БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 11, с. 1718 - 1732

УДК 577.151.63

ОСОБЕННОСТИ УСТРОЙСТВА И МЕХАНИЗМА КАТАЛИЗА

ДВУХ СЕМЕЙСТВ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ:

ГЕМ МЕДНЫХ И bd ТИПА

Обзор

В.Б. Борисов*^,**, С.А. Силецкий

НИИ физико химической биологии им. А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия;

электронная почта: bor@belozersky.msu.ru, siletsky@belozersky.msu.ru

Поступила в редакцию 03.06.2019

После доработки 09.07.2019

Принята к публикации 10.07.2019

Терминальные оксидазы аэробных дыхательных цепей организмов катализируют перенос электронов с ды

хательного субстрата, цитохрома с или хинола, на О₂ с образованием 2Н₂О. Известно два семейства этих ок

сидоредуктаз, интегрированных в мембрану: семейство гем медных оксидаз и семейство оксидаз типа bd

(цитохромов bd), найденных только у прокариот. Катализируемая этими ферментами окислительно восста

новительная реакция сопряжена с генерацией протон движущей силы, которая используется клеткой для

синтеза АТФ и совершения иной полезной работы. Благодаря наличию протонного насоса гем медные ок

сидазы создают мембранный потенциал с большей энергетической эффективностью, чем цитохромы bd.

Последние, однако, играют важную физиологическую роль, позволяя бактериям, в том числе патогенным,

выживать и размножаться в неблагоприятных условиях окружающей среды. В обзоре рассматриваются осо

бенности устройства и молекулярных механизмов функционирования терминальных окидаз из этих двух

семейств в свете полученных за последнее время экспериментальных данных.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дыхательная цепь, терминальная оксидаза, цитохромоксидаза, цитохром bd, гем, ка

талитический цикл, кислородные интермедиаты, мембранный потенциал, протонный насос.

DOI: 10.1134/S0320972519110137

Кислород зависимая дыхательная цепь пе

ные оксидазы катализируют восстановление

реноса электронов митохондрий животных

молекулярного кислорода до воды дыхательным

представлена мембранно связанными фермен

субстратом: цитохромом с или хинолом. Фер

тами окислительного фосфорилирования:

менты делят на три основные группы: суперсе

NADH:хинон оксидоредуктазой, bc₁ комплек

мейство гем/Cu содержащих оксидаз, семей

сом и терминальной оксидазой. Эти белковые

ство хинолоксидаз типа bd и семейство альтер

комплексы играют центральную роль в энерге

нативных оксидаз (рис. 1). Последние в этом об

тическом метаболизме клетки. На каждом из

зоре не рассматриваются.

этих пунктов сопряжения запасается энергия в

виде протон движущей силы, которая затем

утилизируется ATP синтазой F_О F₁ дыхательной

ГЕМ МЕДНЫЕ ТЕРМИНАЛЬНЫЕ

цепи для синтеза ATP. В отличие от митохон

ОКСИДАЗЫ

дрий животных дыхательные цепи бактерий

обычно имеют разветвленный характер. Их на

К суперсемейству гем медных оксидаз

чальный и конечный участок может быть предс

(ГМО) принадлежат цитохромоксидазы (ЦО)

тавлен более чем одним ферментом, а присут

митохондрий высших и низших эукариот, ГМО

ствие bc₁ комплекса необязательно. Терминаль

большинства аэробных прокариот, а также

структурно родственные NO редуктазы [1]. От

личительной особенностью ферментов суперсе

Принятые сокращения: ГМО - гем медная оксида

за; ЦО - цитохромоксидаза; BNC - биядерный центр;

мейства является наличие каталитического би

PLS - протон загрузочный сайт.

ядерного центра (BNC), который состоит из ио

* Адресат для корреспонденции.

на железа гемовой группы (в NO редуктазах -

** Автор является выпускником кафедры биохимии биоло

иона негемового железа) и иона меди, близко

гического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

расположенных.

1718

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1719

ГМО катализируют перенос электронов от

хинолов или цитохромов на кислород с образо

ванием воды сопряженно с генерацией протон

движущей силы [2]. В отличие от оксидаз типа

bd ГМО образуют протон движущую силу как

за счет переноса электронов и протонов в ката

литический центр с разных сторон мембраны,

так и благодаря уникальной способности к ре

докс сопряженному направленному перекачи

ванию протонов через мембрану [3]. Структурно

сходные с ГМО NO редуктазы восстанавливают

NO в N₂O и используются рядом патогенных

бактерий в ходе денитрификации в микро и

анаэробных условиях, реализующихся во мно

гих тканях хозяина [4].

Рис. 1. Терминальные оксидазы аэробных дыхательных це

пей организмов. Ферменты включают в свой состав супер

Цитохромоксидаза митохондрий млекопи

семейство гем медных оксидаз, семейство оксидаз типа bd

тающих содержит 13 субъединиц, из которых

(цитохромов bd), а также семейство альтернативных окси

три наибольшие субъединицы кодируются ми

даз. В зависимости от особенностей строения внутрибелко

тохондриальным геномом. Они образуют ката

вых протон проводящих путей, гем медные оксидазы под

разделяются на семейства A, B и C. Цитохромы bd делятся

литическое ядро фермента (рис. 2) и гомологич

на подсемейства L и S на основании размера «Q петли».

ны трем основным субъединицам, встречаю

Альтернативные оксидазы, которые в этом обзоре не рас

щимся в большинстве типичных прокариоти

сматриваются, не являются интегральными мембранными

ческих цитохромоксидаз семейства А. В первой

ферментами и не генерируют протон движущую силу

субъединице расположены 3 редокс центра:

низкоспиновый гем а и биядерный кислород

редуктазный каталитический центр (BNC), сос

ев разрешены структуры восстановленной фор

тоящий из близкорасположенных иона железа

мы фермента, комплекса фермента с CO и N_3-,

высокоспинового гема a₃ и иона меди (Cu_B)

одной из мутантных форм по ключевому остатку

(рис. 2). В прокариотических ГМО гемы а и а₃

E286Q, а также дыхательного суперкомплекса

могут заменяться гемами b , o и с типа. Гемы с

«респирасомы», в который объединены отдель

типа могут служить также в качестве дополни

ные комплексы дыхательной цепи митоходрий,

тельных редокс центров, к примеру, в caa₃ или

включая первый, третий и четвертый (другое

cbb₃ оксидазах.

название ЦО) в стехиометрии СI(CIII)₂C(IV)

Важнейшим признаком, позволяющим сис

[10]. В то же время с помощью двумерной элект

тематизировать ГМО и NO редуктазы, является

ронной кристаллографии показано, что моно

устройство внутрибелковых протон проводя

мерная форма ЦО млекопитающих функцио

щих путей («каналов»), которые соединяют ка

нально активна и не является артефактом выде

талитический центр с цитоплазматической сто

ления фермента из мембраны митохондрий.

роной мембраны, обеспечивая проведение

Несмотря на выяснение общей топографии, де

субстратных протонов, необходимых для обра

тальная картина элементарных процессов пре

зования воды, а также протонов, перекачивае

вращения атомов кислорода в BNC и сопряжен

мых через мембрану. Используя различие в строе

ного переноса зарядов на молекулярном уровне

ниях этих путей, среди ГМО выделяют семей

только начинает вырисовываться [11, 12].

ства A, B и C [5] (рис. 1).

Характерным признаком ЦО семейства А

В результате использования рентгенострук

является наличие двух протон проводящих пу

турного анализа установлена трехмерная крис

тей (D и К каналы) в мембране, начинающих

таллическая структура типичных представителей

ся со стороны цитоплазмы и имеющих высоко

семейства А ГМО с разрешением, достигающим

консервативные протон обменивающие группы

в ряде случаев 1,8 Å. Это ЦО из митохондрий

[13]. Согласно полученным данным [13, 14], че

сердечной мышцы быка [6], бактериальные ЦО

рез эти пути происходит сопряженный перенос

aa₃ типа из Paracoccus denitrificans

[7] и

протонов со стороны цитоплазмы через мембра

Rhodobacter sphaeroides [8] и хинолоксидаза bo₃ из

ну в каталитический центр (т.н. субстратные

Escherichia coli [9]. Несмотря на высокое разре

протоны или протоны субстрата) и в периплаз

шение, природа лиганда активного центра в за

матическое пространство (т.н. перекачивае

кристаллизованном ферменте (перекись, супер

мые»протоны или протоны, переносимые через

оксид, ион хлора или гидроксил анион) до сих

мембрану) (рис. 2). Исходя из модели, сформу

пор остается предметом дискуссий. В ряде случа

лированной в ходе исследований аа₃ оксидаз из

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1720

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

тивного центра на молекулу O₂ одновременно

поступают четыре электрона и протон. Три

электрона приходят в результате окисления ио

на Fe²⁺ гема а₃ до оксоферрильного состояния

Fe⁴⁺=O2- и Cu₊, окисляющийся до Cu₂₊. Четвер

тый электрон и протон поступают от близко

расположенного консервативного остатка тиро

зина Y288, образующего в ходе посттрансляци

онной модификации ковалентную связь с од

ним из гистидиновых лигандов Cu_B (ссылки в

статье Siletsky [2]).

Две электронные вакансии, возникшие в ка

талитическом центре ЦО, заполняются в ходе

переноса от цитохрома с 3 го и 4 го электронов.

Перенос 3 го электрона от цитохрома c на оста

ток тирозина Y288 приводит к образованию в

каталитическом цикле ЦО состояния F биядер

ного центра (рис. 3). Перенос 4 го электрона от

Рис. 2. Схема устройства цитохромоксидазы. Показаны 3

главные субъединицы: субъединица I, несущая 3 редокс

цитохрома с на гем а₃ восстанавливает оксофер

центра: гемы a, a₃ и медь Cu_B, субъединица II, несущая 4 й

рильное состояние гема а₃ в окисленное состоя

редокс центр Cu_A, и субъединица III. Показаны два внут

рибелковых протон проводящих пути: D и K каналы.

ние O_H. В отсутствие доноров электронов окис

Оба пути ведут из отрицательно заряженной цитоплазма

ленное «неотрелаксированное» состояние O_H в

тической стороны мембраны в направлении к каталити

секундной временной шкале спонтанно превра

ческому биядерному центру (BNC). Показан выходной

щается в окисленное стабильное состояние O.

протон проводящий путь.

Состояния O и O_H отличаются между собой

С цветным вариантом рис. 2 можно ознакомиться в элект

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

сродством к электрону соответствующих ре

journal/biokhsm/

докс центров фермента, а также способностью

к трансмембранной перекачке протонов

P. denitrificans и R. sphaeroides, К канал служит

[15-20]. Вопрос о структурных отличиях между

для проведения части субстратных протонов в

этими двумя состояниями остается открытым и,

каталитическом цикле, тогда как перекачивае

как полагают, может быть связан с лигандной

мые через мембрану протоны и оставшиеся

сферой Cu_B [21].

субстратные протоны переносятся через D ка

С помощью специфической обработки пере

нал (рис. 3).

