БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 11, с. 1683 - 1700

УДК 543.51

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

И ЕГО ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ПАРКИНСОНИЗМЕ И ДЕЙСТВИИ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ*

Обзор

О.А. Бунеева¹**, М.В. Медведева²**^,***, А.Т. Копылов¹, А.Е. Медведев¹

¹ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119121 Москва, Россия

² Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119991 Москва, Россия;

электронная почта: marmed64@yandex.ru

Поступила в редакцию 23.05.2019

После доработки 02.07.2019

Принята к публикации 11.07.2019

Обобщены собственные и литературные данные об убиквитинировании митохондриальных белков мозга и

его изменении при развитии экспериментального паркинсонизма и введении нейропротектора изатина

(индол 2,3 дион). Рассмотрены компоненты убиквитин конъюгирующей системы митохондрий мозга и

локализация убиквитинированных белков в этих органеллах. При инкубации митохондриальной фракции

мозга in vitro обнаружено включение биотинилированного убиквитина как в собственно митохондриальные

белки, так и в белки, ассоциированные с этими органеллами. По данным интерактомного анализа, иденти

фицированные неубиквитиновые белки способны образовывать прочные комплексы с убиквитинирован

ными белками или их партнерами и компонентами митохондриальных мембран. Исследования эндогенно

го убиквитинирования в мозге мышей C57Bl, выполненные в разных лабораториях, показали, что доля

убиквитинированных белков митохондрий составляет ~30%. Однако субпротеомы убиквитинированных

белков митохондрий существенно различались как по своему составу, так и по вовлеченности в биологичес

кие процессы, фигурирующие в базе данных Gene Ontology (GO). Развитие паркинсонизма у мышей C57Bl,

индуцированного введением однократной дозы нейротоксина 1 метил 4 фенил 1,2,3,6 тетрагидропириди

на (МФТП), приводило к снижению общего числа убиквитинированных белков в митохондриальной фрак

ции мозга и увеличению окисленных белков, содержащих убиквитиновую метку (K ε GG). Поскольку ни

один из этих белков не был идентифицирован среди белков, связывающихся с убиквитиновым рецептором

протеасом, субъединицей Rpn10, можно считать, что убиквитинирование митохондриальных белков мозга,

по видимому, прямо не связано с их деградацией в протеасомах. Среди белков мозга, связывающихся с ней

ропротектором изатином, идентифицированы белки, участвующие в работе убиквитин конъюгирующей

системы. Картирование изатин связывающих белков на известные метаболические пути предполагает их

участие в пути, связанном с E3 убиквитинпротеинлигазой паркином (parkin associated pathway;

CH000000947). В контексте взаимодействия убиквитинированных белков митохондрий мозга функцио

нальные связи были обнаружены только в группе животных с МФТП индуцированным паркинсонизмом.

Это позволяет предположить, что нейропротекторный эффект изатина может быть связан с нарушением

взаимодействия белков, подлежащих последующей деградации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: убиквитинирование белков, митохондрии мозга, экспериментальный паркинсо

низм, нейропротектор изатин, субпротеом, интерактом.

DOI: 10.1134/S0320972519110113

Убиквитин - небольшой «вездесущий» (бук

убиквитинирование (называемое также убикви

вально от латинского «ubique» - «везде»), состоя

тинилированием) [1-4].

щий из 76 а.о. белок, с молекулярной массой

Убиквитин ковалентно присоединяется к

~8,5 кДа, который осуществляет посттрансля

белку мишени посредством образования пеп

ционную модификацию различных белков, их

тидной связи между карбоксильной группой

Принятые сокращения: МФТП - нейротоксин 1 метил 4 фенил 1,2,3,6 тетрагидропиридин, МАО - моноаминок

сидаза, GO - база данных Gene Ontology, PPI - белок-белковое взаимодействие.

* Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте изда

тельства Springer (https://link.springer.com/journal/10541), том 84, вып. 11, 2019.

** Автор является выпускником кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

*** Адресат для корреспонденции.

1683

11*

1684

БУНЕЕВА и др.

С концевого остатка убиквитина (Gly76) и ами

ние) или цепочка из нескольких (чаще всего че

ногруппой Lys боковой цепи модифицируемого

тырех) убиквитиновых остатков (полиубикви

белка. Этот процесс осуществляется в несколь

тинирование). Молекулы убиквитина в поли

ко стадий (рис. 1). Сначала убиквитин активи

убиквитиновой цепи могут быть соединены

рующий фермент (Е1) гидролизует АТР и обра

посредством одного из семи остатков лизина

зует тиоэфирную связь с убиквитином. Затем

(Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63)

активированный убиквитин переносится на

или через N концевой остаток метионина

убиквитин конъюгирующий фермент (Е2), ко

(Met1) [4, 5].

торый, в свою очередь, переносит его на моле

Чаще всего молекулы убиквитина, присое

кулу субстрата, специфически узнаваемого од

диняющиеся к белку мишени в виде полиубик

ной из убиквитинлигаз (Е3) (рис. 1). При этом к

витиновой цепи, служат сигналом для протео

белковому субстрату может присоединяться од

литической деградации в протеасомах [1-4].

на молекула убиквитина (моноубиквитинирова

Однако помимо элиминации «ненужных» бел

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая процесс убиквитинирования белков и образования убиквитиновой сигнатуры в ходе их

триптического расщепления для масс спектрометрического анализа.

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1685

ков с участием протеасомы, модификация убик

рассматривать МАО митохондрий мозга в каче

витином различных белков мишеней играет

стве предполагаемой мишени для убиквитин

важную роль во многих других внутриклеточных

зависимой деградации.

процессах: в регуляции экспрессии генов, кле

Действительно, включение экзогенного

точного цикла и деления, в ответе на стресс, ре

убиквитина в митохондрии мозга in vitro, зави

парации ДНК, импорте белков в митохондрии,

севшее от присутствия в среде инкубации АТР и

сборке рибосом, апоптозе, эндоцитозе, борьбе с

АТР регенерирующей системы (креатинфос

вирусной инфекцией и др. [2, 4, 5].

фат креатинфосфокиназа), сопровождалось по

В контексте роли убиквитина в обмене мито

вышением чувствительности МАО к протеоли

хондриальных белков результаты первых иссле

тической инактивации [14, 15]. При этом проис

дований, посвященных этой проблеме, появи

ходило повышение чувствительности и МАО А,

лись примерно через 10 лет после первых работ

и МАО Б к специфическому механизм активи

по убиквитинированию белков цитозоля и кле

рованному ингибитору паргилину и увеличение

точных органелл [6, 7]. Одними из первых работ

включения [³H] паргилина в митохондрии, ко

в этом направлении были работы группы

торое было особенно заметно во фракции, полу

McCauley по встраиванию новосинтезирован

ченной в результате иммунопреципитации ми

ных молекул моноаминоксидаз (МАО) А и Б во

тохондриальных белков антисывороткой к

внешнюю мембрану митохондрий [8, 9].

убиквитину и протеин А сефарозой [16]. Одна

Используя лизат ретикулоцитов и РНК пече

ко включение убиквитина в митохондрии не вы

ни быка в качестве системы биосинтеза, авторы

зывало увеличения молекулярных масс мечен

обнаружили, что синтезированные молекулы

ных [³H] паргилином белков. Это свидетель

МАО встраиваются в добавленные в эту систему

ствовало об опосредованном влиянии убикви

очищенные внешние мембраны митохондрий

тина на чувствительность МАО А и МАО Б ми

[8, 9]. При этом процесс встраивания новосин

тохондрий мозга крыс к протеолизу и специфи

тезированных молекул МАО зависел от присут

ческому ингибированию и о вовлечении других

ствия эндогенного убиквитина [9]. Его истоще

белков в процесс убиквитинирования в мито

ние при помощи очищенных анти убиквитино

хондриях.

вых антител или реконструкция системы с ис

пользованием мутантного убиквитина, не спо

собного образовывать конъюгаты с белками, на

ИССЛЕДОВАНИЯ

рушали процесс встраивания МАО [8]. Еще од

УБИКВИТИНИРОВАНИЯ

ним фактором, нарушающим встраивание МАО

МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

во внешнюю мембрану митохондрий, был дефи

цит АТР [8, 9]. Хотя используемая система со

Идентификация компонентов Е1-Е3 убикви;

держала много компонентов (включая матрицу

тин;конъюгирующей системы и конкретных уби;

для синтеза не только МАО, но и многих других

квитинированных белков. Пионерские исследова

белков), совокупность данных вполне уклады

ния процесса убиквитинирования в митохонд

валась в схему прямого убиквитинирования

риях мозга кроликов с использованием [¹²⁵I]

МАО.

