БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 2, с. 240 - 251

УДК 577.32

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ ФОСФОРЕСЦЕНЦИИ

СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА МЕТОДОМ РАЗРЕШЕННОГО

ВО ВРЕМЕНИ СЧЕТА ФОТОНОВ В РАСТВОРИТЕЛЯХ,

НЕ СОДЕРЖАЩИХ ВОДОРОДНЫХ АТОМОВ^*

А.А. Красновский^1,2**, А.С. Бендиткис¹, А.С. Козлов¹

¹ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха,

119071 Москва, Россия; электронная почта: phoal@mail.ru

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 02.09.18

После доработки 29.10.18

Принята к публикации 29.10.18

Растворители, не содержащие водородных атомов, в которых время жизни синглетного кислорода достига

ет несколько десятков миллисекунд - исключительно удобная модель для изучения свойств синглетного

кислорода, а измерение собственной ИК фосфоресценции синглетного кислорода при 1270 нм является на

иболее надежным методом его детектирования. Однако для эффективного применения фосфоресценции

к этой модели необходимо располагать оборудованием для стационарных и кинетических измерений фос

форесценции при малой скорости генерации синглетного кислорода, что связано с серьезными техничес

кими трудностями. В данной работе описан сконструированный в лаборатории новый высоко чувствитель

ный светодиодный (лазерный) спектрометр для стационарных и кинетических исследований миллисекунд

ной фосфоресценции кислорода. В стационарном режиме этот спектрометр позволил наблюдать фосфорес

ценцию синглетного кислорода при прямом беспигментном возбуждении молекул кислорода в области его

темно красных абсорбционных полос (690 и 765 нм). Для кинетических измерений применен метод разре

шенного во времени счета фотонов при фотовозбуждении фотосенсибилизатора феналенона микросекунд

ными светодиодными импульсами 405 нм средней мощностью <50 мкВт/см². С помощью нового спектро

метра измерено время жизни синглетного кислорода в насыщенных воздухом ССl₄, C₆F₆ и фреоне 113,

а также тушение синглетного кислорода феналеноном и растворенными триплетными молекулами кисло

рода. Определены относительные значения константы скорости излучательной дезактивации синглетного

кислорода в исследованных средах. Результаты сопоставлены с абсорбционными коэффициентами кисло

рода, полученными методом лазерной фотохимии. Приводится обсуждение полученных результатов в срав

нении с данными других исследовательских групп.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: cинглетный кислород, фосфоресценция, светодиодный (лазерный) спектрометр,

счет фотонов, время жизни, тушение кислородом, абсорбционные коэффициенты, растворители, не имею

щие водородных атомов.

DOI: 10.1134/S0320972519020076

Фотосенсибилизированная ИК фосфорес

1976-1977 гг. в растворителях, не содержащих

ценция синглетного (¹Δ_g) кислорода (¹О₂) (рис. 1)

водородных атомов - ССl₄, фреоне 113 и CS₂

широко применяется в лабораторной практике

([3] и указанные там ссылки). Первоначально

для исследования свойств синглетного кислоро

фосфоресценцию регистрировали с помощью

да и фотодинамических фотосенсибилизаторов

спектрометров с механическими фосфороско

в связи с многочисленными теоретическими и

пами и фотодетекторной системой на базе ох

прикладными задачами фотофизики, фотохи

лаждаемых фотоумножителей со спектральной

мии, фотобиологии и фотомедицины [1, 2].

характеристикой С 1 (ФЭУ 83). Конструкция

Первые измерения фосфоресценции синг

этих приборов подробно описана ранее [3, 4] и в

летного кислорода в раствораx пигментов были

последующих публикациях ([1] и указанные там

выполнены одним из авторов этой статьи в

ссылки). Они позволяли измерять спектры воз

буждения, спектры излучения и время жизни

* Первоначально английский вариант рукописи опубли

фосфоресценции при величине времени жизни

кован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

0,7 мс. Было установлено, что время жизни

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 18 244,

синглетного кислорода (τ_Δ) в этих средах >20 мс [3],

24.12.2018.

а не ≈1 мс, как следовало из измерений с по

** Адресат для корреспонденции.

240

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

241

зера или импульсной лампы, используя в каче

стве фотодетектора такой же фотоумножитель

ФЭУ 83 и запоминающий осциллограф [6-8].

В частности, ими было обнаружено, что при вы

сокой мощности возбуждающих вспышек кине

тика затухания фосфоресценции кислорода в

ССl₄ является двухфазной и не описывается экс

понентой. Авторы предположили, что это связа

но с рекомбинацией молекул ¹О₂ при их высокой

концентрации. В результате снижения энергии

вспышки до минимальной величины (7 мДж)

затухание фосфоресценции кислорода станови

Рис. 1. Схема механизма фотосенсибилизированной ИК

лось экспоненциальным с временем жизни 30 мс

фоcфоресценции синглетного кислорода. ¹Dye₀,

¹Dye* и

[6]. Таким образом, авторы этих работ пришли к

³Dye* - молекулы пигментов фотосенсибилизаторов в ос

тому же значению τ_Δ, которое было получено в

новном и возбужденных синглетном и триплетном состоя

наших исследованиях. В растворителях, молеку

ниях; ³O₂ и ¹O₂ - молекулы кислорода в основном и синг

летном состояниях

лы которых содержали водородные атомы,

время жизни фосфоресценции снижалось до

мощью ловушек синглетного кислорода [5].

10-100 мкс [6-8].

Подробные исследования, выполненные в ССl₄,

В 1987 г. Шмидт и Брауер сконструировали

привели к заключению, что время жизни синг

достаточно сложный прибор, в котором источ

летного кислорода в этом растворителе умень

ником возбуждения служила ртутная лампа, де

шается с увеличением концентрации пигмен

тектором - германиевый фотодиод. Прерывис

тов сенсибилизаторов из за физического туше

тый свет получали с помощью механического

ния молекул ¹О₂ невозбужденными пигментны

прерывателя с частотой 2,5 Гц, длительность им

ми молекулами. Максимальное τ_Δ ≈ 30 мс было

пульса - 10 мс. Постоянная времени фотодиода

получено в растворе феофитина a (1 мкМ) при

и его усилительной системы составляла 5,1 мс.