кисью водорода или окисью углерода цитохром

Каталитический цикл цитохромоксидазы

оксидаза может быть зафиксирована в ряде

состоит из двух полуреакций (восстановитель

состояний BNC, соответствующих частичному

ной и окислительной), каждая из которых вклю

восстановлению кислорода (F и/или P). Ис

чает в себя два одноэлектронных перехода. Вос

пользуя прямой электрометрический метод,

становительная фаза в только что окисленном

традиционно применяемый для исследования

«неотрелаксированном» ферменте включает в

стадий переноса зарядов в светозависимых бел

себя последовательный перенос двух электронов

ках генераторах ΔμH+ [22-25], эти подходы

через входные редокс центры в каталитический

позволяют изучать с временным разрешением

центр на гем а₃ и Cu_B (переходы O_H → E_H и E_H → R

отдельные одноэлектронные стадии каталити

соответственно, рис. 3). В результате BNC вос

ческого цикла цитохромоксидазы в ответ на вве

станавливается из полностью окисленного сос

дение электрона от фотоактивируемого ком

тояния О_H в восстановленное состояние (R) и

плекса рутения (перенос в каталитическом цик

приобретает способность связывать молекуляр

ле 1 го [15, 17-20, 26, 27], 3 го [15, 28, 29] и 4 го

ный кислород (ссылки в статье Siletsky [2]).

[13, 14, 30-32] электронов соответственно).

Окислительная фаза начинается связывани

В экспериментах с микросекундным времен

ем молекулы кислорода с центральным ионом

ным разрешением были получены прямые ука

железа высокоспинового гема а₃ восстановлен

зания на то, что каждый из 4 х одноэлектронных

ного биядерного центра. В результате образуется

переходов в каталитическом цикле ЦО семей

первичный двухатомный кислородный аддукт

ства А сопряжен с перекачиванием одного про

(состояние А, не показано на рис. 3), представ

тона через мембрану [14, 15, 33, 34]. Так, при вве

ляющий собой смесь состояний: Fe²⁺ O₂ и Fe³⁺ O_–.

дении электрона в состояние F (переход F→O_H)

На следующей стадии разрывается O-O связь и

цитохромоксидазы семейства А были разрешены

образуется соединение P (рис. 3), для чего из ак

3 основные компоненты генерации мембранно

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1721

го потенциала [26]. «Быстрая» микросекундная

лярного механизма сопряженного перекачива

фаза отражала перенос электрона от Cu_A к гему

ния протонов в прокариотических ГМО семей

а, в то время как «средняя» и «медленная» мил

ства А остаются нерешенными. Точная локали

лисекундные фазы - электрогенный перенос

зация PLS неизвестна. Согласно одним предс

протонов, сопряженный с переносом электрона

тавлениям, в качестве PLS рассматривается A

от гема а в BNC. Исходя из сравнения с ампли

пропионат гема а₃ и/или один из гистидиновых

тудой электрогенного переноса электрона от Cu_A

лигандов Cu_B [35]. Согласно другим, PLS может

к гему а, удалось прямо оценить валовый пере

быть локализован в гидрофильном домене, рас

нос протонов в электрогенных протонных фазах,

положенном над гемами, ближе к гему a [36],

как перенос одного протона через всю диэлект

либо роль PLS может выполняться кластером

рическую толщину мембраны и перенос одного

протон обменивающих групп, включающим

субстратного протона из внутренней водной фа

пропионаты A и D гема а₃ и расположенные

зы в BNC (рис. 3) [14, 32].

вблизи остатки (D52 и K171, как в случае ЦО

Электрогенные фазы значительно отличают

митохондрий) [37]. Наконец, высказано пред

ся между собой эффектом изотопного замеще

положение о том, что в качестве PLS может слу

ния, что позволило идентифицировать их ана

жить расположенный над BNC редокс актив

логи при исследовании мутантных форм и соот

ный остаток триптофана [38].

нести их с переносом протонов разного типа

Неизвестно, каким образом обеспечивается

[14]. «Средняя» фаза отсутствовала в несопря

направленный перенос перекачиваемого прото

женном мутанте с заменой в D канале (N139D),

на от внутреннего донора протонов E286 к PLS и

сохраняющем кислород редуктазную актив

субстратного протона к BNС, а также, каким об

ность без перекачивания протонов через мемб

разом перекачиваемый протон избегает участия

рану. Это указывает на связь «средней» фазы с

в каталитической химии формирования моле

переносом перекачиваемого протона и на то,

кул воды. Можно выделить два принципиально

что перекачиваемый протон перемещается

отличающихся гипотетических механизма. Сог

раньше субстратного

[14]. Соответственно,

ласно первой модели, направленный перенос

«медленная» фаза сохранялась в мутанте и была

перекачиваемого и субстратного протонов от

интерпретирована как перенос субстратного

E286 к PLS и от E286 к BNC соответственно мо

протона в BNC [14]. «Медленная» фаза замедля

жет обеспечиваться посредством модулирова

лась в присутствии ионов цинка (ингибитора

протонного транспорта), добавленных снаружи

к протеолипосомам c ЦО [31], что указывает на

вклад в «медленную» фазу высвобождения пере

качиваемого протона на внешнюю сторону

мембраны. При использовании мутации N139L,

перекрывающей вход в D канал, была выявлена

электрогенная стадия переноса протона от внут

реннего донора E286 в верхней части D канала в

каталитический центр BNC и установлено

электрогенное расстояние между ними [32].

Согласно имеющимся данным, была сфор

мулирована схема организации перекачки про

тона в ходе одноэлектронного перехода F → O в

прокариотических ГМО семейства А

[19].

Транслокация протонов начинается с переноса

перекачиваемого протона от остатка E286 в «ло

вушку», так называемый протон загрузочный

сайт (PLS), расположенный выше BNC (рис. 2).

Субстратный протон переносится также от ос

татка E286 непосредственно в BNC. При этом

E286 репротонируется 2× через D канал. Пере

нос электрона от гема а в BNC и репротониро

вание E286 приводят к тому, что перекачивае

Рис. 3. Каталитический цикл цитохромоксидазы. Соеди

нения в квадратах, нарисованных сплошными линиями

мый протон высвобождается из PLS на внеш

(P, F, O_H, E_H, R), - каталитические интермедиаты фермен

нюю сторону мембраны (рис. 2).

та. Структура соединений обсуждается в тексте обзора.

Несмотря на относительную простоту пред

Протоны, транспортируемые через D и К каналы, обоз

лагаемой модели, ключевые проблемы молеку

начены соответствующими индексами

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1722

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

ния ориентации цепочек воды редокс состоя

Гем медные оксидазы семейств B и С встре

нием гема а и BNC, без заметных изменений

чаются только в прокариотах, они близки между

конформации ЦО [12]. Согласно другой модели,

собой филогенетически и сходны друг с другом

ключевое значение могут играть конформаци

и NO редуктазами по первичной последова

онные изменения в области остатка E286 и/или

тельности и целому ряду структурно функцио

PLS, которые приводят к периодическим изме

нальных особенностей, в то же время значитель

нениям сродства к протону и контакта дан

но отличаясь от оксидаз семейства А. Нужно от

ной(ых) групп(ы) с входным и выходным про

метить их важное биомедицинское значение.

тон транслоцирующим путем [39].

Так, значительное число патогенных микроор

Как было сказано выше, ЦО митохондрий

ганизмов использует в качестве ЦО представи

содержат в дополнение к 3 м главным субъеди

телей семейства С (cbb₃ оксидазы). Среди них

ницам большое количество дополнительных

возбудители таких болезней, как нозокомиаль

субъединиц (до 10), кодируемых ядерным гено

ные инфекции (Pseudomonas aeruginosa), гонорея

мом. Набор этих субъединиц характеризуется

(Neisseria gonorrhoeae), менингококковая инфек

видо и тканеспецифичностью, что приводит к

ция (Neisseria meningitidis), гастроэнтериты

особенностям физиологической регуляции их

(Campylobacter jejuni) и др. Есть также целый ряд

каталитической активности [40].

патогенов, экспрессирующих в качестве един

В то же время, несмотря на сходство архи

ственной терминальной оксидазы ферменты из

тектуры трех главных субъединиц оксидазы ми

семейства C, среди которых такие важные, как,

тохондрий с бактериальными ферментами, бы

например, Helicobacter pylori.

ли выявлены значительные отличия в кинети

Изучение оксидаз семейств B и C начато от

ческих свойствах генерации мембранного по

носительно недавно и активно развивается в пос

тенциала гем медных оксидаз внутри семейства

ледние годы [20, 45]. В отличие от оксидаз семей

А (прокариотических и эукариотических), что

ства А стехиометрия перекачивания протонов в

указывает на то, что электрогенный механизм

ЦО семейств B и C может варьировать в значи

трансформации энергии и перекачивания про

тельных пределах от 0,5 протона на электрон,

тонов не является универсальным [2, 41, 42].

поступающий в BNC, до ~0,85 [27, 42, 45-48].

Если в прокариотических оксидазах ключе

Исходя из первичной последовательности, в

вая роль в «рабочем» электрогенном механизме

ЦО семейств B и C, по видимому, функциони

протонного насоса отводится сопряжению пе

рует лишь один входной протонный канал, го

реноса перекачиваемого протона с восстановле

мологичный К каналу оксидаз семейства А [1].

нием BNC гемом а, то молекулярный механизм

При этом представители обоих семейств спо

перекачки протонов в митохондриальном фер

собны переносить как субстратные протоны с

менте предполагает важную роль редокс пре

цитоплазматической стороны мембраны в BNC,

вращений собственно гема а и конформацион

так и перекачивать протоны через мембрану.

ных изменений вблизи гема а, то есть на значи

Молекулярный механизм перекачивания прото

тельном удалении от BNC. Исходя из данных

нов в этих ферментах мало изучен и, по види

рентгено структурного анализа, было высказа

мому, значительно отличается от такового для

но предположение о том, что в эукариотических

представителей канонического семейства А.

ЦО перенос перекачиваемых протонов через

В случае ЦО ba₃ из Thermus thermophilus, ти

мембрану в ходе каталитического цикла может

пичного представителя семейства B, были раз

происходить с использованием дополнительно

решены стадии электрогенного переноса прото

го протон проводящего пути - H канала, про

нов в окислительной фазе каталитического цик

ходящего вблизи гема а [11, 36].

ла [46] и в первом переходе восстановительной

Функция этого канала и регуляция проведе

части каталитического цикла [20]. Были выявле

ния по нему протонов, включая физиологичес

ны стадии, перенос электрона в которых не соп

кие аспекты этой регуляции, изучена мало. Сог

ряжен с перекачиванием протона через мембра

ласно одной из гипотез, H канал участвует в

ну, что объясняет снижение эффективной сте

проведении перекачиваемого протона через всю

хиометрии перекачки протонов в оксидазах се

мембрану [11]; согласно другой - используется

мейства B [20, 46]. В частности, было показано,

только верхняя часть этого пути [36]. Наконец,

что в отличие от оксидаз семейства А в окисли

согласно третьей гипотезе, H канал не выпол

тельной фазе каталитического цикла ЦО ba₃ из

няет функцию перекачивания протонов вооб

T. thermophilus происходит перекачивание одно

ще, а является т.н. диэлектрическим «колод

го протона через мембрану вместо двух [46]. В то

цем», роль которого может заключаться в моду

же время перенос 1 го электрона в восстанови

ляции редокс потенциала близлежащего пере

тельной части каталитического цикла (переход

носчика электронов гема а [43, 44].

