БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 4, с. 532 - 539

УДК 577.151

СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО МАЛИК ФЕРМЕНТА

У АЭРОБНОГО МЕТАНОТРОФА Methylosinus trichosporium*

С.Ю. Бут, Ю.А. Троценко

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,

ФИЦ ПНЦБИ РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия;

электронная почта: khmelenina@ibpm.pushchino.ru

Поступила в редакцию 14.08.2018

После доработки 12.12.2018

Принята к публикации 18.12.2018

Рекомбинантный малик фермент из облигатного метанотрофа Methylosinus trichosporium получен гетероло

гичной экспрессией в Escherichia coli и очищен металл хелатной аффинной хроматографией. Гомогексамер

ный малик фермент (6 × 80 кДа) катализировал обратимую реакцию декарбоксилирования малата с обра

зованием пирувата и СО₂ в присутствии одно и двухвалентных катионов и NADP⁺в качестве кофактора.

Значения k_cat/K_mуказывали на более высокую каталитическую эффективность фермента в реакции декар

боксилирования малата по сравнению с реакцией карбоксилирования пирувата. Анализ транслированной

аминокислотной последовательности белка выявил С концевой участок, гомологичный последовательнос

ти фосфоацетилтрансферазы, однако фосфоацетилтрансферазная активность не обнаружена ни для полно

размерного белка, ни для С концевого фрагмента, полученного как самостоятельный протеин. С концевой

домен белка оказывал стимулирующее влияние на активность малик фермента.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: малик фермент, метанотрофы, Methylosinus trichosporium.

DOI: 10.1134/S0320972519040067

Малик фермент (MФ) широко распростра

различаются по способности карбоксилировать

нен у макро и микроорганизмов. MФ катализи

пируват - от полного отсутствия этой реакции

рует окислительное декарбоксилирование мала

до ее превалирования над реакцией декарбокси

та до пирувата и CO₂ с восстановлением NAD⁺

лирования [4, 5].

или NADP⁺ [1, 2]:

Аэробные бактерии, использующие метан в

качестве ростового субстрата (метанотрофы),

Малат + NAD(P)⁺ ←Пируват + NAD(P)H₂ + HCO₊.

имеют возрастающий потенциал для биотехно

логий, при этом для его успешного использова

Малик ферменты подразделяются на три ка

ния в настоящее время широко применяются

тегории на основе субстратной специфичности

методы генетической модификации и коррек

и зависимости от кофактора: NAD⁺ зависимые,

ции метаболизма перспективных штаммов. Это,

декарбоксилирующие оксалоацетат (EC 1.1.1.38),

в свою очередь, требует понимания функциони

NAD(P)⁺ зависимые, недекарбоксилирующие

рования основных биохимических путей и

оксалоацетат (EC 1.1.1.39), NADP⁺ зависимые

свойств ферментов. Облигатный метанотроф

(EC1.1.1.40) [1, 3]. Некоторые малик ферменты

Methylosinus trichosporium OB3b - представитель

используют оба пиридиновых нуклеотида, но

класса Alphaproteobacteria, является одним из

при этом имеют различную специфичность к

модельных организмов при изучении метилот

кофакторам. Хотя считается, что малик фер

рофии как способа существования микроорга

менты катализируют обратимую реакцию, они

низмов и оценки метаболического потенциала

этих бактерий. Ms. trichosporium использует се

риновый путь для C1 ассимиляции, в котором

Принятые сокращения: МФ - малик фермент,

ТГФ - тетрагидрофолат, ФЕП - фосфоенолпируват, C3 соединение (серин) является первичным

ДТНБ - 5,5 дитиобис 2 нитробензойная кислота.

продуктом, образующимся в результате конден

* Первоначально английский вариант рукописи опублико

сации метилентетрагидрофолата (метилен

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

ТГФ) и глицина (рис. 1). Малат, один из цент

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 18 230,

28.01.2019.

