БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 12, с. 1854 - 1866

УДК 612.062

РАПАМИЦИН НЕ ОБЛАДАЕТ ЗАЩИТНЫМ ЭФФЕКТОМ

ПРИ ОСТРОМ ПОЧЕЧНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ,

ВЫЗВАННОМ ИШЕМИЕЙ ИЛИ ЦИСПЛАТИНОМ*

Н.В. Андрианова^1,2, Л.Д. Зорова^2,3, В.А. Бабенко^2,3, И.Б. Певзнер^2,3,

В.А. Попков^2,3, Д.Н. Силачев^2,3, Е.Ю. Плотников^2,3,4**, Д.Б. Зоров^2,3**

¹ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия

² НИИ физико$химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия; электронная почта: plotnikov@belozersky.msu.ru, zorov@belozersky.msu.ru

³ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии

и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, 117997 Москва, Россия

⁴ Институт молекулярной медицины, Первый московский государственный

медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 24.06.2019

После доработки 12.07.2019

Принята к публикации 12.07.2019

Аутофагия играет важную роль в патогенезе острого почечного повреждения (ОПП). Показано, что хотя ак

тивация аутофагии связана с увеличением продолжительности жизни и защитными эффектами при разных

патологиях, действие таких активаторов аутофагии, как рапамицин и его аналоги, на ОПП остается неяс

ным. В данной работе исследовали действие рапамицина на модели ишемической и цисплатин индуциро

ванной острой почечной недостаточности как in vivo, так и in vitro. Эффекты рапамицина на функции почек

in vivo на фоне ишемии/реперфузии (И/Р) или инъекции цисплатина оценивали по концентрации мочеви

ны и креатинина в сыворотке крови и уровню маркера ОПП (белка NGAL) в моче. Эксперименты in vitro

выполняли на первичной культуре эпителия почечных канальцев (ЭПК), которую подвергали действию

кислородно глюкозной депривации (КГД) или инкубации с цисплатином на фоне добавления различных

концентраций рапамицина. Жизнеспособность клеток и скорость роста оценивали по МТТ тесту, а также в

режиме реального времени с помощью прибора RTCA iCELLigence. Обнаружено, что рапамицин не приво

дил к активации процесса аутофагии и не уменьшал тяжесть ишемического и цисплатин индуцированного

ОПП. Эксперименты на ЭПК показали, что рапамицин подавлял пролиферацию первичной культуры кле

ток и не обладал защитным действием при КГД или инкубации ЭПК с цисплатином. Впервые показано, что

ингибитор mTOR рапамицин не приводил к защитному действию на почки при ОПП. Предполагается, что

рапамицин нельзя считать идеальным миметиком ассоциированных с аутофагией процессов, для которых

доказано нефропротекторное действие (например, ограничения калорийности питания), как это считали

ранее. Защитное действие может быть более сложным и осуществляться через множество мишеней, связан

ных с аутофагией, а не ограничиваться исключительно ингибированием mTOR. Использование рапамици

на и его аналогов для лечения разных форм ОПП требует дальнейшего изучения для более комплексного

понимания его возможных положительных или отрицательных эффектов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рапамицин, острое почечное повреждение, ишемия, цисплатин, эпителий почечных

канальцев, аутофагия, нефропротекция.

DOI: 10.1134/S0320972519120091

Аутофагия является катаболическим процес

ния клеток и органов при нормальных и небла

сом, направленным на элиминацию ненужных

гоприятных физиологических условиях. В нас

компартментов клетки, и, как следствие, ассо

тоящее время считается, что аутофагия прини

циированным с большей вероятностью выжива

мает участие в патогенезе ряда заболеваний,

Принятые сокращения: ОПП - острое почечное повреждение; И/Р - ишемия/реперфузия; NGAL - липокалин,

ассоциированный с желатиназой нейтрофилов; ЭПК - эпителий почечных канальцев; КГД - кислородно глюкозная

депривация; mTOR - мишень рапамицина млекопитающих; mTORC1 - комплекс 1 мишени рапамицина млекопитаю

щих; ЛО - ложно оперированные; ДМСО - диметилсульфоксид; МТТ - метилтриазоловый тетразолий; ФБС - феталь

ная бычья сыворотка; ЭФР - эпидермальный фактор роста; ФСБ Д - фосфатно солевой раствор Дюльбекко; LC3 - ас

социированный с микротрубочками белок 1А/1В, легкая цепь 3.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/

biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19 194, 23.09.2019.

** Адресат для корреспонденции.

1854

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1855

включая рак, некоторые нейродегенеративные,

увеличивает продолжительность жизни некото

инфекционные заболевания и миопатии [1, 2].

рых животных и препятствует наступлению воз

Работы последних лет показали, что нарушение

растных заболеваний путем замедления процес

аутофагии митохондрий (митофагии) ускоряет

са старения [17]. Теоретически рапамицин мож

процесс старения. Восстановление пула пра

но было бы использовать для активации аутофа

вильно функционирующих митохондрий у ста

гии в клетках почки при ОПП, что должно при

рых организмов путем нормализации процесса

водить к защите почечной ткани. Однако дан

митофагии - перспективный метод борьбы с

ные, касающиеся действия рапамицина при

возрастным ухудшением функций органов, ко

ОПП, доступные в настоящее время, довольно

торый в дальнейшем может быть использован

отрывочны и противоречивы и требуют более

как подход антивозрастной терапии [3, 4]. Ауто

глубокого изучения.

фагия и митофагия также играют важную роль в

В данной работе было исследовано действие

ряде почечных патологий. Однако до сих пор

рапамицина в двух наиболее изученных моделях

нет устоявшегося мнения, несет ли аутофагия

ОПП, ишемии/реперфузии почки и цисплатин

при ОПП исключительно защитную функцию

индуцированной нефротоксичности. Экспери

или при определенных условиях может приво

менты проводили как in vivo на молодых крысах,

дить к запуску патологических сигнальных кас

так и in vitro на первичной культуре эпителия

кадов.

почечных канальцев (ЭПК).

Активация аутофагии и увеличение количе

ства аутофагосом были показаны в ряде экспе

риментальных моделей ОПП. Например, акти

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

вация процесса аутофагии была обнаружена в

клетках почки in vitro и in vivo в модели циспла

Лабораторные животные. В работе в качестве

тин индуцированной почечной недостаточнос

лабораторных животных использовали молодых

ти [5, 6]. И/Р тоже сопровождается увеличением

беспородных крыс (возраст 3-4 мес., масса

количества аутофагосом в ткани почки [7, 8].

300-400 г). Животные были случайным образом

Кроме того, активация аутофагии была показа

поделены на экспериментальные группы, каж

на при септическом ОПП, вызванном инъекци

дая из которых включала по 5-6 крыс: ложно

ей липополисахарида [9, 10] или перфорацией

оперированные (ЛО, как контроль для группы

кишечника [11], а также при ОПП, вызванном

И/Р), контроль с растворителем (для группы с

введением радиоконтрастных веществ [12].

цисплатином), рапамицин, И/Р, рапами

Используя различные экспериментальные

цин+И/Р, цисплатин, рапамицин + цисплатин.

модели на мышах с селективным нокаутом ге

Животные имели свободный доступ к корму и

нов, ответственных за формирование аутофаго

воде, их содержали в помещениях с постоянной

сом (например, Atg5 и Atg7) в проксимальных

температурой (20 ± 1 °C) и стандартным 12 ча

канальцах, было предположено, что активация

совым световым режимом.