плотности мощности возбуждающего света

Для устранения искажения кинетических кри

300-700 мкВт/см² в CCl₄, очищенном двукрат

вых аппаратной функцией прибора, получен

ной перегонкой. Близкое время жизни достига

ный сигнал обрабатывали на компьютере, кото

лось в коммерческих образцах этого растворите

рый с помощью специальной программы вно

ля высокой степени очистки с содержанием

сил исправления, учитывающие постоянную

растворителя более 99,5% без дополнительной

времени фотодетектора. Таким образом, резуль

перегонки ([3] и указанные там ссылки). При

тирующая кинетическая кривая зависела от эф

этих условиях фотосенсибилизатор практически

фективности примененной программы. С по

не разрушался за время облучения. Тушение ¹О₂

мощью этого прибора авторы получили следую

кислородом воздуха в этих экспериментах не

щие значения τ_Δ = 87 мс в ССl₄, 99 мс во фреоне

рассматривали.

113 и 24 мс в гексафторбензоле [9, 10].

Таким образом, было показано, что раство

Параллельно Лосев и соавт. выполнили раз

рители, не имеющие водородных атомов - иск

решенные во времени и стационарные измере

лючительно удобная модель для изучения

ния τ_Δ в ССl₄ и CS₂ [11, 12]. Авторы пришли к

свойств и реакционной способности синглетно

выводу, что при минимальной энергии возбуж

го кислорода фосфоресцентным методом. С по

дения и минимальной концентрации фотосен

мощью этой модели и указанного выше τ_Δ были

сибилизатора (Pd мезопорфирина) в обоих

измерены константы скорости тушения ¹O₂

растворителях τ_Δ ≈ 30 мс при комнатной темпе

многими биологически важными соединения

ратуре. При понижении температуры до 193 К

ми: порфиринами, хлорофиллами, каротинои

время жизни увеличивалось примерно на 30%.

дами, водой, 1,4 диазобицикло (2,2,2) октаном,

Расхождение с данными группы Шмидта было

α токоферолом и другими соединениями, при

объяснено более высокой степенью очистки

чем полученные константы совпали по величи

растворителя в опытах группы Шмидта. Инте

не с аналогичными константами, измеренными

ресно, что рядом авторов [6, 9-12] поднимался

другими методами, что косвенно подтверждает

вопрос о роли кислорода воздуха в тушении

правильность значения τ_Δ, полученного из из

фосфоресценции синглетного кислорода. Одна

мерения фосфоресценции [1, 3].

ко все они пришли к мнению, что этот процесс

В 1979 г. Минская группа разработала спект

не эффективен.

рометр для разрешенных во времени измерений

В 1991 г. группа Шмидта, используя несколь

фосфоресценции после короткой вспышки ла

ко улучшенную процедуру анализа данных, ус

7 БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

242

КРАСНОВСКИЙ и др.

тановила, что при откачке воздуха время жизни

ность и временные параметры фосфоресценции

фосфоресценции возрастает в 1,5-2 раза [13].

при очень малой энергии возбуждения, при ко

При увеличении концентрации кислорода до

торой описанные выше нелинейные и деструк

его парциального давления 1 бар время жизни,

тивные эффекты невозможны. Первые спектро

наоборот, уменьшалось до 10-20 мс. Отсюда

метры нашей лаборатории [3] решали эту задачу,

сделан вывод, что кислород воздуха уменьшает

однако, позволяя определять среднее время

время жизни синглетного кислорода в аэриро

жизни фосфоресценции, они не давали возмож

ванных растворах, причем в аэрированном ССl₄

ности анализировать кинетику ее затухания.

было получено время жизни 59 ± 5 мс, что в 1,5

В настоящее время техника регистрации фос

раза меньше величины 87 мс, ранее опублико

форесценции синглетного кислорода сущест

ванной той же группой [9, 10]. Более низкие

венно усовершенствована. Для кинетических

значения времени жизни были получены также

измерений наиболее эффективны установки с

во фреоне 113 (72 мс) и гексафторбензоле (21 мс)

разрешенным во времени счетом фотонов. Пер

[13]. Эти же значения были приведены в извест

вая установка такого типа, предназначенная для

ном обзоре Schweitzer и Schmidt [14]. Ясного

измерения фосфоресценции синглетного кис

объяснения причин расхождения с более ранни

лорода с микросекундным разрешением, была

ми данными [9, 10] не было представлено. До

сделана в нашей лаборатории [19, 20]. Позже на

настоящего времени эти эксперименты никем

ее основе был сконструирован наносекундный

не повторены, хотя, очевидно, что их проверка

фосфоресцентный спектрометр, работающий в

имеет принципиальное значение.

режиме коррелированного во времени счета

В последнее время кинетические параметры

одиночных фотонов [21]. В настоящее время та

фосфоресценции синглетного кислорода в ССl₄

кие приборы широко применяются многими

исследовались в работах Багрова и соавт., кото

исследователями ([1, 2] и указанные там ссыл

рые использовали импульсную лампу, германи

ки). Однако, как указано, все они были предназ

евый фотодетектор и фуллерены С₇₀и С₆₀ в ка

начены для быстро затухающих микросекунд

честве фотосенсибилизатора. При комнатной тем

ных и наносекундных измерений.

пературе и плотности мощности возбуждения

Сконструированный нами новый прибор,

10 мДж/см² ими получено время жизни 22-55 мс

краткое представление которого приведено в на

[15, 16]. В согласии с данными работы Салохид

ших недавних публикациях [22, 23], предназна

динова и соавт. [6], они наблюдали, что время

чен для исследования медленно затухающих

жизни фосфоресценции в ССl₄ падает с увели

свечений с использованием техники разрешен

чением мощности возбуждения и, аналогично

ного во времени счета фотонов. Технически этот

работам Лосева и соавт. [11, 12], получили, что

прибор полностью решает поставленную задачу.

при нагревании раствора τ_Δ уменьшается.

В настоящей работе этот прибор впервые при

Недавно, группа Wang et al. повторила эти

менен к измерению кинетики фотосенсибили

наблюдения, используя инфракрасный фотоум

зированной фосфоресценции синглетного кис

ножитель Хамаматсу. При минимальной мощ

лорода в растворителях, слабо дезактивирую

ности лазерных вспышек (10 мДж) время жизни

щих ¹О₂, при возбуждении светодиодными

¹О₂ составляло 16-17 мс в ССl₄ при концентра

вспышками, энергия которых на 3-4 порядка

ции С₆₀ 200 мкМ [17]. Одновременно, по данным

ниже, чем во всех описанных выше работах, в ко

этой группы наблюдалось окисление С₆₀ и туше

торых была применена импульсная техника. По

ние синглетного кислорода продуктом окисле

казана также возможность использования при

ния. Hasebe et al. [18], используя Pt (II) мезо

бора для регистрации фосфоресценции синг

тетра (пентафторфенил) порфин (7,4 мкМ) и

летного кислорода, возникающей при прямом

импульсы Nd: YAG лазера (8 нс, 10 Гц) получили

беспигментном возбуждении кислорода темно

τ_Δ = 5,04 мс. Экстраполяция, по данным этих ав

красным светом, соответствующим абсорбцион

торов, к нулевой концентрации порфирина

ным полосам кислорода 690 и 765 нм.