O_H→E_H) также не сопряжен с перекачиванием

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1723

протонов через мембрану, что может быть след

что первые не могут использовать цитохром с в

ствием влияния формирующегося мембранного

качестве донора электронов: все известные на

потенциала [20].

сегодняшний день оксидазы типа bd - хинолок

Выяснение молекулярного механизма соп

сидазы. bd ферменты могут окислять убихинол,

ряженного перекачивания протонов в ЦО раз

менахинол либо даже пластохинол [42]. Еще

ных типов остается одной из наиболее значи

одно важное отличие цитохрома bd от ГМО за

мых задач биоэнергетики, учитывая уникаль

ключается в том, что он генерирует протон дви

ность редокс сопряженного протонного насоса

жущую силу исключительно за счет векторного

ЦО и необходимость создания искусственных

перемещения субстратных протонов по внутри

наномолекулярных устройств, имитирующих

белковому протон проводящему пути без задей

природные молекулярные машины.

ствования механизма трансмембранного про

Представители семейств B и C имеют суще

тонного насоса [56-61]. Отсутствие протонного

ственные отличия в редокс свойствах и во взаи

насоса скорее всего является причиной того, что

модействии биядерного центра с внешними ли

у оксидаз типа bd стехиометрия протон/элект

гандами от ЦО семейства А [27, 49]. Оксидазы

рон равна 1, что в полтора два раза ниже, чем у

семейств B и C имеют большее сродство к кис

ГМО [61].

лороду, что дает возможность колонизировать

Основная роль канонических ГМО семей

микроаэробные ткани организма хозяина. Ката

ства А состоит в обеспечении клетки энергией,

литический центр этих ферментов отличается

необходимой для синтеза ATP в окислительном

также способностью восстанавливать NO в N₂O

фосфорилировании, тогда как главная физио

[50], что, по видимому, способствует, как и в

логическая функция цитохрома bd, по видимо

случае bd оксидаз и NO редуктаз, сопротивле

му, заключается в защите микроорганизма от

нию патогенных представителей семейства C

разных типов стресса [62-65]. «Платой» за та

токсическому действию NO, вырабатываемому

кую способность, вероятно, является понижен

макрофагами хозяина (другими словами, нитро

ная биоэнергетическая эффективность оксида

зильному стрессу), и обусловливает важность их

зы типа bd по сравнению с ГМО. В отличие от

исследования в будущем с точки зрения потен

ГМО цитохром bd, выделенный из E. coli и

циальных биомедицинских приложений.

Azotobacter vinelandii, представлен стабильным

оксигенированным комплексом [66]. Также за

мечено, что повышенная экспрессия bd фер

ТЕРМИНАЛЬНЫЕ ОКСИДАЗЫ ТИПА bd

мента происходит при снижении парциального

давления кислорода. Эти особенности цитохро

Наряду с многообразными представителями

ма bd, вероятно, связаны с его высоким срод

суперсемейства ГМО в терминальном участке

ством к О₂ [67, 68]. Содержание цитохрома bd

дыхательных цепей бактерий и архей широко

также возрастает при наличии в среде цианида,

представлены оксидазы типа bd (цитохромы bd)

разобщителей протонофоров, ее защелачива

[42, 51]. Цитохромы bd в отличие от ГМО в ды

нии [69] и в других неблагоприятных условиях,

хательных цепях эукариот не находят [52]. Вы

при которых традиционные ГМО не способны

равнивание аминокислотных последователь

нормально функционировать, а «альтернатив

ностей оксидаз типа bd и ГМО свидетельствует

ная» bd оксидаза успешно работает. У азотофик

об отсутствии гомологии между ними [53]. Не

сирующих бактерий цитохром bd обеспечивает

обнаруживается и сходства третичной структу

защиту чувствительной к кислороду нитрогена

ры разных представителей ГМО с первой опуб

зы путем поглощения О₂ с очень высокой ско

ликованной трехмерной структурой цитохрома

ростью, тем самым поддерживая его концентра

bd из бактерии Geobacillus thermodenitrificans

цию на достаточно низком уровне.

K1041 [54]. Интересно, однако, отметить, что,

Удалось выявить незаменимую роль терми

несмотря на отсутствие гомологии с ЦО, цито

нальных оксидаз типа bd в функционировании

хром bd I E. coli способен прочно связываться с

дыхательной цепи E. coli в условиях высокой кон

мембраной митохондрий сердца быка и высту

центрации H₂S в кишечнике. Обнаружено, что в

пать в качестве функционального компонента

присутствии дыхательных субстратов (дитиотреи

химерной дыхательной цепи с заингибирован

тола и убихинола 1) H₂S полностью ингибирует

ным bc₁ комплексом, восстанавливая NADH

кислород редуктазную активность ГМО (цито

оксидазную и сукцинат оксидазную активности

хрома bo₃), но не влияет на активность цитохромов

[55]. В отличие от ГМО оксидазы типа bd не со

bd (bd I и bd II) E. coli [70]. Таким образом, благо

держат в своем составе иона меди; по этой при

даря своей нечувствительности к этому кишеч

чине гем медный BNC у них тоже отсутствует.

ному газу оксидаза типа bd делает возможной ра

Несходство bd ферментов и ГМО также и в том,

боту дыхательной цепи E. coli и, вероятно, других

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1724

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

представителей микробиоты кишечника при вы

Для CydA и CydB G. thermodenitrificans K1041

соком содержании сульфида. Также установлено,

наблюдается одинаковая укладка, что, вероят

что цитохром bd I из E. coli делает бактериальную

но, произошло из за дупликации единственного

клетку устойчивой к окиси азота (NO) [62, 63,

гена предка, который кодировал гомодимерный

71-74], перекиси водорода [75, 76] и пероксинит

фермент, а также более поздних мутаций. При

риту [77]. Вероятно, именно благодаря этим и

сравнении пространственных структур терми

другим особенностям цитохром bd является клю

нальных оксидаз двух разных семейств видно,

чевой оксидазой у ряда болезнетворных микро

что ГМО имеют более компактную упаковку в

организмов, среди которых Mycobacterium tuber

мембране, чем bd оксидаза [54].

culosis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae,

Несмотря на одинаковую укладку двух ос

Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Listeria

новных субъединиц цитохрома bd, все три гемо

monocytogenes, Brucella abortus и Bacteroides fragilis

вые группы (b₅₅₈, b₅₉₅ и d), как и «Q петля», ассо

[64]. При этом отмечена положительная корреля

циированы только с субъединицей CydA

ция между уровнем его экспрессии и вирулент

(рис. 4). Нечто подобное наблюдается в фото

ностью патогенов [51]. Причина, возможно, в

синтетических реакционных центрах: хотя их

том, что активные формы кислорода и азота ге

ядро представлено двумя структурно сходными

нерируются иммунной системой организма и от

субъединицами, в переносе электрона участвует

них атакующей бактерии нужно защищаться.

лишь одна из них [42, 81]. Гемы b₅₅₈ и b₅₉₅ предс

Поскольку цитохром bd у человека и животных

тавляют собой протогемы IX. В геме d один из

отсутствует, его можно было бы использовать в

пропионатов и один из двух дополнительных

качестве терапевтической мишени для разраба

гидроксилов образуют спиролактоновое коль

тываемых новых антибактериальных препаратов.

цо, то есть он является цис гем d гидроксихло

Экспериментально наиболее подробно изу

рин γ спиронолактоном [51]. Наличие гема типа

чен цитохром bd I из E. coli. Фермент типа bd

d в активном центре терминальной оксидазы -

состоит из двух основных субъединиц - CydA и

уникальная черта bd ферментов, отличающая их

CydB. У цитохрома bd I E. coli молекулярная

от всех известных представителей ГМО. В каче

масса этих субъединиц составляет 57 и 43 кДа

стве аксиальных лигандов редокс кофакторы

соответственно. Каждая из них является типич

цитохрома bd G. thermodenitrificans K1041 исполь

ным интегральным мембранным белком. Кроме

зуют аминокислотные остатки субъединицы

того, согласно недавним исследованиям, в

CydA: гем b₅₅₈ - H186 и M325 (у E. coli - H186 и

комплексе цитохромов bd протеобактерий при

M393), гем b₅₉₅ - H21 и E101 (у E. coli - H19 и

сутствует третья субъединица - маленький бе

E99), гем d - E378 (у E. coli - E445) [51, 54]. При

лок (4 кДа) [78]. В случае цитохрома bd I E. coli

сутствие глутамата в качестве аксиального ли

этот полипептид назвали CydX [78]. У bd окси

ганда гемового железа - также уникальная чер

даз ряда других бактерий он имеет обозначение

та цитохрома bd. Пока не известно ни одного

CydY, CydZ или CydS. Полагают, что третья

другого гемсодержащего белка, включая ГМО,

субъединица нужна для поддержания активнос

который использовал бы остаток глутаминовой

ти фермента и/или вносит вклад в стабилиза

кислоты в такой роли [82]. Гем b₅₅₈ вовлечен в

цию гемов [78]. В цитохроме bd обнаруживают

окисление дыхательного субстрата хинола, выс

три активных редокс кофактора: один низко

тупая в качестве первичного акцептора электро

спиновый (гем b₅₅₈) и два высокоспиновых (ге

нов. В этом смысле он функционально аналоги

мы b₅₉₅ и d) [79, 80], а также сайт связывания и

чен низкоспиновому гему хинолоксидаз гем

окисления хинола (так называемая «Q петля» -

медного суперсемейства, к примеру, гему b ци

гидрофильная область субъединицы CydA, со

тохрома bo₃ E. coli [83]. Пентакоординирован

единяющая трансмембранные α спирали 6 и 7);

ный гем d - главный редокс активный сайт ци

она обращена во внеклеточное (или периплаз

тохрома bd. В этом сайте второй субстрат фер

матическое) пространство.

мента, О₂, связывается, активируется и восста

Трехмерная структура bd фермента из G. ther

навливается 4 мя электронами до 2Н₂О [59, 67,

modenitrificans K1041, полученная с разрешением

68]. Таким образом, гем d выполняет кислород

3,1-4 Å, подтверждает, что в его состав входят

редуктазную функцию высокоспинового гема

три субъединицы: CydA, CydB и CydS [54]. Бел

a₃, b₃, или o₃ в ГМО. При этом оксидазы типа bd,

ковый комплекс содержит 19 трансмембранных

как правило, обнаруживают гораздо более высо

α спиралей: по 9 α спиралей приходится на

кое сродство к кислороду, чем ГМО: например,

субъединицы CydA и CydB, а 19 я α спираль

значения констант связывания кислорода ци

принадлежит CydS. Следует отметить, что CydS

тохрома bd I из E. coli и ЦО из митохондрий

G. thermodenitrificans K1041 не имеет гомологии с

сердечной мышцы быка составляют

0,3 и

первичной последовательностью CydX E. coli.

