БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 11, с. 1759 - 1768

УДК 576.385.5

ВЛИЯНИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

НА ЭКСПРЕССИЮ МАРКЕРОВ ОПУХОЛЕВЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК, ЭПИТЕЛИАЛЬНО МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА

И РЕТИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

O. Исаев¹, Ю. Джу², Е. Гасимов¹, Дж. Вернер³, А.В. Бажин³*^,**

¹ Department of Histology, Embryology and Cytology, Azerbaijan Medical University,

Baku, Azerbaijan; E Mail: isayev.orkhan@yahoo.com, geldar1949@gmail.com

² International Joint Laboratory for Cell Medical Engineering of Henan Province, Department of Oncology,

Henan University Huaihe Hospital, Kaifeng, Henan 475000, People’s Republic of China; E mail: celltransplant@163.com

³ Department of General, Visceral, and Transplantation Surgery, Ludwig Maximilians University Munich,

Munich 81377, Germany; E mail: alexandr.bazhin@med.uni muenchen.de

Поступила в редакцию 14.05.2019

После доработки 14.05.2019

Принята к публикации 14.05.2019

Есть много данных, свидетельствующих о том, что опухолевые стволовые клетки (CSC - cancer stem cells),

процесс эпителиально мезенхимального перехода (EMT - epithelial mesenchymal transition), а также

экспрессия и функционирование ретиноидных рецепторов являются ключевыми признаками возникнове

ния опухоли, ее прогрессирования и развития устойчивости к действию химиотерапевтических агентов. Это

положение также верно для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC - pancreatic ductal

adenocarcinoma), которая является клинической проблемой в связи c ухудшающейся ситуацией с распрост

раненностью этого заболевания. Поэтому понимание вышеупомянутых особенностей может открыть но

вые возможности для разработки будущих стратегий лечения PDAC. Главной целью настоящей работы бы

ло изучение взаимосвязей между опухолевыми стволовыми клетками, эпителиально мезенхимальным пе

реходом и ретиноидными рецепторами в клетках аденокарциномы протоков поджелудочной железы после

их обработки химиотерапевтическими препаратами: гемцитабином и 5 фторурацилом. Нами были выявле

ны различия в уровне экспрессии маркеров CSC и EMT, а также ретиноидных рецепторов в нативных клет

ках линий MiaPaca и Panc1 аденокарциномы протоков поджелудочной железы. Кроме того, было показано,

что эти линии клеток также различаются по степени развития спонтанного апоптоза и их распределению по

различным фазам клеточного цикла. Также нами было показано, что химиотерапия вызывает снижение ко

личества опухолевых клеток, находящихся в S фазе клеточного цикла. Более того, было обнаружено, что

гемцитабин и 5 фторурацил модулируют экспрессию маркеров CSC, а именно e кадгерина и RXRβ в клет

ках Panc1, но не в клетках линии MiaPaca. Мы предположили, что эти эффекты можно объяснить различи

ем в базальном уровне экспрессии исследуемых генов. Полученные результаты могут представлять интерес

в плане проведения дальнейших доклинических исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аденокарцинома протоков поджелудочной железы, опухолевые стволовые клетки,

эпителиально мезенхимальный переход, ретиноидные рецепторы.

DOI: 10.1134/S0320972519110162

Аденокарцинома желчных протоков подже

них клинических симптомов, а также наличия

лудочной железы (PDAC - pancreatic ductal ade

метастазов на момент постановки диагноза,

nocarcinoma) является одной из наиболее опас

только ~20% больных могли быть подвергнуты

ных форм рака во всем мире. Она характеризу

хирургическому лечению [2]. Частично такая

ется высокой смертностью и общей 5 летней

ситуация обусловлена недостаточным понима

выживаемостью <5% [1]. Из за отсутствия ран

нием патофизиологии этого заболевания. В слу

чае невозможности оперировать больных

PDAC, их лечат химиотерапевтическими сред

Принятые сокращения: CSC - опухолевые стволо

вые клетки, EMT - эпителиально мезенхимальный пере

ствами, в том числе гемцитабином (gemcitabine

ход, PDAC - аденокарцинома протоков поджелудочной

или gem) и/или 5 фторурацилом (5 FU - 5 fluo

железы, gem - гемцитабин, 5 FU - 5 фторурацил, RAR -

рецепторы ретиноевой кислоты, RXR - рецепторы рети

rouracil), а также смесью этих веществ [1]. Ана

ноида X.

лог пиримидина - gem в настоящее время явля

* Адресат для корреспонденции.

ется стандартным химиотерапевтическим сред

** Автор является выпускником кафедры биохимии биоло

ством, которое применяется для лечения боль

гического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

ных с метастазами или неоперабельными опухо

1759

1760

ИСАЕВ и др.

лями поджелудочной железы. Его применяют

влияние гемцитабина и 5 фторурацила на рецеп

как в отдельности, так и в сочетании с другими

торы ретиноидов до сих пор изучено не было.