аутофагии является скорее защитным механиз

Протокол И/Р почки и цисплатиновой нефро>

мом в различных моделях ишемического, септи

токсичности. Для проведения И/Р крыс вводили

ческого, цисплатин индуцированного и гипер

в общий наркоз с помощью внутрибрюшинной

урикемического ОПП [7, 13, 14]. Недавно нами

инъекции хлоралгидрата (300 мг/кг) и подверга

было показано, что ограничение калорийности

ли 40 минутной ишемии левой почки, как опи

питания, которое у молодых крыс характеризо

сано ранее [18]. Для этого сосудистый пучок ле

валось ярко выраженными защитными свой

вой почки пережимали атравматическим мик

ствами, также сопровождалось активацией ауто

рососудистым зажимом на 40 мин, затем кро

фагии [15].

воснабжение восстанавливали путем снятия за

С точки зрения фармакологии, важно найти

жима; прекращение кровотока в течение ише

вещества, которые могли бы активировать кас

мии и его восстановление при реперфузии оце

кады аутофагии и повторять положительные эф

нивали визуально по цвету почки. Перед сняти

фекты ограничения калорийности питания и

ем зажима с левой почки проводили правосто

других подходов, стимулирующих аутофагию.

роннюю нефрэктомию. В процессе операции

Для некоторых таких веществ, действующих че

температуру тела крыс поддерживали на уровне

рез схожие сигнальные пути, уже показано по

37 ± 0,5 °C. Ложнооперированных животных

ложительное влияние как на продолжитель

подвергали тем же манипуляциям, что и живот

ность жизни, так и на проявление некоторых за

ных с И/Р, кроме наложения микрососудистого

болеваний, в развитии которых аутофагия игра

зажима и удаления правой почки.

ет важную роль [16]. Одним из таких веществ

Часть крыс с И/Р получала инъекцию рапа

считается рапамицин, применение которого

мицина («Temsirolimus, Abcr GmbH», Германия)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1856

АНДРИАНОВА и др.

за 1 ч до начала ишемии. Рапамицин растворяли

ли со вторичными IgG антителами против анти

в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентра

тел кролика или мыши, конъюгированными с

ции 1 мг/мл и проводили внутрибрюшинную

пероксидазой хрена, в разведении 1 :

7500

инъекцию 0,1 мл раствора рапамицина на каж

(«Jackson ImmunoResearch», Великобритания),

дые 100 г массы крысы.

сигнал детектировали с помощью прибора

Цисплатиновую нефротоксичность модели

Chemidoc MP system («BioRad», США). Концен

ровали путем однократной внутрибрюшинной

трацию белков в гомогенатах почек определяли

инъекции цисплатина («TevaGuard», Нидерлан

с помощью бицинхониновой кислоты («Sigma

ды) в дозе 15 мг/кг. Рапамицин, растворенный в

Aldrich»). Интенсивность полос на мембранах

ДМСО, вводили за 3 ч до и через 24 ч после инъ

анализировали с использованием программы

екции цисплатина в дозе 1 мг/кг. Контрольная

ImageJ («NIH», США) [19].

группа животных получала только ДМСО в те

Для мембран, которые в последующем инку

же временные промежутки, что и группа, кото

бировали с антителами против фосфорилиро

рой вводили рапамицин.

ванной (по Thr389) формы p70 S6K, вместо

Образцы крови забирали из сонной артерии

обезжиренного молока использовался блокирую

крысы через 48 ч после И/Р или инъекции цис

щий агент («Amersham», Великобритания). Для

платина и определяли в сыворотке концентра

этих мембран растворы для блокировки и разве

цию мочевины и креатинина с помощью анали

дения антител готовили на Tris буфере

затора AU480 Chemistry System

(«Beckman

(pH 7,6).

Coulter», США). Крыс выводили из экспери

Первичная культура эпителия почечных ка>

мента путем декапитации.

нальцев. Почки крыс выделяли в стерильных ус

Для анализа сигнальных путей, активируе

ловиях, корковое вещество почек промывали,

мых рапамицином, двум группам крыс делали

измельчали и инкубировали в 0,25% ном раст

однократную инъекцию раствора рапамицина в

воре коллагеназы

2 типа

(«Thermo Fisher

ДМСО в дозе 1 мг/кг за 3 ч или 24 ч до получе

Scientific», США) 30 мин при 37 °C. Крупные

ния образцов почек. Контрольные крысы полу

куски ткани удаляли, суспензию пипетировали,

чали 0,1 мл ДМСО на каждые 100 г массы.

а затем центрифугировали 5 мин при 100×g для

Вестерн>блоттинг. Образцы мочи собирали у

осаждения канальцев. Осадок канальцев ресус

крыс через 24 ч после И/Р или через 48 ч после

пендировали в полной питательной среде

инъекции цисплатина, центрифугировали при

(DMEM/F12 с 10% ной ФБС («Invitrogen»,

10 000× g и смешивали с буфером для образцов.

США) и эпидермальным фактором роста (ЭФР)

У крыс, которым вводили рапамицин, через 3 ч

(10 нг/мл, «Invitrogen»)), сеяли на культураль

и 24 ч забирали почки, ткань гомогенизировали

ные флаконы или 96 луночные планшеты в

при 4 °C в гомогенизаторе тефлон стекло в фос

концентрации 10⁵ клеток/мл и растили при

фатном буфере, содержащем 10 мМ фенилме

37 °C в инкубаторе с атмосферой, содержащей

тилсульфонилфторида.

5% CO₂. Через 48 ч производили смену культу

Образцы вносили в 15% ный полиакрила

ральной среды для удаления неприкрепивших

мидный гель (мочу наносили из расчета 20 мкл

ся клеток и дебриса. ЭПК формировали монос

на дорожку, гомогенаты - 10 мг белка на дорож

лой через 4 сут после выделения, поэтому все

ку), разделяли методом электрофореза по Лэм

эксперименты проводили на 2-3 день после

мли и переносили белки на мембрану из поли

выделения.

винилендифторида («Sigma Aldrich», США).

Для моделирования ишемии in vitro ЭПК

Мембраны блокировали 5% ным раствором

подвергали кислородно глюкозной депривации

обезжиренного молока в фосфатном буфере с

(КГД) в течение 18 ч, для этого полную пита

добавлением 0,05% ного Tween 20, а затем ин

тельную среду меняли на фосфатно солевой

кубировали с первичными антителами: моно

раствор Дюльбекко (ФСБ Д) и помещали куль

клональными кроличьими антителами против

туру ЭПК в мультигазовый инкубатор Galaxy

NGAL 1 : 1000 («Abcam», Великобритания), мо

170R («Eppendorf/NewBrunswick», Великобрита

ноклональными кроличьими антителами про

ния) с содержанием кислорода 1%. После КГД

тив p70 S6K 1 : 1000 («Cell Signaling», США), мо

снова заменяли ФСБ Д на описанную выше пи

ноклональными кроличьими антителами про

тательную среду и помещали в инкубатор с нор

тив фосфорилированной формы (по Thr389)

мальным содержанием O₂. Часть клеток инку

p70 S6K 1 : 1000 («Cell Signaling»), моноклональ

бировали с 0,5 мкМ раствором рапамицина в те

ными кроличьими антителами против LC3 A/B

чение 6 ч до КГД, во время КГД или в течение

1 : 1000 («Cell Signaling»), моноклональными

24 ч после КГД. Часть клеток ЭПК инкубирова

мышиными антителами против β актина 1 : 2000

ли с 0,5 мкM рапамицина 24 ч до МТТ теста.