убиквитина [11] свидетельствовали в пользу ас

Поскольку МАО принадлежит ключевая

социации всех трех ферментов (рис. 1), необхо

роль в катаболизме важнейших медиаторных

димых для образования конъюгатов убикви

моноаминов центральной нервной системы, на

тин-белок, с митохондриями. Эксперименты по

рушения обмена которых обнаружены при мно

фракционированию митохондрий мозга с диги

гих нейродегенеративных заболеваниях, мы по

тонином выявили, что высвобождение [¹²⁵I]

пытались оценить возможную роль убиквитина

убиквитин конъюгирующей активности проис

в адресной деградации МАО митохондрий мозга

ходило параллельно с высвобождением с NADH

крыс. К тому времени уже было известно, что:

цитохром с редуктазой - маркером внешней

(i) меченый убиквитин ([¹²⁵I] убиквитин) обра

мембраны митохондрий [11]. По данным Вес

зует конъюгаты с белками не только пермеаби

терн блоттинга с использованием антител к ко

лизованных клеток гепатомы [10], но и мито

нъюгатам убиквитина и авторадиографии, моле

хондрий кролика [11]; (ii) патологические со

кулярные массы убиквитинированных белков

стояния, приводящие к активации окислитель

варьировали в широком диапазоне, однако сами

ных процессов и увеличению образования уби

белки идентифицированы не были. Позднее на

квитиновых конъюгатов в митохондриях [12],

личие убиквитин активирующего фермента Е1 в

вызывают окислительную модификацию МАО,

митохондриях было подтверждено в ходе элект

сопровождающуюся увеличением чувствитель

ронно микроскопического исследования клеток

ности к трипсинолизу [13]. Все это позволяло

HepG2 c использованием моноклональных ан

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1686

БУНЕЕВА и др.

тител к Е1 [17]. На долю митохондрий этих кле

о пуле убиквитинированных митохондриальных

ток приходилось 7% всего пула Е1 [17].

белков в конкретный момент времени не только

У человека обнаружено ~40 убиквитин ак

на уровне клеточных культур, но и в отдельных

тивирующих ферментов Е2 [4, 5, 18] и >700

органах животных.

убиквитин протеинлигаз Е3 [5]. Исследования,

В экспериментах на очищенных митохон

выполненные на различных типах клеток, пока

дриях дрожжей, подвергнутых лизису, трипси

зали существенную роль нескольких Е2 и Е3 в

нолизу и аффинному обогащению при помощи

убиквитинировании митохондриальных белков

иммобилизованных антител к убиквитиновой

(и белков, ассоциированных с этими органелла

сигнатуре (anti K ε GG) с последующим масс

ми). При помощи siRNA опосредованного нок

спектрометрическим анализом, было иденти

дауна было показано, что ферменты UBE2N,

фицировано 36 убиквитинированных белков

UBE2L3 и UBE2D2/3 играют важную роль в т.н.

(таблица) [21, 22]. Важно отметить, что убикви

паркин зависимой митофагии (селективной

тинирование ряда белков, характеризующихся

деградации митохондрий путем аутофагии).

исключительно митохондриальной локализаци

Совместное выключение UBE2N, UBE2L3 и

ей, было подтверждено несколькими методами.

UBE2D2/3 в клетках HeLa приводило к сниже

При этом в очищенных митохондриях Lehmann

нию убиквитинирования ряда белков, которое

et al. [21] обнаружили дрожжевую убиквитин

оценивали при помощи антител к полиубикви

протеинлигазу Dma1p (гомолог убиквитинпро

тину и антител к конкретным исследуемым бел

теинлигазы человека RNF8).

кам: митофузинам, субъединицам TOM20 и

Для оценки убиквитинирования белков

TOM70 транслоказного комплекса наружной

сердца Jeon et al. создали линию трансгенных

мембраны митохондрий (ТОМ), белку 1 потен

мышей, которые экспрессировали убиквитин,

циал зависимого анионного канала [19]. При

содержащий октагистидиновую метку (octahisti

этом локализация Е2 ферментов, выключенных

dine/Flag tagged ubiquitin; HisF Ub) [22]. Это

при помощи siRNA, специально не исследова

позволило выделить пул убиквитинированных

лась. В контексте убиквитинирования именно

белков сердца для масс спектрометрической

митохондриальных белков клеток мозга недав

идентификации. Из 121 го идентифицирован

но описана новая форма митохондриального

ного белка, несущего убиквитиновую сигнатуру

убиквитин конъюгирующего фермента Е2 -

(K ε GG), на долю убиквитинированных бел

E2I в клетках зрелого пигментного эпителия

ков митохондрий приходилось ~38%. По субми

сетчатки крыс [20]. Эксперименты по субкле

тохондриальной локализации идентифициро

точному фракционированию, ко иммунолока

ванные белки были локализованы как во внеш

лизации и иммуноаффинной очистке свиде

ней, так и во внутренней мембранах митохон

тельствуют в пользу специфической локализа

дрий и в матриксе (таблица). Интересно, что в

ции новой изоформы именно в митохондриаль

отличие от исследований, выполненных на

ном компартменте [20].

культурах клеток [19], среди идентифицирован

Использование аналогичного инструмента

ных белков был выявлен всего один белок

рия (адресного выключения определенных ге

(Mitochondrial fission 1 protein, таблица), имею

нов и использования различных антител) позво

щий отношение к процессам деления митохон

лило охарактеризовать роль нескольких убикви

дрий.

тин протеинлигаз Е3 в убиквитинировании ми

Сопоставление убиквитинированных белков

тохондриальных белков преимущественно в

матрикса митохондрий дрожжей и сердца мы

культурах клеток и роли конкретных ферментов

шей не выявило ни одного общего белка. В кон

(преимущественно Е2-Е3) в контексте митофа

тексте убиквитинирования именно митохон

гии, слиянии и делении митохондрий и др.

дриальных белков мозга все это, очевидно, сви

Хотя использование специфических антител

детельствует о том, что к экстраполяции дан

позволяет выяснить возможную роль опреде

ных, полученных на других объектах (например,

ленных белков в том или ином процессе, «за

на клеточных культурах, а также других биоло

бортом» таких исследований зачастую остаются

гических видах и органах), следует подходить с

другие (в контексте данного обзора убиквити

очень большой осторожностью. Это можно про

нированные) белки. В связи с этим особого вни

иллюстрировать результатами исследований,

мания заслуживают работы по профилирова

выполненных на клетках HeLa [23]. Обработка

нию определенных групп белков (субпротео

этих клеток ингибитором протеасом MG132

мов) как целой клетки (ткани), так и ее отдель

приводила к накоплению полиубиквитиниро

ных компартментов.

ванных белков во фракции митохондрий. Масс

Использование протеомных подходов поз

спектрометрический анализ цельного экстракта

волило существенно расширить представления

клеток позволил авторам идентифицировать 203

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1687

Убиквитинированные белки митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae и сердца мышей Mus musculus

Локализация*

Ген

Название белка

Ген

Название белка

MIS

MIM

MOM

Дрожжи (Saccharomyces cerevisiae)

Мышь (Mus musculus)

1 − генерация энергии и углеводный обмен

Lpd1

Dihydrolipoyl dehydrogenase,

•

Ndufc2

NADH dehydrogenase

•

mitochondrial

[ubiquinone] 1 subunit C2

Adh3

Alcohol dehydrogenase 3, mito

•

Atp5f1b

ATP synthase subunit beta,

•

chondrial

mitochondrial

Ald4

Potassium activated aldehyde

•

Atp5f1a

ATP synthase subunit alpha,

•

dehydrogenase, mitochondrial

mitochondrial

Mdh1

Malate dehydrogenase, mito

•

Atp5f1c

ATP synthase subunit gamma,

•

chondrial

mitochondrial

Cit1

Citrate synthase, mitochondrial

•

Atp5pb

ATP synthase F(0) complex

•

subunit B1, mitochondrial

Dld2

D 2 hydroxyglutarate pyruvate

•

transhydrogenase DLD2

Atp5f1d

ATP synthase subunit delta,

•

mitochondrial

Fum1

Fumarate hydratase, mitochon

•

drial

mt+Co3

cytochrome c oxidase subunit 3

•

Pda1

Pyruvate dehydrogenase E1

•

Cox6a2

cytochrome c oxidase subunit

•

component subunit alpha, mito

6A2, mitochondrial

chondrial

Ckmt2

creatine kinase S type, mito

•

Pdb1

Pyruvate dehydrogenase E1

•

chondrial

component subunit beta, mito

chondrial

Etfdh

electron transfer flavoprotein

•

ubiquinone oxidoreductase,

Idh1

Isocitrate dehydrogenase [NAD],

•

mitochondrial

subunit 1, mitochondrial

Etfa

electron transfer flavoprotein

•

Idh2

Isocitrate dehydrogenase [NAD],

•

subunit alpha, mitochondrial

subunit 2, mitochondrial^a

Idh2

isocitrate dehydrogenase

•

Kgd2

Dihydrolipoyllysine residue

•

[NADP] mitochondrial

succinyltransferase component

of 2 oxoglutarate dehydrogenase

Mdh2

malate dehydrogenase, mito

•

complex, mitochondrial

chondrial

Lat1

Dihydrolipoyllysine residue

•

Ndufa10

NADH dehydrogenase

•

acetyltransferase component

[ubiquinone] 1 alpha subcom

of pyruvate dehydrogenase

plex subunit 10, mitochondrial

complex, mitochondrial

Ndufa11

NADH dehydrogenase

•

[ubiquinone] 1 alpha subcom

plex subunit 11

Ndufa9

NADH dehydrogenase

•

[ubiquinone] 1 alpha subcom

plex subunit 9, mitochondrial

Ndufs3

NADH dehydrogenase

•

[ubiquinone] iron sulfur

protein 3, mitochondrial

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1689

Продолжение таблицы

4 − передача сигнала и регуляция активности ферментов

Slc25a4

ADP/ATP translocase 1

•

Fis1

mitochondrial fission 1 protein

•

Phb2

prohibitin 2

•

Rab11fip5

Rab11 family interacting protein 5

•

5 − антиоксидантные и протекторные свойства

Mcx1

ATP dependent clpX like chaper

•

Hsp90ab1

heat shock protein HSP 90 beta

•

one, mitochondrial

Sod1

superoxide dismutase [Cu Zn]