лекарствами. 5 FU принадлежит к группе фтор

Поэтому целью настоящей работы было

пиримидинов. Его также используют при пал

изучение взаимосвязей между опухолевыми

лиативной терапии PDAC в отдельности [3] или

стволовыми клетками, эпителиально мезенхи

в комбинации с другими химиотерапевтически

мальным переходом и ретиноидными рецепто

ми средствами, например, в рамках лечения в

рами в линиях клеток аденокарциномы прото

режиме ФОЛФЕРИНОКС (FOLFIRINOX) [4].

ков поджелудочной железы в нативных услови

Однако результаты лечения больных с исполь

ях и после обработки клеток химиотерапевти

зованием этих препаратов весьма скромны. Ра

ческими препаратами, гемцитабином и 5 фтор

нее нами были продемонстрированы иммуно

урацилом.

модулирующие свойства химиотерапевтических

препаратов, которые могли бы быть использова

ны для разработки новых иммунотерапевтичес

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ких подходов [5-7].

Все больше данных говорит в пользу того, что

Реактивы. В работе использовали следующие

опухолевые стволовые клетки (CSC - cancer stem

реактивы: линии клеток MiaPaca и Panc1 адено

cells) участвуют в возникновении опухолей, спо

карциномы протоков поджелудочной железы

собствуют их развитию и ответственны за воз

человека были получены от ATCC, США; среда

никновение метастазов [8]. В целом, основными

RPMI 1640 («Gibco», Германия); фетальная

поверхностными маркерами CSC для солидных

бычья сыворотка («PAN Biotech», Германия); ан

опухолей являются CD24, CD44 и CD133 [9]. In

тибиотики («Sigma», Германия); вода, не содер

vitro, в клеточных линиях PDAC, все эти маркеры

жащая примесей РНКаз, наборы RNeasy Mini

были установлены для того, чтобы обнаружить

Kit, QuantiNova Reverse Transcription Kit,

PDAC CSC в культуре клеток [10]. Эпителиаль

QuantiTect Primer Assays, QuantiNova SYBR Green

но мезенхимальный переход (ЕМТ) важен для

PCR Kit («Qiagen», Германия), конъюгирован

развития многих органов, в том числе поджелу

ный с красителем APC CD24, FITC конъюгиро

дочной железы. ЕМТ является стержневым меха

ванные CD44 антитела и 7AAD («Biolegend», Гер

низмом метастазирования PDAC и отвечает за

мания) и конъюгированные с красителем PE

преобразование клеток PDAC от низкой до вы

CD133 антитела («eBioscience», Германия). На

сокой степени злокачественности [11]. Рецепто

бор реактивов для проточной цитометрии BD

ры ретиноидов, которые относятся к лиганд за

Pharmingen BrdU Flow Kit (APC BrdU Flow Kit)

висимому транскрипционному фактору суперсе

(«BD Pharmingen», Германия).

мейства рецепторов ядерных гормонов, служат

Линии клеток. Клетки аденокарциномы про

рецепторами для всех транс ретиноевых кислот.

токов поджелудочной железы поддерживали в

Существует две группы рецепторов: (i) рецепто

виде монослоя. Перед проведением пассирова

ры ретиноевой кислоты (RAR) и (ii) рецепторы

ния раствор трипсина и культуральную среду

ретиноида X (RXR). Было идентифицировано

нагревали в водяной бане до 37 °С. Клетки куль

несколько изотипов RAR и RXR: RARα, RARβ,

тивировали в среде RPMI 1640, дополненной

RARγ, RXRα, RXRβ и RXRγ [12]. Ранее нами бы

10% ной фетальной бычьей сывороткой, в при

ло показано, что при аденокарциноме протоков

сутствии 1% пенициллина и стрептомицина, и

поджелудочной железы существует связь между

инкубировали при 37 °С в увлажненной атмос

опухолевыми стволовыми клетками, эпители

фере из 5% CO₂ и 95% воздуха. Клетки пассиро

ально мезенхимальным переходом и ретиноид

вали дважды в неделю до достижения состояния

ными рецепторами и их лигандами [13, 14].

70-80% ной конфлуентности. Культуральную

Получены доказательства накопления CSC в

среду меняли каждые 2-3 дня. Все клетки про

солидных опухолях человека, в том числе при

веряли на наличие микоплазм в кондициониру

PDAC, при терапевтическом использовании gem

емой клеточной среде с использованием ПЦР,

и 5 FU [15]. На мышах, в условиях in vivo, было

согласно внутренним стандартам проведения

показано, что при обработке ксенографтов

процедуры (SOPs).

PDAC, полученных от пациентов после лечения

Обработка опухолевых клеток химиотерапев

gem, наблюдается индукция EMT [16]. В случае

тическими препаратами. Линии клеток PDAC

5 FU также показана активация EMT в условиях

высевали в 12 луночные планшеты, плотность

in vitro в опухолевых клетках при колоректальном

клеток составляла 2 × 10⁵ клеток на 1 мл и остав

раке [17], что указывает на влияние химиотера

ляли на 24 ч. После этого клетки обрабатывали в

певтических препаратов на индукцию эпители

течение 24 ч в присутствии 5 FU (450 мкМ) или

ально мезенхимального перехода. В то же время

gem (15 мкМ).