40-280 мкМ соответственно [67].

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1725

Примечательная и неожиданная особенность

указывающие на его возможное взаимодействие

трехмерной структуры цитохрома bd G. thermo

с перекисью водорода [76, 84] и окисью углеро

denitrificans K1041 заключается в треугольном рас

да [80, 85-87]. Действительно, один из двух ак

положении гемовых групп, причем расстояние

сиальных лигандов (остаток глутамата) - сла

между гемами b₅₅₈ и b₅₉₅ оказалось большим, чем

бый, ввиду относительно слабых взаимодей

между b₅₅₈ и d. Так, расстояние между централь

ствий между гемовым железом и карбоксилат

ными ионами железа гемов b₅₅₈ и b₅₉₅ - 19,4 Å, а

ным фрагментом, которые, вероятно, являются

между b₅₅₈ и d - 15,2 Å. Аналогично расстояние

в основном ионными, а не ковалентными из за

между краями гемов b₅₅₈ и b₅₉₅ - 8,5 Å, а гемов b₅₅₈

низкой основности карбоксильной группы [82].

и d - 5,9 Å [54]. Данные рентгеноструктурного

Поэтому его замещение более сильным экзоген

анализа позволили Safarian et al. [54] предложить

ным лигандом, таким как H₂O₂ или CO, пред

следующую модель внутрибелкового электрон

ставляется вполне возможным. Расстояние меж

ного транспорта: электрон с хинола переносится

ду центральными ионами железа гема d и гема

на гем b₅₅₈, затем на гем d, после чего перерасп

b595 в цитохроме bd G. thermodenitrificans K1041

ределяется («уравновешивается») между гемами

составляет 11,6 Å [54]. Эта величина полностью

d и b₅₉₅. В пользу этой модели свидетельствует тот

соответствует рассчитанной ранее на основе мо

факт, что между ионами железа гемов b₅₅₈ и d рас

делирования спектров кругового дихроизма ци

полагается высококонсервативный остаток

тохрома bd I E. coli [88] и константы скорости

W374 [54], который мог бы играть важную роль в

быстрого переноса электрона с d на b₅₉₅ в том же

переносе электрона между гемами. Следует от

ферменте [89]. Однако эти высокоспиновые ге

метить, что консервативный остаток триптофана

мы структурный биядерный центр, вероятнее

обнаруживается и между низкоспиновым и вы

всего, не образуют. Для формирования такого

сокоспиновым гемами ГМО, а также между бак

центра расстояние между его редокс компонен

териофеофитином и хиноном Q_A в активной вет

тами должно быть гораздо меньше. Так, расстоя

ви переноса электрона фотосинтетических реак

ние между гемом a₃ и ионом меди Cu_B, составля

ционных центров [42, 81]. Тем не менее резуль

ющими биядерный центр ЦО, всего 4,5-5,2 Å

таты более позднего исследования цитохрома

(ссылки в статье Siletsky [42]). Поэтому гем b₅₉₅,

bd I из E. coli, проведенного Murali и Gennis [82]

с использованием направленного мутагенеза, не

вполне согласуются с моделью переноса элект

ронов, предложенной Safarian et al. Согласно вы

водам работы Murali и Gennis, электрон с гема

b₅₅₈ не может напрямую прийти на гем d. Снача

ла он переносится на гем b₅₉₅ и только после это

го оказывается на геме d [82]. Заключение Murali

и Gennis полностью соответствует гипотетичес

кой последовательности переноса электрона в bd

ферменте, предложенной еще до расшифровки

пространственной структуры цитохрома bd

G. thermodenitrificans K1041 [53]. Стоит также под

черкнуть, что последовательность переноса

электрона между гемами, постулированная

Safarian et al., может быть реализована только в

анаэробных условиях. В физиологических усло

виях, т.е. в присутствии кислорода, приход

электрона с гема b₅₅₈ на гем d вызывал бы очень

Рис. 4. Схема устройства оксидазы типа bd. Показаны три

быстрое связывание последнего с О₂ с образова

составляющие ее субъединицы: I (CydA), II (CydB) и III

нием прочного оксикомплекса, что не позволи

(CydX - у E. coli, CydS - у G. thermodenitrificans K1041). Субъ

единица I несет на себе сайт окисления хинола, а также три

ло бы этому электрону уйти с оксигенированого

гема: b₅₅₈, b₅₉₅ и d. При окислении хинола протоны высво

гема d на гем b₅₉₅. Таким образом, несмотря на

бождаются на внешнюю, положительно заряженную сторо

наличие опубликованной трехмерной структу

ну мембраны, обращенную во внеклеточное (или периплаз

ры, точная последовательность внутрибелкового

матическое) пространство. Также показаны два предполага

переноса электрона между гемами в цитохроме

емых трансмембранных протон проводящих пути: CydA и

CydB каналы. Оба пути ведут из отрицательно заряженной

bd пока не известна; ее установление требует

цитоплазматической стороны мембраны к гему b₅₉₅.

дальнейших исследований.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в элект

Функция высокоспинового гема b₅₉₅ все еще

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

остается не выясненной. Получены данные,

journal/biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1726

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

скорее всего, не выполняет ту же функцию в bd

лировали необходимость существования протон

оксидазе, что и Cu_B в ГМО. Тем не менее отно

проводящего пути для доставки субстратных

сительно небольшое расстояние между краями

протонов из цитоплазмы в кислородоредуктаз

гемов b₅₉₅ и d (3,5 Å [54]) подразумевает возмож

ный центр фермента, что должно сопровождать

ность ван дер ваальсовых взаимодействий меж

ся генерацией протон движущей силы.

ду этими кофакторами. При наличии таких взаи

Предполагается, что CydA канал составляют

модействий между b₅₉₅ и d может осуществлять

аминокислотные остатки H128, Q39, Y115, T58,

ся быстрый межгемовый перенос электрона.

E108, S139, S142 и E101. Как уже упоминалось

Изучение процесса фотолиза СО от одноэлек

выше, E101 образует связь с железом гема b₅₉₅, та

тронной формы изолированной оксидазы bd I

ким образом, являясь 6 м аксиальным лигандом

E. coli и последующей рекомбинации, проведен

этого редокс кофактора. Важная роль высоко

ное Siletsky et al. [89, 90] с помощью импульсной

консервативного аминокислотного остатка E108

абсорбционной спектрофотометрии с микросе

(у E. coli - E107) во внутрибелковом трансмем

кундным временным разрешением, действи

бранном проведении протонов была предсказана

тельно указывает на возможность обмена элек

ранее Borisov et al. [60] на основании результатов

троном между гемом b₅₉₅ и гемом d в интервале

исследования мутантной формы E107L цитохро

0,2-1,5 мкс. В ходе реакции четырехэлектрон

ма bd I E. coli методами электрометрии и абсорб

ного восстановления O₂ до 2H₂O гем b₅₉₅ мог бы

ционной спектроскопии с микросекундным вре

обеспечивать подачу на гем d электрона и, воз

менным разрешением. Обнаружено, что замена

можно, протона с высокой скоростью. В связи с

глутамата на лейцин ведет к потере ферментом

этим можно считать, что гем b₅₉₅ совместно с ге

убихинол 1 оксидазной активности. В режиме

мом d образует функциональный двухгемовый

одного молекулярного оборота фермента показа

центр для эффективного проведения кислород

но, что при смешивании полностью восстанов

редуктазной реакции. Большое количество дан

ленной мутантной формы E107L цитохрома bd I

ных спектроскопии, полученных на цитохромах

с кислородом образование феррильного интер

bd из E. coli и A. vinelandii, говорит в пользу такой

медиата существенно замедляется в сравнении с

гипотезы [58-60, 79, 85, 86, 88, 91-96]. Важно

оксидазой дикого типа, что также сопровождает

отметить, что анализ спектров кругового дихро

ся значительным снижением скорости генера

изма изолированной оксидазы bd I E. coli свиде

ции мембранного потенциала. Кроме того, най

тельствует о наличии сильного экситонного взаи

дено, что в отличие от цитохрома bd I дикого ти

модействия между гемом b₅₉₅ и гемом d [88]. В то

па фотодиссоциация молекулы СО из ее комп

же время в цитохроме bd G. thermodenitrificans

лекса с восстановленным гемом d в одноэлект

K1041 в тех же экспериментальных условиях эк

ронной форме мутантного фермента E107L не

ситонное взаимодействие между двумя высо

приводит к внутрибелковому перераспределе

коспиновыми редокс кофакторами заметно ни

нию электрона между гемами и сопряженной с

же [80]. Такая разница могла бы объясняться

ним генерации мембранного потенциала [60].

различиями в величине угла между плоскостями

CydB канал, по видимому, формируют ами

порфириновых колец гема b₅₉₅ и гема d у этих bd

нокислотные остатки субъединицы CydB: H36,

оксидаз. Другое объяснение, которое представ

S32, Y103, D25, R99, Y18, а также T73 субъедини

ляется нам менее вероятным, состоит в том, что

цы CydA. Протон с T73, вероятно, может перено

выявленные отличия отражают разницу в рас

ситься на пропионатную группу O1/2A гема b₅₉₅.

стоянии между этими гемами в цитохроме bd G.

Таким образом, оба пути ведут из цитоплаз

thermodenitrificans K1041 и оксидазе bd I E. coli,

мы к гему b₅₉₅, находящемуся в толще бислоя -

пространственная структура которой пока не

на расстоянии примерно 22,5 Å от внеклеточной

опубликована.

(или периплазматической) стороны мембраны

Анализ пространственной структуры указы

[54]. Дальнейший путь переноса протонов от ге

вает на существование двух потенциальных

ма b₅₉₅ к гему d в структуре не прослеживается.

трансмембранных внутрибелковых протон про

На основании анализа полученной трехмерной

водящих путей: одного - в субъединице CydA,

структуры цитохрома bd Safarian et al. [54] ис

другого - в CydB. В соответствии с названиями

ключают возможность прямого переноса прото

субъединиц эти гипотетические пути для перено

на между двумя высокоспиновыми гемами.

са протонов в цитохроме bd G. thermodenitrificans

Представляется более вероятным, что перенос

K1041 назвали CydA и CydB каналами. Стоит

протона с гема b₅₉₅ на гем d обеспечивается це

отметить, что за 11 лет до опубликования первой

почкой молекул воды, которые не видны при

трехмерной структуры цитохрома bd Belevich et

данном разрешении (3,1-4 Å).

al. [58] на основании электрометрических и

Не ясно, использует ли фермент один или

спектрофотометрических данных впервые посту

оба пути для трансмембранного переноса про

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1727

тонов. Имеющиеся данные по одиночной заме

нии со спектрофотометрическими и электро

не E107 [60], ключевого аминокислотного ос

метрическими измерениями [57-61]. Фотолиз

татка CydA канала в цитохроме bd I E. coli, ука

СО из ее комплекса с полностью восстановлен

зывают на то, что этот канал активен. Каких ли

ным цитохромом bd (R³-CO, b²⁺⁵⁵⁸b²⁺⁵⁹⁵d²⁺-CO)

бо сведений о функционировании (или не

приводит к образованию свободной от этого ли

функционировании) гипотетического CydB ка

ганда формы фермента (R³, b²⁺⁵⁵⁸b²⁺⁵⁹⁵d²⁺). В присут

нала в литературе пока нет.