(«Sigma Aldrich»). Далее мембраны инкубирова

Для контроля действия ДМСО на клетки к ним

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1857

добавляли ДМСО в таком же разведении

кубации к ЭПК добавляли 2 мкM зонда на ауто

(1 : 2000), что и в случае добавления рапамицина.

фагосомы Cyto ID («Enzo Life Sciences», США)

Для анализа цисплатиновой токсичности in

и анализировали флуоресценцию с помощью

vitro ЭПК инкубировали 24 ч с разными концен

конфокального микроскопа LSM 510 (возбуж

трациями цисплатина (6,25 мкM, 12,5 мкM,

дающий лазер 488 нм, флуоресценция 500-

25 мкM), которые разводили в среде DMEM/F12.

530 нм, пинхол 150 мкм). Среднюю интенсив

Эффект рапамицина исследовали в двух экспе

ность флуоресценции Cyto ID оценивали с по

риментальных протоколах: 1) при предвари

мощью программы ImageJ.

тельном добавлении 0,5 мкM рапамицина на 3 ч

Статистика. Все значения представлены в

до 24 часовой инкубации с цисплатином, 2) при

виде среднее ± стандартная ошибка среднего.

одновременном добавлении 0,5 мкM раствора

Однородность выборки оценивали с помощью

рапамицина и цисплатина во всех перечислен

теста Ливиня. Сравнение групп осуществляли с

ных выше концентрациях на 24 ч.

использованием теста Манна-Уитни. Статис

Выживаемость клеток оценивали широко

тический анализ выполняли в библиотеке SciPy

используемым методом с метилтриазоловым

для Python и программе Microsoft Excel.

тетразолием (MTT тест). Для проведения теста

ЭПК культивировали на 96 луночных планше

тах, подвергали описанным выше воздействи

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ям, а затем инкубировали с МТТ (5 мг/мл в сре

де DMEM/F12) в течение 120 мин при 37 °C. За

Действие рапамицина на ОПП, вызванное

тем раствор красителя удаляли, а образовав

И/Р или цисплатином. Была использована И/Р

шийся в клетках формазан растворяли в 50 мкл

как наиболее изученная модель ОПП; тяжесть

ДМСО, абсорбцию измеряли при 540 нм на уни

почечного повреждения определяли по уровню

версальном планшетном спектрофотометре

мочевины и креатинина в сыворотке крови. И/Р

Zenyth («Anthos Labtec», Австрия).

приводила к почти 6 кратному повышению

Наблюдение за ростом клеток в режиме реаль>

концентрации мочевины через 48 ч после нача

ного времени. Анализ кинетики роста клеток вы

ла реперфузии, с 7,1 ± 0,2 мМ до 42,2 ± 4,7 мМ

полняли с помощью прибора RTCA

(n = 6, рис. 1, а). Аналогичное повышение наб

iCELLigence™ («ACEA», США). Метод основан

людали и по уровню креатинина, который уве

на анализе электрического импеданса, измеряе

личивался с 47,0 ± 1,7 мкМ до 326,8 ± 54,3 мкМ

мого в специальных лунках, на которые нанесе

(рис.1, б). С помощью вестерн блоттинга был

ны электроды [20], и может быть использован

также изучен уровень маркера ОПП (NGAL) в

для исследования пролиферации и гибели ЭПК

моче и обнаружено, что его содержание много

[21]. Прибор RTCA iCELLigence помещался в

кратно возрастает через 24 ч после И/Р (рис. 1, в).

инкубатор с атмосферой, содержащей 5% ную

Введение рапамицина за 1 ч до И/Р не предотв

CO₂, при 37 °С. ЭПК сажали на 8 луночные

ращало повышение уровней мочевины, креати

планшеты со встроенными микроэлектродами.

нина и NGAL (n = 5, рис. 1, а, б, в), что указыва

Часть клеток инкубировали с 0,5, 1 или 2 мкM

ет на отсутствие защитного действия данного

рапамицина, разведенного в полной культу

вещества.

ральной среде (DMEM/F12 с 10% ной ФБС и

Для выявления действия рапамицина на

10 нг/мл ЭФР). Через 24 ч ЭПК подвергали

цисплатиновую нефротоксичность было иссле

КГД, затем возвращали клетки в полную пита

довано цисплатин индуцированное ОПП на

тельную среду и атмосферу с нормальным со

фоне введения рапамицина или без него. Од

держанием O₂. Скорость роста наблюдали еще в

нократная инъекция цисплатина в дозе 15 мг/кг

течение 48 ч после окончания КГД.

приводила к выраженному ОПП через 48 ч, о

Конфокальная микроскопия. Количество ауто

чем можно судить по повышению концентра

фагосом анализировали на инвертированном

ции мочевины (n = 6, рис. 1, г) и креатинина

конфокальном микроскопе LSM510 («Carl Zeiss»,

(рис. 1, д). При этом уровень маркеров почечной

Германия). Культуру ЭПК получали, как описано

недостаточности в группе крыс с введением ра

выше; клетки инкубировали 3 ч с 0,5 мкM рапа

памицина перед цисплатином был близок к та

мицина, 30 мМ хлорохина («Sigma Aldrich») или

ковому у животных, получавших только циспла

в совместном растворе 0,5 мкM рапамицина и

тин: ко второму дню после инъекции цисплати

30 мМ хлорохина. В качестве контроля исполь

на мочевина повышалась до 30,1 ± 4,2 мМ, а на

зовали раствор ДМСО в среде (1: 2000). Рапами

фоне рапамицина - до 28,3 ± 5,0 мМ (n = 5,

цин, хлорохин и ДМСО растворяли в полной

рис. 1, г). Аналогичным образом менялся и креа

питательной среде (DMEM/F12 с 10% ной ФБС

тинин: через 2 дня после введения цисплатина

и 10 нг/мл ЭФР). После окончания времени ин

его уровень составлял 123,0 ± 24,3 мкМ в группе

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1858

АНДРИАНОВА и др.

Рис. 1. Оценка почечной дисфункции и ОПП по маркерам в сыворотке и моче крыс, подвергшихся И/Р или введению

цисплатина. (а-б) - Концентрация мочевины и креатинина в сыворотке крыс через 48 ч после И/Р (n = 6) или И/Р на

фоне 1 мг/кг рапамицина (Рапа + И/Р, n = 5). В качестве контроля были использованы ложнооперированные (ЛО) жи

вотные; в - уровень NGAL, измеренный с помощью вестерн блоттинга в образцах мочи крыс через 24 ч после И/Р или

И/Р на фоне 1 мг/кг рапамицина; г-д - концентрация мочевины и креатинина в сыворотке крыс через 48 ч после инъек

ции цисплатина в дозе 15 мг/кг (n = 6) или на фоне 1 мг/кг рапамицина (Рапа + цисплатин) за 3 ч до и через 24 ч после

введения цисплатина (n = 5); е - уровень NGAL, измеренный с помощью вестерн блоттинга в образцах мочи крыс через

48 ч после инъекции цисплатина или на фоне 1 мг/кг рапамицина за 3 ч до и через 24 ч после введения цисплатина. В груп

пе негативного контроля крысам вводили раствор ДМСО в те же временные интервалы; * p < 0,05 по сравнению с ЛО и

контрольными крысами, которым вводился растворитель

цисплатина и 146,6 ± 40,3 мкМ на фоне рапами

шому уменьшению жизнеспособности клеток

цина (рис. 1, д). Повышение уровня NGAL в мо

по сравнению с контролем. Кроме того, выжи

че, отражающее почечное повреждение при

ваемость клеток, которая уменьшалась после

цисплатин индуцированном ОПП, коррелиро

КГД более чем вдвое, снижалась еще больше

вало с функциональными маркерами (рис.1, е).