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ХИМИОТЕРАПИЯ И ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ CSC И EMT

1761

Получение препарата суммарной мРНК из

ния в течение 10 с при 60 °C. Для нормализации

культивированных клеток. Препарат суммарной

полученных данных в качестве конститутивного

мРНК из культивированных клеток получали с

гена использовали мРНК глицероальдегид

использованием набора RNeasy Mini Kit в соот

фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Для расчетов

ветствии с инструкциями производителя и как

изменений уровня экспрессии генов использо

было описано во многих источниках [18]. Коли

вали ранее описанный метод 2-ΔΔCt [19].

чество РНК определяли с помощью NanoDrop

Определение маркеров CSC с помощью метода

One («Thermo Fisher», Германия). Качество по

проточной цитометрии (FACS). FACS осущес

лученных препаратов мРНК оценивали по зна

твляли, как описано ранее [10]. Вкратце: после

чению A260/A280 (A260/A280 value).

обработки клетки PDAC собирали, переносили

Количественный ПЦР анализ с использовани

в полистирольные пробирки объемом 5 мл и ин

ем SYBR Green. Геномную ДНК удаляли из об

кубировали при комнатной температуре в тем

разцов РНК перед началом обратной тран

ноте в течение 15 мин с флуоресцентно мечены

скрипции с помощью набора QuantiNova

ми APC конъюгированными CD24, FITC конъ

Reverse Transcription Kit, используя 1000 нг РНК

югированными CD44 антителами, а также с

из каждого образца. Реакционные смеси для

конъюгированными с красителем PE антитела

удаления геномной ДНК (общий объем состав

ми к CD133 и 7AAD. После проведения инкуба

лял 15 мкл) включали 2 мкл смеси gDNA

ции клетки дважды промывали, ресуспендиро

Removal Mix и различные объемы РНК матри

вали в 300 мкл буфера для окрашивания и ана

цы (Template RNA) и воды, свободной от приме

лизировали на проточном цитометре BD

сей РНКаз. После инкубации в течение 2 мин

LSRFortess («BD Biosciences», США). Оценку

при 45 °С пробирки сразу помещали в лед. По

полученных результатов проводили с использо

сле этого для каждой пробирки во льду готовили

ванием программы FlowJo V10.1.

5 мкл смеси для проведения обратной тран

Анализ клеточного цикла и апоптоза клеток.

скрипции (1 мкл раствора обратной транскрип

Обработанные клетки PDAC тщательно марки

тазы и 4 мкл смеси для проведения обратной

ровали 1 мМ BrdU и инкубировали в течение 1 ч

транскрипции). Затем в каждую пробирку, со

в атмосфере 5% CO₂при температуре 37 °C. За

держащую 15 мкл РНК матрицы (после удале

тем клетки обрабатывали набором BD Pharmingn

ния ДНК), добавляли по 5 мкл раствора обрат

BrdU Flow Kit (APC BrdU Flow Kit) и анализиро

ной транскриптазы. Реакцию обратной тран

вали с помощью прибора BD LSRFortessa в соот

скрипции проводили в термоблоке Thermomixer

ветствии с инструкциями производителя.

comfort («Eppendorf», Германия) в течение 3 мин

Статистическая обработка полученных резуль

при 25 °C и 10 мин при 45 °С, затем обратную

татов. Для статистического анализа полученных

транскриптазу инактивировали инкубацией в

данных была использована программа GraphPad

течение 5 мин при 85 °С. Образцы разводили 10×

Prism Version 7.01. Распределения непрерывных

водой, не содержащей примесей РНКаз.

переменных описывались средним значением,

Экспрессию генов определяли с помощью

SD, медианой, 25% и 75% процентилями и

набора QuantiNova SYBR Green PCR Kit соглас

представлялись в виде столбчатых гистограмм

но инструкциям производителя и как описано в

или в виде диаграмм размаха. Нулевая гипотеза

литературе [13]. Вкратце, в каждую лунку с реак

(средние значения были равны) по сравнению с

ционной смесью в 96 луночном планшете до

альтернативной гипотезой (средние значения не

бавляли 2 мкл раствора предварительно синте

были равны) проверялась с использованием не

зированной кДНК. Реакционная смесь содер

парного двустороннего критерия Стьюдента (для

жала следующие компоненты: 10 мкл смеси 2×

двух групп) и однофакторного дисперсионного

QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix, 2 мкл

анализа ANOVA с поправкой Бонферрони (для

смеси праймеров 10× QuantiTect Primers, 2 мкл

более чем двух групп). Значимым считалось зна

красителя QuantiNova ROX Reference Dye и

чение р < 0,05. Корреляционный анализ непара

4 мкл воды, свободной от РНКаз. Затем 96 лу

метрических данных проводили с использовани

ночный планшет центрифугировали в течение

ем корреляции Спирмена. Все статистические

1 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха. Поли

тесты были двухсторонними. Уровень значимос

меразную цепную реакцию проводили на при

ти α был равен 5%.

боре StepOnePlus™ Real Time PCR System

(«Thermo Fisher», Германия). Были выставлены

следующие параметры: 2 мин начальной актива

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ции ПЦР при 95 °С, затем 40 двухэтапных цик

лов, состоящих из денатурации при 95 °C в тече

Клеточные линии MiaPaсa и Panc1 различают

ние 5 с и комбинированного отжига и удлине

ся по уровню экспрессию маркеров CSC и EMT,

16 БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1762

ИСАЕВ и др.