приводит к величине τ_Δ ≈ 14 мс. Однако инфор

мация об энергии вспышек не указана.

Таким образом, из за неопределенности вре

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

мени жизни создавалось впечатление некоторой

ненадежности этих систем, что позволяло неко

Блок схема нового спектрометра показана

торым исследователям подвергать сомнению

на рис. 2. Для стационарных измерений люми

данные, полученные в этих растворителях, или

несценции использовался светодиод с максиму

отказываться от их применения. Для получения

мом полосы испускания 399 нм и полушириной

достоверной информации нужны приборы, ко

полосы 14 нм («Полироник», Россия). Излуче

торые могут измерять стационарную интенсив

ние фотодиода фокусировали в пятно диамет

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

243

Рис. 2. Блок схемы лазерных (светодиодных) спектрометров для стационарных и разрешенных во времени измерений ИК

(1270 нм) долгоживущей фосфоресценции синглетного кислорода в растворителях, слабо дезактивирующих синглетный

кислород

ром 5 мм на поверхности кварцевой кюветы с

Для кинетических измерений использовали

исследуемым раствором. Интенсивность воз

импульсный светодиод («Полироник», Россия)

буждающего света контролировали измерите

с управляющим блоком («Альком Медика»,

лем мощности ThorLabs PM 100D с сенсорной

Россия), который позволял облучать образцы мо

головкой S120VC («Thorlabs», США). В отдель

нохроматическим светом 405 нм (полуширина

ных опытах использовали также диодные лазе

полосы - 14 нм). Длительность вспышки - 10 мкс,

ры с максимумом испускания 765 нм (полуши

частота повторения вспышек - 5 или 10 Гц.

рина 2 нм, мощность до 1 Вт) («ЛАМИ Гелиос»,

Средняя мощность возбуждающего света сос

Россия) и 690 нм (полуширина 3 нм, мощность

тавляла 15-30 мкВт, соответственно энергия од

до 5 Вт) («Милон Лахта», Россия). Мощность

ной вспышки равна 3 мкДж. Сигнал фотоумно

излучения измеряли с помощью прибора Ophir

жителя через предусилитель попадал на компью

ORION TH с сенсорной головкой 20C SH

терную плату, которая работала в двух режимах -

(«Ophir», Израиль). Фосфоресценцию синглет

разрешенного во времени многоканального сче

ного кислорода измеряли под углом 90° охлаж

та фотонов или время разрешенного счета оди

даемым фотоумножителем ФЭУ 112 («Экран»,

ночных фотонов («Парсек», Россия). Постоян

Новосибирск, Россия) со спектральной характе

ная времени регистрирующей системы состав

ристикой С 1 через светофильтры пропускаю

ляла ~10 нс. Запуск счетной платы производит

щие ИК свет в области

950 нм и один из трех

ся от дополнительного импульса управляющего

сменных интерференционных светофильтров с

блока, синхронизированного с импульсом све

максимумами пропускания при 1230, 1270 и

тодиода. Счетная плата разделяла интервал вре

1310 нм и полушириной 10 нм. Стационарную

мени между вспышками на 1024 канала. Кине

интенсивность фосфоресценции измеряли циф

тические кривые получены методом накопле

ровым высокоомным милливольтметром («Эко

ния фотоимпульсов в каждом канале. Метод кор

никс Эксперт», Россия) и анализировали на

релированного во времени счета одиночных фо

персональном компьютере.

тонов в данной работе не использовался.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

244

КРАСНОВСКИЙ и др.

Исследуемые растворы помещали в 1 см

500 раз (рис. 3). Такое же свечение возникало в

кварцевую кювету, объем раствора - 1,5 мл. В ка

этих растворителях без фотосенсибилизаторов

честве фотосенсибилизаторов применяли, глав

при облучении в присутствии воздуха светодио

ным образом, феналенон (другие названия: пе

дами в области 400 нм [16, 25, 26]. Однако кван

ринафтенон, 1H фенален 1 он), а также в от

товая эффективность беспигментного свечения

дельных опытах тетрафенилпорфирин («Aldrich

на несколько порядков слабее, чем в растворах

Chemical», Бельгия). Концентрацию феналено

фотосенсибилизаторов, поэтому оно практичес

на рассчитывали, используя молярный коэффи

ки не влияло на суммарную интенсивность фо

циент в максимуме его поглощения, равный

тосенсибилизированной фосфоресценции.

9700 M^-1см^-1 [24]. В некоторых экспериментах,

В стационарном режиме собранный спектро

использовали ловушку синглетного кислорода

метр позволяет регистрировать фосфоресценцию

1,3 дифенилизобензофуран (ДФИБФ) («Acros

кислорода при облучении беспигментных раство

Organics», Бельгия). Растворителями служили

ров лазерными диодами 765 и 690 нм (1-3 Вт),

четыреххлористый углерод («Лабтех», Россия),

длина волны которых соответствовала полосам

гексафлуоробензол («Пиминвест», Россия) и

поглощения кислорода. Способность лазеров

хладон 113 (1,1,2 Трифтор 1,2,2 трихлорэтан)

765 нм возбуждать фосфоресценцию кислорода

(«Русхимпром», Россия), которые, согласно пас

уже была описана ранее в работах лаборатории

порту, содержали не менее 99,5-99,8% основно

Огилби [27] и наших предшествующих публика

го вещества. Спектры поглощения измеряли на

циях [22, 23]. В настоящей работе мы сообщаем о

спектрофотометре СФ 56 («ЛОМО Спектр»,

возбуждении кислорода также излучением 690 нм

Россия).

(1-3 Вт) (рис. 3) (предварительные данные были

представлены ранее [23]). Ацетон ослаблял эту

фосфоресценцию (рис. 3), причем интенсив

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ность регистрируемого в присутствии ацетона

свечения соответствовала уровню собственной

Стационарные измерения. При регистрации

люминесценции кварцевой кюветы. Следует от

сигнала фотоумножителя в режиме измерения

метить, что на рис. 3 показаны кривые, норми

постоянного тока мы наблюдали, что освещение

рованные по интенсивности к 1.

насыщенных воздухом растворов феналенона

В реальности квантовая эффективность фо

или тетрафенилпорфирина в ССl₄, C₆F₆ или

тосенсибилизированной фосфоресценции при

С₂F₃Сl₃, непрерывным или импульсным излуче

мерно на 5 порядков выше, чем квантовая эф

нием светодиодов в области ≈400 нм приводит к

фективность фосфоресценции, вызванной тем

появлению фосфоресценции ¹O₂ со спектраль

нокрасным светом без фотосенсибилизатора.