при инкубации с рапамицином в течение 6 ч до

Действие рапамицина на первичную культуру

КГД (рис. 2, г). При добавлении рапамицина к

эпителия почечных канальцев. Для моделирова

культуре ЭПК во время КГД, или сразу после

ния И/Р in vitro на первичной культуре ЭПК

24 ч реоксигенации, также наблюдали тенден

применяли протокол КГД с последующей реок

цию к более выраженному падению жизнеспо

сигенацией. Наблюдение за пролиферацией

собности клеток по сравнению с культурами,

ЭПК в режиме реального времени с использова

подвергавшимися только КГД (рис. 2, г).

нием прибора iCELLigence выявило, что рапа

Инкубация ЭПК с цисплатином в течение

мицин в концентрациях 0,5, 1 и 2 мкМ в некото

24 ч вызывала клеточную гибель дозо зависи

рой степени снижал скорость пролиферации

мым образом (рис. 3, а, б). Добавление к ЭПК

клеток до КГД (рис. 2, а, б) и значительно замед

рапамицина одновременно с цисплатином не

лял скорость роста клеток в фазу восстановле

оказывало значимого влияния на клетки почки

ния после КГД (рис. 2, а, в). Похожие результа

(при концентрациях цисплатина 6,25 мкМ и

ты были получены с помощью МТТ теста. Ин

25 мкМ) или даже ухудшало выживаемость ЭПК

кубация с 0,5 мкM рапамицина вела к неболь

(рис. 3, а). Схожие результаты были получены

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1859

при добавлении рапамицина до инкубации с

клетки от гибели, но при некоторых концентра

цисплатином, в этом случае рапамицин также

циях цисплатина даже усугубляет ее (рис. 3, д, е).

или не оказывал никакого эффекта на гибель

Ингибирование mTOR и отсутствие актива>

клеток почки, или даже увеличивал ее (рис. 3, б).

ции аутофагии после введения рапамицина. Для

Наблюдение за пролиферацией ЭПК в ре

подтверждения действия рапамицина на сиг

альном времени с помощью прибора RTCA

нальные пути mTOR мы проанализировали

iCELLigence в процессе инкубации с различны

уровень киназы p70 S6K и ее фосфорилирован

ми концентрациями цисплатина на фоне рапа

ной формы, которая, как известно, является од

мицина или без него показало, что цисплатин

ной из основных мишеней mTORC1 [22]. Вес

значительно замедляет скорость роста ЭПК

терн блоттинг гомогенатов почек крыс, которым

(рис. 3, в, д, е). МТТ тест подтвердил, что цис

за 3 или 24 ч до забора образцов вводили рапа

платин приводил к существенной гибели клеток

мицин, выявил снижение относительного со

(рис. 3, а, б), при этом в концентрациях 25 мкМ

держания фосфорилированной формы p70 S6K

и 50 мкМ он вызывал практически полную ги

в группе крыс, получавших инъекцию за 24 ч

бель клеток (рис. 3, г). Таким образом, рапами

(рис. 4, а). Таким образом, рапамицин, как и

цин в данной модели не только не защищает

ожидалось, ингибировал активность mTORC1 в

Рис. 2. Действие разных доз рапамицина на скорость роста первичной культуры ЭПК при КГД. а - Кривая пролифера

ции ЭПК в реальном времени, полученная с помощью RTCA iCelligence и включающая в себя рост клеток в условиях нор

моксии, рост после добавления разных доз рапамицина (0,5, 1 и 2 мкМ), гибель клеток во время КГД и восстановление

пролиферации ЭПК после возобновления доступа кислорода и полной питательной среды; б - скорость роста ЭПК до

начала КГД, но после добавления рапамицина (Рапа); в -скорость роста ЭПК в фазу восстановления после КГД; г - ре

зультаты МТТ теста при добавлении 0,5 мкМ рапамицина за 6 ч до, во время или после КГД на 24 ч с соответствующими

контролями растворителя (ДМСО); * p < 0,05 по сравнению с соответствующими контролями с добавлением растворите

ля (ДМСО); ** p < 0,05 по сравнению с контрольными клетками

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1860

АНДРИАНОВА и др.

почечной ткани. Однако соотношение LC3 II/

Недостаточную активацию аутофагии после

LC3 I оставалось неизменным во всех группах,

инкубации с рапамицином также подтвердили с

что говорит об отсутствии активации аутофагии

помощью окрашивания первичной культуры

(рис. 4, б).

ЭПК красителем Cyto ID, который селективно

Рис. 3. Анализ скорости пролиферации первичной культуры ЭПК после инкубации с цисплатином и влияние на нее ра

памицина (Рапа). а - Выживаемость ЭПК, измеренная с помощью МТТ теста, после инкубации с разными концентра

циями цисплатина и при добавлении рапамицина за 3 ч до цисплатина; б - выживаемость ЭПК, измеренная с помощью

МТТ теста, после инкубации с разными концентрациями цисплатина при одновременном добавлении рапамицина;

в - кривая пролиферации ЭПК в реальном времени, полученная с помощью RTCA iCelligence, включающая в себя рост

клеток (при нормальных условиях) и гибель клеток (при инкубации с разными концентрациями цисплатина); г -измене

ние скорости роста ЭПК при инкубации с разными дозами цисплатина; д - кинетика пролиферации ЭПК при добавле

нии только 12,5 мкМ цисплатина, рапамицина за 3 ч до добавления цисплатина или при одновременной инкубации с ра

памицином и цисплатином; е - изменение кривой пролиферации ЭПК после добавления только 25 мкМ цисплатина, до

бавления рапамицина за 3 ч до цисплатина или одновременной инкубации с рапамицином и цисплатином; * p < 0,05 по

сравнению с 12,5 мкМ цисплатина

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1861

Рис. 4. Выявление ингибирования mTORC1 и активации аутофагии в почках крыс через 3 ч или 24 ч после введения ра

памицина (Рапа) в дозе 1 мг/кг. а - Соотношение фосфорилированной и тотальной формы киназы p70 S6K; б - соотно

шение LC3 II/LC3 I; * p < 0,05 по сравнению с контрольными крысами, которым вводился только растворитель (ДМСО)

накапливается в аутофагосомах и аутофаголизо

был неэффективен во всех исследованных моде

сомах [23]. Инкубация с рапамицином в течение

лях почечного повреждения.