Comp PE A :: CD133

Comp PE A

Comp FITC A :: CD44

Comp FITC A

Comp PE A :: CD133

Comp PE A

Рис. 1. Экспрессия маркеров опухолевых стволовых клеток (CSC) на поверхности клеток линии Panc1 и MiaPaca.

а - Экспрессия CD133, CD44/CD133 и CD24/CD44/CD133 человека была измерена с помощью метода проточной цито

метрии (FACS). Данные представлены в виде столбчатых гистограмм (среднее значение ± SD) (n = 5-6), * p < 0,05,

** p < 0,01 и *** p < 0,001. б - Представлены репрезентативные картины результатов проточной цитометрии.

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

ретиноидных рецепторов, а также по уровню спон

тем, что EMT маркеры e кадгерин и виментин,

танного апоптоза и фазам клеточного цикла. Была

а также рецепторы ретиноидов локализуются

продемонстрирована экспрессия CD24, CD44 и

внутри клеток, мы решили измерить их экспрес

CD133 на поверхности клеток MiaPaCa и Panc1

сию на уровне мРНК с помощью метода ПЦР в

(не показано). Значительные различия между

реальном времени. Было показано, что клетки

этими клеточными линиями были обнаружены

Panc1 обладают более высокой экспрессией

в случае экспрессии CD133, двойной экспрес

e кадгерина и RXRβ по сравнению с клетками

сии CD44/CD133 и тройной экспрессии CD24/

MiaPaca (рис. 2). В то же время мы не смогли об

CD44/CD133 (рис. 1), что указывает на возмож

наружить существенных различий в уровне

ное накопление CSC в клетках Panc1. В связи с

экспрессии виментина и других рецепторов ре

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ХИМИОТЕРАПИЯ И ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ CSC И EMT

1763

тиноидов между изучаемыми нами клеточными

5 FU клеток Panc1. В случае клеток MiaPaca та

линиями (не показано).

кой эффект действия лекарств выявлен не был

Поскольку мы планировали исследовать

(рис. 6). Эти результаты свидетельствуют о пере

влияние химиотерапии на экспрессию выше

ходе клеток линии Panc1 в состояние мезенхи

упомянутых белков и генов, нам было интерес

мы. Химиотерапевтические препараты не ока

но узнать разницу между этими двумя клеточ

зывали влияния на экспрессию виментина в обе

ными линиями в плане развития у них процесса

их линиях клеток (не показано). Уровень

спонтанного апоптоза и протекания клеточного

экспрессии RXRβ также снижался в результате

цикла. Поэтому сначала мы провели анализ кле

обработки клеток Panc1 и оставался без видимых

ток, находящихся в нативном состоянии, т.е. без

изменений в клетках линии MiaPaca (рис. 6). Не

добавления химиотерапевтических препаратов,

обходимо подчеркнуть, что в случае обработки

с помощью BrdU/7AAD. В результате проведе

клеток 5 фторурацилом наблюдалась строгая

ния анализа было выяснено, что клетки MiaPaca

положительная корреляция между экспрессией

характеризуются более высоким уровнем спон

виментина и RXRα (r = 1, p = 0,08). В то же вре

танного апоптоза по сравнению с клетками

мя в клетках, не подвергавшихся обработке хи

Panc1 (рис. 3). В то же время наблюдалось сни

миотерапевтическими препаратами, корреля

жение уровня пролиферации клеток MiaPaca,

ции обнаружено не было (r = 0,6, p = 0,42).

находящихся в состоянии митоза (рис. 3). На

этом основании можно предположить, что клет

ки MiaPaca обладают меньшей способностью к

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

пролиферации, предположительно из за воз

никновения спонтанного апоптоза.

Увеличение количества CSC в результате

В завершение необходимо подчеркнуть, что

применения химиотерапевтических препаратов

клетки MiaPaca показывали отрицательную кор

является одной из наиболее часто обсуждаемых

реляцию между CD133⁺ и клетками, находящи

сторон побочных эффектов, возникающих при

мися в состоянии апоптоза (r = -0,9, p = 0,08). В

проведении химиотерапии рака. Кроме того, ус

то же время в случае клеток Panc1 нами была об

тойчивость различных опухолей к действию

наружена положительная корреляция между

экспрессией RXRα и CD24 (r = 1, p = 0,07).

Гемцитабин и 5 фторурацил снижают количе

ство опухолевых клеток, находящихся в S фазе

клеточного цикла. На следующем этапе мы обра

ботали клетки из обеих линий препаратами gem

или 5 FU и затем проанализировали их клеточ

ный цикл. Необходимо отметить, что нам не уда

лось обнаружить какие либо существенные раз

личия между этими клетками, находящимися в

фазе M или G0/G1. Также не было выявлено раз

личий в количестве клеток, находящихся в ста

дии апоптоза (рис. 4). Однако оба химиотерапев

тических препарата вызвали снижение количе

ства клеток, находящихся в S фазе (рис. 4), что

отражает нарушение процесса репликации ДНК

в результате действия этих лекарств.