ным максимумом 1270 нм (рис. 3). Добавление

Анализ механизма свечения, индуцированного

50% ацетона, приводящее к резкому уменьше

темнокрасными лазерами, выходит за рамки на

нию времени жизни ¹O₂, ослабляло фотосенси

стоящей работы и будет представлен в отдель

билизированную фосфоресценцию примерно в

ной публикации.

Рис. 3. Интенсивность и спектр фосфоресценции ¹O₂ при фотосенсибилизированном (а и г) и прямом (б-г) возбуждении

кислорода в насыщенном воздухом четыреххлористом углероде. а - Раствор феналенона при возбуждении светодиодом

399 нм (4 мВт), верхняя кривая без ацетона, нижняя - после добавления 50% ацетона; б - без феналенона при возбужде

нии кислорода диодным лазером 765 нм (900 мВт); в - без феналенона при возбуждении диодным лазером 690 нм (1-3 Вт).

г - Спектры фосфоресценции а-в после вычета свечения, наблюдаемого в присутствии ацетона (слева направо)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

245

Во всех растворителях при стационарном

линейной зависимости от интенсивности воз

возбуждении 399 нм интенсивность фотосенси

буждающего света, наблюдаемой при I_ex

4 мВт.

билизированной феналеноном фосфоресценции

Кинетические измерения. Кинетические кри

линейно зависела от интенсивности возбуждаю

вые затухания фосфоресценции после возбуж

щего света (I_ex) при ее изменении 0,05-4 мВт

дения 10 мкс вспышками светодиода (405 нм),

(данные не показаны). При более высоких ин

измеренные на установке с разрешенным во

тенсивностях наблюдалось некоторое отклоне

времени счетом фотонов, показаны на рис. 4-6.

ние от линейности, относительно слабое в C₆F₆,

Постоянную времени затухания определяли из

но отчетливо заметное в ССl₄ и фреоне. Напри

тангенса угла наклона кинетических кривых в

мер, при максимальной мощности фотодиода

полулогарифмическом масштабе. Для определе

(200 мВт) интенсивность фосфоресценции в ССl₄

ния этого параметра из исходной кинетической

вдвое меньше, чем следовало бы ожидать при

кривой вычитали усредненный контрольный

Рис. 4. Кривые затухания фосфоресценции ¹O₂ в растворах феналенона (35 мкM) в CCl₄ после облучения 10 мкс вспыш

ками светодиода (405 нм) в присутствии воздуха (а) и после насыщения кислородом (б). Кривые получены при частоте

повторения вспышек 5 Гц в результате 30 мин накопления сигнала. Длительность одного канала 164 мкс. Средняя мощ

ность возбуждающего света 15 мкВт. Во врезке показана кривая затухания в полулогарифмическом масштабе

Рис. 5. Кривые затухания фосфоресценции ¹O₂ в растворах феналенона (35 мкМ) в гексафторбензоле после облучения

10 мкс вспышками светодиода (405 нм) в присутствии воздуха (а) и после насыщения кислородом (б). Кривые получены

при частоте повторения вспышек 10 Гц в результате 20 мин накопления сигнала. Длительность одного канала 82 мкс.

Средняя мощность возбуждающего света 30 мкВт. Во врезке показана кривая затухания в полулогарифмическом масштабе

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

246

КРАСНОВСКИЙ и др.

Рис. 6. Кривые затухания фосфоресценции ¹O₂ в растворах феналенона (35 мкМ) во фреоне 113 после облучения 10 мкс

вспышками светодиода (405 нм) в присутствии воздуха (а) и после насыщения кислородом (б). Кривые получены при час

тоте повторения вспышек 5 Гц в результате 30 мин накопления сигнала. Длительность одного канала 164 мкс. Средняя

мощность возбуждающего света 15 мкВт. Во врезке показана кривая затухания в полулогарифмическом масштабе

сигнал люминесценции от кюветы с чистым

лорода в 4,8 раза, сопровождалось ускорением

растворителем при тех же условиях освещения.

затухания фосфоресценции в 1,5-1,7 раза. Сни

Первые 10 мкс кинетической кривой не учиты

жение времени жизни наблюдали также при

вали, так как в этом временном интервале воз

увеличении концентрации фотосенсибилизато

можен вклад нарастания сигнала из за дезакти

ра - феналенона. Как указывалось, аналогич

вации триплетного состояния фотосенсибили

ный эффект наблюдали ранее в растворах других

затора. Отбрасывали также конечный участок

фотосенсибилизаторов разной природы [1, 3].

кривых, в котором в полулогарифмическом

Отсюда можно предположить, что ¹О₂ подверга

масштабе шумы начинали вносить существен

ется физическому тушению феналеноном и

ные искажения. Из рисунков видно, что затуха

триплетным кислородом. Процесс тушения

ние фосфоресценции является экспоненциаль

можно описать следующим вариантом уравне

ным. При концентрации феналенона ~30 мкМ в

ния Штерна-Фольмера:

насыщенном воздухом ССl₄ время затухания

фосфоресценции равно 30 ± 1 мс (рис. 4). Сле

k_obs = k₀ + k_ox[O₂] + k_ph[Ph],

(1)

довательно, оно совпадает с данными, получен

ным в наших первоначальных работах [3] и пос

где k_obs - скорость затухания фосфоресценции

ледующих работах Минской группы исследова

(k_obs = 1/τ_decay) в растворах, содержащих фенале

телей [6-8, 11, 12] и вдвое меньше, чем в работах

нон и кислород; k₀ - скорость затухания в чис

группы Шмидта (59 мс) [13, 14].

том растворителе; k_ox и k_ph- константы скорости

В насыщенном воздухом гексафторбензоле

тушения ¹O₂ триплетным кислородом или фена

(рис. 5) время жизни составило 16 мс. Эта вели

леноном. Отсюда получаем:

чина совпадает с результатом наших предшест

вующих измерений, выполненных на установке с

(k_obs)_oxygen - (k_obs)_air = k_ox([O₂]_oxygen - [O₂]_air),

(2)

фосфороскопом [3, 28] и достаточно близка к пос

ледним данным группы Шмидта (21 мс) [13, 14].

значения k_ox, рассчитанные с помощью этого

В насыщенном воздухом фреоне 113 мы получи

уравнения, по данным рис. 5-7 и литературным

ли время жизни ≈37 мс (рис. 6), что вдвое мень

данным о концентрации кислорода в растворах

ше, чем в работе Шмидта (72 ± 5 мс) [13, 14].

[29, 30], приведены в табл. 1.