3 ч не только не приводила к увеличению интен

Хотя участие аутофагии в патогенезе острой

сивности флуоресценции Cyto ID в ЭПК по

почечной недостаточности хорошо известно,

сравнению с контролем, но даже демонстрирова

эффекты активаторов или ингибиторов аутофа

ла тенденцию к ее уменьшению (рис. 5, а, д). Для

гии на ОПП остаются неоднозначными. Тем не

лучшей визуализации возможного эффекта рапа

менее данные большинства работ подтверждают

мицина на формирование аутофагосом был ис

защитную роль аутофагии, поскольку подавле

пользован ингибитор поздних стадий аутофагии

ние аутофагии в большинстве экспериментов

(хлорохин), который также добавляли в культу

ассоциировалось с увеличением тяжести ОПП.

ральную среду ЭПК на 3 ч. Добавление хлорохи

Например, использование ингибитора аутофа

на приводило к значительному усилению интен

гии хлорохина увеличивало тяжесть ОПП у жи

сивности флуоресценции и увеличению количе

вотных [10, 14]. В то же время, парадоксальным

ства Cyto ID положительных органелл в ЭПК

образом, при использовании значительно мень

(рис. 5, в, д). Однако совместная инкубация с ра

ших доз хлорохина было показано снижение тя

памицином и хлорохином в течение 3 ч не способ

жести ОПП после И/Р [24]. Следует отметить,

ствовала росту средней интенсивности флуорес

что в этом исследовании параметры аутофаги

ценции Cyto ID по сравнению с хлорохином,

ческо лизосомальной системы не анализирова

подтверждая отсутствие активации аутофагии в

ли, поэтому невозможно четко определить ме

ответ на присутствие рапамицина (рис. 5, г, д).

ханизмы, ответственные за защитное действие

хлорохина в этих дозах. Эксперименты, прове

дённые с другим ингибитором аутофагии 3 ме

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

тиладенином, который терминирует образова

ние аутофагофора через ингибирование фосфа

Целью данной работы было исследование

тидилинозитол 3 киназы, также указывали на

нефропротекторного потенциала известного

негативные последствия ингибирования ауто

индуктора аутофагии, рапамицина, при остром

фагии [12, 25, 26].

почечном повреждении, индуцированном И/Р

Нам удалось найти только несколько экспе

или цисплатином. Показано, что рапамицин риментальных статей, которые прямо исследо

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1862

АНДРИАНОВА и др.

Рис. 5. Формирование аутофагосом в ответ на добавление рапамицина (Рапа) и/или хлорохина. (а-г) - Конфокальные

изображения культуры ЭПК после инкубации в течение 3 ч с 0,5 мкM рапамицина, 30 мM хлорохина или обоими этими

веществами; д - средняя интенсивность флуоресценции Cyto ID в ЭПК после инкубации с перечисленными выше веще

ствами в течение 3 ч; * p < 0,05 по сравнению с соответствующими контролями с добавлением растворителя (ДМСО).

Шкала - 50 мкм

вали эффект введения рапамицина на ОПП.

ные эффекты рапамицина также наблюдались

Например, внутривенная инъекция рапамицина

при И/Р печени [28]. Рапамицин в дозах 1 и

в дозе 1 мг/кг за 15 мин до И/Р почки улучшала

5 мг/кг, вводимый за 1 ч до начала ишемии пече

почечную функцию, оцененную по уровням сы

ни, в значительной степени снижал ее повреж

вороточного креатинина и мочевины через 24 ч

дение, что выражалось в понижении уровней

после ишемии [25]. Введение рапамицина в

АСТ и АЛТ в сыворотке крови и сохранении

этом исследовании также снижало морфологи

нормальной морфологии печени [28].

ческие признаки повреждения ткани почки и

Чтобы иметь возможность соотнести наши

уменьшало количество апоптотических клеток

результаты с предыдущими исследованиями

[25]. Аналогичные данные были получены после

других авторов, мы использовали рапамицин в

внутрибрюшинной инъекции 1 мг/кг рапами

таких же дозировках (1 мг/кг) за 1 ч до индукции

цина за 2 ч до И/Р [27] и в дозе 10 мг/кг через 1 ч

почечной ишемии, однако не увидели никакого

после И/Р [26]. Наконец, помимо почек, защит

снижения патологически повышенных уровней

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1863

креатинина и мочевины в крови (рис. 1, а, б).

влияние рапамицина не только на модели И/Р,

Более того, был проведен дополнительный ана

но и КГД in vitro на первичной культуре ЭПК.

лиз биомаркеров ОПП в моче и также не обна

Эта экспериментальная система не содержит

ружено снижение уровня NGAL в группе, полу

иммунные клетки, что исключает влияние вос

чавшей рапамицин (рис. 1, в). Отметим, что на

палительной и иммунной компонент на ОПП.

ши негативные результаты согласуются с ранни

Для оценки сигнализации mTOR мы измери

ми исследованиями, опубликованными до того,

ли уровень общего количества и фосфорилиро

как появились статьи, описывающие положи

ванной формы киназы p70 S6K в почках крыс

тельные эффекты рапамицина. Поскольку рапа

после стандартно используемой дозы рапамици

мицин и его аналоги исходно позиционирова

на (1 мг/кг). p70 S6K киназа является одним из

лись как иммуносупрессоры, первые исследова

главных эффекторов пути mTOR и фосфорили

ния рапамицина на почках были направлены на

руется активированным mTORC1 [22]. В тех же

сравнение его с другими известными иммуно

гомогенатах почек была проанализирована акти

супрессорами. Например, сравнение действия

вация пути аутофагии по соотношению LC3 II/

1 мг/кг рапамицина, вводимого за шесть и один

LC3 I, а также с помощью специфического флу

час до ишемии, с метилпреднизолоном не выя

оресцентного зонда Cyto ID в клетках, обрабо

вило никаких различий между группами ни в

танных рапамицином. Хотя наблюдали ингиби

уровне сывороточного креатинина, ни в гисто

рование mTORC1 по снижению уровня фосфо

логической картине почки [29]. В другой работе

рилированной киназы p70 S6K через 24 ч после

анализировали эффекты 3 мг/кг рапамицина,

введения рапамицина (рис. 4), не была обнару

вводимого в течение двух дней до ишемии поч

жена активация аутофагии в обеих моделях in

ки и затем через 24 ч или в течение 7 дней. Вли

vivo и in vitro (рис. 4, в, рис. 5). Таким образом,

яние рапамицина сравнивали с действием им

можно сделать вывод, что ингибирование

муносупрессора циклоспорина А и не обнару

mTOR в наших условиях не приводит к последую

жили значимых изменений в функции почки,

щей активации аутофагии, и рапамицин не мо

нарушенной после ишемии [30].

жет отменить или уменьшить гибель клеток

Наконец, ряд исследований показывает, что

почки после КГД.

рапамицин, наоборот, может увеличивать тя

Наблюдаемое снижение скорости пролифе

жесть повреждения после И/Р. Так, введение ра

рации клеток ЭПК, инкубированных с рапами

памицина в дозе 3 мг/кг за один день до и в те

цином, может объясняться антипролифератив

чение дня после И/Р сопровождалось более вы

ным эффектом рапамицина, которое было впер

раженной почечной дисфункцией через 48 и

вые описано для Т клеток и опухолевых клеток

120 ч после И/Р по сравнению с нелеченными

[36, 37]. Снижение скорости пролиферации,

животными [31]. В этой же работе меньшая доза

вызванное этим препаратом, уже было показано

рапамицина (1,5 мг/кг) не вызывала ни наруше

ранее для культуры проксимальных эпителиаль

ний функции почек, ни каких либо улучшений.