Химиотерапевтические препараты модулируют

экспрессию маркеров CSC (e кадгерин) и RXRβ в

клетках Panc1, но не в клетках MiaPaca. На зак

лючительном этапе нами было проведено изме

рение уровня экспрессии поверхностных марке

ров CSC и мРНК e кадгерина и рецепторов ре

тиноидов в клетках MiaPaca и Panc1 после обра

ботки gem и 5 FU. Было выявлено увеличение

тройных положительных по CD24/CD44/CD133

Рис. 2. Экспрессия e кадгерина и рецептора RXRβ на клет

клеток в культуре Panc1, но не наблюдалось в

ках Panc1 и MiaPaca. Экспрессию генов определяли с по

культуре клеток MiaPaca (рис. 5). Что касается

мощью метода ПРЦ в реальном времени. Полученные

экспрессии маркеров EMT, то экспрессия мРНК

данные представлены в виде диаграмм размаха (n = 6-7),

e кадгерина снижалась после обработки gem и

** p < 0,01 и *** p < 0,001

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

16*

1764

ИСАЕВ и др.

PerCP Cv5 5 A :: 7AAD

Рис. 3. Анализ протекания клеточного цикла у клеток Panc1 и MiaPaca. а - Обобщенные данные представлены в виде

столбчатых гистограмм (среднее значение ± SD) (n = 4-6), * p < 0,05. б - Представлены репрезентативные картины ре

зультатов определения клеточного цикла FACS.

С цветным вариантом рис. 3 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

противораковых препаратов также может быть

CD24, CD44 и CD133. В настоящей работе с ис

связана с накоплением CSC [15]. Поэтому необ

пользованием другого набора линий клеток:

ходимо более глубокое понимание роли опухо

аденокарциномы протоков поджелудочной же

левых столовых клеток при проведении химио

лезы и другой системы измерения, нами были

терапии, в особенности в случае аденокарцино

получены результаты, которые подтвердили по

мы протоков поджелудочной железы, которая

лученные ранее данные и продемонстрировали

является одной из наиболее устойчивых к химио

повышенные количества этих белков в клетках

терапии форм рака. Для решения этой пробле

PDAC линии Panc1 в сравнении с клетками ли

мы необходимо разработать доклинические мо

нии MiaPaca [10]. Также была показана стабиль

дели in vitro с использованием линий опухоле

ность этих маркеров при проведении пассажей

вых клеток. Чтобы изучить влияние химиотера

клеток. В связи с тем, что клетки линии MiaPaca

певтических препаратов, таких как гемцитабин

показали меньшую скорость пролиферации, и

и 5 фторурацил, на линии опухолевых клеток,

они в меньшей степени были подвержены спон

нами был проведен анализ уровня экспрессии

танному апоптозу по сравнению с клетками ли

широко известных CSC маркеров, таких как

нии Panc1, нами были сделаны выводы о том,

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ХИМИОТЕРАПИЯ И ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ CSC И EMT

1765

что эти различия связаны с присутствием CSC,

5 фторурацила. Однако было обнаружено сни

что соответствует общей теории этих клеток [8],

жение продолжительности S фазы клеточного

а также укладывается в контекст биологии

цикла, что показывает проявление начальной

PDAC [20].

стадии цитотоксичности из за действия этих ле

Признавая CSC в качестве возможной при

карств. Обработка клеток обоими химиотера

чины возникновения хеморезистентности, мы

певтическими препаратами, исследованными в

обработали клеточные линии с различным ко

нашей работе, вызывало накопление CSC в

личеством CSC стандартными химиотерапевти

клетках линии Panc1, что также согласуется с ра

ческими препаратами - gem и 5 FU. В соответ

нее опубликованными данными [23, 24]. Удиви

ствии с некоторыми ранее опубликованными

тельно, что этот эффект наблюдался только в

данными [21, 22] обе линии клеток, протестиро

клетках линии Panc1 и не был выявлен в клетках

ванные в настоящей работе, обладают выражен

MiaPaca. Пока неясно, в чем заключается при

ной устойчивостью к действию гемцитабина и

чина этого несоответствия. Может быть это свя

PerCP Cv5 5 A :: 7AAD

Рис. 4. Анализ клеточного цикла в клетках линии Panc1 и MiaPaca после их обработки гемцитабином и 5 фторурацилом.

а - Обобщенные данные представлены в виде столбчатых гистограмм (среднее значение ± SD) (n = 5-6), ** p < 0,01.

б - Представлены репрезентативные картины результатов определения клеточного цикла FACS.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1766

ИСАЕВ и др.

Рис. 5. Экспрессия маркеров опухолевых стволовых клеток на поверхности клеток линии Panc1 и MiaPaca после их обра

ботки gem и 5 FU. а - Экспрессия CD133, CD44/CD133 и CD24/CD44/CD133 человека, определенная с помощью FACS.

Данные представлены в виде столбчатых гистограмм (среднее значение ± SD) (n = 5-6), * p < 0,05 и ** p < 0,01. б - Предс

тавлены репрезентативные картины результатов FACS.

С цветным вариантом рис. 5 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

зано с исходными различиями в количестве CSC

и/или различном катаболизме этих лекарств в

анализируемых линиях клеток. Однако в нашей

предыдущей работе по изучению влияния ин

терферона α на опухолевые стволовые клетки в

линиях клеток Panc1 и MiaPaca также было про

демонстрировано различие в накоплении CSC в

***

этих клеточных линиях [10]. Поэтому мы дума

ем, что существование таких различий может

действительно быть объяснено исходным коли

чеством опухолевых стволовых клеток.

