1c). Таким образом, тромбоциты, выделенные

из крови больных сахарным диабетом 2$го типа, имеют повышенный уровень экспрессии субъединиц

IGF$1R, что может способствовать более высокой чувствительности тромбоцитов к IGF$1, за счет увели$

чения скорости их активации в процессе агрегации, индуцированной тромбином. Однако необходимы

дальнейшие эксперименты для изучения потенциальной роли IGF$1 в тромботических осложнениях, сопро$

вождающих диабет.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: тромбоциты крови, диабет 2$го типа, гемостаз, инсулиноподобный фактор роста 1,

агрегация тромбоцитов.

DOI: 10.1134/S0320972519100129

При сахарном диабете (DM) наблюдается ги$

ния крови, таких как фибриноген, тромбин, тка$

перкоагуляционное состояние, и пациенты,

невые факторы, факторы коагуляции VII, VIII,

страдающие от этой болезни, отличаются повы$

XI, XII, калликреин и фактор Виллебранда [2, 3].

шенным риском образования тромбов [1]. При$

У больных DM фибриноген рассматривается как

мерно 80% случаев смерти людей с сахарным диа$

тромбообразующий фактор, так как из него обра$

бетом связаны с тромбозом. При DM повыша$

зуется фибрин, который более устойчив к лизису

ется концентрация многих факторов свертыва$

из$за сниженной проницаемости тромба, пони$

женного образования плазмина и повышенного

Принятые сокращения: IGF - инсулиноподобный

связывания ингибитора активатора плазминоге$

фактор роста (insulin like growth factor); DM - сахарный

на 1 (plasminogen activator inhibitor$1) [4-6].

диабет; DM2 - диабет 2$го типа; IGF$1R - рецептор инсу$

В общем, при сахарном диабете наблюдается

линоподобного фактора роста 1; IR -рецептор инсулина;

повышенная реактивность тромбоцитов, обус$

HbA1c - гликированный гемоглобин.

ловленная несколькими факторами: 1) более вы$

* Приложение к статье на английском языке опубликова$

но на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте из$

сокой мобилизацией ионов Ca²⁺, 2) гликировани$

дательства Springer (https://link.springer.com/journal/10541),

ем мембраны тромбоцитов, что может приводить

том 84, вып. 10, 2019.

к повышеной экспрессии отдельных рецепторов,

** Адресат для корреспонденции.

включая P$селектин, гликопротеин Ib$IX и ре$

1511

1512

GLIGORIJEVIC и др.

цептор фибриногена IIb/IIIa [7, 8] и 3) снижени$

БСА, использованный для работы с суспензией

ем концентрации cAMP [9]. Также недавно было

тромбоцитов, применяется при проведении ра$

показано, что у больных сахарным диабетом 2$го

диоиммунологических определений (RIA grade),

типа (DM2) наблюдается повышенный уровень

и он не содержит примесей инсулина. Препарат

активированного рецептора P2Y₁₂[10]. Все эти из$

IGF$1 был получен от компании

«GroPep

менения приводят к повышению чувствительнос$

Bioreagents» (Австралия), инсулин был получен

ти тромбоцитов к различным агонистам, таких

от компании «Novo Nordisk» (Дания).

как тромбин, ADP и коллаген. Кроме того, возни$

Выделение тромбоцитов из образцов крови

кает устойчивость к действию аспирина [11].

больных. Тромбоциты выделяли из образцов

На сегодня результаты по влиянию инсулина

цельной крови взрослых больных со слабо конт$

на функционирование тромбоцитов довольно

ролируемым DM2 (n = 20, 12 мужчин и 8 жен$

противоречивы. Одни исследователи выявили

щин в возрасте 35-79 лет, содержание гликиро$

инсулиноподобные ингибирующие эффекты, в

ванного гемоглобина (HbA1c): 7,5-10,1%) и

то время как другие не обнаружили изменений в

здоровых людей (n = 20, 9 мужчин и 11 женщин

подверженности тромбоцитов коагуляции после

в возрасте

30-80 лет, содержание HbA1c:

действия инсулина [12, 13]. Инсулиноподобный

4,5-5,5%). Больным были поставлены диагно$

фактор роста 1 (IGF$1) является гомологичным

зы, и они наблюдались в клинических центрах

инсулину белком, который действует в основном

Сербии. После забора проб крови (пробирки,

как анаболический гормон, участвующий в про$

используемые в данной работе, содержали анти$

цессах роста, дифференцировки и миграции

коагулянт - лимонную кислоту) каждый обра$

клеток [14]. Этот белок также принимает участие

зец крови мягко перемешивали и затем центри$

в гемостазе. Он способен стимулировать зажив$

фугировали при 200 g при комнатной темпера$

ление ран, сам по себе или совместно с другими

туре в течение 20 мин, чтобы получить плазму

молекулами. Предполагается, что нарушение

крови, обогащенную тромбоцитами. Эту плазму

взаимодействия этого белка с его рецептором

затем переносили в новые пробирки и добавляли

приводит к замедлению заживления кожи у

равный объем буфера HEP (140 мМ NaCl, 2,7 мМ

больных сахарным диабетом [15]. На поверхнос$

KCl, 3,8 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, pH 7,4) и под$

ти тромбоцитов располагаются рецептор инсу$

вергали мягкому перемешиванию. Затем полу$

лина (IR), рецептор инсулиноподобного факто$

ченную суспензию клеток центрифугировали

ра роста 1 (IGF$1R) и гибридный рецептор обо$

при 100 g в течение 15 мин, чтобы осадить эрит$

их белков (IGF$1R/IR) [16]. IGF$1, предпочти$

роциты и лейкоциты. Полученную суспензию

тельно, связывается со своим специфичным ре$

тромбоцитов далее центрифугировали при 800 g

цептором (IGF$1R) и с гибридным рецептором

в течение 20 мин. Выпавшие при этом в осадок

(IGF$1R/IR) [17]. В одиночку IGF$1 не способен

тромбоциты суспендировали в буфере Tyrode

активировать тромбоциты, однако он усиливает

(134 мМ NaCl, 12 мМ NaHCO₃, 2,9 мМ KCl,

их активацию в присутствии различных актива$

0,34 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES,

торов [18, 19]. Сами тромбоциты содержат IGF$1

pH 7,4). Чистоту препарата тромбоцитов и их

в α$гранулах, которые высвобождаются в про$

количество определяли с использованием счет$

цессе активации тромбоцитов, что приводит к

чика клеток Mythic 18 («Orphee», Швейцария).

повышению локальной концентрации этого

Для проведения дальнейших экспериментов ис$

фактора роста в месте повреждения ткани.

пользовали суспензию тромбоцитов в концент$

Поскольку все предыдущие исследования, в

рации (1-2) × 10⁸ клеток/мл. Итоговая суспен$

которых изучалось влияние IGF$1 на тромбоци$

зия также содержала 5 мМ глюкозы и 0,25%

ты в популяции, подверженной сахарному диа$

(w/v) БСА. Каждый образец подвергался изуче$

бету, проводились только на лабораторных жи$

нию как описано ниже.

вотных, у которых искусственно вызвали DM

Анализ связывания IGF 1 и инсулина с изоли

[20, 21], представляется актуальным исследовать

рованными тромбоцитами. Суспензию тромбо$

влияние IGF$1 на тромбоциты, выделенные из

цитов (0,5 × 10⁸ клеток/0,5 мл) инкубировали

крови больных со слабо контролируемым сахар$

с мечеными

[¹²⁵I] IGF$1 или инсулином

ным диабетом 2$го типа.

(5 × 10⁴ cpm, конечная концентрация белков

45 пмоль, специфическая активность обоих ли$

гандов 36 МБк/нмоль или 2,22 × 10⁹ cpm/нмоль)

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

в течение ночи при комнатной температуре.

Препараты [¹²⁵I]$меченый IGF$1 и [¹²⁵I]$ме$

Материалы. Все реагенты были приобретены

ченый инсулин получали с помощью метода, в

в компании «Sigma» (США), за исключением

котором используется хлорамин T [22]. Вкратце,

тех реактивов, о которых сказано отдельно.

4 мкг IGF$1 или инсулина в 0,2 мл 0,05 M фос$

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

IGF$1 И АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ДИАБЕТЕ 2$го ТИПА

1513

фатного буфера, pH 7,4 инкубировали при пос$

(0,2 × 10⁸ клеток/0,1 мл в буфере Tyrode, допол$

тоянном перемешивании с

1 мКи Na¹²⁵I

ненном 2 мМ CaCl₂) инкубировали с IGF$1

(«Izotop», Венгрия) и 10 мкл хлорамина T (1 мг/мл)

(100 нМ) при комнатной температуре в течение

в течение 60 с. Реакцию прекращали, добавляя

5 мин. В контрольных экспериментах (для каж$

50 мкл Na₂S₂O₅ (1мг/мл). Меченый белок осво$

дого образца отдельно) смешивали вместе все

бождали от избытка Na¹²⁵I с помощью гель$

необходимые реагенты без добавления IGF$1.

фильтрации на колонке Sephadex G$50 (30 × 1 см).

Затем измеряли исходное значение оптической

Все эксперименты проводили не позднее 2$х не$

плотности суспензии при 405 нм, и в каждую

дель после мечения белка, чтобы избежать су$

ячейку как можно быстрее добавляли тромбин

щественного влияния на результаты процесса

до конечной концентрации 1 IU/мл. Сразу пос$

разрушения лиганда. В контрольном экспери$

ле добавления тромбина микропланшет поме$

менте смешивали все реагенты без добавления

щали на ридер Victor³V и регистрировали опти$

тромбоцитов согласно методу Hunter и Hers [16].