•

Mdj1

DnaJ homolog 1, mitochondrial

•

Sod2

superoxide dismutase [Mn], mito

•

Hsp10

10 kDa heat shock protein, mito

•

chondrial

Hsp60

Heat shock protein 60, mitochondrial

•

Hsp78

Heat shock protein 78, mitochondrial

•

Ssc1

Heat shock protein SSC1, mito

•

chondrial

Yhb1

Frataxin homolog, mitochondrial

•

6 − метаболизм аминокислот и других азотистых соединений

Mae1

NAD dependent malic enzyme,

•

^#Gatd3a

glutamine amidotransferase like

mitochondrial

class 1 domain containing protein

3A, mitochondrial

Alt1

Probable alanine aminotransferase,

•

mitochondrial

Bat1

Branched chain amino acid

•

aminotransferase, mitochondrial

Mmf1

Protein MMF1, mitochondrial

•

Ilv5

Ketol acid reductoisomerase,

•

mitochondrial

7 − метаболизм липидов

Etr1

Enoyl [acyl carrier protein]

•

Acadvl

very long chain specific acyl CoA

•

reductase, mitochondrial

dehydrogenase, mitochondrial

Cpt1b

carnitine O palmitoyltransferase 1,

•

muscle isoform

Acsl1

long chain fatty acid CoA ligase 1

•

Hadhb

trifunctional enzyme subunit beta,

•

mitochondrial

Hadha

Trifunctional enzyme subunit alpha,

•

mitochondrial

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1690

БУНЕЕВА и др.

Окончание таблицы

Смешанные группы: 1, 2, 3, 4, 5, 6

Aco1

Aconitate hydratase, mitochondrial

•

Aco2

aconitate hydratase, mitochondrial

•

(1,2,3)

(1,6)

Pim1

Lon protease homolog, mitochon

•

drial (4,5)

Примечание. *Локализация убиквитинированных белков митохондрий приведена в соответствии с терминологией Gene

Ontology: MM - матрикс митохондрий; MN - митохондриальный нуклеоид; MIS - межмембранное пространство;

MOM - внешняя мембрана митохондрий; MIM - внутренняя мембрана митохондрий. # Точная субмитохондриальная

локализация неизвестна. ^a У дрожжей ген Idh2 кодирует субъединицу 2 митохондриальной NAD зависимой изоцитратде

гидрогеназы (КФ 1.1.1.41). ^b У мыши ген Idh2 кодирует митохондриальную NADP зависимую изоцитратдегидрогеназу

(КФ 1.1.1.42). Анализ выполнен на основании данных, представленных в статьях Lehmann et al. [21] и Jeon et al. [22].

белка, содержащих убиквитиновую сигнатуру и

убиквитин конъюгирующей системой, включа

имеющих отношение к митохондриям. При пос

ющей компоненты Е1-Е3. Увеличение убикви

ледующем фракционировании митохондрий

тинирования белков митохондрий в ответ на

убиквитиновые конъюгаты белков были обнару

воздействие ингибиторов протеасом является

жены во внешней и внутренней мембранах ми

важным аргументом в пользу того, что эти бел

тохондрий, но не в матриксе. К сожалению, от

ки, очевидно, предназначены для протеасомной

сутствие полного списка идентифицированных

деградации.

белков не позволяет сопоставить эти данные с

Убиквитинирование белков митохондрий мозга

результатами других исследований, что особен

in vitro и in vivo. Используя систему инкубации

но важно в связи с сообщением авторов об отсут

митохондриальной фракции мозга крыс, в кото

ствии убиквитинированных белков в матриксе.

рой было обнаружено убиквитин зависимое

Тем не менее рассмотренные в данном разде

увеличение чувствительности МАО к протеоли

ле результаты исследований свидетельствуют о

тической инактивации [14-16], мы попытались

том, что митохондрии обладают собственной

выявить убиквитинирование белков митохон

Рис. 2. Интерактом белков митохондриальной фракции мозга крыс, содержащих убиквитиновые сигнатуры (а) и возмож

ный механизм формирования убиквитинового интерактома (б). а - Жирными линиями обозначены прямые взаимодей

ствия между идентифицированными белками, аннотированные в String (версия 11.0 от 19 января 2019 года). Жирные

пунктирные линии показывают доказанные взаимодействия между внутримитохондриальными белками и кластером

внемитохондриальных белков, вовлеченных в формирование цитоскелета, углеводный обмен и др. Названия белков, фи

гурирующие в этом и др. рисунках, приведены в Приложении. Внутримитохондриальные белки показаны в виде красных

кружков. Внемитохондриальные белки, опосредованно взаимодействующие с компонентами митохондрий (при помощи

нескольких белков линкеров), представлены в виде несвязанных кружков. б - 1) Убиквитин, 2) убиквитин связывающий

домен, 3) домены олигомеризации (по данным, представленным в статье Бунеевой и соавт. [25]).

С цветным вариантом рис. 2 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1691

дрий мозга in vitro. Для идентификации белков,

подвергающихся убиквитинированию в мито

хондриях мозга в этих условиях, был использо

ван биотинилированный убиквитин [24]. Инку

бация митохондриальной фракции мозга in vitro

с биотинилированным убиквитином и последу

ющие хроматография лизата митохондрий на

авидин агарозе и масс спектрометрический

анализ связавшихся с аффинным сорбентом

белков привели к идентификации не менее 50

белков локализующихся как в митохондриях,

так и вне этих органелл. При этом только у 20%

белков, связавшихся с авидин агарозой, была

обнаружена так называемая убиквитиновая сиг

натура K ε GG, свидетельствующая о прямом

убиквитинировании белка.

По данным интерактомного анализа [24],

идентифицированные неубиквитинированные

белки способны образовывать прочные комп

лексы с убиквитинированными белками или их

партнерами и компонентами митохондриаль

ных мембран, в которых, по видимому, важную

роль играют взаимодействия убиквитиновых

цепей с убиквитин связывающими доменами

белков [25] (рис. 2).

При исследовании эндогенного убиквити

нирования во фракции неочищенных митохон

Рис. 3. Функциональные связи между убиквитинирован

дрий мозга мышей C57Bl было обнаружено не

ными белками митохондрий мозга мышей (созданы по

данным, представленным в статье Buneeva et al. [26]).

менее 75 ти индивидуальных белков, содержа

С цветным вариантом рис. 3 можно ознакомиться в элект

щих убиквитиновую сигнатуру K ε GG [26]

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

(формирование этой сигнатуры в ходе трипси

journal/biokhsm/

нолиза перед масс спектрометрическим анали

зом рассмотрено на рис. 1). Всего в этом иссле

довании было идентифицировано 565 белков, из

GO:0009064) и пролина (p

4,61e 05,

которых 301 относился в базе данных Gene

GO:0006560). Анализ межмолекулярных взаи

Ontology (GO) к группе митохондриальных бел

модействий показывает, что 10 белков из 22

ков. В соответствии с анализом внутриклеточ

формируют единую сеть белок-белковых взаи

ной локализации PANTHER (protein annotation

модействий (PPI, p = 0,000765), образованную

through evolutionary relationship) ~315 белков,

несколькими кластерами взаимодействий с об

выделенных из митохондрий клеток мозга мы

щими белками (рис. 3). Среди таких кластеров

шей, также были классифицированы как мито

наиболее представленными являются метабо

хондриальные. Из них 171 белок относится к так

лизм глиоксилата и деградация глицина

называемой митохондриальной оболочке (mito

(FDR = 0,00037; Got2, Aldh4a1, Dld), мета

chondrial envelope; в соответствии с определени

болизм аминокислот и их производных

ем GO - это двойной билипидный слой, охва

(FDR = 0,0035, Got2, Aldh4a1, Dld, Oat) и био

тывающий и отделяющий митохондрию от ци

синтез аминокислот (FDR = 0,0013, Pkm, Dld).

топлазмы клетки; этот отдел включает в себя

С учетом аннотированной специализации

также и межмембранное пространство).

этих белков в биологических процессах направ

Среди белков, относящихся к митохондри

ленное убиквитинирование может иметь отно

альной оболочке, убиквитиновая сигнатура бы

шение к функционированию ацетилхолинерги

ла идентифицирована у 22 белков. Распределе

ческой, ГАМК и глутаматергической систем,

ние этих белков по биологическим процессам

нарушение которых имеет важное значение в

показывает, что подавляющее большинство их

контексте развития и прогрессирования нейро

вовлечено в катаболизм глутамина (p = 1,84e 06,

дегенеративных заболеваний. Например, учас

GO:0009065), обмен глутаминовой кислоты (p =

тие таких белков, как Atp1a2, Ctsb и Ctsd и нару

= 3,17e 06, GO:0006536), а также метаболизм про

шение их молекулярных функций, обусловлен

изводных глутаминовой кислоты (p = 2,50e 05,

ное убиквитин опосредованной деградацией,

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1692

БУНЕЕВА и др.