Последующие эксперименты посвящены

Полученные в наших экспериментах значе

выяснению того, в какой мере полученные зна

ния k_ox в ССl₄ и C₆F₆ разумно коррелируют с

чения зависят от концентрации фотосенсиби

данными группы Шмидта и других групп иссле

лизатора и кислорода. Из рисунков видно, что

дователей [13, 14, 31]. Несколько меньшее зна

насыщение растворов чистым кислородом (пу

чение этой константы получено во фреоне. Од

тем его барботирования в течение 20 мин), кото

нако следует отметить, что точные сведения о

рое приводит к увеличению концентрации кис

растворимости кислорода во фреоне, насколько

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

247

Таблица 1. Константы скорости тушения ¹О₂ триплетным кислородом (k_ox) и феналеноном (k_ph) и константы скорости дез

активации (k_obs) и время жизни (τ_Δ) синглетного кислорода в исследованных растворах

Растворитель

[O₂], М [29, 30]

k_obs, с^-1*

k_ox, M^-1 c^-1

k₀ + k_ph[Ph], c^-1**

k_ph × 10^-5,

k₀, с^-1*** (τ₀ = 1/k₀, мс)

(τ_Δ = 1/k_obs, мс)

(τ = 1/k₀ + k_ph[Ph], мс)

М^-1 с^-1

ССl₄

2,6; воздух

33 (30 мс)

2600

27 (38 мс)

1,7 ± 0,3

~20 (50 мс)

12,4; кислород

59 (17 мс)

С₆F₆

4,4; воздух

62,5 (16 мс)

2600

51 (20 мс)

1,0 ± 0,1

~48 (21 мс)

21; кислород

105 (9,5 мс)

C₂F₃Cl₃

3,2****; воздух

27 (37 мс)

1400

22 (45 мс)

1,0 ± 0,1

~19 (53 мс)

15,4; кислород

44 (23 мс)

* Измерено при концентрации феналенона 35 мкМ.

** Результаты расчета констант затухания и времени жизни ¹O₂ в отсутствии кислорода.

*** Результаты расчета констант затухания и времени жизни ¹O₂ в отсутствии кислорода и феналенона.

**** Концентрация кислорода получена из данных табл. 2 (см. ниже).

нам известно, отсутствуют. Поэтому для оценки

Радиационные и абсорбционные коэффициенты.

константы k_ox мы использовали значения [O₂],

Как известно, измеренное время жизни синглет

полученные из данных настоящей работы, пу

ного кислорода (τ_Δ) характеризуется, главным об

тем сравнения квантовых выходов фосфорес

разом, его безызлучательной дезактивацией, тог

ценции и абсорбционных коэффициентов кис

да как интенсивность фосфоресценции ¹О₂оп

лорода. Детали этого расчета описаны ниже

ределяется радиационной константой (k_r), а ее

(табл. 2). Полученная таким образом константа

квантовый выход (Ф_r) соответствует уравнению:

k_ox во фреоне имеет разумную величину, хотя,

безусловно, ее значение является оценочным.

Ф_r = k_rτ_Δ.

(3)

Зависимость константы скорости дезактива

ции фосфоресценции ¹О₂ oт концентрации фе

Радиационная константа характеризует элект

наленона в гексафторбензоле и фреоне 113 хо

ронную структуру и состояние молекулы кисло

рошо соответствует прямой в координатах

рода и, согласно общеизвестному соотношению

Штерна-Фольмера (рис. 7). В четыреххлорис

Эйнштейна, прямо пропорциональна молярно

том углероде разброс точек оказался существен

му коэффициента поглощения:

но более высоким (не показано). Значения k_ph,

полученные в наших экспериментах, указаны в

ε₁₂₇₀~k_r /n².

(4)

табл. 1. Эти значения несколько ниже величи

ны, измеренной в нашей лаборатории ранее (3 ×

Сконструированный нами спектрометр поз

× 10⁵M^-1с^-1в ССl₄) [28], и несколько больше ве

волил сравнить константы скорости излучатель

личины, приведенной в работах группы Шмид

ной дезактивации синглетного кислорода в изу

та (3,5 × 10⁴M^-1с^-1) [13, 14].

ченных растворителях.

Таблица 2. Относительные значения k_r для ИК полосы излучения ¹О₂ и рассчитанные из них относительные значения мо

лярных коэффициентов поглощения в максимуме поглощения кислорода в области 1270 нм (ε₁₂₇₀). Сравнение с абсолют

ными значениями А₁₂₇₀ и ε₁₂₇₀, полученными методом лазерной фотохимии [22, 34, 35]

Растворитель

n²

I_Δ/I₃₉₉, отн. ед.

τ_Δ, мс

k_r, отн. ед.

ε₁₂₇₀, отн. ед.

А₁₂₇₀ × 10⁵,

ε₁₂₇₀× 10³,

(± 10%)

(± 2%)

(± 15%)

(1 см)

М^-1 см^-1

ССl₄

2,13

29,5

1,0

1,33

5,1

С₆F₆

1,9

0,57

0,94

1,05

2,2

5,0

C₂F₃Cl₃

1,85

0,92

0,68

0,78

1,3

4,0*

* Получено умножением относительной величины ε₁₂₇₀ во фреоне (нижняя строка в третьем столбце справа) на абсолют

ную величину ε₁₂₇₀ в М^-1 см^-1 в ССl₄ (верхняя строка в крайнем правом столбце).

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

248

КРАСНОВСКИЙ и др.

интервала. Есть тенденция к некоторому умень

шению k_rи ε₁₂₇₀ во фреоне, что отмечалось также

ранее [33].

В течение последних 15 лет наша лаборато

рия разработала фотохимический метод опреде

ления оптической плотности (А₁₂₇₀ и А₇₆₅) и мо

лярных коэффициентов поглощения (ε₁₂₇₀ и ε₇₆₅)

в максимумах поглощения кислорода, основан

ный на кинетическом анализе скорости фото

окисления ловушек синглетного кислорода при

прямом лазерном возбуждении кислородных

молекул [1, 22, 33-35]. Принцип метода иллю

стрируется рис. 8.

В последние годы методики измерения и

Рис. 7. Тушение фосфоресценции синглетного кислорода

феналеноном в насыщенном воздухом гексафторбензоле.

расчетов были нами существенно улучшены за

k_obs - константа скорости дезактивации фосфоресценции

счет разработки метода сравнения скоростей

синглетного кислорода; R² - коэффициент детерминации

окисления ловушек при прямом (V_dir, M/с) и фо

(достоверности)

тосенсибилизированном (V_psr, M/с) возбужде

нии кислорода. Этим методом удалось опреде

лить коэффициенты поглощения кислорода,

Для измерений использовали растворы фе

растворенного во многих органических раство

наленона с одинаковой оптической плотностью

рителях и в воде [22, 33-35].