Между CSC и процессом эпителиально ме

зенхимального перехода есть много общего.

Особенно это касается их роли в развитии ус

тойчивости клеток к действию химиотерапевти

***

ческих агентов [8]. Кроме того, недавно было

показано, что экспрессия маркеров EMT корре

лирует с присутствием CSC в клетках аденокар

циномы протоков поджелудочной железы у че

ловека и мыши [13]. В настоящей работе на ос

нове экспрессии e кадгерина показано, что

клетки Panc1 обладают более выраженным эпи

телиальным фенотипом по сравнению с клетка

Рис. 6. Экспрессия e кадгерина и RXRβ в клетках Panc1 и

ми Mia Paca, что также согласуется с результата

MiaPaca, обработанных gem и 5 FU. Экспрессия генов оп

ми других исследований [25, 26]. Влияние химио

ределялась с помощью метода ПЦР в реальном времени.

терапевтических препаратов на процесс EMT

Полученные данные представлены в виде диаграмм разма

был показан в случае различных солидных опу ха (n = 4-7), * p < 0,05, ** p < 0,01 и *** p < 0,001

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ХИМИОТЕРАПИЯ И ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ CSC И EMT

1767

холей [17, 27-29], включая PDAC [16, 25, 30].

зультаты интересными с точки зрения будущих

Также в нашей работе было выявлено снижение

доклинических исследований.

экспрессии e кадгерина в клетках линии Panc1 в

В целом, нами косвенно было продемон

отличие от клеток линии MiaPaca.

стрировано существование взаимосвязей между

До сих пор нет данных о связи химиотерапии

опухолевыми стволовыми клетками, эпители

с ретиноидными рецепторами. Однако не вызы

ально мезенхимальным переходом и ретиноид

вает сомнений значение этих рецепторов, т.е.

ными рецепторами. Экспрессия маркеров CSC

снижение уровня их экспрессии в клетках PDAC

и процесса EMT, а также вышеупомянутых ре

по сравнению с нормальными клетками, корре

тиноидных рецепторов модулируется химиоте

ляция с маркерами дифференцировки клеток, а

рапевтическими препаратами, такими как гем

также их значение для предсказания выживае

цитабин и 5 фторурацил. Эти эффекты зависят

мости больных аденокарциномой протоков

от уровня экспрессии их генов.

поджелудочной железы [13]. Кроме того, базо

вый уровень RXRβ, исследованный в настоящей

работе, оказался ниже в клетках линии MiaPaca

Благодарности. Авторы выражают благодар

по сравнению с клетками Panc1. Следует отме

ность Микаэле Свихла и Томми Бауэру за ока

тить, что в клетках Panc1 химиотерапевтические

занную замечательную техническую помощь и

препараты индуцировали пониженную регуля

Маре Таверне за административную поддержку.

цию RXRβ и корреляцию с EMT. В этом плане

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

есть только одно сообщение, описывающее пред

них нет конфликтов интересов.

отвращение возникновения резистентности к

Соблюдение этических норм. Настоящая

действию гемцитабина в клетках немелкокле

статья не содержит каких либо исследований с

точного рака легких в результате действия се

участием людей или использованием животных

лективного агониста [31], что делает наши ре в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Werner, J., Combs, S. E., Springfeld, C., Hartwig, W.,

8. Hanahan, D., and Weinberg, R.A. (2011) Hallmarks of

Hackert, T., and Buchler, M.W. (2013) Advanced stage

cancer: the next generation, Cell, 144, 646-674.

pancreatic cancer: therapy options, Nat. Rev. Clin. Oncol.,

9. Tirino, V., Desiderio, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, F.,

10, 323-333.

La Noce, M., Laino, L., De Francesco, F., and Papaccio, G.

Hartwig, W., Werner, J., Jager, D., Debus, J., and Buchler, M.W.

(2013) Cancer stem cells in solid tumors: an overview and

(2013) Improvement of surgical results for pancreatic can

new approaches for their isolation and characterization,

cer, Lancet Oncol., 14, e476-e485.

FASEB J., 27, 13-24.

Burris, H.A. 3rd, Moore, M.J., Andersen, J., Green, M.R.,

10. Zhu, Y., Karakhanova, S., Huang, X., Deng, S.P., Werner, J.,

Rothenberg, M.L., Modiano, M.R., Cripps, M.C.,

and Bazhin, A.V. (2014) Influence of interferon alpha on

Portenoy, R.K., Storniolo, A.M., Tarassoff, P., Nelson, R.,

the expression of the cancer stem cell markers in pancreat

Dorr, F.A., Stephens, C.D., and Von Hoff, D.D. (1997)

ic carcinoma cells, Exp. Cell Res., 324, 146-156.

Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine

11. Rhim, A.D., Mirek, E.T., Aiello, N.M., Maitra, A.,

as first line therapy for patients with advanced pancreas can

Bailey, J.M., McAllister, F., Reichert, M., Beatty, G.L.,

cer: a randomized trial, J. Clin. Oncol., 15, 2403-2413.