ческую плотность при 405 нм с интервалами,

После завершения инкубации суспензию тром$

равными 1 мин, в течение 9 мин (время от вре$

боцитов центрифугировали при 800 g в течение

мени покачивая микропланшет). Начальную

20 мин. Полученный супернатант удаляли, в

скорость агрегации тромбоцитов рассчитывали

осадках, содержащих тромбоциты, измеряли ра$

по линейной части кривой, описывающей про$

диоактивность на гамма$счетчике Genesys

цесс агрегации.

Gamma 1 («Laboratory Technologies», США) [16].

Анализ полученных данных. Некоторые полу$

Определение рецепторов IGF 1 и инсулина с

ченные результаты не показывали нормальное

помощью метода вестерн блоттинга. После изме$

распределение. Поэтому все полученные дан$

рения радиоактивности в осадке, содержащем

ные представлены в виде медиан с персентилем

тромбоциты, как это было описано выше, каж$

(2,5$й-97,5$й). Денситометрический анализ

дый образец смешивали с буфером для образ$

белковых полос на нитроцеллюлозных мембра$

цов, используемым при проведении электрофо$

нах проводили с использованием программы

реза белков в полиакриламидном геле в присут$

Image Master TotalLab software, версия

2.01

ствии восстанавливающих агентов и додецил$

(«Amersham BioSciences», Великобритания).

сульфата натрия (SDS). Белки солюбилизиро$

Полученные данные денситометрии нормали$

ванных тромбоцитов подвергали электрофорезу

зовали путем деления интенсивности окрашен$

в восстанавливающих условиях в 10%$ном по$

ных с помощью антител полос на интенсив$

лиакриламидном геле (SDS$PAGE) в соответ$

ность белковых полос, определяемую при их ок$

ствии с методом, описанным Laemmli [23]. За$

рашивании с помощью красителя Ponceau S. Во

тем разделенные белки переносили из геля на

всех экспериментах статистически достоверные

нитроцеллюлозную мембрану. Для обнаружения

различия между группами определяли с исполь$

рецептора IGF$1 и инсулинового рецептора

зованием U$критерия Манна-Уитни. Корреля$

сначала использовали моноклональные мыши$

ционный анализ осуществляли с помощью теста

ные антитела против рецептора IGF$1 («Santa

Спирмена.

Cruz Biotechnology», США) и рецептора инсули$

на («GroPep Bioreagents», Австралия). Затем до$

бавляли биотинилированные вторые антитела

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

против мышиных IgG («Vector», США) и ави$

дин, конъюгированный с пероксидазой хрена

Анализ связывания IGF 1 и инсулина с изоли

(«Vector», США). Визуализацию прореагировав$

рованными тромбоцитами и определение содержа

ших с антителами белков осуществляли с по$

ния IGF 1R и IR. В нашей работе показано, что

мощью радиографии с использованием реагента

как [¹²⁵I]$меченый IGF$1, так и [¹²⁵I]$меченый

ECL (enhanced chemiluminescence, усиленная

инсулин связываются с изолированными тром$

хемолюминесценция) («Pierce Biotechnology»,

боцитами. В то же время гораздо больше [¹²⁵I]$

США).

меченый IGF$1 связывается с тромбоцитами, по$

Анализ агрегации тромбоцитов. Влияние ин$

лученными от больных с сахарным диабетом 2$го

сулиноподобного фактора роста 1 на скорость

типа, чем с тромбоцитами от здоровых людей

агрегации тромбоцитов изучали с помощью ри$

(рис. 1, а). На основании данных, полученных

дера Victor³V с высокоскоростным орбитальным

при измерении специфической активности радио$

шейкером, на котором можно определять раз$

активно меченого IGF$1 (2,22 × 10⁹ cpm/нмоль),

личные метки («PerkinElmer», США), используя

было определено количество IGF$1, которое

96$луночные микропланшеты и тромбин в каче$

связалось с поверхностью тромбоцитов. Оно

стве активатора, в соответствии с методом,

оказалось равным 0,71 (0,516-0,943) фмоль у

опубликованным ранее

[24]. Тромбоциты

здоровых индивидов и 1,69 (0,326-3,073) фмоль

10 БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1514

GLIGORIJEVIC и др.

у больных DM2. Иммуноблоттинг белков тром$

каждой исследованной группы показан на

боцитов и денситометрический анализ подтвер$

рис. 1, б (результаты окрашивания белковых по$

дили значительные различия экспрессии рецеп$

лос в тех же образцах красителем Ponceau S

тора инсулиноподобного фактора роста 1 у боль$

представлены на рис. S1 Приложения; иммуноб$

ных DM2 по сравнению с контрольной группой

лоты всех образцов представлены на рис. S2 При$

людей (рис. 1, б), обусловленные повышением

ложения). Статистический анализ всех образцов

связывания лиганда из$за увеличения количест$

показан ниже (n = 20 в каждой группе). Результа$

ва рецепторов на мембране тромбоцитов. Репре$

ты отражают широкий разброс значений в случае

зентативный иммуноблот с пятью образцами из

группы больных сахарным диабетом 2$го типа.