ствии кислорода R³ связывает эту двухатомную

Belevich et al. [58] постулировали существова

молекулу с k_on ~ 2 × 10⁹ М^-1 с^-1 [59, 68], образуя

ние двух ионизируемых групп, чувствительных к

оксикомплекс гема d

- соединение A³

редокс состоянию высокоспиновых гемов. На

(b²⁺⁵⁵⁸b²⁺⁵⁹⁵d²⁺-O₂). A³ превращается с τ ~ 4,5 мкс в

основании разрешенного во времени электро

другое короткоживущее соединение, которое

метрического и оптического исследований мутан

назвали P. Впервые его зарегистрировали

тной формы E445A цитохрома bd I E. coli было

Belevich et al. [59] при температуре 21 °C. Пока

показано, что остаток глутамата (у G. thermodeni

зано, что R³→A³ и A³→P переходы не сопряжены

trificans K1041 - E378), скорее всего, является од

с генерацией мембранного потенциала фермен

ной из таких групп. Предположили, что эти ге

том, встроенным в липосомы [59-61]. Belevich

мосопряженные группы требуются для компен

et al. [59] предположили, что соединение P

сации отрицательных зарядов двух электронов,

представляет собой истинный перекисный

которые переносятся на два высокоспиновых ге

комплекс или оксоферрильный интермедиат: с

ма для их восстановления [58]. Важную роль в

аминокислотным радикалом либо с катион ра

компенсации заряда при восстановлении гема

дикалом порфиринового кольца. Позже Paulus

b₅₉₅ может играть аминокислотный остаток E101,

et al. [97] сообщили, что, по их данным, соеди

которым «заканчивается» CydA канал. Протон,

нение P - оксоферрильный интермедиат с кати

пришедший на E101 по CydA каналу, мог бы пе

он радикалом порфиринового кольца [97]. В ре

реноситься на E378 для компенсации отрица

зультате сейчас принято полагать, что в этом со

тельного заряда второго электрона, используе

единении гем d уже находится в оксоферриль

мого для восстановления высокоспиновых ге

ном состоянии, причем с π катион радикалом

мов. Альтернативная возможность протонирова

на порфириновом кольце, то есть P имеет струк

ния E378 заключается в том, что протон мог бы

туру b²⁺⁵⁵⁸b³⁺⁵⁹⁵d*⁴⁺=O^2-. Предполагается, что в ходе

приходить на E378 с внеклеточной (или пери

A³→P перехода на молекулу O₂ одновременно

плазматической) стороны мембраны. В этом

переносятся четыре электрона и два протона,

случае маловероятно, что этот протон использу

приводя к разрыву O-O связи с образованием

ется в кислород редуктазной реакции [58].

одной молекулы Н₂O. При этом два электрона

Хотя CydA канал, скорее всего, участвует в

поступают за счет окисления иона Fe²⁺ гема d до

проведении протонов, его точная функция пока

оксоферрильного состояния Fe⁴⁺=O^2-. Один

не определена. Нельзя исключить, что этот ка

электрон - в результате окисления иона Fe²⁺ ге

нал переносит протоны только для компенса

ма b₅₉₅ до Fe³⁺. Еще один электрон берется из

ции заряда при восстановлении высокоспино

порфиринового кольца гема d, приводя к обра

вого гема. Другая возможность состоит в том,

зованию π катион радикала. Похожий интер

что E108 является «точкой ветвления», то есть

медиат (P_M) находят в каталитическом цикле

обладает способностью к переносу протонов че

ЦО, однако в нем регистрируют не катион ра

рез пропионатную группу O1/2D гема b₅₉₅ на

дикал порфиринового кольца, а нейтральный

кислород редуктазный сайт. Согласно структу

тирозильный радикал [2]. Следует, однако, за

ре, пропионатные группы гема b₅₉₅ находятся в

метить, что в отличие от Belevich et al. [59]

гидрофобном окружении без какой либо ком

Paulus et al. [97] проводили эксперименты в ус

пенсации заряда [54]. По этой причине они,

ловиях, далеких от физиологических - при тем

скорее всего, протонированы и могли бы слу

пературе 1 °C. По этой причине полной уверен

жить в качестве доноров субстратных протонов

ности в точном определении структуры соеди

для реакции восстановления кислорода до воды.

нения P в каталитическом цикле цитохрома bd

Ушедшие с пропионатных групп протоны могли

пока нет.

бы восполняться путем задействования одного

Далее следует P→F переход с τ ~47 мкс, в хо

или обоих протонных каналов.

де которого, по видимому, происходит «гаше

На рис. 5 представлена предполагаемая схе

ние» π катион радикала порфиринового кольца

ма каталитического цикла оксидазы типа bd.

гема d за счет электрона, пришедшего с иона

Она базируется на исследовании цитохрома bd I

Fe²⁺ гема b₅₅₈. Соответственно, соединение F

E. coli в режиме одного молекулярного оборота с

имеет структуру b³⁺⁵⁵⁸b³⁺⁵⁹⁵d⁴⁺=O^2-. Оно, скорее все

использованием метода «флоу флэш» в сочета

го, аналогично каталитическому интермедиату

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1728

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

F, описанному у ЦО. P→F переход сопряжен с

Оставшаяся часть фермента (~20%) в стацио

переносом заряда поперек мембраны, т.е. явля

нарных условиях, по видимому, находится в

ется электрогенным [59-61]. В случае трехэлек

состоянии O¹ - одноэлектронной форме фер

тронной формы фермента реакция останавли

мента с окисленным гемом d (b²⁺⁵⁵⁸b³⁺⁵⁹⁵d³⁺-ОН).

вается на образовании соединения F [57]. Если

Эти данные вполне согласуются с давно извест

же фермент имеет в своем составе связанный

ным фактом, что как в цитохром bd содержащих

хинол, окисление последнего в присутствии O₂

мембранах, так и в изолированном ферменте

позволяет осуществить превращение F в соеди

гем d в основном находится в стабильных окси

нение A¹ с τ ~ 600-1100 мкс [58, 59]. A¹, вероят

генированном и оксоферрильном состояниях.

нее всего, является оксигенированной формой

Напротив, в случае ЦО, в стационарных услови

восстановленного гема d в ферменте с одним

ях кислородные интермедиаты (в частности, P и

электроном (b³⁺⁵⁵⁸b³⁺⁵⁹⁵d²⁺-O₂). Этот переход, как и

F) в скольких нибудь значительных количествах

предыдущий, электрогенен [58, 59].

не присутствуют (<10%) (ссылки в статье Borisov

Генерация мембранного потенциала в P→F и

et al. [98]). Хотя соединение O¹ в режиме одного

F→A¹ переходах, по видимому, обусловлена пе

оборота цитохрома bd в опытах с задействовани

реносом Н⁺ по протон проводящему пути

ем метода «флоу флэш» разрешено не было [57,

(CydA или/и CydB каналу) из цитоплазмы в

59, 60], вероятно, оно также является частью ка

активный центр для восстановления O₂. Этот

талитического цикла (рис. 5). Следует также от

перенос заряда (Н⁺) поперек мембраны, сопря

метить, что в отличие от ЦО полностью окис

женный с переносом электрона с гема b₅₅₈ на вы

ленная (O, b³⁺⁵⁵⁸b³⁺⁵⁹⁵d³⁺-OН) и полностью восста

сокоспиновые гемы b₅₉₅ и d, вероятно, вносит

новленная (R³) формы цитохрома bd, по види

основной вклад в генерацию потенциала, опи

мому, не входят в число его каталитичеких ин

санную в работах Jasaitis et al. [57], Belevich et al.

термедиатов [98, 99], однако их можно генери

[59, 59] и Borisov et al. [60, 61]. Кроме того, при

ровать искусственным путем.

окислении хинола протоны высвобождаются во

Семейство оксидаз типа bd принято делить

внеклеточное (или периплазматическое) про

на два подсемейства: «L» и «S» [53, 80] (рис. 1).

странство, что также вносит вклад в образова

Классификация основана на размере «Q пет

ние цитохромом bd протон движущей силы.

ли». Ферменты подсемейства «L» содержат про

Показано, что в стационарных условиях,

тяженную вставку на С конце «Q петли», поэто

поддерживаемых O₂ и восстановленным дитио

му такую петлю назвали «длинной» (Long Q loop).

треитолом убихиноном, в качестве основных ка

К этому семейству относятся, к примеру, белко

талитических интермедиатов цитохрома bd пре

вые комплексы bd I и bd II из E. coli. Ферменты

обладают A¹ и F (примерно по 40% каждый) [98].

подсемейства «S» не обладают этой вставкой, и

поэтому их петля «короткая» (Short Q loop). Наи

более изученный представитель подсемейства

«S» - bd оксидаза из G. thermodenitrificans [54].

Данные, полученные Arutyunyan et al. [80] с ис

пользованием методов абсорбционной спект

роскопии, КД и МКД, указывают на то, что bd

ферменты из двух разных подсемейств, «L» и

«S», могут существенно различаться по органи

зации активного центра [80]. Некоторые из

представителей подсемейства «S» способны

поддерживать дыхание даже в присутствии 1 мМ

KCN [53]. В силу этой примечательной особен

ности их нередко выделяют в особую группу

«цианид резистентных оксидаз». Состав гемов

этих ферментов не вполне ясен; однако установ

лено, что по крайней мере у некоторых из них

гем d замещен на гем b [100].

Рис. 5. Предполагаемый каталитический цикл оксидазы

Финансирование. Работа выполнена при фи

типа bd. Соединения в квадратах, нарисованных сплошны

ми линиями (A³, P, F, O¹, A¹), - каталитические интерме

нансовой поддержке Российского научного

диаты фермента. Соединения в квадратах, нарисованных

фонда (проект № 19 14 00063).

пунктирными линиями (R³, O), скорее всего, не являются

частью каталитического цикла цитохрома bd. Структура

Благодарности. Авторы признательны

соединений обсуждается в тексте обзора

В.П. Скулачеву, А.А. Константинову и А.Д. Ви

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1729

ноградову за интерес к работе, полезное обсуж

Соблюдение этических норм. Настоящая

дение и критические замечания.

статья не содержит каких либо исследований с

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

участием людей или использованием животных

них нет конфликта интересов.

в качестве объектов исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Hemp, J., and Gennis, R.B. (2008) Diversity of the heme

tion during the ferryl oxo → oxidized transition in a non

copper superfamily in archaea: insights from genomics and

pumping mutant of cytochrome c oxidase, J. Biol. Chem.,

structural modeling, Results Probl. Cell Differ., 45, 1-31,

279, 52558-52565, doi: 10.1074/jbc.M407549200.

doi: 10.1007/400_2007_046.