Rustgi, A.K., Vonderheide, R.H., Leach, S.D., and

Pusceddu, S., Ghidini, M., Torchio, M., Corti, F.,

Stanger, B.Z. (2012) EMT and dissemination precede pan

Tomasello, G., Niger, M., Prinzi, N., Nichetti, F., Coinu, A.,

creatic tumor formation, Cell, 148, 349-361.

Di Bartolomeo, M., Cabiddu, M., Passalacqua, R., de

12. Amann, P.M., Eichmuller, S.B., Schmidt, J., and Bazhin, A.V.

Braud, F., and Petrelli, F. (2019) Comparative effectiveness

(2011) Regulation of gene expression by retinoids, Curr.

of gemcitabine plus Nab Paclitaxel and FOLFIRINOX in

Med. Chem., 18, 1405-1412.

the first line setting of metastatic pancreatic cancer: a sys

13. Bleul, T., Ruhl, R., Bulashevska, S., Karakhanova, S.,

tematic review and meta analysis, Cancers (Basel), 11,

Werner, J., and Bazhin, A.V. (2015) Reduced retinoids and

E484, doi: 10.3390/cancers11040484.

retinoid receptors’ expression in pancreatic cancer: a link

Shevchenko, I., Karakhanova, S., Soltek, S., Link, J.,

to patient survival, Mol. Carcinog., 54, 870-879.

Bayry, J., Werner, J., Umansky, V., and Bazhin, A.V. (2013)

14. Bazhin, A.V., Bleul, T., de Lera, A.R., Werner, J., and

Low dose gemcitabine depletes regulatory T cells and

Ruhl, R. (2016) Relationship between all trans 13,14

improves survival in the orthotopic Panc02 model of pan

dihydro retinoic acid and pancreatic adenocarcinoma,

creatic cancer, Int. J. Cancer, 133, 98-107.

Pancreas, 45, e29-e31.

Karakhanova, S., Mosl, B., Harig, S., von Ahn, K., Fritz, J.,

15. Martins Neves, S.R., Cleton Jansen, A.M., and

Schmidt, J., Jager, D., Werner, J., and Bazhin, A.V. (2014)

Gomes, C.M.F. (2018) Therapy induced enrichment of

Influence of interferon alpha combined with chemo (radio)

cancer stem like cells in solid human tumors: where do we

therapy on immunological parameters in pancreatic adeno

stand? Pharmacol. Res., 137, 193-204.

carcinoma, Int. J. Mol. Sci., 15, 4104-4125.

16. Bulle, A., Dekervel, J., Libbrecht, L., Nittner, D.,

Fritz, J., Karakhanova, S., Brecht, R., Nachtigall, I.,

Deschuttere, L., Lambrecht, D., Van Cutsem, E., Verslype, C.,

Werner, J., and Bazhin, A.V. (2015) In vitro immunomod

and van Pelt, J. (2019) Gemcitabine induces epithelial to

ulatory properties of gemcitabine alone and in combination

mesenchymal transition in patient derived pancreatic ductal

with interferon alpha, Immunol. Lett., 168, 111-119.

adenocarcinoma xenografts, Am. J. Transl. Res., 11, 765-779.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1768

ИСАЕВ и др.

17.

Quan, Q., Zhong, F., Wang, X., Guo, L., and Chen, K.

25. Arumugam, T., Ramachandran, V., Fournier, K.F., Wang, H.,

(2019) PAR2 inhibition enhanced the sensitivity of colo

Marquis, L., Abbruzzese, J. L., Gallick, G.E., Logsdon,

rectal cancer cells to 5 FU and reduced EMT signaling,

C.D., McConkey, D.J., and Choi, W. (2009) Epithelial to

Oncol. Res., doi: 10.3727/096504018X15442985680348.

mesenchymal transition contributes to drug resistance in

18.

Bazhin, A.V., Tambor, V., Dikov, B., Philippov, P.P.,

pancreatic cancer, Cancer Res., 69, 5820-5828.

Schadendorf, D., and Eichmuller, S. B. (2010) cGMP

26. Zheng, X., Carstens, J.L., Kim, J., Scheible, M., Kaye, J.,

phosphodiesterase 6, transducin and Wnt5a/Frizzled 2

Sugimoto, H., Wu, C.C., LeBleu, V.S., and Kalluri, R.

signaling control cGMP and Ca(2+) homeostasis in

(2015) Epithelial to mesenchymal transition is dispens

melanoma cells, Cell. Mol. Life Sci., 67, 817-828.

able for metastasis but induces chemoresistance in pancre

19.

Schmittgen, T.D., and Livak, K.J. (2008) Analyzing real

atic cancer, Nature, 527, 525-530.

time PCR data by the comparative C(T) method, Nat.

27. Zhang, W., Feng, M., Zheng, G., Chen, Y., Wang, X., Pen,

Protoc., 3, 1101-1108.

B., Yin, J., Yu, Y., and He, Z. (2012) Chemoresistance to

20.

Diab, M., Azmi, A., Mohammad, R., and Philip, P.A.

5 fluorouracil induces epithelial mesenchymal transition

(2019) Pharmacotherapeutic strategies for treating pancre

via up regulation of Snail in MCF7 human breast cancer

atic cancer: advances and challenges, Expert. Opin.

cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 417, 679-685.