Рис. 1. Связывание [¹²⁵I]$меченого IGF$1 с тромбоцитами (a), относительный уровень экспрессии в тромбоцитах рецеп$

тора IGF$1 (IGF$1R) (б), связывание [¹²⁵I]$меченого инсулина с тромбоцитами (в) и относительный уровень экспрессии

в тромбоцитах рецептора инсулина (IR) (г), выделенных из образцов крови здоровых людей (n = 20) и больных сахарным

диабетом 2$го типа (DM2) (n = 20). Репрезентативные иммуноблоты показаны на панелях (б) и (г), образцы были промар$

кированы как H (1-5) и D (1-5). Различия между двумя группами выражены в виде значений p

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

IGF$1 И АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ДИАБЕТЕ 2$го ТИПА

1515

Результаты определения связывания меченого

сулиноподобного фактора роста 1 приводит к

¹²⁵I инсулина (рис. 1, в) и в присутствии инсулино$

увеличению (как и ожидалось) начальной ско$

вого рецептора (рис. 1, г) показали, что нет статис$

рости агрегации тромбоцитов, индуцированной

тически достоверных различий между двумя попу$

тромбином, в обеих исследуемых группах лю$

ляционными группами, хотя значения, получен$

дей. Этот эффект IGF$1 был более заметен у

ные в группе больных DM2, были несколько ни$

больных DM2 (рис. 2, б). Полученные результа$

же, чем у группы здоровых людей. Используя дан$

ты позволяют предположить, что повышение

ные по специфической активности радиоактивно

экспрессии рецептора инсулиноподобного фак$

меченого инсулина (2,22 × 109 cpm/нмоль),

тора роста 1 на мембранах тромбоцитов приво$

было рассчитано, что количество инсулина, свя$

дит к увеличению количества связанного с

занного с поверхностью тромбоцитов составля$

тромбоцитами IGF$1 и повышению начальной

ет 0,38 (0,322-0,711) фмоль у здоровых людей и

скорости агрегации тромбоцитов у больных

0,34 (0,245-0,442) фмоль у больных DM2. Ин$

DM2.

тенсивность полученных сигналов в иммуноб$

В связи с тем, что гликированный гемогло$

лотах нормализовали по интенсивности окра$

бин используется как маркер при мониторинге

шенных белков Ponceau S, получив относитель$

гликемического профиля больных DM, пред$

ные уровни IGF$1R и IR$суммарного протеома

ставляется целесообразным исследовать воз$

тромбоцитов. Репрезентативный иммуноблот с

можную корреляцию между уровнем HbA1c и

пятью образцами из каждой исследованной

влиянием инсулиноподобного фактора роста 1

группы показан на рис. 1, г (результаты окраши$

на процесс агрегации тромбоцитов. В результате

вания белковых полос в тех же образцах краси$

была выявлена слабая корреляция между увели$

телем Ponceau S представлены на рис. 1 Прило$

чением начальной скорости агрегации тромбо$

жения). Статистический анализ проводили с ис$

цитов в присутствии IGF$1 и концентрацией

пользованием всех выборок (n = 20 в каждой

HbA1c в крови больных (рис. 2, в).

группе).

Если провести сравнение соотношения по$

казателей связывания IGF$1 и инсулина, то у

ОБСУЖДЕНИЕ

здоровых людей оно составляет

1,87

(1,309-2,805) и 4,97 (2,285-6,952) у больных с

Известно, что в присутствии агонистов ин$

сахарным диабетом 2$го типа. Эти различия ста$

сулиноподобный фактор роста 1 усиливает ак$

тистически достоверны (p = 0,012), и полученные

тивацию тромбоцитов крови [25]. В то же время

соотношения косвенно свидетельствуют о боль$

этот белок в одиночку не может активировать

шей чувствительности тромбоцитов к экзогенно$

тромбоциты. Присутствие агонистов является

му IGF$I, чем к инсулину, причем эффект более

обязательным условием. IGF$1 воздействует на

выражен у больных DM, чем у здоровых людей.