15.

Siletsky, S., Kaulen, A.D., and Konstantinov, A.A. (1999)

Siletsky, S.A. (2013) Steps of the coupled charge transloca

Resolution of electrogenic steps couples to conversion of

tion in the catalytic cycle of cytochrome c oxidase, Front.

cytochrome c oxidase from the peroxy to the ferryl oxo

Biosci. (Landmark Ed)., 18, 36-57.

state, Biochemistry,

38,

4853-4861, doi:

10.1021/

Wikstrom, M. (1977) Proton pump coupled to cytochrome

bi982614a.

c oxidase in mitochondria, Nature,

266,

271-273,

16.

Belevich, I., Bloch, D.A., Belevich, N., Wikstrom, M., and

doi: 10.1038/266271a0.

Verkhovsky, M.I. (2007) Exploring the proton pump mech

Ter Beek, J., Krause, N., and Adelroth, P.

(2016)

anism of cytochrome c oxidase in real time, Proc. Natl.

Investigating the proton donor in the NO reductase from

Acad. Sci. USA,

104,

2685-2690, doi:

10.1073/

Paracoccus denitrificans, PLoS One,

11, e0152745,

pnas.0608794104.

doi: 10.1371/journal.pone.0152745.

17.

Siletsky, S.A., Belevich, I., Wikstrom, M., Soulimane, T.,

Pereira, M.M., and Teixeira, M. (2004) Proton pathways,

and Verkhovsky, M.I. (2009) Time resolved O_H → E_H tran

ligand binding and dynamics of the catalytic site in haem

sition of the aberrant ba₃ oxidase from Thermus ther

copper oxygen reductases: a comparison between the three

mophilus, Biochim. Biophys. Acta,

1787,

201-205,

families, Biochim. Biophys. Acta,

1655,

340-346,

doi: 10.1016/j.bbabio.2008.12.020.

doi: 10.1016/j.bbabio.2003.06.003.

18.

Siletsky, S.A., Belevich, I., Belevich, N.P., Soulimane, T.,

Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T.,

and Verkhovsky, M.I. (2011) Time resolved single turnover

Yamaguchi, H., Shinzawa Itoh, K., Nakashima, R.,

of caa₃ oxidase from Thermus thermophilus. Fifth electron

Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1996) The whole structure

of the fully reduced enzyme converts O_H into E_H state,

of the 13 subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2,8 Å,

Biochim. Biophys. Acta, 1807, 1162-1169, doi: 10.1016/

Science, 272, 1136-1144, doi: 10.1126/science.272.5265.

j.bbabio.2011.05.006.

1136.

19.

Siletsky, S.A., Belevich, I., Soulimane, T., Verkhovsky, M.I.,

Koepke, J., Olkhova, E., Angerer, H., Muller, H., Peng, G.,

and Wikstrom, M. (2013) The fifth electron in the fully

and Michel, H. (2009) High resolution crystal structure of

reduced caa₃ from Thermus thermophilus is competent in

Paracoccus denitrificans cytochrome c oxidase: new insights

proton pumping, Biochim. Biophys. Acta, 1827, 1-9,

into the active site and the proton transfer pathways,

doi: 10.1016/j.bbabio.2012.09.013.

Biochim. Biophys. Acta, 1787, 635-645, doi: 10.1016/

20.

Siletsky, S.A., Belevich, I., Belevich, N.P., Soulimane, T.,

j.bbabio.2009.04.003.

and Wikstrom, M. (2017) Time resolved generation of

Svensson Ek, M., Abramson, J., Larsson, G., Tornroth, S.,

membrane potential by ba₃ cytochrome c oxidase from

Brzezinski, P., and Iwata, S. (2002) The X ray crystal

Thermus thermophilus coupled to single electron injection

structures of wild type and EQ(I 286) mutant

into the O and O_H states, Biochim. Biophys. Acta, 1858,

cytochrome c oxidases from Rhodobacter sphaeroides,

915-926, doi: 10.1016/j.bbabio.2017.08.007.

J. Mol. Biol.,

321,

329-339, doi:

10.1016/S0022

21.

Sharma, V., Karlin, K.D., and Wikstrom, M. (2013)

2836(02)00619 8.

Computational study of the activated O_H state in the cat

Abramson, J., Riistama, S., Larsson, G., Jasaitis, A.,

alytic mechanism of cytochrome c oxidase, Proc. Natl.

Svensson Ek, M., Laakkonen, L., Puustinen, A., Iwata, S.,

Acad. Sci. USA, 110, 16844-16849, doi: 10.1073/pnas.

and Wikstrom, M. (2000) The structure of the ubiquinol

1220379110.

oxidase from Escherichia coli and its ubiquinone binding

22.

Drachev, L.A., Jasaitis, A.A., Kaulen, A.D., Kondrashin, A.A.,

site, Nat. Struct. Biol., 7, 910-917, doi: 10.1038/ 82824.

Liberman, E.A., Nemecek, I.B., Ostroumov, S.A.,

10.

Letts, J.A., Fiedorczuk, K., and Sazanov, L.A. (2016) The

Semenov, A.Y., and Skulachev, V.P. (1974) Direct measure

architecture of respiratory supercomplexes, Nature, 537,

ment of electric current generation by cytochrome oxidase,

644-648, doi: 10.1038/nature19774.

H⁺ ATPase and bacteriorhodopsin, Nature, 249, 321-324,

11.

Yoshikawa, S., and Shimada, A. (2015) Reaction mecha

doi: 10.1038/249321a0.

nism of cytochrome c oxidase, Chem. Rev.,

115,

23.

Mamedov, M.D., Tyunyatkina, A.A., Siletsky, S.A., and

1936-1989, doi: 10.1021/cr500266a.

Semenov, A.Y. (2006) Voltage changes involving photosys

12.

Wikstrom, M., Sharma, V., Kaila, V.R., Hosler, J.P., and

tem II quinone iron complex turnover, Eur. Biophys. J., 35,

Hummer, G. (2015) New perspectives on proton pumping

647-654, doi: 10.1007/s00249 006 0069 3.

in cellular respiration, Chem. Rev., 115, 2196-2221,

24.

Siletsky, S.A., Mamedov, M.D., Lukashev, E.P.,

doi: 10.1021/cr500448t.

Balashov, S.P., Dolgikh, D.A., Rubin, A.B., Kirpichnikov,

13.

Konstantinov, A.A., Siletsky, S., Mitchell, D., Kaulen, A.,

M.P., and Petrovskaya, L.E. (2016) Electrogenic steps of

and Gennis, R.B. (1997) The roles of the two proton input

light driven proton transport in ESR, a retinal protein from

channels in cytochrome c oxidase from Rhodobacter

Exiguobacterium sibiricum, Biochim. Biophys. Acta, 1857,

sphaeroides probed by the effects of site directed mutations

1741-1750, doi: 10.1016/j.bbabio.2016.08.004.

on time resolved electrogenic intraprotein proton transfer,

25.

Siletsky, S.A., Mamedov, M.D., Lukashev, E.P.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 9085-9090, doi: 10.1073/

Balashov, S.P., Dolgikh, D.A., Rubin, A.B., Kirpichnikov, M.P.,

pnas.94.17.9085.

and Petrovskaya, L.E. (2019) Elimination of proton donor

14.

Siletsky, S.A., Pawate, A.S., Weiss, K., Gennis, R.B., and

strongly affects directionality and efficiency of proton

Konstantinov, A.A. (2004) Transmembrane charge separa

transport in ESR, a light driven proton pump from

14 БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1730

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

Exiguobacterium sibiricum, Biochim. Biophys. Acta

survival, Mitochondrion, 12, 46-56, doi: 10.1016/j.mito.

Bioenerg., 1860, 1-11, doi: 10.1016/j.bbabio.2018.09.365.

2011.05.003.

26.

Zaslavsky, D.L., Smirnova, I.A., Siletsky, S.A., Kaulen, A.D.,

41.

Siletsky, S.A., and Konstantinov, A.A. (2012) Cytochrome

Millett, F., and Konstantinov, A.A. (1995) Rapid kinetics

c oxidase: charge translocation coupled to single electron

of membrane potential generation by cytochrome c oxidase

partial steps of the catalytic cycle, Biochim. Biophys. Acta,

with the photoactive Ru(II) Tris bipyridyl derivative of

1817, 476-488, doi: 10.1016/j.bbabio.2011.08.003.

cytochrome c as electron donor, FEBS Lett., 359, 27-30,

42.

Siletsky, S.A., Borisov, V.B., and Mamedov, M.D. (2017)

doi: 10.1016/0014 5793(94)01443 5.

Photosystem II and terminal respiratory oxidases: molecu

27.

Siletskiy, S., Soulimane, T., Azarkina, N., Vygodina, T.V.,

lar machines operating in opposite directions, Front. Biosci.

Buse, G., Kaulen, A., and Konstantinov, A. (1999) Time

(Landmark Ed.), 22, 1379-1426, doi: 10.2741/4550.

resolved generation of a membrane potential by ba₃

43.

Rich, P.R., and Marechal, A. (2013) Functions of the

cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus.

hydrophilic channels in protonmotive cytochrome c oxi

Evidence for reduction induced opening of the binuclear

dase, J. R. Soc. Interface, 10, 20130183, doi: 10.1098/

center, FEBS Lett., 457, 98-102, doi: 10.1016/S0014

rsif.2013.0183.

5793(99)01019 4.

44.

Sharma, V., Jambrina, P.G., Kaukonen, M., Rosta, E., and

28.

Siletsky, S.A., Kaulen, A.D., and Konstantinov, A.A.

Rich, P.R. (2017) Insights into functions of the H channel

(1997) Electrogenic events associated with peroxy to

of cytochrome c oxidase from atomistic molecular dynam

ferry oxo state transition in cytochrome c oxidase, Eur.

ics simulations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

114,

Biophys. J., 26, 98.

E10339-E10348, doi: 10.1073/pnas.1708628114.

29.

Siletsky, S.A., Han, D., Brand, S., Morgan, J.E., Fabian, M.,

45.

Rauhamaki, V., Bloch, D.A., and Wikstrom, M. (2012)

Geren, L., Millett, F., Durham, B., Konstantinov, A.A.,

Mechanistic stoichiometry of proton translocation by

and Gennis, R.B. (2006) Single electron photoreduction

cytochrome cbb₃, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109,

of the P_M intermediate of cytochrome c oxidase, Biochim.

7286-7291, doi: 10.1073/pnas.1202151109.

Biophys. Acta, 1757, 1122-1132, doi: 10.1016/j.bbabio.

46.

Siletsky, S.A., Belevich, I., Jasaitis, A., Konstantinov, A.A.,

2006.07.003.

Wikstrom, M., Soulimane, T., and Verkhovsky, M.I. (2007)

30.