было описано в работе на модельных мышах с

(ii) анализ убиквитинирования белков ткани

болезнью Альцгеймера [27].

мозга мышей без выделения фракции митохон

Один из наиболее интересных и многофунк

дрий в исследовании Wagner et al. [30] и выделе

циональных белков, идентифицированных при

ние суммарной фракции митохондрий мозга в

изучении субпротеома митохондрий мозга мы

наших исследованиях; (iii) различия в возрасте

шей C57Bl, оказался Aldh4a1 - фермент семей

экспериментальных животных и, очевидно,

ства альдегиддегидрогеназ. Данный фермент

условиях их содержания.

локализован в митохондриальном матриксе

Среди 56 убиквитинированных белков 17

[28]. Он является основным участником метабо

имеют митохондриальную локализацию. Хотя

лизма пролина и превращения пирролин 5 кар

количественно они сопоставимы с размером

боксилата в глутамат.

выборки митохондриальных убиквитинирован

Дефицит это фермента, который отмечен

ных белков, обнаруженных в нашей работе [26],

при гиперпролинемии 2 го типа, приводит к на

они существенно отличаются по вовлеченности

рушению целостности митохондрий [28]. Инте

в биологические процессы, фигурирующие в ба

ресно, что прямое убиквитинирование по а.о.

зе данных GO. Основная часть убиквитиниро

Lys495 было показано в другом широкомасш

ванных белков участвует в процессах элимина

табном протеомном исследовании, выполнен

ции и нейтрализации супероксидного радикала

ном на клетках HEK293 с использованием аф

(GO:0019430, p = 9,69e 03), ответной реакции на

финного обогащения перед масс спектрометри

токсины и токсические стимулы (GO:0097237 и

ческой детекцией убиквитиновой сигнатуры

GO:0051716, p = 1,20e 03, p = 3,58e 02 соответ

[29].

ственно), метаболизма активных форм кислоро

В контексте (немногочисленных) исследова

да (GO:0072593, p = 8,54e 04), ответной реакции

ний субпротеома убиквитинированных белков

на стресс (GO:0006950, p = 1,00e 03), а также в

митохондрий именно здорового мозга следует

процессах негативной регуляции клеточной

подробнее остановиться на работе, посвящен

смерти, индуцированной окислительным стрес

ной анализу сайтов убиквитинирования в мозге

сом (GO:1903202, p = 2,97e 03). Кроме того,

и периферических тканях мышей C57Bl [30].

идентифицированные убиквитинированные

Используя аффинное обогащение при помощи

белки участвуют в процессах трансмембранного

антител к убиквитиновой сигнатуре, Wagner et

переноса ионов, белкового и пептидного транс

al. охарактеризовали сайты убиквитинирования

порта.

белков в цельных препаратах мозга, печени, по

Сетевой анализ убиквитинированных бел

чек, сердца и мышц мышей C57Bl.

ков митохондрий показывает формирование

Проведенный нами анализ данных, доступ

единой сети из всех без исключения белков (PPI,

ных в «Дополнительных материалах» к этой

p = 1,17e 13) (рис. 4). Объяснение наблюдаемо

статье [30], показывает, что согласно информа

му феномену может заключаться в том, что не

ции, приведенной в базе данных GO, идентифи

которым из белков свойственны множествен

цированные белки митохондрий являются не

ные молекулярные функции, благодаря кото

посредственными участниками 61 го типа био

рым эти белки являются ключевыми переклю

логических процессов. Всего для этого пула бел

чателями (хабами) между различными биологи

ков было охарактеризовано 244 биологических

ческими процессами. Из данных, приведенных

процесса с величиной p < 0,05. При этом всего 4

на рис. 4, видно, что сетевое взаимодействие

процесса полностью совпадают с теми, что были

убиквитинированных белков формируется тре

охарактеризованы для выборки белков, иденти

мя функциональными горизонтальными слоя

фицированных нами в митохондриальной

ми, связь между которыми осуществляется че

фракции мозга без аффинного обогащения [26]:

рез три ключевых белка, кодируемых генами

метаболизм малых молекул (GO:0044281, p =

Park7

(Parkinsonism Associated Deglycase),

= 3,44e 05), клеточные метаболические процес

Hsp90aa1 (Heat Shock Protein 90 Alpha Family

сы (GO:0044237, p = 2,33e 03), метаболические

Class A Member 1) и Sod2 (Superoxide Dismutase

процессы (GO:0008152, p = 4,97e 03) и метабо

2). Взаимодействие между этими тремя белками

лизм органических субстанций (GO:0071704, p =

характеризуется максимальной величиной:

= 3,32e 02). Возможные различия в профилях

Park7 Hsp90aa1 PPI = 0,985, Park7 Sod2 PPI =

убиквитинированных белков митохондрий моз

= 0,987, Sod2 Park7 PPI = 0,879 и Sod2 Hsp90aa1

га могут быть обусловлены рядом причин, среди

PPI = 0,893. Каждый из этих трех белков являет

которых следует отметить: (i) отсутствие этапа

ся входной точкой в отдельный слой сетевого

аффинного обогащения убиквитиновой сигна

взаимодействия (на рис. 4 обозначены красным,

туры при подготовке проб для масс спектромет

синим и зеленым цветами), однако именно эти

рического анализа в наших исследованиях;

три белка выполняют общие функции в таких

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1693

процессах, как организация митохондрий

(GO:0007005, p = 1,50е 07), ответная реакция на

стресс (GO:0006950, p = 9,49е 06), регуляция ло

кализации (GO:0032879, p = 0,00014) и ответная

реакция на стимулирование (GO:0050896, p =

= 6,96е 07). В то же время, все эти белки, вклю

чая основные точки входа в сетевое взаимодей

ствие, объединяются ответными реакциями на

окислительный стресс, что согласуется с ранее

приведенными данными о распределении мито

хондриальных убиквитинированных белков

между биологическими процессами, направлен

ными на развитие и активизацию механизмов

нейтрализации активных форм кислорода. Ин

тересно отметить, что помимо мозга убиквити

нирование Sod2 было обнаружено также и в ми

тохондриях сердца мышей (таблица), что также

вписывается в контекст взаимосвязи убиквити

нирования митохондриальных белков и нейтра

лизации активных форм кислорода.

Особое место в этой группе белков занимает

Рис. 4. Сетевой анализ данных по идентифицированным

DJ 1 (кодируемый геном Park7), основная моле

убиквитинированным белкам мозга мышей [30], имеющих

заведомо митохондриальную локализацию (см. пояснения

кулярная функция которого состоит в каталити

в тексте).

ческой репарации гликозилированных белков

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в элект

или нуклеотидов [31]. Этому белку, ассоцииро

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

ванному с некоторыми формами раковых забо

journal/biokhsm/

леваний и болезнью Паркинсона, свойственны

и другие функции, к числу которых относятся

регуляция транскрипции, антиоксидантных за

тивны результаты недавнего исследования

щитных механизмов, функций митохондрий, а

Scudamore и Ciossek [37], выполненного на

также шаперонная и протеазная активности

трансгенных мышах, экспрессирующих альфа

[32]. В интактных митохондриях содержание

синуклеин (Thy 1) h[A30P] α synuclein челове

DJ 1 невелико, однако в условиях окислитель

ка и характеризующихся дефицитом SOD2. Они

ного стресса его уровень существенно повыша

показали значительно более высокий уровень

ется за счет транслокации молекул этого белка

синуклеинопатий у 16 месячных трансгенных

из цитозоля [32].

животных и накопление альфа синуклеина в

Роль белка Hsp90α, кодируемого геном

нерастворимой фракции гомогената мозга.

Hsp90aa1, не менее многогранна. Одна из изо

Таким образом, единое сетевое взаимодей

форм этого белка (Trap1) преимущественно ло

ствие, выявляемое среди убиквитинированных

кализована в митохондриях [33]. Hsp90α специ

белков митохондрий мозга [30], обусловлено

ализируется на поддержании и регуляции функ

межмолекулярным взаимодействием, главным

циональной активности различных белков,

образом трех белков хабов, кодируемых генами

включая транскрипционные факторы, различ

Park7, Hsp90aa1, Sod2 и объединенных общими

ные киназы, а также Е3 лигазы, осуществляю

биологическими процессами, которые связаны

щие убиквитинирование белков для протеасом

с защитными механизмами от окислительного

ной деградации; по данным интерактомных ис

стресса, включающими процессы убиквитини

следований Hsp90α может взаимодействовать со

рования митохондриальных белков.

135 ю белками [34]. Hsp90aa1 представляет со

бой одну из основных мишеней в процессе ак

тивации убиквитин опосредованной деграда

ИЗМЕНЕНИЯ УБИКВИТИНОВОГО

ции белков [35].

СУБПРОТЕОМА МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

Ген SOD2 кодирует митохондриальную мар

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ганец зависимую супероксиддисмутазу, сниже

ПАРКИНСОНИЗМЕ И ДЕЙСТВИИ

ние уровня и активности которой имеет далеко

НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ

идущие последствия при развитии митохондри

альной дисфункции и нейродегенеративной па

Болезнь Паркинсона - распространенное

тологии [36]. В этом плане особенно демонстра

нейродегенеративное заболевание, молекуляр

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1694

БУНЕЕВА и др.