тромбоциты через сигнальный путь: IGF$1R/

Анализ агрегации тромбоцитов. Так как инсу$

субстрат инсулинового рецептора/фосфоинози$

линоподобный фактор роста 1 может усиливать

тид 3$киназу/протеинкиназу B [18, 19], как эн$

индуцированную агонистами активацию тром$

докринный, паракринный или аутокринный

боцитов, в следующих экспериментах нами бы$

фактор, благодаря своему присутствию в крово$

ла изучена возможная связь между увеличением

токе и в α$гранулах тромбоцитов [26]. Также бы$

количества IGF$1R на мембране тромбоцитов у

ло показано, что тромбоциты способны специ$

больных сахарным диабетом 2$го типа и началь$

фически связывать белок, связывающий инсу$

ной скоростью агрегации тромбоцитов. Изоли$

линоподобный фактор роста IGFBP$3 [27] и,

рованные тромбоциты из обеих исследуемых

возможно, IGFBP$1, которые могут взаимодей$

групп обрабатывали экзогенным IGF$1 (конеч$

ствовать с интегрином α5β1, локализованным

ная концентрация 100 нМ) и запускали процесс

на поверхности тромбоцитов [28], что способ$

их агрегации, добавляя тромбин. Для каждого

ствует сближению IGF$1 и его рецептора. Ло$

образца определяли начальную скорость агрега$

кальная концентрация IGF$1 может также по$

ции тромбоцитов в присутствии и в отсутствии

вышаться в результате взаимодействия белков

экзогенного IGF$1. Результаты представлены на

IGFBP$1 и IGFBP$3 с фибриногеном/фибри$

рис. 2, а. Затем влияние IGF$1 на тромбоциты

ном [29, 30].

оценивали, как выраженное в процентах увели$

Результаты нашей работы свидетельствуют о

чение начальной скорости агрегации тромбоци$

существовании прямой корреляции между сте$

тов в присутствии IGF$1 по сравнению со ско$

пенью связывания IGF$1 и уровнем экспрессии

ростью агрегации в его отсутствие.

его рецептора на поверхности тромбоцитов, вы$

Полученные нами результаты свидетель$

деленных из крови здоровых людей и больных

ствовали о том, что добавление экзогенного ин$

сахарным диабетом 2$го типа. У больных DM2

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

10*

1516

GLIGORIJEVIC и др.

Рис. 2. Определение начальной скорости активации тромбоцитов в отсутствии или в присутствии экзогенного IGF$1

(a - репрезентативный пример), возрастание начальной скорости агрегации тромбоцитов в присутствии IGF$1 (б) и

корреляция между рассчитанным влиянием IGF$1 на начальную скорость агрегации тромбоцитов и концентрацией

гликированного гемоглобина (HbA1c) (в). Различия между двумя группами выражены в виде значений p, и корреляция

выражена в виде значений ρ коэффициента корреляции Спирмена.

С цветным вариантом рис. 2 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

было выявлено повышение связывания [¹²⁵I]$

димера рецептора IGF$1. Другим возможным

меченого IGF$1 и повышение экспрессии его

объяснением, которое еще более вероятно, яв$

рецептора в тромбоцитах. Уровень связывания

ляется то, что повышенная экспрессия IGF$1R

меченого [¹²⁵I] инсулина с тромбоцитами в группе

может вызвать дополнительное образование

больных DM2 был ниже, чем в группе здоровых

гибридных рецепторов вместо гомодимеров IR.

людей, однако эти различия не были статисти$

Это событие могло бы объяснить наблюдаемую

чески достоверными. В целом, полученные нами

тенденцию снижения связывания инсулина.

результаты соответствуют литературным данным

При обсуждении полученных нами результа$

[31, 32]. В противоположность результатам, по$

тов необходимо помнить о существовании го$

лученным на мышах, результаты экспериментов

мологии между рецептором IGF$1 и рецептором

на образцах, полученных от людей, предполага$

инсулина и о перекрестных реакциях между

ют, что инсулин не оказывает существенного

IGF$1 и инсулином с этими рецепторами и их

влияния на функционирование тромбоцитов

гибридом, хотя при этом наблюдаются различ$

[16, 20]. В целом, полученные противоположные

ные константы связывания. Тромбоциты содер$

результаты оправдывают необходимость даль$

жат все типы рецепторов но принято считать,

нейшего изучения факторов, оказывающих вли$

что каждый лиганд предпочтительно связывает$

яние на процесс активации тромбоцитов.

ся со своим специфичным рецептором благода$

Как уже было сказано ранее, кроме образо$

ря высокому сродству. Стоит также упомянуть,

вания гомодимеров, тромбоциты экспрессиру$

что из$за очень низкого уровня экспрессии

ют гибридные рецепторы (IGF$1R/IR) [16], для

IGF$1R и IR в физиологических образцах требу$

которых характерно большее сродство к IGF$1

ются большие количества ткани/клеток для их

по сравнению с инсулином [17]. Вероятно,

выделения и разделения, что не применимо в

экспрессия рецептора инсулина на тромбоцитах

случае тромбоцитов.