0,12 ± 0,005 при 399 нм. Константы k_r рассчиты

Оптическую плотность кислорода А₁₂₇₀(А₇₆₅в

вали по следующей формуле для стационарной

настоящей работе не рассматривается) опреде

интенсивности фотосенсибилизированной лю

ляли по следующей формуле:

минесценции:

A₁₂₇₀ = (V_dir/I₁₂₇₀)/(V_psr/I₅₁₁)

I_Δ = (K/n²) Ф_Δ I₃₉₉ α(1-10^-Aph) k_r τ_Δ,

(5)

Ф_Δ(1-10^-Aps)/(α_las2,3),

(7)

где K - коэффициент пропорциональности,

учитывающий конструкцию прибора; I_Δ и I₃₉₉-

в которой I₁₂₇₀ и I₅₁₁ - интенсивность прямого

интенсивности (в фотонах в секунду) фотосен

лазерного возбуждения кислорода при 1270 нм и

сибилизированной фосфоресценции кислорода

и возбуждающего света, n - показатель прелом

ления растворителя, Ф_Δ - квантовый выход ге

нерации синглетного кислорода феналеноном,

равный ≈1 [24, 32], A_ph - оптическая плотность

феналенона в области возбуждения (399 нм);

α - коэффициент показывающий степень пе

рекрытия полосы излучения светодиода и абсо

рбционной полосы феналенона. Отсюда:

k_r = (n² I_Δ/I₃₉₉)/τ_Δ KФ_Δ α(1-10^-Aph),

(6)

где параметр KФ_Δ α(1-10^-Aph) одинаков для всех

растворов, поэтому при расчете относительных

значений k_r, этот параметр не учитывался. От

носительные значения молярного коэффициен

та поглощения для той же полосы рассчитывали

из относительных значений k_r по соотношению

Рис. 8. Принципы регистрации синглетного кислорода ме

Эйнштейна (4).

тодом лазерной фотохимии. Слева показан спектр погло

Полученные значения суммированы в табл. 2.

щения ловушки синглетного кислорода 1,3 дифенилизо

Отношение I_Δ/I₃₉₉и значения k_r и ε₁₂₇₀ в ССl₄ бы

бензофурана (максимум 414 нм), которая выцветает под

действием лазерного излучения 1273 нм, соответствующе

ли приняты за 1. Из таблицы видно, что во всех

го максимуму поглощения растворенного кислорода. Оп

(изученных в настоящей работе) растворителях

тическая плотность кислорода в этом максимуме ≈10^-5 [22,

константы k_rи ε₁₂₇₀ имеют близкие значения, ле

33-35], поэтому в масштабе данного рисунка максимум

жащие в пределах указанного доверительного

кислорода не виден

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

249

интенсивность возбуждения фотосенсибилиза

времени жизни синглетного кислорода в ССl₄

тора (тетрафенилпорфина, ТФП) в фотонах в

(30 мс), которые были получены в наших пер

секунду, Ф_Δ - квантовый выход генерации синг

вых работах [3] и последующих работах Минс

летного кислорода порфирином (Ф_Δ = 0,73), A_ps -

кой школы [6-8, 11-12]. Однако эта величина

оптическая плотность ТФП на длине волны воз

вдвое меньше значения, полученного группой

буждения (511 нм), α_las -степень перекрывания

Шмидта [13, 14]. Во фреоне 113 наши измере

полосы излучения диодного лазера и спектра

ния привели к значению времени жизни (37 мс),

поглощения кислорода [22, 34, 35]. Полученные

которое также вдвое меньше величины, полу

таким образом значения А₁₂₇₀ показаны в табл. 2.

ченной группой Шмидта [13, 14]. В гексафтоp

Поскольку:

бензоле наши данные и данные группы Шмидта

[13, 14] достаточно близки (табл. 1, рис. 5 и 6).

А₁₂₇₀ = ε₁₂₇₀ [O₂]l,

(8)

В последующих работах других групп были по

лучены значения τΔ в ССl₄, лежащие в пределах

где l = 1 см, а значения [O₂] указаны в табл. 2, из

14-55 мс [15-18], причем условия их измере

формулы (8) легко получить ε₁₂₇₀ (см. табл. 2).

ния описаны недостаточно подробно для де

Растворимость кислорода во фреоне 113 точ

тального анализа. Ранее многие предполагали,

но не известна (различные оценки были описа

что высокие значения τ_Δ, полученные группой

ны ранее [13,31]). Наши данные (табл. 2) позво

Шмидта, обусловлены более высокой степенью

ляют определить эту величину. Для этой цели

очистки использованных им растворителей.

использовали значение ε₁₂₇₀ в ССl₄, полученное

Действительно, в работах этой группы указано,

методом лазерной фотохимии [22, 34, 35]. Вели

что «все растворители были очищены много

чина ε₁₂₇₀ во фреоне была получена путем умно

кратной хроматографией на колонках с Al₂O₃».

жения ε₁₂₇₀ в ССl₄на относительное значение

В наших опытах и в экспериментах других

ε₁₂₇₀, рассчитанное по фотосенсибилизирован

групп были использованы высокоочищенные

ной фосфоресценции кислорода. Отсюда, ис

коммерческие растворители без дополнитель

пользуя A₁₂₇₀ во фреоне, измеренную методом

ной обработки или после перегонки. Однако

лазерной фотохимии и уравнению (8), получа

очевидно, что разработанная группой Шмидта

ем, что [O₂] = 3,2 мМ. В табл. 1 эта величина бы

система регистрации и обработки данных несо

ла использована для расчета константы скорос

вершенна (см. введение), поэтому нельзя иск

ти тушения ¹О₂ триплетным кислородом во фре

лючить, что затягивание самых медленно зату

оне. Интересно, что аналогичная процедура

хающих кривых происходило из за техничес

после некоторого усовершенствования может

ких проблем. Тем не менее, наши измерения

быть применена к определению растворимости

подтверждают наблюдение Шмидта и др. о том,

кислорода в любых средах, допускающих спект

что ¹О2 подвергается тушению триплетным

ральные измерения.

кислородом воздуха и феналеноном. Получен

ные нами константы скорости тушения, нахо

Таким образом, из изложенного следует, что

дятся в разумном соответствии с данными

разработанные нами спектрометры позволяют

Шмидта.