ные механизмы которого до сих пор охарактери

тинирования 114 ти белков, включая 21 извест

зованы недостаточно полно. Результаты много

ный субстрат паркина [46]. При этом среди бел

численных исследований, выполненных на раз

ков митохондриального облака были выявлены

личных экспериментальных моделях, а также

нарушения всего 7 ми белков, 4 из которых яв

данные клинических наблюдений свидетель

ляются собственно митохондриальными: субъ

ствуют о важной роли в развитии этого заболе

единица АТР синтазы (Atp5b; ATP synthase, H⁺

вания многочисленных нарушений в митохон

transporting mitochondrial F1 complex, beta sub

дриях, которые оказывают серьезное влияние на

unit), субъединица цитохромоксидазы (Cox7a2;

функционирование убиквитин протеасомной

cytochrome c oxidase subunit VIIa 2), митофузин 1

системы [32, 38-40].

(Mfn1; mitofusin 1) и белок потенциал зависи

Несмотря на то что изучению убиквитини

мого анионного канала (Vdac3; voltage dependent

рования митохондриальных белков при модели

anion channel 3). При этом 6 из 7 белков фор

ровании болезни Паркинсона посвящено нема

мируют функциональную регуляторную цепь

ло экспериментальных и обзорных работ

(рис. 5). Следует отметить, что в базе данных

[39-44], исследований по системному анализу

KEGG для 3 х белков (АТР5b, Cox7a2 и Vdac3)

убиквитинового субпротеома (т.н. убиквитило

показана строгая ассоциация с сигнальными пу

ма) именно в мозге выполнено не так много.

тями mmu05012 и mmu05010, имеющими отно

Животные с нокаутированным геном Е3

шение к патогенезу болезни Паркинсона и

убиквитинлигазы паркина привлекают внима

Альцгеймера соответственно.

ние исследователей в связи с описанными в ли

Другая часто используемая модель болезни

тературе мутациями в гене, кодирующим белок

Паркинсона - МФТП индуцированный пар

Е3, у пациентов с болезнью Паркинсона [45].

кинсонизм у мышей (рис. 6). Развитие экспери

Протеомное исследование всей совокупнос

ментальной модели болезни Паркинсона в этом

ти убиквитинированных белков (т.н. глобально

случае связано с превращением протоксина

го убиквитилома) мозга 18 месячных мышей с

МФТП в нейротоксин МФП⁺ (ион 1 метил 4

нокаутированным геном Parkin выявили суще

фенилпиридиния) под действием МАО Б. Обра

ственные (в два и более раз) нарушения убикви

зующийся нейротоксин МФП⁺ ингибирует

комплекс I дыхательной цепи, приводя в конеч

ном итоге к развитию симптомокомплекса, ха

рактерного для этого заболевания [43, 48]. Вве

дение ингибиторов МАО Б (например, депрени

ла или изатина [49, 50]) или конкурирующих за

активный центр этого фермента субстратов

(например, фенилэтиламина) [51], препятству

ющих метаболической активации МФТП, пре

дупреждает развитие дефицита нейромедиатора

дофамина и двигательных нарушений, свой

ственных болезни Паркинсона.

На высоте двигательных расстройств, выз

ванных введением однократной дозы МФТП

мышам C57Bl, в митохондриальной фракции

мозга выявлено снижение числа убиквитиниро

ванных белков (с 75 ти у контрольных мышей

до 49 ти у мышей с МФТП индуцированным

паркинсонизмом) [26]. Сравнение профилей

идентифицированных белков митохондриаль

ной фракции мозга мышей выявило всего 5 бел

ков, общих для этих двух групп животных. Это

свидетельствует в пользу того, что развитие

МФТП индуцированного паркинсонизма ока

зывало существенное влияние на убиквитини

Рис. 5. Сетевой анализ данных по идентифицированным

рование белков, ассоциированных с митохон

убиквитинированным белкам мозга 18 месячных крыс с

дриями.

выключенным геном паркина [46], имеющих заведомо ми

Поскольку митохондриальную фракцию

тохондриальную локализацию (см. пояснения в тексте).

мозга мышей выделяли через 2 ч после введения

С цветным вариантом рис. 5 можно ознакомиться в элект

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

МФТП животным, изменения убиквитинирова

journal/biokhsm/

ния митохондриальных белков, очевидно, отра

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1695

Рис. 6. Схема, иллюстрирующая МАО Б зависимое превращение протоксина МФТП в нейротоксин МФП⁺ и его

действие на дыхательную цепь митохондрий. OMM - внешняя мембрана митохондрий, IMM - внутренняя мембрана ми

тохондрий, Q - убихинон.

С цветным вариантом рис. 6 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

жают наиболее ранние сдвиги, происходящие в

ческие эффекты реализуются изатин связываю

клетках мозга в ответ на нейротоксин. Примеча

щими белками, локализованными в различных

тельно, что процент убиквитинированных бел

внутриклеточных компартментах, включая ми

ков митохондрий, содержащих убиквитиновую

тохондрии [52-55]. Физиологические концен

метку и окисленный остаток метионина, при

трации изатина in vitro ингибируют МАО Б и

введении МФТП был в полтора раза выше (12%)

гуанилатциклазу рецепторов натрийуретичес

по сравнению с контролем (8%) [26]. Последнее

ких пептидов, более высокие (нейропротектор

можно было бы расценить как свидетельство в

ные) концентрации (50-400 мкМ) вызывают

пользу того, что убиквитинирование окислен

апоптоз различных (в том числе злокачествен

ных белков способствует их деградации в протеа

ных) опухолей клеточных линий и влияют на

сомах. Однако сравнение убиквитинированных

экспрессию генов, связанных с апоптозом. При

белков, ассоциированных с митохондриальной

введении in vivo изатин проявляет различные

фракцией мозга мышей, и белков митохондри

поведенческие эффекты: он ослабляет проявле

альной фракции мозга мышей, связывающихся

ния МФТП индуцированного паркинсонизма и

с убиквитиновым рецептором протеасом, субъ

роста опухолей на экспериментальных моделях

единицей Rpn10 [47], не выявили ни одного об

животных [44, 47], а также существенно ограни

щего белка. Это свидетельствует в пользу того,

чивает репертуар белков, связывающихся с

что убиквитинирование митохондриальных

убиквитиновым рецептором протеасом - субъ

белков прямо не связано с их деградацией в про

единицей Rpn10 [44].

теасомах. При введении нейропротектора иза

В контексте функциональных связей убикви

тина количество таких белков, содержащих

тинированных белков митохондрий мозга при

окисленный метионин и убиквитиновую сигна

МФТП индуцированном паркинсонизме и вве

туру, было значительно выше (22%), чем у жи

дении нейропротектора изатина следует отме

вотных других групп (контроль, МФТП и

тить, что такие связи были выявлены только в

МФТП + изатин).

группе животных с МФТП индуцированным

Изатин (индол 2,3 дион)

- эндогенный

паркинсонизмом (рис. 7). Такие взаимосвязи не

окисленный индол, присутствующий в тканях и

были выявлены среди убиквитинированных бел

биологических жидкостях млекопитающих [47].

ков митохондрий мозга других групп животных

Его многочисленные (дозозависимые) биологи

(введение МФТП и изатина или изатина) из за

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1696

БУНЕЕВА и др.

альных белков [26] и (ii) сужает репертуар мито

хондриальных белков, связывающихся с протеа

сомным рецептором убиквитина, Rpn10 [44],

нейропротекторный эффект этого вещества мо

жет быть обусловлен нарушением функцио

нальных связей, свойственных убиквитиниро

ванным белкам при паркинсонизме и переклю

чением протеасомной деградации на селектив

ную аутофагию (митофагию) (рис. 8), которая

включает другой маршрут убиквитинирован

ных белков, не связанный с протеасомами

[57, 58].

Убиквитинирование белков является важ

ным механизмом, который не только обеспечи

вает специфическое мечение для последующей

деградации, но и во многом определяет локали

зацию белков в клетке и регуляцию белок-бел

ковых взаимодействий. Накопленные на сегод

няшний день экспериментальные данные сви

Рис. 7. Функциональные связи между убиквитинирован

детельствуют в пользу того, что убиквитиновый

ными белками митохондрий мозга мышей с МФТП инду

субпротеом митохондрий представлен большим

цированным (созданы по данным, представленным в

числом белков, локализованных как в митохон

статье Buneeva et al. [26]).

дриальных мембранах (внешней и внутренней),

С цветным вариантом рис. 7 можно ознакомиться в элект

межмембранном пространстве, так и в матрик

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

journal/biokhsm/

се. По оценке Lehman et al. [59], у человека на

долю митохондрий приходится до 8% всего пула

убиквитинированных белков. При этом до сих

сильно различающихся паттернов убиквитини

пор остается неясным, где происходит их убик

рованных белков митохондрий. Это позволяет

витинирование [59]. Подавляющее большин

предположить, что нейропротекторный эффект

ство митохондриальных белков синтезируется в

изатина может быть обусловлен в том числе и на

цитозоле и затем поступает, собственно, в мито

рушением функциональных взаимосвязей бел

хондрии. Поэтому нельзя исключить, что убик

ков, подлежащих последующей деградации.