низка и большинство субъединиц IR участвуют

Конечные концентрации обоих лигандов сос$

в образовании гибридных рецепторов [16]. Ре$

тавляют 45 пмоль, что ~5× меньше концентрации

зультаты, полученные в нашей лаборатории с

свободного IGF$1 в крови [33]. Эта концентра$

использованием меченых радиоактивным изо$

ция также сходна с физиологической концентра$

топом йода IGF$1 и инсулина, свидетельствуют

цией инсулина [34]. Количество тромбоцитов,

в пользу большей предпочтительности IGF$1R в

использованных в наших экспериментах, было

сравнении с IR, что вполне соответствует лите$

того же порядка, что и в крови. Так как ожидает$

ратурным данным [16]. Поскольку мы обнару$

ся, что при физиологических условиях оба лиган$

жили увеличение уровня экспрессии IGF$1R на

да реагируют с их специфичными рецепторами,

тромбоцитах у больных сахарным диабетом 2$го

можно допустить, что в наших эксперименталь$

типа вместе с небольшим снижением уровня

ных условиях происходит то же самое, и возмож$

экспрессии рецептора инсулина, то можно

ность перекрестных реакций незначительна.

предположить, что повышена экспрессия гомо$

Сродство IGF$1R и гибридных рецепторов сход$

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

IGF$1 И АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ДИАБЕТЕ 2$го ТИПА

1517

но друг с другом и намного выше для IGF$1, чем

явиться синергичный эффект действия IGF$1 и

для инсулина, поэтому ожидается, что они оба

тромбина, который, наряду с другими эффекта$

связывают предпочтительно IGF$1 [35].

ми, вносил свой вклад в механизм повышенной

Более интенсивное связывание тромбоцита$

активации тромбоцитов при сахарном диабете.

ми добавленного экзогенного IGF$1 приводит к

усилению процесса их агрегации, индуцирован$

Тромбоциты человека, выделенные из крови

ной тромбином, и этот эффект наиболее выра$

больных со слабо контролируемым DM2, отлича$

жен у тромбоцитов, полученных из крови боль$

ются повышенным уровнем экспрессии субъеди$

ных DM2. Согласно полученным нами результа$

ниц IGF$1R. Это может быть одной из причин бо$

там, по$видимому, концентрация IGF$1 в кро$

лее высокой чувствительности тромбоцитов к сти$

вотоке может быть одним из факторов, влияю$

муляции, вызываемой добавлением IGF$1, в усло$

щих на процесс активации тромбоцитов у боль$

виях, когда агрегация тромбоцитов инициируется

ных сахарным диабетом. Слабая положительная

тромбином за счет увеличения скорости их акти$

корреляция между концентрацией HbA1c и ско$

вации. Однако необходимы дальнейшие исследо$

ростью индуцированной тромбином активации

вания, направленные на изучение возможной ро$

тромбоцитов при добавлении экзогенного инсу$

ли IGF$1 в тромботических осложнениях, кото$

линоподобного фактора роста 1 подразумевает,

рые сопровождают течение сахарного диабета.

что тяжесть протекания DM2 может быть связа$

на с влиянием IGF$1. Увеличение количества

IGF$1R может быть одним из факторов, ответ$

Финансирование. Проведение данной работы

ственных за этот эффект. Однако необходимы

было поддержано Министерством образования,

дальнейшие эксперименты, чтобы делать такие

науки и технологий Республики Сербия (грант

выводы. Удаление рецепторов инсулина из

№ 173042).

тромбоцитов в мышиной модели DM (ir$нокау$

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от$

тированные мыши) способствовало тому, что

сутствии конфликта интересов.

эти мыши становились менее восприимчивыми

Соблюдение этических норм. Проведение

к действию IGF$1. Авторы статьи утверждают,

данной работы было одобрено Комитетом по

что этот эффект скорее всего является следстви$

этике при Институте прикладной ядерной энер$

ем пониженной экспрессии гибридных рецеп$

гии (INEP). Все процедуры, выполненные в ис$

торов [20]. В 2013 г. Stolla et al. показали, что

следовании с участием людей, соответствуют

IGF$1 способен повышать активацию тромбо$

этическим стандартам институционального

цитов в присутствии активированного протеа$

и/или национального комитета по исследова$

зой рецептора PAR4 [21]. Так как PAR4 является

тельской этике. От каждого из включенных в

рецептором тромбина, а мы также использовали

исследование участников было получено ин$

тромбин для активации тромбоцитов, то мог по$

формированное добровольное согласие.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Tripodi, A., Branchi, A., Chantarangkul, V., Clerici, M.,

8. Pomero, F., Di Minno, M.N.D., Fenoglio, L., Gianni, M.,

Merati, G., Artoni, A., and Mannucci, P.M.

(2011)

Ageno, W., and Dentali, F. (2015) Is diabetes a hypercoagulable

Hypercoagulability in patients with type 2 diabetes mellitus

state? A critical appraisal, Acta Diabetol., 52, 1007-1016.

detected by a thrombin generation assay, J. Thromb.