ральных метаболитов этого пути, синтезируется

** Адресат для корреспонденции.

посредством трансформации серина в серии ре

532

МАЛИК ФЕРМЕНТ У Methylosinus trichosporium

533

акций, включающих переаминирование с гли

тез малата из оксалоацетата - малатдегидроге

оксилатом, восстановление образующегося гид

наза в NADH зависимой реакции [7]. Дальней

роксипирувата в глицерат, фосфорилирование

шее превращение малата в сериновом пути свя

глицерата и карбоксилирование фосфоенолпи

зано с образованием малил CoA и распадом

рувата (ФЕП) в оксалоацетат [6, 7]. Последнюю

этого соединения в ацетил CoA и глиоксилат,

из перечисленных реакций у Ms. trichosporium

который является предшественником глицина -

осуществляет высокоактивная ФЕП карбокси

акцептора одноуглеродного соединения. Таким

лаза, представленная двумя изоформами [8], а син

образом, декарбоксилирующая активность ма

лик фермента приводит к потере С-С связи,

образованной в процессе C1 ассимиляции.

Данная работа направлена на изучение катали

тических свойств рекомбинантного малик фер

мента с целью понимания регуляции данного

участка метаболизма у аэробного метанотрофа

Ms. trichosporium.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии и условия выращивания. Ms. tricho-

ОПР

sporium OB3b^Т(VKM B 2117=ATCC 35070) выра

щивали в атмосфере метана и воздуха (1 : 1) (v/v)

на минеральной среде «П» [9], содержавшей (г/л):

KNO₃ - 1,0; MgSO₄ × 7H₂O - 0,2; СаС1₂ - 0,02;

Na₂HPO₄ × 5H₂O - 1,5; КН₂РО₄ - 0,7; Трилон Б

(Nа₂ЭДТА) - 0,005; FeSO₄ × 7Н₂О - 0,002;

ZnSO₄ × 7Н₂О - 0,0001; МnС1₂ × 4Н₂О - 0,00003;

СоС1₂ × 6Н₂О - 0,0002; CuSO₄ × 5Н₂0 - 0,0001;

NiCl₂ × 6H₂O - 0,00002; Na₂MoO₄ × 2Н₂О - 0,00003,

при 28 °C и постоянном перемешивании (200 об/мин)

в термостатированной качалке («New Brunswick

Scientific», США). Штамм Escherichia coli BL21(DE3)

(«Novagen», Германия) выращивали в жидкой

или на агаризованной среде Луриа-Бертани [10]

при 37 °C. При выращивании клеток E. coli, со

державших плазмиду, добавляли ампициллин в

концентрации 100 мкг/мл.

Методы работы с ДНК. Выделение плазмид,

рестрикцию, агарозный гель электрофорез, ли

гирование и трансформацию клеток E. coli про

водили согласно описанным методикам [10].

Использовали рестрикционные ферменты, T4

ДНК лигазу, Pfu и Taq ДНК полимеразы, смесь

dNTPs и белковые маркеры Page Ruler Prestained

Protein Ladder для Ds Na ПААГЭ («Thermo

Scientific», США).

Получение и очистка малик фермента. Хромо

сомную ДНК из Ms. trichosporium выделяли описан

ным ранее методом [11]. Ген dme (ID 2507408727),

кодирующий предполагаемый МФ у Ms. tricho-

Рис. 1. Предполагаемое участие малик фермента в цент

sporium (IMG https://img.jgi.doe.gov), амплифици

ральном метаболизме Ms. trichosporium. СОМТ - серинок

симетилтрансфераза, СГАТ - серинглиоксилатаминотранс

ровали с помощью ПЦР и праймеров N dme Nde

фераза, ОПР - оксипируватредуктаза, ГК - глицераткиназа,

(5' TCCATATGGCGGAGAAGCCGCGCATG

ЕН - енолаза, ФЕПК - ФЕП карбоксилаза, МДГ - малат

GACC 3') и C dme Hind (5' ATAAGCTTCCCC

дегидрогеназа, МФ - малик фермент, ПФДК - пируват

CCGACGCCGAAGGCCGCCAGC 3'), содер

фосфатдикиназа, МТК - АТФ зависимая малаттиокиназа,

МСЛ - малил СоА лиаза, метилен ТГФ - метилентетра

жавших сайты для эндонуклеаз рестрикции

гидрофолат

NdeI и HindIII соответственно. Для экспрессии

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

534

РОЗОВА и др.