ных клеток и приводило к снижению числа де

Аналогичные результаты были получены Lui et

лящихся почечных клеток [33]. Об этом же гово

al.: у мышей, получавших рапамицин (2 мг/

рит то, что срезы почек мышей, получивших ра

кг/сут) перорально, начиная с 24 ч до И/Р поч

памицин, демонстрировали значительно мень

ки, через день после И/Р уровни сывороточного

шее число PCNA позитивных клеток после

креатинина были выше, а гистологическое ис

ишемии/реперфузии [32].

следование почек продемонстрировало более

Мы также проанализировали эффект рапа

выраженное повреждение канальцев [32]. Ана

мицина на еще одной модели ОПП, цисплатин

логично Lieberthal et al. показали, что рапами

индуцированной нефротоксичности. Так как па

цин ухудшает восстановление после острой по

тогенетические механизмы цисплатин индуци

чечной недостаточности, вызывая ингибирова

рованного повреждения клеток почки могут от

ние пролиферации, остановку клеточного цик

личаться от механизмов, запускаемых ишемией

ла и апоптоз эпителия канальцев [33].

с последующей реперфузией, действие рапами

Важно отметить, что рапамицин является

цина в этой модели может быть совсем другим.

сильным иммуносупрессорным агентом, кото

Ранее неоднократно было показано, что при

рый действует путем ингибирования пролифе

цисплатин индуцированном ОПП происходит

рации и клональной экспансии стимулирован

активация аутофагии как in vitro, так и in vivo [5,

ных Т клеток [34]. Таким образом, его действие

6]. Более того, ингибирование аутофагии хлоро

in vivo является комбинацией активации аутофа

хином усиливало ОПП, тогда как стимуляция ау

гии и иммунного ответа, причем последний иг

тофагии сохраняла функцию и гистологию поч

рает важную роль при ишемии почки и других

ки, что подтверждает защитную роль аутофагии

формах ОПП [35]. Поэтому мы исследовали

при цисплатин индуцированном ОПП [38].

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1864

АНДРИАНОВА и др.

Однако не был обнаружен защитный эффект

Обращает на себя внимание тот факт, что

введения рапамицина in vivo в экспериментах по

большинство работ, демонстрирующих защит

цисплатин индуцированной нефротоксичности

ные эффекты рапамицина при ОПП, опублико

у крыс или в модели in vitro на клетках почечных

ваны после 2010 г., когда набрали популярность

канальцев (рис.1, г е, рис. 3). Отметим, что наши

взгляды на аутофагию и ее активаторы как на

данные согласуются с исследованием Hakagawa

процесс, играющий исключительно положи

et al., показавших, что уровни сывороточного

тельную роль в продлении жизни и здоровом

креатинина и маркера ОПП KIM 1 были выше у

долголетии. В то же время исследования, опи

крыс при совместном введении аналога рапами

сывающие отрицательные эффекты рапамици

цина, эверолимуса и цисплатина. Авторы сдела

на или отсутствие каких либо эффектов на

ли вывод, что ингибирование mTOR эверолиму

ОПП, относятся к более раннему периоду, когда

сом снижает почечную функцию [39]. Хотя

рапамицин рассматривался еще исключительно

цисплатин в этом исследовании вызывал актива

как иммуносупрессор.

цию mTOR, а введение эверолимуса ингибирова

ло эту активацию, никакого защитного эффекта

На основании наших исследований и анали

эверолимуса на почку не было обнаружено.

за аналогичных работ следует обратить внима

Таким образом, имеющиеся в настощее время

ние, что существует необходимость очень тща

результаты исследований аутофагии и ее актива

тельного анализа эффектов фармакологических

ции при ОПП можно разделить на две группы. С

воздействий, призванных имитировать физио

одной стороны, большое число работ четко дока

логические походы, активирующие аутофагию.

зывают важную роль аутофагии в патогенезе

Не всегда вещества, ингибирующие mTOR, бу

ОПП, при этом активация аутофагии (например,

дут абсолютно идентичны в своем действии ес

при ограничении калорийности питания) обес

тественным физиологическим процессам, нап

печивает защиту почки от различных форм ОПП

ример, ограничению калорийности питания.

[15, 40, 41]. С другой стороны, попытки влияния

Эффекты рапамицина на ишемическое и цисп

на аутофагию с помощью фармакологических

латин индуцированное ОПП остаются проти

препаратов, в частности, рапамицина и его ана

воречивыми, и на данный момент нельзя одноз

логов, часто оказываются не способными обес

начно делать вывод о его нефропротекторных

печить выраженную нефропротекцию. Более то

свойствах. Возможно, это одна из причин, по

го, в ряде случаев наблюдается даже усиление

которой пока не известно об успешных попыт

повреждения почки при использовании рапами

ках применения рапамицина в клинической

цина. В этой связи нам кажется важным обратить

практике.

внимание исследователей на то, что рапамицин

не является идеальным миметиком ограничения

калорийности питания, как это зачастую счита

Финансирование. Работа выполнена при фи

ется, поскольку ограничение питания действует

нансовой поддержке Российского научного

на mTOR через различные сигнальные пути, нап

фонда (грант 18 15 00058).

ример, через механизмы фосфорилирования/де

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

фосфорилирования AMPK и Akt [42]. Рапамицин

сутствии конфликта интересов.

же действует как аллостерический ингибитор

Соблюдение этических норм. Настоящая ра

mTOR [43] за счет формирования комплекса с

бота не содержит каких либо исследований, в

FK506 связывающим белком, и этот комплекс, в

которых в качестве объектов были использова

свою очередь, связывается с mTOR и блокирует

ны люди. Работу с лабораторными животными

его. Вероятно, ограничение калорийности пита

проводили в соответствии с требованиями Ко

ния имеет ряд других мишеней в клетке по срав

миссии по биоэтике НИИ физико химической

нению с рапамицином, действующим только как

биологии им. А.Н. Белозерского. Все манипуля

ингибитор mTORC1, поэтому нельзя ставить

ции выполняли в соответствии с руководством

знак равенства в действии рапамицина и ограни

Федерации европейских научных ассоциаций

чения питания [44, 45].

по лабораторным животным.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Levine, B., and Kroemer, G. (2008) Autophagy in the

digestion, Nature,

451,

1069-1075, doi:

10.1038/

pathogenesis of disease, Cell, 132, 27-42, doi: 10.1016/

nature06639.

j.cell.2007.12.018.

Ryu, D., Mouchiroud, L., Andreux, P.A., Katsyuba, E.,

Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A.M., and Klionsky, D.J.

Moullan, N., and Nicolet Dit Félix, A.A., et al. (2016)

(2008) Autophagy fights disease through cellular self

Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

РАПАМИЦИН НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ОПП

1865

C. elegans and increases muscle function in rodents, Nat.

nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat

Med., 22, 879-888, doi: 10.1038/nm.4132.

kidney, Kidney Int., 72, 1493-1502, doi: 10.1038/sj.ki.

Andreux, P.A., Blanco Bose, W., Ryu, D., Burdet, F.,

5002568.

Ibberson, M., and Aebischer, P., et al. (2019) The

19.