9. Kakouros, N., Rade, J.J., Kourliouros, A., and Resar, J.R.

Thrombolysis, 31, 165-172.

(2011) Platelet function in patients with diabetes mellitus:

Carr, M.E. (2001) Diabetes mellitus. A hypercoagulable

from a theoretical to a practical perspective, Int. J. Endo

state, J. Diabetes Complications, 15, 44-54.

crinol., 2011, 742719.

Vazzana, N., Ranalli, P., Cuccurullo, C., and Davi, G.

10. Hu, L., Chang, L., Zhang, Y., Zhai, L., Zhang, S., Qi, Z.,

(2012) Diabetes mellitus and thrombosis, Thromb. Res.,

Yan, H., Yan, Y., Luo, X., Zhang, S., Wang, Y., Kunapuli, S.P.,

129, 371-377.

Ye. H., and Ding, Z. (2017) Platelets express activated

Dunn, E.J., Ariens, R.A., and Grant, P.J. (2005) The influ$

P2Y₁₂

receptor in patients with diabetes mellitus,

ence of type 2 diabetes on fibrin structure and function,

Circulation, 136, 817-833.

Diabetologia, 48, 1198-1206.

11. Di Minno, M.N.D., Lupoli, R., Palmieri, N.M.,

Dunn, E.J., Philippou, H., Ariens, R.A., and Grant, P.J.

Russolillo, A., Buonauro, A., and Di Minno, G. (2012)

(2006) Molecular mechanisms involved in the resistance of

Aspirin resistance, platelet turnover, and diabetic angiopa$

fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 dia$

thy: a 2011 update, Thromb. Res., 129, 341-344.

betes mellitus, Diabetologia, 49, 1071-1080.

12. Randriamboavonjy, V., and Fleming, I. (2009) Insulin,

Dunn, E.J., and Ariens, R.A. (2004) Fibrinogen and fibrin

insulin resistance, and platelet signaling in diabetes,

clot structure in diabetes, Herz, 29, 470-479.

Diabetes Care, 32, 528-530.

Kim, J.H., Bae, H.Y., and Kim, S.Y. (2013) Clinical marker

13. Ferreiro, J.L., Gomez$Hospital, J.A., and Angiolillo, D.J.

of platelet hyperreactivity in diabetes mellitus, Diabetes

(2010) Platelet abnormalities in diabetes mellitus, Diab.

Metab. J., 37, 423-428.

Vasc. Dis. Res., 7, 251-259.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019

1518

GLIGORIJEVIC и др.

14.

Annunziata, M., Granata, R., and Ghigo, E. (2011) The

25. Motani, A.S., Anggard, E.E., and Ferns, G.A.A. (1996)

IGF system, Acta Diabetol., 48, 1-9.

Recombinant insulin$like growth factor$1 modulates

15.

Aghdam, S.Y., Eming, S.A., Willenborg, S., Neuhaus, B.,

aggregation in human platelets via extracellular calcium,

Niessen, C.M., Partridge, L., Krieg, T., and Bruning, J.C.

Life Sci., 58, 269-74.

(2012) Vascular endothelial insulin/IGF$1 signaling con$

26. Blair, P., and Flaumenhaft, R. (2009) Platelet α$granules:

trols skin wound vascularization, Biochem. Biophys. Res.

basic biology and clinical correlates, Blood Rev., 23,

Commun., 421, 197-202.

177-189.

16.

Hunter, R.W., and Hers, I. (2009) Insulin/IGF$1 hybrid

27. Taylor, V.L., and Spencer, E.M. (2001) Characterisation of

receptor expression on human platelets: consequences for

insulin$like growth factor$binding protein$3 binding to a

the effect of insulin on platelet function, J. Thromb.

novel receptor on human platelet membranes, J. Endo

Haemost., 7, 2123-2130.

crinol., 168, 307-315.

17.

Andersen, M., Norgaard$Pedersen, D., Brandt, J.,

28. Simic, D., Bogdan, N., Teng, F., and Otieno, M. (2017)

Pettersson, I. and Slaaby, R. (2017) IGF1 and IGF2 speci$

Blocking α5β1 integrin attenuates sCD40L$mediated

ficities to the two insulin receptor isoforms are determined

platelet activation, Clin. Appl. Thromb. Hemost., 23,

by insulin receptor amino acid 718, PLoS One, 12,

607-614.

e0178885.

29. Campbell, P.G., Durham, S.K., Hayes, J.D., Suwanichkul, A.,

18.

Kim, S., Garcia, A., Jackson, S.P., and Kunapuli, S.P.

and Powell, D.R. (1999) Insulin$like growth factor$bind$

(2007) Insulin$like growth factor$1 regulates platelet acti$

ing protein$3 binds fibrinogen and fibrin, J. Biol. Chem.,

vation through PI3$Kα isoform, Blood, 110, 4206-4213.