Lee, A., Kirichenko, A., Vygodina, T., Siletsky, S.A.,

Time resolved single turnover of ba₃ oxidase from Thermus

Das, T.K., Rousseau, D.L., Gennis, R., and Konstantinov, A.A.

thermophilus, Biochim. Biophys. Acta, 1767, 1383-1392,

(2002) Ca²⁺ binding site in Rhodobacter sphaeroides

doi: 10.1016/j.bbabio.2007.09.010.

cytochrome c oxidase, Biochemistry, 41, 8886-8898,

47.

Kannt, A., Soulimane, T., Buse, G., Becker, A., Bamberg, E.,

doi: 10.1021/bi020183x.

and Michel, H. (1998) Electrical current generation and

31.

Kuznetsova, S.S., Azarkina, N.V., Vygodina, T.V., Siletsky, S.A.,

proton pumping catalyzed by the ba₃ type cytochrome c

and Konstantinov, A.A. (2005) Zinc ions as cytochrome c

oxidase from Thermus thermophilus, FEBS Lett., 434,

oxidase inhibitors: two sites of action, Biochemistry

17-22, doi: 10.1016/S0014 5793(98)00942 9.

(Moscow), 70, 128-136.

48.

Rauhamaki, V., and Wikstrom, M. (2014) The causes of

32.

Siletsky, S.A., Zhu, J., Gennis, R.B., and Konstantinov, A.A.

reduced proton pumping efficiency in type B and C respi

(2010) Partial steps of charge translocation in the non

ratory heme copper oxidases, and in some mutated vari

pumping N139L mutant of Rhodobacter sphaeroides

ants of type A, Biochim. Biophys. Acta, 1837, 999-1003,

cytochrome c oxidase with a blocked D channel,

doi: 10.1016/j.bbabio.2014.02.020.

Biochemistry, 49, 3060-3073, doi: 10.1021/bi901719e.

49.

Rauhamaki, V., Bloch, D.A., Verkhovsky, M.I., and

33.

Verkhovsky, M.I., Jasaitis, A., Verkhovskaya, M.L.,

Wikstrom, M. (2009) Active site of cytochrome cbb₃, J.

Morgan, J.E., and Wikstrom, M. (1999) Proton transloca

Biol. Chem.,

284,

11301-11308, doi:

10.1074/jbc.

tion by cytochrome c oxidase, Nature, 400, 480-483,

M808839200.

doi: 10.1038/22813.

50.

Forte, E., Urbani, A., Saraste, M., Sarti, P., Brunori, M.,

34.

Ruitenberg, M., Kannt, A., Bamberg, E., Fendler, K., and

and Giuffre, A. (2001) The cytochrome cbb3 from

Michel, H. (2002) Reduction of cytochrome c oxidase by a

Pseudomonas stutzeri displays nitric oxide reductase activi

second electron leads to proton translocation, Nature, 417,

ty, Eur. J. Biochem., 268, 6486-6491, doi: 10.1046/j.0014

99-102, doi: 10.1038/416099a.

2956.2001.02597.x.

35.

Kaila, V.R., Sharma, V., and Wikstrom, M. (2011) The

51.

Forte, E., Borisov, V.B., Vicente, J.B., and Giuffre, A.

identity of the transient proton loading site of the proton

(2017) Cytochrome bd and gaseous ligands in bacterial

pumping mechanism of cytochrome c oxidase, Biochim.

physiology, Adv. Microb. Physiol.,

71,

171-234,

Biophys. Acta,

1807,

80-84, doi:

10.1016/j.bbabio.

doi: 10.1016/bs.ampbs.2017.05.002.

2010.08.014.

52.

Borisov, V.B. (1996) Cytochrome bd: structure and proper

36.

Capitanio, N., Palese, L.L., Capitanio, G., Martino, P.L.,

ties, Biochemistry (Moscow), 61, 565-574.

Richter, O.M., Ludwig, B., and Papa, S. (2012) Allosteric inter

53.

Borisov, V.B., Gennis, R.B., Hemp, J., and Verkhovsky, M.I.

actions and proton conducting pathways in proton pumping aa₃

(2011) The cytochrome bd respiratory oxygen reductases,

oxidases: heme a as a key coupling element, Biochim. Biophys.

Biochim.

Biophys.

Acta,

1807,

1398-1413,

Acta, 1817, 558-566, doi: 10.1016/j.bbabio.2011.11.003.

doi: 10.1016/j.bbabio.2011.06.016.

37.

Lu, J., and Gunner, M.R. (2014) Characterizing the proton

54.

Safarian, S., Rajendran, C., Muller, H., Preu, J., Langer, J.D.,

loading site in cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci.

Ovchinnikov, S., Hirose, T., Kusumoto, T., Sakamoto, J.,

USA, 111, 12414-12419, doi: 10.1073/pnas.1407187111.

and Michel, H. (2016) Structure of a bd oxidase indicates

38.

De Vries, S. (2008) The role of the conserved trypto

similar mechanisms for membrane integrated oxygen

phan272 of the Paracoccus denitrificans cytochrome c oxi

reductases, Science, 352, 583-586, doi: 10.1126/science.

dase in proton pumping, Biochim. Biophys. Acta, 1777,

aaf2477.

925-928, doi: 10.1016/j.bbabio.2008.05.008.

55.

Gavrikova, E.V., Grivennikova, V.G., Borisov, V.B.,

39.

Brzezinski, P., and Larsson, G. (2003) Redox driven pro

Cecchini, G., and Vinogradov, A.D. (2009) Assembly of a

ton pumping by heme copper oxidases, Biochim. Biophys.

chimeric respiratory chain from bovine heart submito

Acta, 1605, 1-13, doi: 10.1016/S0005 2728(03)00079 3.

chondrial particles and cytochrome bd terminal oxidase of

40.

Arnold, S. (2012) The power of life - cytochrome c oxidase

Escherichia coli, FEBS Lett.,

583,

1287-1291,

takes center stage in metabolic control, cell signalling and

doi: 10.1016/j.febslet.2009.03.022.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ

1731

56.

Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (1997)

and Giuffre, A. (2016) The terminal oxidase cytochrome

Generation of protonic potential by the bd type quinol oxi

bd promotes sulfide resistant bacterial respiration and

dase of Azotobacter vinelandii, FEBS Lett., 414, 369-372,

growth, Sci. Rep., 6, 23788, doi: 10.1038/srep23788.

doi: 10.1016/S0014 5793(97)01047 8.

71.

Borisov, V.B., Forte, E., Konstantinov, A.A., Poole, R.K.,

57.

Jasaitis, A., Borisov, V.B., Belevich, N.P., Morgan, J.E.,

Sarti, P., and Giuffre, A. (2004) Interaction of the bacter

Konstantinov, A.A., and Verkhovsky, M.I.

(2000)

ial terminal oxidase cytochrome bd with nitric oxide,

Electrogenic reactions of cytochrome bd, Biochemistry, 39,

FEBS Lett., 576, 201-204, doi: 10.1016/j.febslet.2004.09.

13800-13809, doi: 10.1021/bi001165n.

013.

58.

Belevich, I., Borisov, V.B., Zhang, J., Yang, K.,

72.

Borisov, V.B., Forte, E., Sarti, P., Brunori, M.,

Konstantinov, A.A., Gennis, R.B., and Verkhovsky, M.I.

Konstantinov, A.A., and Giuffre, A. (2006) Nitric oxide

(2005) Time resolved electrometric and optical studies on

reacts with the ferryl oxo catalytic intermediate of the

cytochrome bd suggest a mechanism of electron proton

Cu_B lacking cytochrome bd terminal oxidase, FEBS Lett.,

coupling in the di heme active site, Proc. Natl. Acad. Sci.

580, 4823-4826, doi: 10.1016/j.febslet.2006.07.072.

USA, 102, 3657-3662, doi: 10.1073/pnas.0405683102.

73.

Borisov, V.B., Forte, E., Sarti, P., Brunori, M.,

59.

Belevich, I., Borisov, V.B., and Verkhovsky, M.I. (2007)

Konstantinov, A.A., and Giuffre, A. (2007) Redox control

Discovery of the true peroxy intermediate in the catalytic

of fast ligand dissociation from Escherichia coli cytochrome

cycle of terminal oxidases by real time measurement, J.

bd, Biochem. Biophys. Res. Commun., 355, 97-102,

Biol. Chem.,

282,

28514-28519, doi:

10.1074/jbc.

doi: 10.1016/j.bbrc.2007.01.118.

M705562200.

74.

Borisov, V. B., Forte, E., Giuffre, A., Konstantinov, A., and

60.

Borisov, V.B., Belevich, I., Bloch, D.A., Mogi, T., and

Sarti, P. (2009) Reaction of nitric oxide with the oxidized

Verkhovsky, M.I. (2008) Glutamate 107 in subunit I of

di heme and heme copper oxygen reducing centers of ter

cytochrome bd from Escherichia coli is part of a transmem

minal oxidases: different reaction pathways and end prod

brane intraprotein pathway conducting protons from the

ucts, J. Inorg. Biochem., 103, 1185-1187, doi: 10.1016/

cytoplasm to the heme b₅₉₅/heme d active site,

j.jinorgbio.2009.06.002.

Biochemistry, 47, 7907-7914, doi: 10.1021/bi800435a.

75.

Borisov, V.B., Davletshin, A.I., and Konstantinov, A.A.

61.

Borisov, V.B., Murali, R., Verkhovskaya, M.L., Bloch, D.A.,

(2010) Peroxidase activity of cytochrome bd from

Han, H., Gennis, R.B., and Verkhovsky, M.I. (2011)

Escherichia coli, Biochemistry (Moscow), 75, 428-436,

Aerobic respiratory chain of Escherichia coli is not allowed

doi: 10.1134/S000629791004005X.

to work in fully uncoupled mode, Proc. Natl. Acad. Sci.

76.

Borisov, V.B., Forte, E., Davletshin, A., Mastronicola, D.,

USA, 108, 17320-17324, doi: 10.1073/pnas.1108217108.

Sarti, P., and Giuffre, A. (2013) Cytochrome bd oxidase

62.

Forte, E., Borisov, V.B., Konstantinov, A.A., Brunori, M.,

from Escherichia coli displays high catalase activity: an

Giuffre, A., and Sarti, P. (2007) Cytochrome bd, a key oxi

additional defense against oxidative stress, FEBS Lett., 587,

dase in bacterial survival and tolerance to nitrosative stress,

2214-2218, doi: 10.1016/j.febslet.2013.05.047.

Ital. J. Biochem., 56, 265-269.

77.

Borisov, V.B., Forte, E., Siletsky, S.A., Sarti, P., and

63.

Giuffre, A., Borisov, V.B., Mastronicola, D., Sarti, P., and

Giuffre, A. (2015) Cytochrome bd from Escherichia coli

Forte, E. (2012) Cytochrome bd oxidase and nitric oxide:

catalyzes peroxynitrite decomposition, Biochim. Biophys.

from reaction mechanisms to bacterial physiology, FEBS

Acta, 1847, 182-188, doi: 10.1016/j.bbabio.2014.10.006.

Lett., 586, 622-629, doi: 10.1016/j.febslet.2011.07.035.

78.

Hoeser, J., Hong, S., Gehmann, G., Gennis, R.B., and

64.