надежно исследовать кинетические параметры

Сравнение квантовых выходов фосфорес

фосфоресценции синглетного кислорода в раст

ценции ¹О₂ в растворах феналенона позволили

ворителях, в которых время жизни ¹О₂достигает

определить относительные значения констант

десятков миллисекунд. С технической точки

скоростей излучательной дезактивации ¹О₂ в

зрения сконструированные спектрометры более

исследованных растворителях. Показано, что

совершенны и информативны по сравнению со

относительные значения излучательных конс

всеми приборами, использованными ранее для

тант и абсорбционных коэффициентов, изме

изучения кинетических параметров фосфорес

ренных методом лазерной фотохимии, близки.

ценции кислорода в таких системах. Как указа

Обоснование этого представления на более

но, кинетические кривые измерены под действи

широком круге растворителей дано в наших

ем очень низкой интенсивности возбуждающе

предшествующих работах [1, 22, 33-35]. Кроме

го света (15-30 мкВт), которая на порядки ниже

того, сконструированные приборы предостав

той, которая использовалась ранее. Это исклю

ляют новые возможности для исследования ге

чает вклад нелинейных эффектов, обнаружен

нерации и тушения ¹О₂ различными соедине

ных ранее [6]. Временное разрешение фотоде

ниями. Как показывает рис. 3, открываются

текторной системы (наносекунды) не могло

также новые перспективы для исследования ге

вносить искажений в кинетику затухания. Кине

нерации синглетного кислорода темно крас

тические измерения, выполненные с помощью

ным светом в аэрированных беспигментных

этих приборов, привели к тем же значениям

системах.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

250

КРАСНОВСКИЙ и др.

Финансирование

лон Лахта, Ltd», С. Петербург за диодные лазе

Работа частично поддержана Программой РАН

ры и техническую помощь.

«Фундаментальные науки - медицине» и грантам

и РФФИ (проекты № 15 04 05500 и 19 04 00331).

Конфликт интересов

Благодарности

Авторы благодарят фирму «Инновационные

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

хирургические технологии Ltd», Москва и «Ми интересов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Красновский А.А., мл. (2015) Синглетный кислород и

16.

Багров И.В., Киселев В.М., Кисляков И.М., Соснов

первичные механизмы фотодинамической и лазерной

E.H. (2014) Прямое оптическое возбуждение синглет

медицины, Фундаментальные науки - медицине. Био<

ного кислорода в органических растворителях, Опт.

физические медицинские технологии (под ред. А.И. Гри

спектр., 116, 609-618.

горьева и Ю.А. Владимирова), ООО «Maкс Пресс»,

17.

Wang, J., Leng, J., Yang, H., Sha, G., and Zhang, C.

Москва, с. 173-217.

(2014) Luminescence properties and kinetic analysis of

Nonell, S., and Flors, C. (Eds.) (2016) Singlet Oxygen

singlet oxygen from fullerene solutions, J. Luminescence,

Applications in Biosciences and Nanosciences, in Compre<

149, 267-271.

hensive series in photochemistry and photobiology, Vol. 13.

18.

Hasebe, N., Suzuki К., Horiuchi, H., Suzuki, Н.,

Krasnovsky, A.A., Jr. (1979) Photoluminescence of singlet

Yoshihara, T., Okutsu, T., and Tobita, S. (2015) Absolute

oxygen in pigment solutions, Photochem. Photobiol., 29,

phosphorescence quantum yields of singlet molecular oxy

29-36.

gen in solution determined using an integrating sphere

Krasnovsky, A.A., Jr. (1993) Detection of photosensitized

instrument, Anal. Chem., 87, 2360-2366.

singlet oxygen luminescence in systems of biomedical

19.

Егоров С.Ю., Красновский А.А., мл. (1983) Фотосен

importance. Steady state and time resolved spectral mea

сибилизированная люминесценция кислорода при

surements based on application of S 1 photomultiplier

импульсном лазерном возбуждении. Кинетика затуха

tubes, SPIE Proceedings, 1887, 177-186.

ния в водных растворах, Биофизика, 28, 497-498.

Merkel, P.B., and Kearns, D.R. (1972) Radiationless decay

20.

Krasnovsky, A.A., Jr., Egorov, S.Yu., Nasarova, O.V.,

of singlet molecular oxygen in solution. An experimental

Yartsev E.I., and Ponomarev, G.V. (1988) Photosensitized

and theoretical study of electronic to vibrational energy

formation of singlet molecular oxygen in solutions of

transfer, J. Am. Chem. Soc., 94, 7244-7253.

water soluble porphyrins. Direct luminescence measure

Салохиддинов К.И., Бытева И.М., Джагаров Б.М.

ments, Studia biophys., 124, 123-142.

(1979) Длительность люминесценции синглетного

21.

Еgorov, S.Yu., Kamalov, V.F., Koroteev, N.I., Krasnov

кислорода в растворах при импульсном лазерном воз

sky, A.A., Jr., Toleutaev, B.N., and Zinukov, S.V. (1989)

буждении, Опт. спектр., 47, 881-886.

Rise and decay kinetics of photosensitized singlet oxygen

Byteva, I.M., and Gurinovich, G.P. (1979) Sensitized lumi

luminescence in water. Measurements with nanosecond

nescence of oxygen in solutions, J. Luminescence, 21, 17-20.

time correlated photon counting technique, Chem. Phys.

Бытева И.М. (1979) Исследование люминесценции

Lett., 163, 421-424.

кислорода в растворах методом импульсной спектро

22.

Krasnovsky, A.A., and Kozlov, A.S. (2017) Laser photo

скопии, Журн. прикл. спектр., 31, 333-335.

chemistry of oxygen. Application to studies of the absorp

Schmidt, R., and Brauer, H. D. (1987) Radiationless

tion spectra of dissolved oxygen molecules, J. Biomed.

deactivation of singlet oxygen (¹Δ_g) by solvent molecules,

Photon. Engin., 3, 1-10.

J. Am. Chem. Soc., 109, 6976-6981.

23.

Benditkis, A.S., Kozlov, A.S., Goncharov, S.E., and

10.

Schmidt, R. (1989) Influence of heavy atoms on the deac

Krasnovsky, A.A., Jr. (2018) Absorption of dark red laser

tivation of singlet oxygen (¹Δ_g) in Solution, J. Am. Chem.

light by oxygen molecules in organic media. Results of

Soc., 111, 6983-6987.

photochemical and luminescence measurements, in Proc.

11.

Losev, A.P., Byteva, I.M., and Gurinovich, G.P. (1988)

International Conference on laser optics, IEEE Xplor Digital

Singlet oxygen luminescence yield in organic solvents and

library, p. 598, doi: org/10.1109/LO.2018.8435689.

water, Chem. Phys. Lett., 143, 127-129.

24.

Oliveros, E., Suardi Murasecco, P., Aminian Saghafi, T.,

12.