274, 30215-30221.

19.

Hers, I. (2007) Insulin$like growth factor$1 potentiates

30. Gligorijevic, N., and Nedic, O. (2016) Interaction between

platelet activation via the IRS$PI3Kα pathway, Blood, 110,

fibrinogen and insulin$like growth factor$binding protein$1

4243-4252.

in human plasma under physiological conditions,

20.

Moore, S.F., Williams, C.M., Brown, E., Blair, T.A.,

Biochemistry (Moscow), 81, 135-140.

Harper, M.T., Coward, R.J., Poole, A.W., and Hers, I.

31. Udvardy, M., Pfliegler, G., and Rak, K. (1985) Platelet

(2015) Loss of the insulin receptor in murine megakaryo$

insulin receptor determination in non$insulin dependent

cytes/platelets causes thrombocytosis and alterations in

diabetes mellitus, Experimentia, 41, 422-423.

IGF signaling, Cardiovasc. Res., 107, 9-19.

32. Boucher, J., Kleinridders, A., and Khan, R. (2014) Insulin

21.

Stolla, M.C., Li, D., Lu, L., and Woulfe, D.S. (2013)

receptor signaling in normal and insulin$resistant states,

Enhanced platelet activity and thrombosis in a murine

Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 6, a009191.

model of type I diabetes are partially insulin$like growth

33. Vestergaard, P.F., Hansen, M., Frystyk, J., Espelund, U.,

factor 1$dependent and phosphoinositide 3$kinase$depen$

Christiansen, J.S., Jorgensen, J.O., and Fisker, S. (2013)

dent, J. Thromb. Haemost., 11, 919-929.

Serum levels of bioactive IGF1 and physiological markers

22.

Hunter, W.M., and Greenwood, F.C. (1963) Preparation of

of ageing in healthy adults, Eur. J. Endocrinol., 170,

iodine$131 labelled human growth hormone of high specif$

229-236.

ic activity, Biochem. J., 89, 114-123.

34. Wilcox, G. (2005) Insulin and insulin resistance, Clin.

23.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins dur$

Biochem. Rev., 26, 19-39.

ing the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature,

35. Benyoucef, S. Katharina, H., Surinya, K.H., Hadaschik,

227, 680-685.

D., and Siddle, K. (2007) Characterization of insulin/IGF

24.

Bednar, B., Condra, C., Gould, R.J., and Connolly, T.M.

hybrid receptors: contributions of the insulin receptor L2

(1995) Platelet aggregation monitored in a 96 well

and Fn1 domains and the alternatively spliced exon 11

microplate reader is useful for evaluation of platelet ago$

sequence to ligand binding and receptor activation,

nists and antagonists, Thromb. Res., 77, 453-463.

Biochem. J., 403, 603-613.

AN ENHANCED PLATELET SENSITIVITY TO IGF 1 IN PATIENTS

WITH DIABETES MELLITUS TYPE 2

N. Gligorijevic*, D. Robajac, and O. Nedic

Institute for the Application of Nuclear Energy (INEP), University of Belgrade,

11080 Belgrade, Serbia; E mail: nikolag@inep.co.rs

Received April 3, 2019

Revised June 8, 2019

Accepted June 24, 2019

Diabetes mellitus is characterized by an increased platelet activation mediated by many factors including changes in

the expression of platelet membrane proteins. The aim of this study was to investigate the sensitivity of human platelets

towards insulin$like growth factor (IGF) system in patients with poorly controlled diabetes mellitus type 2 (DM2).

¹²⁵I$labelled insulin$like growth factor 1 (IGF$1) and insulin were used for the analysis of ligand binding, and Western

blot for determination of the relative expression level of IGF$1 and insulin receptors (IGF$1R and IR, respectively).

Aggregation of platelets in the presence of IGF$1 was studied by plate aggregometry assay. IGF$1 binding and IGF$1R

expression level were significantly higher in platelets from DM2 patients compared to healthy persons. Insulin bind$

ing and IR expression level were generally lower in DM2 group, but the differences were not statistically significant.

Potentiating effect of IGF$1 on thrombin$induced activation of platelets was detected in both groups, being signifi$

cantly more pronounced in platelets from DM2 patients. Initial speed of platelet activation in the presence of IGF$1

positively correlated with concentration of glycated hemoglobin (HbA1c). Thus, platelets from DM2 patients have an

increased expression of IGF$1R subunits, which may contribute to their higher sensitivity towards IGF$1 due to an

increase in rate of their activation during thrombin$induced aggregation. However, further experiments are needed to

investigate a potential role of IGF$1 in thrombotic complications accompanying diabetes.

Keywords: blood platelets, diabetes mellitus type 2, hemostasis, insulin$like growth factor$1, platelet aggregation

БИОХИМИЯ том 84 вып. 10 2019