витинирование ряда белков может осуществ

Снижение проявлений токсического

ляться на этапе их импорта в митохондрии при

действия МФТП введением нейропротекторной

помощи внемитохондриальной убиквитин

дозы изатина, по видимому, обусловлено тор

конъюгирующей системы [60, 61]. Правда, био

можением МАО Б [44]. Кроме того, следует от

синтез митохондриальных белков прямо сопря

метить, что изатин может взаимодействовать с

жен с их импортом в эти органеллы, что снижа

компонентами убиквитиновой системы. В ходе

ет вероятность их убиквитинирования в цитозо

проведенного протеомного профилирования

ле [62]. К тому же в прямых экспериментах на

изатин связывающих белков мозга [56] были

клетках HeLa показано убиквитинирование ми

идентифицированы ферменты, участвующие в

тохондриальных белков именно под действием

работе убиквитин конъюгирующей системы

митохондриальной убиквитин конъюгирующей

мозга: E3 убиквитинпротеинлигаза MYCBP2

системы [23]. Однако такого рода исследования

(Q9TPH6), убиквитин карбоксиконцевая гид

до сих пор не проведены на клетках (митохон

ролаза 24 (B1AY13), E3 убиквитинпротеинлига

дриях) мозга.

за MIB2 (Q8R516), E3 убиквитинпротеинлигаза

Исследования роли ферментов убиквитин

HUWE1 (Q7TMY8), вариант 1 убиквитин конъ

конъюгирующей системы и убиквитинирован

югирующего фермента E2 (Q9CZY3) и поли

ных белков митохондрий идут по двум направ

убиквитин (P0CG49). Картирование идентифи

лениям. В контексте митохондрий мозга первое

цированных изатин связывающих белков на из

направление специализируется на выяснении

вестные метаболические пути предполагает их

возможной роли конкретных белков в развитии

участие в пути, связанном с E3 убиквитинпроте

нейродегенеративной патологии. Например,

инлигазой паркином (parkin associated pathway;

сверхэкспрессия митохондриальных Е3 убикви

CH000000947) [56].

тинлигаз (Mul1 и Park) у мушек Drosophila обра

С учетом того, что изатин (i) увеличивает

щала проявления экспериментального паркин

убиквитинирование окисленных митохондри

сонизма, индуцированного введением ротено

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1697

Рис. 8. Предполагаемый механизм нейропротекторного действия изатина на пути метаболической деградации убиквити

нированных белков митохондрий в условиях МФТП индуцированного паркинсонизма. Изатин способствует увеличе

нию убиквитинирования окисленных белков митохондрий, но ограничивает их связывание с убиквитиновым рецептором

26S (Rpn10). Это ограничивает доступ убиквитинированных белков в протеасому и сдвигает поток окисленных и убикви

тинированнх белков митохондрий по пути аутофагии.

С цветным вариантом рис. 8 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

на, и способствовала нормализации дегенера

тем не менее, свидетельствуют об убиквитини

тивных нарушений в нейронах, вызванных этим

ровании большого числа белков митохондрий и

пестицидом; однако уровень убиквитинирова

физическом взаимодействии убиквитинирован

ния митохондриальных белков не был изучен

ных белков друг с другом. Это способствует об

[41]. Второе направление включает исследова

разованию различных белковых сетей (интерак

ния всей совокупности белков митохондрий

томов), некоторые из которых были рассмотре

мозга, подвергающихся убиквитинированию в

ны в данной работе. Важный момент, которому

норме и при моделировании нейродегенератив

до сих пор не уделено должное внимание, - осо

ной патологии, которые и были рассмотрены в

бенности структуры убиквитиновых цепей, ко

данном обзоре более предметно. Помимо разно

торые и определяют судьбу убиквитинирован

образных методов «мокрой» (т.е. эксперимен

ных белков [4] как в контексте деградации, так и

тальной) биологии, это направление активно

при формировании различных интерактомов.

использует также методы «сухой» биологии,

В последнее время становится все более оче

анализирующие накопленные к настоящему

видным, что подавляющее большинство про

времени массивы теоретических и эксперимен

цессов, протекающих в клетках, осуществляется

тальных данных [59]. Хотя результаты таких ис

(и регулируется) различными долго или корот

следований носят вероятностный характер, они,

коживущими белковыми комплексами, а сами

12 БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1698

БУНЕЕВА и др.

внутриклеточные белки образуют белковые се

Финансирование. Анализ данных литературы

ти - интерактомы [63-65], изменяющиеся в от

выполнен при поддержке Российского фонда

вет на действие патологических факторов и фар

фундаментальных исследований (грант № 19

макологических препаратов. С учетом того, что

015 00073), анализ интерактома с использовани

в наших исследованиях новые функциональные

ем программного обеспечения открытого досту

связи убиквитинированных белков митохон

па STRING выполнен в рамках Программы фун

дрий были обнаружены только в группе живот

даментальных научных исследований государ

ных с МФТП индуцированным паркинсониз

ственных академий наук на 2013-2020 годы.

мом, но не при введении изатина [26], есть все

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

основания полагать, что действие нейропротек

сутствии конфликта интересов.

торов (изатина) способствует нарушению бе

Соблюдение этических норм. Эксперименты

лок-белковых взаимодействий, характерных

по анализу интерактома, выполненные при под

для паркинсонизма и сформировавшихся в моз

готовке данной работы, не предполагали ис

ге при участии убиквитинированных белков ми

пользования людей и животных в качестве объ

тохондрий.

ектов исследования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Hershko, A., and Ciechanover, A. (1998) The ubiquitin

dria is accompanied by increased proteolytic digestibility of

system, Annu. Rev. Biochem., 67, 425-479.

MAO, Neurobiology (Bp), 7, 257-261.

Hershko, A., Ciechanover, A., and Varshavsky, A. (2000)

15.

Buneeva, O.A., Medvedeva, M.V., and Medvedev, A.E.

Basic Medical Research Award. The ubiquitin system, Nat.

(2008) Ubiquitin causes selective increase in the sensitivity

Med., 6, 1073-1081.

of rat brain mitochondrial monoamine oxidases to various

Schwartz, A.L., and Ciechanover, A. (2009) Targeting pro

proteases, Biochemistry (Moscow) Supplement Series B:

teins for destruction by the ubiquitin system: implications

Biomedical Chemistry, 2, 101-104.

for human pathobiology, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.,

16.

Buneeva, O.A., Medvedeva, M.V., and Medvedev, A.E.

49, 73-96, doi: 10.1146/annurev.pharmtox.051208.165340.

(2009) The study of ubiquitin dependent increase in

Komander, D., and Rape, M. (2012) The ubiquitin code,

monoamine oxidase sensitivity to proteolysis and specific

Annu. Rev. Biochem., 81, 203-229.

inhibitor, pargyline, Biochemistry (Moscow), Suppl. Ser. B:

Buneeva, O.A., and Medvedev, A.E. (2017) The role of

Biomed. Chem., 3, 145-148.

atypical ubiquitination in cell regulation, Biochemistry

17.

Schwartz, A.L., Trausch, J.S., Ciechanover, A., Slott, J.W.,

(Moscow), Suppl. Ser. B: Biomed. Chem., 11, 16-31.

and Geuze, H. (1992) Immunoelectron microscopic local

Goldknopf, I.L., and Busch,H. (1977) Isopeptide linkage

ization of the ubiquitin activating enzyme El in HepG2

between nonhistone and histone 2A polypeptides of chro

cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5542-5546.

mosomal conjugate protein A24, Proc. Natl. Acad. Sci.

18.

Hormaechea Agulla, D., Kim, Y., Song, M.S., and

USA, 74, 864-868.

Song, S.J. (2018) New insights into the role of E2s in the

Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A.L., and

pathogenesis of diseases: lessons learned from UBE2O, Mol.

Rose, I.A. (1980) Proposed role of ATP in protein break

Cells, 41, 168-178, doi: 10.14348/molcells.2018. 0008.

down: conjugation of proteins with multiple chains of the

19.

Geisler, S., Vollmer, S., Golombek, S., and Kahle, P.J.

polypeptide of ATP dependent proteolysis, Proc. Natl.

(2014) The ubiquitin conjugating enzymes UBE2N,

Acad. Sci. USA, 77, 1783-1786.

UBE2L3 and UBE2D2/3 are essential for Parkin depen

Zhuang, Z., and McCauley, R. (1989) Ubiquitin is involved in

dent mitophagy, J. Cell Sci.,

127,

3280-3293,

the in vitro insertion of monoamine oxidase B into mitochon

doi: 10.1242/jcs.146035.

drial outer membranes, J. Biol. Chem., 264, 14594-14596.

20.

Patila, H., Yoon, D., Bhowmick, R., Cai, I., Cho, K.I.,

Zhuang, Z., Marks, B., and McCauley, R. (1992) The

and Ferreira, P.A. (2019) Impairments in age dependent

insertion of monoamine oxidase A into the outer membrane

ubiquitin proteostasis and structural integrity of selective

of rat liver mitochondria, J. Biol. Chem., 267, 591-596.

neurons by uncoupling Ran GTPase from the Ran binding

10.

Raboy, B., Parag, H.A., and Kulka, R.G.