Schneider, C.A., Rasband, W.S., and Eliceiri, K.W. (2012)

mitophagy activator urolithin A is safe and induces a mo

NIH image to imageJ: 25 years of image analysis, Nat.

lecular signature of improved mitochondrial and cellular

Methods, 9, 671-675.

health in humans, Nat. Metab., 1, 595-603, doi: 10.1038/

20.

Giaever, I., and Keese, C.R. (1984) Monitoring fibroblast

s42255 019 0073 4.

behavior in tissue culture with an applied electric field,

Periyasamy Thandavan, S., Jiang, M., Wei, Q., Smith, R.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3761-3764.

Yin, X. M., and Dong, Z. (2008) Autophagy is cytoprotec

21.

Popkov, V.A., Andrianova, N.V., Manskikh, V.N., Silachev, D.N.,

tive during cisplatin injury of renal proximal tubular cells,

Pevzner, I.B., and Zorova, L.D., et al. (2018) Pregnancy

Kidney Int., 74, 631-640, doi: 10.1038/ki.2008.214.

protects the kidney from acute ischemic injury, Sci. Rep., 8,

Takahashi, A., Kimura, T., Takabatake, Y., Namba, T.,

14534, doi: 10.1038/s41598 018 32801 8.

Kaimori, J., and Kitamura, H., et al. (2012) Autophagy

22.

Tavares, M.R., Pavan, C.B., Amaral, C.L., Meneguello, L.,

guards against cisplatin induced acute kidney injury, Am. J.

Luchessi, A.D., and Simabuco, F.M. (2015) The S6K pro

Pathol., 180, 517-525, doi: 10.1016/j.ajpath.2011.11.001.

tein family in health and disease, Life Sci., 131, 1-10,

Liu, S., Hartleben, B., Kretz, O., Wiech, T., Igarashi, P., and

doi: 10.1016/j.lfs.2015.03.001.

Mizushima, N., et al. (2012) Autophagy plays a critical role

23.

Stankov, M., Panayotova Dimitrova, D., Leverkus, M.,

in kidney tubule maintenance, aging and ischemia reperfu

Klusmann, J. H., and Behrens, G. (2014) Cytometric

sion injury, Autophagy, 8, 826-837, doi: 10.4161/auto.19419.

analysis of autophagic activity with cyto ID staining in pri

Li, L., Wang, Z. V., Hill, J.A., and Lin, F. (2014) New

mary cells, Bio$Protocol., 4, doi: 10.21769/BioProtoc.1090.

autophagy reporter mice reveal dynamics of proximal tubu

24.

Todorovic, Z., Medic, B., Basta Jovanovic, G., Radojevic

lar autophagy, J. Am. Soc. Nephrol., 25, 305-315,

Skodric, S., Stojanovic, R., and Rovcanin, B., et al. (2014)

doi: 10.1681/ASN.2013040374.

Acute pretreatment with chloroquine attenuates renal I/R

Li, T., Liu, Y., Zhao, J., Miao, S., Xu, Y., and Liu, K., et al.

injury in rats, PLoS One, 9, 92673, doi: 10.1371/

(2017) Aggravation of acute kidney injury by mPGES 2

journal.pone.0092673.

down regulation is associated with autophagy inhibition

25.

Zhang, Y. L., Zhang, J., Cui, L. Y., and Yang, S. (2015)

and enhanced apoptosis, Sci. Rep.,

10247, doi:

Autophagy activation attenuates renal ischemia reperfu

10.1038/s41598 017 10271 8.

sion injury in rats, Exp. Biol. Med., 240, 1590-1598,

10.

Mei, S., Livingston, M., Hao, J., Li, L., Mei, C., and

doi: 10.1177/1535370215581306.

Dong, Z. (2016) Autophagy is activated to protect against

26.

Ling, H., Chen, H., Wei, M., Meng, X., Yu, Y., and Xie, K.

endotoxic acute kidney injury, Sci. Rep., 6, 22171,

(2016) The effect of autophagy on inflammation cytokines

doi: 10.1038/srep22171.

in renal ischemia/reperfusion injury, Inflammation, 39,

11.

Karagiannidis, I., Kataki, A., Glustianou, G., Memos, N.,

347-356, doi: 10.1007/s10753 015 0255 5.

Papalois, A., and Alexakis, N., et al. (2016) Extended cyto

27.

Guan, X., Qian, Y., Shen, Y., Zhang, L., Du, Y., and Dai, H.,

protective effect of autophagy in the late stages of sepsis

et al. (2015) Autophagy protects renal tubular cells against

and fluctuations in signal transduction pathways in a rat

ischemia/reperfusion injury in a time dependent manner, Cell.

experimental model of kidney injury, Shock, 45, 139-147,

Physiol. Biochem., 36, 285-298, doi: 10.1159/000374071.

doi: 10.1097/SHK.0000000000000505.

28.

Zhu, J., Lu, T., Yue, S., Shen, X., Gao, F., and Busuttil, R.W.,

12.

Ko, G.J., Bae, S.Y., Hong, Y. A., Pyo, H.J., and Kwon, Y.J.

et al. (2015) Rapamycin protection of livers from ischemia

(2016) Radiocontrast induced nephropathy is attenuated

and reperfusion injury is dependent on both autophagy

by autophagy through regulation of apoptosis and inflam

induction and mammalian target of rapamycin complex

mation, Hum. Exp. Toxicol., 35, 724-736, doi: 10.1177/

2 Akt activation, Transplantation, 99, 48-55, doi: 10.1097/

0960327115604198.

TP.0000000000000476.

13.

Kimura, T., Takabatake, Y., Takahashi, A., Kaimori, J.,

29.

Parra, C., Salas, P., and Dominguez, J. (2010) Effects of

Matsui, I., and Namba, T., et al. (2011) Autophagy pro

immunosuppressive drugs on rat renal ischemia reperfu

tects the proximal tubule from degeneration and acute

sion injury, Transplant. Proc., 42, 245-247, doi: 10.1016/

ischemic injury, J. Am. Soc. Nephrol., 22, 902-913,

j.transproceed.2009.11.018.

doi: 10.1681/ASN.2010070705.

30.

Pereira, B.J., Castro, I., Burdmann, E.A., Malheiros, D.M.,

14.

Jiang, M., Wei, Q., Dong, G., Komatsu, M., Su, Y., and

and Yu, L. (2010) Effects of sirolimus alone or in combina

Dong, Z. (2012) Autophagy in proximal tubules protects

tion with cyclosporine A on renal ischemia/reperfusion

against acute kidney injury, Kidney Int., 82, 1271-1283,

injury, Braz. J. Med. Biol. Res., 43, 737-744.

doi: 10.1038/ki.2012.261.

31.

Gonçalves, G.M., Cenedeze, M.A., Feitoza, C.Q., de

15.

Andrianova, N.V., Jankauskas, S.S., Zorova, L.D.,

Paula, C.B., Marques, G.D., and Pinheiro, H.S., et al.

Pevzner, I.B., Popkov, V.A., and Silachev, D.N., et al.

(2007) The role of immunosuppressive drugs in aggravating

(2018) Mechanisms of age dependent loss of dietary

renal ischemia and reperfusion injury, Transplant. Proc.,

restriction protective effects in acute kidney injury, Cells, 7,

39, 417-420, doi: 10.1016/j.transproceed.2007.01.027.

178, doi: 10.3390/cells7100178.

32.