Pharmacother., 20, 535-546.

28. Wu, Q., Wang, R., Yang, Q., Hou, X., Chen, S., Hou, Y.,

21.

Chen, W.H., Horoszewicz, J.S., Leong, S.S., Shimano, T.,

Chen, C., Yang, Y., Miele, L., Sarkar, F. H., Chen, Y., and

Penetrante, R., Sanders, W.H., Berjian, R., Douglass, H.O.,

Wang, Z. (2013) Chemoresistance to gemcitabine in

Martin, E.W., and Chu, T.M. (1982) Human pancreatic

hepatoma cells induces epithelial mesenchymal transition

adenocarcinoma: in vitro and in vivo morphology of a new

and involves activation of PDGF D pathway, Oncotarget, 4,

tumor line established from ascites, In Vitro, 18, 24-34.

1999-2009.

22.

Sipos, B., Moser, S., Kalthoff, H., Torok, V., Lohr, M., and

29. Druzhkova, I., Ignatova, N., Prodanets, N., Kiselev, N.,

Kloppel, G. (2003) A comprehensive characterization of pan

Zhukov, I., Shirmanova, M., Zagainov, V., and Zagaynova, E.

creatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment

(2019) E Cadherin in colorectal cancer: relation to

of an in vitro research platform, Virchows Arch., 442, 444-452.

chemosensitivity, Clin. Colorectal Cancer, 18, e74-e86.

23.

Kim, S.K., Kim, H., Lee, D.H., Kim, T.S., Kim, T.,

30. Wang, R., Cheng, L., Xia, J., Wang, Z., Wu, Q., and Wang, Z.

Chung, C., Koh, G.Y., Kim, H., and Lim, D.S. (2013)

(2014) Gemcitabine resistance is associated with epithe

Reversing the intractable nature of pancreatic cancer by

lial mesenchymal transition and induction of HIF 1alpha

selectively targeting ALDH high, therapy resistant cancer

in pancreatic cancer cells, Curr. Cancer Drug Targets, 14,

cells, PLoS One, 8, e78130.

407-417.

24.

Was, H., Czarnecka, J., Kominek, A., Barszcz, K., Bernas, T.,

31. Tooker, P., Yen, W. C., Ng, S. C., Negro Vilar, A., and

Piwocka, K., and Kaminska, B. (2018) Some chemothera

Hermann, T. W. (2007) Bexarotene (LGD1069, Targretin),

peutics treated colon cancer cells display a specific pheno

a selective retinoid X receptor agonist, prevents and revers

type being a combination of stem like and senescent cell

es gemcitabine resistance in NSCLC cells by modulating

features, Cancer Biol. Ther., 19, 63-75.

gene amplification, Cancer Res., 67, 4425-4433.

INFLUENCE OF CHEMOTHERAPEUTICS ON EXPRESSION

OF THE CANCER STEM CELL AND EPITHELIAL MESENCHYMAL

TRANSITION MARKERS, AND RETINOID RECEPTORS

O. Isayev¹, Y. Zhu², E. Gasimov¹, J. Werner³, and A. V. Bazhin³*^,**

¹ Department of Histology, Embryology and Cytology, Azerbaijan Medical University,

Baku, Azerbaijan; E mail: isayev.orkhan@yahoo.com, geldar1949@gmail.com

² International Joint Laboratory for Cell Medical Engineering of Henan Province, Department of Oncology, Henan

University Huaihe Hospital, Kaifeng, Henan 475000, People’s Republic of China; E mail: celltransplant@163.com

³ Department of General, Visceral, and Transplantation Surgery, Ludwig Maximilians University Munich,

Munich 81377, Germany; E mail: alexandr.bazhin@med.uni muenchen.de

Received May 14, 2019

Revised May 14, 2019

Accepted May 14, 2019

The accumulated evidence suggests that cancer stem cells (CSC) and epithelial mesenchymal transition (EMT) as

well as expression and function of retinoid receptors are pivotal features of tumor initiation, progression and chemo

resistance. This is true also for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) which is still a clinical challenge due to a

deteriorated prognosis. Therefore, understanding of the above mentioned features could open new avenues for future

treatment strategies of PDAC. The main aim of this study was to investigate an interrelation between CSC, EMT and

retinoid receptors in PDAC after treatment with chemotherapeutics gemcitabine and 5 fluorouracil. We demonstrat

ed a differentiated expression of CSC and EMT markers as well as of retinoid receptors in native MiaPaca and Panc1

PDAC cell lines. Besides, these cell lines are also different in spontaneous apoptosis and in distribution during phas

es of cell cycle. We showed that the chemotherapy reduces amount of cancer cells in the S phase of the cell cycle.

Further, gemcitabine and 5 fluorouracil modulate expression of CSC markers, E cadherin and RXRβ in Panc1 but

not in MiaPaca cells. We supposed that these effects could be ascribed to the difference in the basal level of expression

of the genes investigated. This evidence makes our data interesting in context of future preclinical research.

Keywords: pancreatic ductal adenocarcinoma, cancer stem cells, epithelial mesenchymal transition, retinoid receptors

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019