(1986)

domain 3 of Ranbp2 and identification of novel mitochon

Conjugation of [¹²⁵I]ubiquitin to cellular proteins in per

drial isoforms of ubiquitin conjugating enzyme E2I (ubc9)

meabilized mammalian cells: comparison of mitotic and

and Ranbp2, Small GTPases, 10, 146-161.

interphase cells, EMBO J., 5, 863-869.

21.

Lehmann, G., Ziv, T., Braten, O., Admon, A., Udasin, R.G.,

11.

Magnani, M., Serafini, G., Antonelli, A., Malatesta, M.,

and Ciechanover, A. (2016) Ubiquitination of specific

and Gazzanelli, G. (1991) Evidence for a particulate loca

mitochondrial matrix proteins, Biochem. Biophys. Res.

tion of ubiquitin conjugates and ubiquitin cojugating

Commun., 475, 13-18, doi: 10.1016/j.bbrc.2016.04.150.

enzymes in rabbit brain, J. Biol. Chem., 266, 21018-21024.

22.

Jeon, H.B., Choi, E.S., Yoon, J.H., Hwang, J.H., Chang, J.W.,

12.

Hayashi, T., Takada, K., and Matsuda, M.

(1992)

Lee, E.K., Choi, H.W., Park, Z. Y., and Yoo, Y.J. (2007) A pro

Subcellular distribution of ubiquitin protein conjugates in

teomics approach to identify the ubiquitinated proteins in

the hippocampus following transient ischemia. J. Neurosci.

mouse heart, Biochem. Biophys. Res. Commun., 357, 731-736.

Res., 31, 561-564, doi: 10.1002/jnr.490310321.

23.

Lavie, J., De Belvalet, H., Sonon, S., Ion, A.M., Dumon,

13.

Medvedev, A.E., Kirkel, A.Z., Kamyshanskaya, N.S., and

E., Melser, S., Lacombe, D., Dupuy, J.W., Lalou, C., and

Gorkin, V.Z. (1993) Lipid peroxidation affects catalytic prop

Benard, G. (2018) Ubiquitin dependent degradation of

erties of rat liver mitochondrial monoamine oxidases and their

mitochondrial proteins regulates energy metabolism, Cell

sensitivity to proteolysis, Int. J. Biochem., 25, 1791-1799.

Rep., 23, 2852-2863, doi: 10.1016/j.celrep.2018.05.013.

14.

Buneeva, O.A., Medvedeva, M.V., and Medvedev, A.E.

24.

Buneeva, O., Medvedeva, M., Kopylov, A., Zgoda, V., and

(1999) Incorporation of ubiquitin into rat brain mitochon

Medvedev, A. (2012) Use of biotinylated ubiquitin for

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

УБИКВИТИНОВЫЙ СУБПРОТЕОМ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА

1699

analysis of rat brain mitochondrial proteome and interac

ease, Front. Cell Dev. Biol., 5, 110, doi: 10.3389/fcell.2017.

tome, Int. J. Mol. Sci., 3, 11593-11609, doi: 10.3390/

00110.

ijms130911593.

41.

Doktor, B., Damulewicz, M., and Pyza, E.

(2019)

25.

Бунеева О.А., Гнеденко О.В., Медведева М.В., Иванов А.С.,

Overexpression of mitochondrial ligases reverses rotenone

Медведев А.Е. (2014) Использование иммобилизован

induced effects in a Drosophila model of Parkinson’s disease,

ного убиквитина для биосенсорного анализа убикви

Front. Neurosci., 13, 94, doi: 10.3389/fnins.2019.00094.

тинового субинтерактома митохондрий, Биомедицин+

42.

Covill Cooke, C., Howden, J.H., Birsa, N., and Kittler, J.T.

ская химия, 60, 615-622.

(2018) Ubiquitination at the mitochondria in neuronal

26.

Buneeva, O., Kopylov, A., Kapitsa, I., Ivanova, E., Zgoda, V.,

health and disease, Neurochem. Int.,

117,

55-64,

and Medvedev, A. (2018) The effect of neurotoxin MPTP

doi: 10.1016/j.neuint.2017.07.003.

and neuroprotector isatin on the profile of ubiquitinated

43.

Buneeva, O.A., and Medvedev, A.E. (2011) Mitochondrial

brain

mitochondrial proteins, Cells,

91,

disfunction in Parkinson’s disease, Biochemistry (Moscow),

doi: 10.3390/cells7080091.

Suppl. Ser. B: Biomed. Chem., 5, 313-336.

27.

Bouter, Y., Kacprowski, T., Weissmann, R., Dietrich, K.,

44.

Medvedev, A.E., Buneeva, O.A., Kopylov, A.T.,

Borgers, H., Brauß, A., Sperling, C., Wirths, O., Albrecht, M.,

Tikhonova, O.V., Medvedeva, M.V., Nerobkova, L.N.,

Jensen, L.R., Kuss, A.W., and Bayer, T.A.

(2014)

Kapitsa, I.G., and Zgoda, V.G. (2017) Brain mitochondri

Deciphering the molecular profile of plaques, memory

al subproteome of Rpn10 binding proteins and its changes

decline and neuron loss in two mouse models for

induced by the neurotoxin MPTP and the neuroprotector

Alzheimer’s disease by deep sequencing, Front. Aging

isatin, Biochemistry (Moscow), 82, 330-339.

Neurosci., 6, 75, doi: 10.3389/fnagi.2014.00075.

45.

Lucking, C.B., Durr, A., Bonifati, V., Vaughan, J., De

28.

He, F., and DiMario, P.J. (2011) Drosophila delta 1

Michele, G., Gasser, T., Harhangi, B.S., Meco, G.,

pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase (P5CDh) is

Denefle, P., Wood, N.W., Agid, Y., and Brice, A.; French

required for proline breakdown and mitochondrial integri

Parkinson’s Disease Genetics Study Group; European

ty establishing a fly model for human type II hyperproline

Consortium on Genetic Susceptibility in Parkinson’s

mia, Mitochondrion, 11, 397-404.

Disease

(2000) Association between early onset

29.

Wagner, S.A., Beli, P., Weinert, B.T., Nielsen, M.L., Cox, J.,

Parkinson’s disease and mutations in the Parkin gene, N.

Mann, M., and Choudhary, C. (2011) A proteome wide,

Engl. J. Med., 342, 1560-1567.

quantitative survey of in vivo ubiquitylation sites reveals

46.

Key, J., Mueller, A.K., Gispert, S., Matschke, L., Wittig, I.,

widespread regulatory roles, Mol. Cell. Proteomics, 10,

Corti, O., Munch, C., Decher, N., and Auburger, G.

M111.013284, doi: 10.1074/mcp.M111.013284.

(2019) Ubiquitylome profiling of Parkin null brain reveals

30.

Wagner, S.A., Beli, P., Weinert, B.T., Scholz, C.,

dysregulation of calcium homeostasis factors ATP1A2,

Kelstrup, C.D., Young, C., Nielsen, M.L., Olsen, J.V.,

Hippocalcin and GNA11, reflected by altered firing of

Brakebusch, C., and Choudhary, C. (2012) Proteomic

noradrenergic neurons, Neurobiol. Dis., 127, 114-130.

analyses reveal divergent ubiquitylation site patterns in

47.

Medvedev, A., Buneeva, O., Gnedenko, O., Ershov, P., and

murine tissues, Mol. Cell. Proteomics, 11, 1578-1585.

Ivanov, A. (2018) Isatin, an endogenous non peptide bio

31.

Lee, J.Y., Song, J., Kwon, K., Jang, S., Kim, C., Baek, K.,

factor: a review of its molecular targets, mechanisms of

Kim, J., and Park, C. (2012) Human DJ 1 and its

actions and their biomedical implications, Biofactors, 44,

homologs are novel glyoxalases, Hum. Mol. Genet., 21,

95-108, doi: 10.1002/biof.1408.

3215-3225, doi: 10.1093/hmg/dds155.

48.

Maret, G., Testa, B., Jenner, P., el Tayar, N., and Carrupt, P.A.

32.

Ariga, H., Takahashi Niki, K., Kato, I., Maita, H., Niki, T.,

(1990) The MPTP story: MAO activates tetrahydropyri

and Iguchi Ariga, S.M.M. (2013) Neuroprotective func

dine derivatives to toxins causing parkinsonism, Drug

tion of DJ 1 in Parkinson’s disease, Oxid. Med. Cell.

Metab. Rev., 22, 291-332.

Longev., 2013, 683920, doi: 10.1155/2013/683920.

49.

Zhou, Y., Zhao, Z.Q., and Xie, J.X. (2001) Effect of isatin

33.

Felts, S.J., Owen, B.A.L., Nguyen, P.M., Trepel, J.,

on rotational behavior and DA levels in caudate putamen

Donner, D.B., and Toft, D.O. (2000) The HSP90 related

in Parkinsonian rats, Brain Res., 917, 127-132.

protein TRAP1 is a mitochondrial protein with distinct

50.

Hamaue, N., Minami, M., Terado, M., Hirafuji, M.,

functional properties, J. Biol. Chem., 275, 3305-3312.

Endo, T., Machida, M., Hiroshige, T., Ogata, A., Tashiro, K.,

34.

Zuehlke, A.D., Beebe, K., Neckers, L., and Prince, T.