Lui, S.L., Chan, K.W., Tsang, R., Yung, S., Lai, K.N., and

16.

Kuo, S. Y., Castoreno, A.B., Aldrich, L.N., Lassen, K.G.,

Chan, T.M. (2006) Effect of rapamycin on renal ischemia

Goel, G., and Danč k, V., et al. (2015) Small molecule

reperfusion injury in mice, Transpl. Int., 19, 834-839,

enhancers of autophagy modulate cellular disease pheno

doi: 10.1111/j.1432 2277.2006.00361.x.

types suggested by human genetics, Proc. Natl. Acad. Sci.

33.

Lieberthal, W., Fuhro, R., Andry, C.C., Rennke, H.,

USA, 112, 4281-4287, doi: 10.1073/pnas.1512289112.

Abernathy, V.E., and Koh, J.S., et al. (2001) Rapamycin

17.

Blagosklonny, M.V. (2017) From rapalogs to anti aging

impairs recovery from acute renal failure: role of cell cycle

formula, Oncotarget, 8, 35492-35507, doi: 10.18632/

arrest and apoptosis of tubular cells, Am. J. Physiol. Renal.

oncotarget.18033.

Physiol., 281, 693-706, doi: 10.1152/ajprenal.2001.281.4.F693.

18.

Plotnikov, E.Y., Kazachenko, A.V., Vyssokikh, M.Y.,

34.

Martel, R.R., Klicius, J., and Galet, S. (1977) Inhibition of

Vasileva, A.K., Tcvirkun, D.V., and Isaev, N.K., et al.

the immune response by rapamycin, a new antifungal

(2007) The role of mitochondria in oxidative and

antibiotic, Can. J. Physiol. Pharmacol., 55, 48-51.

7 БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1866

АНДРИАНОВА и др.

35. Kim, B.S., Lim, S.W., Li, C., Kim, J.S., Sun, B.K., and

ischemia reperfusion injury in mice, Aging Cell, 9, 40-53,

Ahn, K.O., et al. (2005) Ischemia reperfusion injury acti

doi: 10.1111/j.1474 9726.2009.00532.x.

vates innate immunity in rat kidneys, Transplantation, 79,

41. Ning, Y. C., Cai, G. Y., Zhuo, L., Gao, J. J., Dong, D.,

1370-1377.

and Cui, S. Y., et al. (2013) Beneficial effects of short term

36. Dumont, F.J., and Su, Q. (1996) Mechanism of action of

calorie restriction against cisplatin induced acute renal

the immunosuppressant rapamycin, Life Sci., 58, 373-395.

injury in aged rats, Nephron. Exp. Nephrol., 124, 19-27,

37. Law, B.K. (2005) Rapamycin: an anti cancer immunosup

doi: 10.1159/000357380.

pressant? Crit. Rev. Oncol. Hematol.,

56,

47-60,

42. Tokunaga, C., Yoshino, K., and Yoneezawa, K. (2004)

doi: 10.1016/j.critrevonc.2004.09.009.

mTOR integrates amino acid and energy sensing path

38. Kaushal, G.P. (2012) Autophagy protects proximal tubular

ways, Biochem. Biophys. Res. Commun., 313,443-446.

cells from injury and apoptosis, Kidney Int.,

82,

43. Li, J., Kim, S.G., and Blenis, J. (2014) Rapamycin: one

1250-1253, doi: 10.1038/ki.2012.337.

drug, many effects, Cell Metab.,

19,

373-379,

39. Nakagawa, S., Nishihara, K., Inui, K., and Masuda, S. (2012)

doi: 10.1016/j.cmet.2014.01.001.

Involvement of autophagy in the pharmacological effects of

44. Lee, S. H., and Min, K. J. (2013) Caloric restriction and

the mTOR inhibitor everolimus in acute kidney injury, Eur. J.

its mimetics, BMB Rep., 46, 181-187.

Pharmacol., 696, 43-54, doi: 10.1016/j.ejphar.2012.09.010.

45. Lamming, D.W. (2016) Inhibition of the mechanistic tar

40. Mitchell, J.R., Verweij, M., Brand, K., van de Ven, M.,

get of rapamycin (mTOR)-rapamycin and beyond, Cold

Goemaere, N., and van den Engel, S., et al. (2010) Short

Spring Harb. Perspect. Med., 6, a025924, doi: 10.1101/csh

term dietary restriction and fasting precondition against

perspect.a025924.

RAPAMYCIN DOES NOT PROTECT AGAINST ISCHEMIC

AND CISPLATIN>INDUCED KIDNEY INJURY

N. V. Andrianova^1,2, L. D. Zorova^2,3, V. A. Babenko^2,3, I. B. Pevzner^2,3,

V. A. Popkov^2,3, D. N. Silachev^2,3, E. Y. Plotnikov^2,3,4*, and D. B. Zorov^2,3*

¹ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, 119992 Moscow, Russia

² Belozersky Institute of Physico$Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 119992 Moscow, Russia;

E$mail: plotnikov@belozersky.msu.ru, zorov@belozersky.msu.ru

³ Kulakov National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, 117997 Moscow, Russia

⁴ Sechenov First Moscow State Medical University, Institute of Molecular Medicine, 119991 Moscow, Russia

Received June 24, 2019

Revised July 12, 2019

Accepted July 12, 2019

Autophagy plays an important role in the pathogenesis of acute kidney injury (AKI). Although autophagy activation

was shown to be associated with an increased lifespan and beneficial effects in various pathologies, the impact of

autophagy activators, particularly, rapamycin and its analogues, on AKI remains obscure. In our study, we explored

the effects of rapamycin treatment in in vivo and in vitro models of ischemic and cisplatin induced AKI. The impact

of rapamycin on the kidney function after renal ischemia/reperfusion (I/R) or exposure to the nephrotoxic agent cis

platin was assessed by quantifying blood urea nitrogen and serum creatinine and evaluating the content of neutrophil

gelatinase associated lipocalin, a novel biomarker of AKI. In vitro experiments were performed on the primary cul

ture of renal tubular cells (RTCs) that were subjected to oxygen glucose deprivation (OGD) or incubated with cis

platin under various rapamycin treatment protocols. Cell viability and proliferation were estimated by the MTT assay

and real time cell analysis using an RTCA iCELLigence system. Although rapamycin inhibited mTOR (mammalian

target of rapamycin) signaling, it failed to enhance the autophagy and to ameliorate the severity of AKI caused by

ischemia or cisplatin induced nephrotoxicity. Experiments with RTCs demonstrated that rapamycin exhibited the

anti proliferative effect in primary RTC cultures but did not protect renal cells exposed to OGD or cisplatin. Our

study revealed for the first time that the mTOR inhibitor rapamycin did not prevent AKI caused by renal I/R or cis

platin induced nephrotoxicity and, therefore, cannot be considered as an ideal mimetic of the autophagy associated

nephroprotective mechanisms (e.g., those induced by caloric restriction), as it had been suggested earlier. The pro

tective action of such approaches like caloric restriction might not be limited to mTOR inhibition and can proceed

through more complex mechanisms involving alternative autophagy related targets. Thus, the use of rapamycin and

its analogues for the treatment of various AKI forms requires further studies in order to understand potential protec

tive or adverse effects of these compounds in different contexts.

Keywords: rapamycin, acute kidney injury, ischemia, cisplatin, renal tubular cells, autophagy, nephroprotection

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019