Giuffre, A., Borisov, V.B., Arese, M., Sarti, P., and Forte, E.

Friedrich, T. (2014) Subunit CydX of Escherichia coli

(2014) Cytochrome bd oxidase and bacterial tolerance to

cytochrome bd ubiquinol oxidase is essential for assembly

oxidative and nitrosative stress, Biochim. Biophys. Acta,

and stability of the di heme active site, FEBS Lett., 588,

1837, 1178-1187, doi: 10.1016/j.bbabio.2014.01.016.

1537-1541, doi: 10.1016/j.febslet.2014.03.036.

65.

Borisov, V.B., Forte, E., Siletsky, S.A., Arese, M.,

79.

Borisov, V., Arutyunyan, A.M., Osborne, J.P., Gennis, R.B.,

Davletshin, A.I., Sarti, P., and Giuffre, A.

(2015)

and Konstantinov, A.A. (1999) Magnetic circular dichro

Cytochrome bd protects bacteria against oxidative and

ism used to examine the interaction of Escherichia coli

nitrosative stress: a potential target for next generation

cytochrome bd with ligands, Biochemistry, 38, 740-750,

antimicrobial agents, Biochemistry (Moscow), 80, 565-575,

doi: 10.1021/bi981908t.

doi: 10.1134/S0006297915050077.

80.

Arutyunyan, A.M., Sakamoto, J., Inadome, M.,

66.

Borisov, V.B., Smirnova, I.A., Krasnosel’skaya, I.A., and

Kabashima, Y., and Borisov, V.B. (2012) Optical and mag

Konstantinov, A.A. (1994) Oxygenated cytochrome bd

neto optical activity of cytochrome bd from Geobacillus

from Escherichia coli can be converted into the oxidized

thermodenitrificans, Biochim. Biophys. Acta,

1817,

form by lipophilic electron acceptors, Biochemistry

2087-2094, doi: 10.1016/j.bbabio.2012.06.009.

(Moscow), 59, 437-443.

81.

Leonova, M.M., Fufina, T.Y., Vasilieva, L.G., and Shuvalov,

67.

Belevich, I., Borisov, V.B., Konstantinov, A.A., and

V.A. (2011) Structure function investigations of bacterial

Verkhovsky, M.I.

(2005) Oxygenated complex of

photosynthetic reaction centers, Biochemistry (Moscow), 76,

cytochrome bd from Escherichia coli: stability and photola

1465-1483, doi: 10.1134/S0006297911130074.

bility, FEBS Lett., 579, 4567-4570, doi: 10.1016/j.febslet.

82.

Murali, R., and Gennis, R.B. (2018) Functional impor

2005.07.011.

tance of Glutamate 445 and Glutamate 99 in proton cou

68.

Belevich, I., Borisov, V.B., Bloch, D.A., Konstantinov, A.A.,

pled electron transfer during oxygen reduction by

and Verkhovsky, M.I.

(2007) Cytochrome bd from

cytochrome bd from Escherichia coli, Biochim. Biophys.

Azotobacter vinelandii: evidence for high affinity oxygen bind

Acta, 1859, 577-590, doi: 10.1016/j.bbabio.2018.04.012.

ing, Biochemistry, 46, 11177-11184, doi: 10.1021/bi700862u.

83.

Borisov, V.B., and Verkhovsky, M.I. (2015) Oxygen as

69.

Avetisyan, A.V., Bogachev, A.V., Murtasina, R.A., and

acceptor, EcoSal Plus, 6, doi: 10.1128/ecosalplus.ESP

Skulachev, V.P. (1992) Involvement of a d type oxidase in

0012 2015.

the Na⁺ motive respiratory chain of Escherichia coli grow

84.

Forte, E., Borisov, V.B., Davletshin, A., Mastronicola, D.,

ing under low Δμ_H+ conditions, FEBS Lett., 306, 199-202,

Sarti, P., and Giuffre, A. (2013) Cytochrome bd oxidase

doi: 10.1016/0014 5793(92)80999 W.

and hydrogen peroxide resistance in Mycobacterium tuber

70.

Forte, E., Borisov, V.B., Falabella, M., Colaco, H.G.,

culosis, MBio, 4, e01006-e01013, doi: 10.1128/mBio.

Tinajero Trejo, M., Poole, R.K., Vicente, J.B., Sarti, P.,

01006 13.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

14*

1732

БОРИСОВ, СИЛЕЦКИЙ

85. Borisov, V.B., Sedelnikova, S.E., Poole, R.K., and

gand heme interactions in the high affinity quinol oxidase

Konstantinov, A.A. (2001) Interaction of cytochrome bd

bd: a di heme active site? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,

with carbon monoxide at low and room temperatures: evi

1554-1559, doi: 10.1073/pnas.030528197.

dence that only a small fraction of heme b₅₉₅ reacts with

94. Borisov, V.B., Liebl, U., Rappaport, F., Martin, J.L.,

CO, J. Biol. Chem., 276, 22095-22099, doi: 10.1074/jbc.

Zhang, J., Gennis, R.B., Konstantinov, A.A., and Vos, M.H.

M011542200.

(2002) Interactions between heme d and heme b₅₉₅ in

86. Borisov, V.B., and Verkhovsky, M.I. (2013) Accommoda

quinol oxidase bd from Escherichia coli: a photoselection

tion of CO in the di heme active site of cytochrome bd ter

study using femtosecond spectroscopy, Biochemistry, 41,

minal oxidase from Escherichia coli, J. Inorg. Biochem.,

1654-1662, doi: 10.1021/bi0158019.

118, 65-67, doi: 10.1016/j.jinorgbio.2012.09.016.

95. Borisov, V.B. (2008) Interaction of bd type quinol oxidase

87. Siletsky, S.A., Dyuba, A.V., Elkina, D.A., Monakhova, M.V.,

from Escherichia coli and carbon monoxide: heme d binds

and Borisov, V.B. (2017) Spectral kinetic analysis of

CO with high affinity, Biochemistry (Moscow), 73, 14-22,

recombination reaction of heme centers of bd type quinol

doi: 10.1134/S0006297908010021.

oxidase from Escherichia coli with carbon monoxide,

96. Rappaport, F., Zhang, J., Vos, M.H., Gennis, R.B., and

Biochemistry (Moscow), 82, 1354-1366, doi: 10.1134/

Borisov, V.B. (2010) Heme heme and heme ligand inter

S000629791711013X.

actions in the di heme oxygen reducing site of cytochrome

88. Arutyunyan, A.M., Borisov, V.B., Novoderezhkin, V.I.,

bd from Escherichia coli revealed by nanosecond absorption

Ghaim, J., Zhang, J., Gennis, R. B., and Konstantinov,

spectroscopy, Biochim. Biophys. Acta, 1797, 1657-1664,

A.A. (2008) Strong excitonic interactions in the oxygen

doi: 10.1016/j.bbabio.2010.05.010.

reducing site of bd type oxidase: the Fe to Fe distance

97. Paulus, A., Rossius, S.G., Dijk, M., and de Vries, S. (2012)

between hemes d and b₅₉₅ is 10 Å, Biochemistry, 47,

Oxoferryl porphyrin radical catalytic intermediate in

1752-1759, doi: 10.1021/bi701884g.

cytochrome bd oxidases protects cells from formation of

89. Siletsky, S.A., Rappaport, F., Poole, R.K., and Borisov, V.B.

reactive oxygen species, J. Biol. Chem., 287, 8830-8838,

(2016) Evidence for fast electron transfer between the high

doi: 10.1074/jbc.M111.333542.

spin haems in cytochrome bd I from Escherichia coli, PLoS

98. Borisov, V.B., Forte, E., Sarti, P., and Giuffre, A. (2011)

One, 11, e0155186, doi: 10.1371/journal.pone.0155186.

Catalytic intermediates of cytochrome bd terminal oxidase

90. Siletsky, S.A., Zaspa, A.A., Poole, R.K., and Borisov, V.B.

at steady state: ferryl and oxy ferrous species dominate,

(2014) Microsecond time resolved absorption spec

Biochim. Biophys. Acta, 1807, 503-509, doi: 10.1016/

troscopy used to study CO compounds of cytochrome bd

j.bbabio.2011.02.007.

from Escherichia coli, PLoS One, 9, e95617, doi: 10.1371/

99. Yang, K., Borisov, V.B., Konstantinov, A.A., and Gennis, R.B.

journal.pone.0095617.

(2008) The fully oxidized form of the cytochrome bd quinol

91. Borisov, V., Gennis, R., and Konstantinov, A.A. (1995)

oxidase from E. coli does not participate in the catalytic

Peroxide complex of cytochrome bd: kinetics of generation

cycle: direct evidence from rapid kinetics studies, FEBS

and stability, Biochem. Mol. Biol. Int., 37, 975-982.

Lett., 582, 3705-3709, doi: 10.1016/j.febslet.2008. 09.038.

92. Borisov, V.B., Gennis, R.B., and Konstantinov, A.A. (1995)

100. Azarkina, N., Siletsky, S., Borisov, V., von Wachenfeldt, C.,

Interaction of cytochrome bd from Escherichia coli with

Hederstedt, L., and Konstantinov, A.A.

(1999) A

hydrogen peroxide, Biochemistry (Moscow), 60, 231-239.

cytochrome bb’ type quinol oxidase in Bacillus subtilis

93. Vos, M.H., Borisov, V.B., Liebl, U., Martin, J.L., and

strain 168, J. Biol. Chem., 274, 32810-32817, doi: 10.1074/

Konstantinov, A.A. (2000) Femtosecond resolution of li

jbc.274.46.32810.

FEATURES OF ORGANIZATION AND MECHANISM

OF CATALYSIS OF TWO FAMILIES OF TERMINAL OXIDASES:

HEME COPPER AND bd TYPE

Review

V. B. Borisov*^,** and S. A. Siletsky

Belozersky Institute of Physico Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119991 Moscow, Russia; E mail: bor@belozersky.msu.ru, siletsky@belozersky.msu.ru

Received June 3, 2019

Revised July 9, 2019

Accepted July 10, 2019

Terminal oxidases of aerobic respiratory chains of organisms catalyze transfer of electrons from the respiratory substrate,

cytochrome c or quinol, to O₂ to form 2H₂O. There are two known families of these membrane integrated oxidoreduc

tases: heme copper oxidases and bd type oxidases (cytochromes bd), the latter being found only in prokaryotes. The

redox reaction catalyzed by these enzymes is coupled to the generation of a proton motive force which is used by the cell

to synthesize ATP and perform other useful work. Due to the presence of proton pump, heme copper oxidases generate

membrane potential with greater energy efficiency than cytochromes bd. The latter, however, play an important physio

logical role enabling bacteria, including pathogens, to survive and multiply in unfavorable environment. The recent data

on the organization and molecular mechanisms of functioning of the two families’ terminal oxidases are reviewed.

Keywords: respiratory chain, terminal oxidase, cytochrome oxidase, cytochrome bd, heme, catalytic cycle, oxygen

intermediates, membrane potential, proton pump

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019