Лосев А.П., Бытева И.М., Гуринович Г.П. (1989) Де

and Braun, A.M. (1991) 1H Phenalen 1 one: photophys

зактивация синглетного кислорода в ССl₄и CS₂, Хим.

ical properties and singlet oxygen production, Helv. Chim.

физика, 8, 732-739.

Acta, 74, 79-90.

13.

Afshari, E., and Schmidt, R. (1991) Isotope dependent

25.

Krasnovsky, A.A., Jr., Sukhorukov, V.L., Egorov, S.Yu., and

quenching of singlet molecular oxygen (¹Δ_g) by ground

Potapenko, A.Ya. (1986) Generation and quenching of sin

state oxygen in several perhalogenated solvents, Chem.

glet molecular oxygen by furocoumarins. Direct lumines

Phys. Lett., 184, 128-132.

cence measurements, Studia Biophys., 114, 149-158.

14.

Schweitzer, C., and Schmidt, R. (2003) Physical mecha

26.

Scurlock, R.D., and Ogilby, P.R. (1989) Singlet molecular

nisms of generation and deactivation of singlet oxygen,

oxygen (¹Δ₂O₂) formation upon irradiation of an oxygen

Chem. Rev., 103, 1685-1757.

(3Σg-O2) organic molecule charge transfer absorption band

15.

Багров И.В., Белоусова И.М., Данилов В.М., Киселев

absorption band, J. Phys. Chem., 93, 5493-5500.

В.М., Муравьева Т.Д., Соснов E.H. (2007) Фотоинду

27.

Bregnhoj, M., Kraegpoth, M.V., Serensen, R. J., Westberg,

цированное тушение люминесценции синглетного

M., and Ogilby, P.R. (2016) Solvent and heavy atom effects

кислорода в растворах фуллеренов, Опт. спектр., 102,

on the O₂(X³Σ_g-) → O₂(b¹Σ_g+) absorption transition, J. Phys.

58-65.

Chem. A, 120, 8285-8296.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019

СИНГЛЕТНЫЙ КИСЛОРОД: КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ

251

28. Красновский А.А., мл., Неверов К.В. (2010) О меха

the determination of yields of singlet oxygen O₂(¹Δ_g) sensi

низме фотосенсибилизированной люминесценции

tization, J. Photochem. Photobiol. A Chem., 79, 11-17.

димолей синглетного кислорода в насыщенных возду

33. Krasnovsky, A.A., Jr. Roumbal, Ya.V., Ivanov, A.V., and

хом растворах пигментов, Биофизика, 55, 389-393.

Ambartzumian, R.V. (2006) Solvent dependence of the

29. Batino, R., Rettich, T.R., and Tominaga, T. (1983) The

steady state rate of ¹O₂ generation upon excitation of

solubility of oxygen and ozone in liquids, J. Phys. Chem.

dissolved oxygen by cw 1267 nm laser radiation in air satu

Ref. Data, 12,163-178.

rated solutions. Estimates of the absorbance and molar

30. Murov, S.L., Charmichael, I., and Hug, G.L. (1993)

absorption coefficients of oxygen at the excitation wave

Handbook of Photochemistry, Marcel Dekker Inc., New York,

length, Chem. Phys. Lett., 430, 260-264.

Basel, Hong Kong.

34. Krasnovsky, A.A., Jr., and Kozlov, A.S. (2014) New

31. Matheson, I.B.C., Lee, J., Yamanashi, B.S., and

approach to measurement of IR absorption spectra of dis

Wolbarsht, M.L. (1974) Measurement of the Absolute Rate

solved oxygen molecules based on photochemical activity of

Constants for Singlet Molecular Oxygen (¹Δ_g) Reaction

oxygen upon direct laser excitation, Biofizika, 59, 199-205.

with 1,3 diphenylisobenzofuran and physical quenching by

35. Krasnovsky, A.A., Jr., and Kozlov, A.S. (2016) Photonics of

ground state molecular oxygen, J. Am. Chem. Soc., 96,

dissolved oxygen molecules. Comparison of the rates of

3343-3358.

direct and photosensitized excitation of oxygen and reevalu

32. Schmidt, R., Tanelian, C., Dunsbach, R., and Wolff, C.J.

ation of the oxygen absorption coefficients, J. Photochem.

(1994) Phenalenon, a universal reference compound for

Photobiol., A Chemistry, 329, 167-174.

KINETIC MEASUREMENTS OF SINGLET OXYGEN

PHOSPHORESCENCE IN SOLVENTS LACKING HYDROGEN

ATOMS USING THE METHOD OF TIMEQRESOLVED

PHOTON COUNTING

A. A. Krasnovsky^1,2*, A. S. Benditkis¹, and A. S. Kozlov¹

¹Federal Research Center of Biotechnology, Bach Institute of Biochemistry,

Russian Academy of Sciences, 119071 Moscow, Russia;

E<mail: phoal@mail.ru

²Lomonosov Moscow State University, Department of Biology,

119234 Moscow, Russia

Received September 2, 2018

Revision received October 29, 2018

Accepted October 29, 2018

Solvents lacking hydrogen atoms, in which the lifetime of singlet oxygen reaches tens milliseconds, are very conve

nient model for elucidation of properties of singlet oxygen. Measurement of intrinsic IR phosphorescence of singlet

oxygen at 1270 nm is the most reliable method of singlet oxygen detection. However, for efficient application of the

phosphorescence method to this model, an equipment for reliable measurements of the phosphorescence kinetic

parameters in millisecond range under low rates of singlet oxygen generation is required. The present paper describes

recently designed in our laboratory highly sensitive LED (laser) spectrometer for steady state and time resolved mea

surements of the millisecond phosphorescence of singlet oxygen. In the steady state mode, this spectrometer enables

detection of singlet oxygen phosphorescence under direct excitation of oxygen molecules in the region of its dark red

absorption bands at 690 and 765 nm. For kinetic measurements, the method of time resolved photon counting was

applied using phenalenone as a photosensitizer and LED microsecond pulses of mean energy

50 μW/cm²for excita

tion. Using this spectrometer, the lifetime of singlet oxygen and quenching of singlet oxygen by dissolved molecules

of oxygen and phenalenone were measured in air saturated ССl₄, C₆F₆ and Freon 113. The relative values of the radia

tive rate constants of singlet oxygen in these media were obtained. The results were compared with the values of the

absorption coefficients of oxygen, determined by our group using methods of laser photochemistry. Critical discus

sion of the obtained results and the data of other researchers is presented.

Keywords: singlet oxygen, phosphorescence, LED (laser) spectrometer, time resolved photon counting, lifetime,

quenching by oxygen, absorption coefficients of oxygen molecules, solvents lacking hydrogen atoms

БИОХИМИЯ том 84 вып. 2 2019