Saito, H., and Parvez, S.H. (2004) Comparative study of

(2015) Regulation and function of the human HSP90AA1

the effects of isatin, an endogenous MAO inhibitor, and

gene, Gene, 570, 8-16.

selegiline on bradykinesia and dopamine levels in a rat

35.

Kundrat, L., and Regan, L. (2010) Identification of

model of Parkinson’s disease induced by the Japanese

residues on Hsp70 and Hsp90 ubiquitinated by the cochap

encephalitis virus, Neurotoxicology, 25, 205-213.

erone CHIP, J. Mol. Biol., 395, 587-594.

51.

Melamed, E., and Youdim, M.B.H. (1985) Prevention of

36.

Flynn, J.M., and Melov, S. (2013) SOD2 in mitochondrial

dopaminergic toxicity of MPTP in mice by phenylethyl

dysfunction and neurodegeneration, Free Radic. Biol.

amine, a specific substrate of type B monoamine oxidase,

Med.,

62,

4-12, doi:

10.1016/j.freeradbiomed.2013.

Br. J. Pharmacol., 86, 529-531.

05.027.

52.

Crumeyrolle Arias, M., Buneeva, O., Zgoda, V., Kopylov, A.,

37.

Scudamore, O., and Ciossek, T. (2018) Increased oxidative

Cardona, A., Tournaire, M.C., Pozdnev, V., Glover, V., and

stress exacerbates α synuclein aggregation in vivo, J.

Medvedev, A. (2009) Isatin binding proteins in rat brain: in

Neuropathol.

Exp.

Neurol.,

77,

443-453,

situ imaging, quantitative characterization of specific

doi: 10.1093/jnen/nly024.

[3H]isatin binding, and proteomic profiling, J. Neurosci.

38.

Cookson, M.R. (2005) The biochemistry of Parkinson’s

Res., 87, 2763-2772.

disease, Annu. Rev. Biochem., 74, 9-52.

53.

Buneeva, O., Gnedenko, O., Zgoda, V., Kopylov, A.,

39.

Haelterman, N.A., Yoon, W.H., Sandova, H., Jaiswa, M.,

Glover, V., Ivanov, A., Medvedev, A., and Archakov, A.

Shulman, J.M., and Bellen, H.J. (2014) A mitocentric view

(2010) Isatin binding proteins of rat and mouse brain: pro

of Parkinson’s disease, Annu. Rev. Neurosci., 37, 137-159,

teomic identification and optical biosensor validation,

doi: 10.1146/annurev neuro 071013 014317.

Proteomics, 10, 23-37.

40.

Plotegher, N., and Duchen, M.R. (2017) Crosstalk

54.

Иванов Ю.Д., Панова Н.Г., Гнеденко О.В., Бунеева

between lysosomes and mitochondria in Parkinson’s dis

О.А., Медведев А.Е., Арчаков А.И. (2002) Исследова

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

12*

1700

БУНЕЕВА и др.

ние тканевого и субклеточного распределения иза

ubiquitin-proteasome system, Open Biol., 7, 170007,

тин связывающих белков при помощи оптического

doi: 10.1098/rsob.170007.

биосенсора, Вопросы медицинской химии, 48, 73-83.

61. Taylor, E.B., Rutter, J. (2011) Mitochondrial quality con

55.

Medvedev, A., Buneeva, O., Gnedenko, O., Fedchenko, V.,

trol by the ubiquitin-proteasome system, Biochem. Soc.

Medvedeva, M., Ivanov, Y., Glover, V., and Sandler, M. (2006)

Trans., 39, 1509-1513, doi: 10.1042/BST0391509.

Isatin interaction with glyceraldehyde 3 phosphate dehydro

62. Lesnik, C., Cohen, Y., Atir Lande, A., Schuldiner, M.,

genase, a putative target of neuroprotective drugs: partial ago

Arava, Y. (2014) OM14 is a mitochondrial receptor for

nism with deprenyl, J. Neural Transm. Suppl., 71, 97-103.

cytosolic ribosomes that supports co translational import

56.

Buneeva, O.A., Kopylov, A.T., Tikhonova, O.V., Zgoda, V.G.,

into mitochondria, Nat. Commun.,

5711,

Medvedev, A.E., and Archakov, A.I. (2012) Effect of affini

doi: 10.1038/ncomms6711.

ty sorbent on proteomic profiling of isatin binding proteins

63. Ivanov, A.S., Zgoda, V.G., and Archakov, A.I.

(2011)

of mouse brain, Biochemistry (Moscow), 77, 1326-1338.

Technologies of protein interactomics: a review, Russ. J.

57.

Shaid, S., Brandts, C.H., Serve, H., and Dikic, I. (2013)

Bioorg. Chem., 37, 4-16.

Ubiquitination and selective autophagy, Cell Death Differ.,

64. Ivanov, A.S., Ershov, P.V., Molnar, A.A., Mezentsev, Y.V.,

20, 21-30, doi: 10.1038/cdd.2012.72.

Kaluzhskiy, L.A., Yablokov, E.O., Florinskaya, A.V.,

58.

Ji, C.H., and Kwon, Y.T. (2017) Crosstalk and interplay

Gnedenko, O.V., Medvedev A.E., Kozin, S.A.,

between the ubiquitin proteasome system and autophagy,

Mitkevichm, V.A., Makarov, A.A., Gilep, A.A.,

Mol. Cells,

40,

441-449, doi:

10.14348/mol

Lushchik, A.Ya., Gaidukevich, I.V., and Usanov, S.A.

cells.2017.0115.

(2016) Direct molecular fishing in molecular partners

59.

Lehmann, G., Udasin, R.G., and Ciechanover, A. (2016) On

investigation in protein-protein and protein-peptide

the linkage between the ubiquitin proteasome system and the

interactions, Russ. J. Bioorg. Chem., 42, 18-27.

mitochondria, Biochem. Biophys. Res. Commun., 473, 80-86.

65. Luck, K., Sheynkman, G.M., Zhang, I., and Vidal, M.

60.

Bragoszewski, P., Turek, M., and Chacinska, A. (2017)

(2017) Proteome scale human interactomics, Trends

Control of mitochondrial biogenesis and function by the

Biochem. Sci., 42, 342-354, doi: 10.1016/j.tibs.2017.02.006.

UBIQUITIN SUBPROTEOME OF BRAIN MITOCHONDRIA

AND ITS CHANGES INDUCED BY EXPERIMENTAL PARKINSONISM

AND THE NEUROPROTECTOR ACTION*

Review

O. A. Buneeva¹**, M. V. Medvedeva²**^,***, A. T. Kopylov¹, and A. E. Medvedev¹

¹ Institute of Biomedical Chemistry, Department of Proteomic Research, 119121 Moscow, Russia

² Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 119991 Moscow, Russia; E+mail: marmed64@yandex.ru

Received May 23, 2019

Revised July 2, 2019

Accepted July 11, 2019

Own and literature data on the ubiquitination of brain mitochondrial proteins and its changes during the development

of experimental parkinsonism and administration of the neuroprotector isatin (indole 2,3 dione) have been summa

rized. Special attention has been paid to the mitochondrial ubiquitin conjugating system and localization of ubiqui

tinated proteins in mitochondria. Incubation of brain mitochondrial fraction in vitro with biotinylated ubiquitin

resulted in incorporation of biotinylated ubiquitin both in mitochondrial and mitochondria associated proteins.

According to the interactome analysis, the identified non ubiquitinated proteins are able to form tight complexes with

ubiquitinated proteins or their partners and components of mitochondrial membranes. Studies of endogenous ubiq

uitination in the total brain mitochondrial fraction of C57Bl mice, performed in different laboratories, have shown

that mitochondrial ubiquitinated proteins represented about 30% of all ubiquitinated proteins in brain. However, sub

proteomes of brain mitochondrial ubiquitinated proteins significantly differed both in their composition and involve

ment of identified ubiquitinated proteins in the biological processes listed in the Gene Ontology database.

Development in C57Bl mice of experimental parkinsonism after single administration of 1 methyl 4 phenyl 1,2,3,6

tetrahydropyridine (MPTP) caused (i) a decrease in the total number of brain mitochondrial ubiquitinated proteins

and (ii) an increase in the number of oxidized mitochondrial proteins containing the ubiquitin signature (K ε GG).

A comparison of the ubiquitinated proteins associated with the mouse brain mitochondrial fraction and the mouse

brain mitochondrial proteins bound to the proteasome ubiquitin receptor, the Rpn10a subunit, did not reveal any

common proteins. This suggests that ubiquitination of brain mitochondrial proteins is not directly related to their

degradation in proteasomes. Proteomic profiling of brain isatin binding proteins revealed enzymes involved in the

ubiquitin conjugating system functioning. Mapping the identified isatin binding proteins to known metabolic path

ways indicates their participation in the parkin (E3 ubiquitin ligase) associated pathway (CH000000947). As for an

interaction of brain mitochondrial ubiquitinated proteins, functional links were found only in a group of animals with

MPTP induced parkinsonism, but not with the administration of MPTP and isatin or only isatin. This suggests that

the neuroprotective effect of isatin may be associated with impaired functional relationships of proteins that are tar

geted to subsequent degradation.

Keywords: protein ubiquitination, brain mitochondria, experimental Parkinsonism, isatin neuroprotector, subpro

teome, interactome

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019