гена был сконструирован вектор pET22b:dme,

акции анализировали с помощью HPLC на ко

которым трансформировали клетки E. coli BL21

лонке Reprosil Pur c 18 AQ (5 мкм, 250 × 10 мм)

(DE3). Синтез фермента индуцировали добавле

(«Dr. Maisch», Германия) с использованием 1 мМ

нием 0,5 мМ изопропил β D тиогалактопира

H₂SO₄ и 8 мМ Na₂SO₄ в качестве подвижной фа

нозида (ИПТГ) в экспоненциальной фазе роста

зы при 25 °C и скорости потока 1 мл/мин.

культуры (А₆₀₀ = 0,6-0,7). После 15 ч роста при

Тестирование фосфотрансацетилазной актив

18 °C клетки осаждали центрифугированием

ности МФ и его С концевого фрагмента прово

(30 мин при 8 °C и 5000 g) и хранили при -20 °C.

дили по образованию 5 тио 2 нитробензойной

Рекомбинантный фермент очищали аффинной

кислоты в результате взаимодействия 5,5 дитио

хроматографией на колонке с Ni²⁺ нитрилотри

бис 2 нитробензойной кислоты (ДТНБ) с об

ацетат (Ni NTA) агарозой, как описано ранее [12].

разующимися в ходе реакции сульфгидрильны

Очищенный малик фермент хранили в 40% ном

ми группами СоА SH [15]. Реакционная смесь

глицерине при -20 °C.

(1 мл) содержала 50 мМ K фосфатный буфер,

Для клонирования N концевой последова

рН 7,5, 0,1 мМ ДТНБ, 2,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ

тельности гена (mae фрагмент), использовали

ацетил СоА. Реакцию начинали добавлением

праймер N dme Nde (см. выше) и обратный

10-50 мкг фермента. Измерения проводили при

праймер (5' TAAGCTTATCCAGCGCGGCGA

412 нм.

CCGGATCGCGCC 3'). Для клонирования С кон

Для изучения влияния рН на активность фер

цевой области гена (patr фрагмент) использовали

мента использовали следующие буферы (50 мМ):

праймеры C dme Hind и PaTR74 Nde F (5' TA

Glycine NaOH (pH 9,0-10,5), CHES NaOH

CATATGCATACGATCTACGATCGCGTGCG

(pH 8,5-10,0), Tris HCl (pH 7,6-8,9), K фосфат

GC 3'). Клонирование и экспрессия mae и patr

ный (pH 6,0-8,0) и MES NaOH (pH 5,0-7,0).

фрагментов и очистку белков проводили, как

Зависимость активности МФ от одно и двухва

описано выше.

лентных ионов тестировали добавлением водных

Определение молекулярной массы. Определе

растворов KCl, NH₄Cl, NaCl (в конечной концент

ние четвертичной структуры фермента проводи

рации 50 мМ) и MgCl₂, MnCl_2,CoCl₂ (1 мМ). В ка

ли гель электрофорезом в неденатурирующих

честве потенциальных ингибиторов или актива

условиях с использованием пороограничиваю

торов МФ в реакции декарбоксилирования тес

щего градиента полиакриламида (4-30%) [13] и

тировали интермедиаты, такие как: глюкоза,

набора белковых маркеров («Sigma Aldrich»,

фруктоза, глюкозо 6 фосфат, фруктозо 6 фос

Германия), включавшего тироглобулин (660 кДа,

фат, фруктозо 1,6 бисфосфат (в концентрации

димер), ферритин (440 кДа, 24 субъединицы),

5 мМ), пируват, ФЕП, гидроксипируват, оксало

каталазу (232 кДа, тетрамер), лактатдегидроге

ацетат, цитрат, серин, аспартат, глицерат, α ке

назу (140 кДа, тетрамер), бычий сывороточный

тоглутарат (1 мМ), ATP, ADP, AMP, PPi (1 или

альбумин (67 кДа, мономер).

2 мМ). Для определения влияния двухвалент

Определение активности МФ. Активность

ных металлов на активность малик фермента в

малик фермента в направлении декарбоксили

стандартную реакционную смесь, содержавшую

рования малата определяли, измеряя скорость

1 мМ MnCl₂(вместо 2,5 мМ MgCl₂), вносили вод

восстановления NADP⁺при 30 °C в реакцион

ные растворы CuCl₂, RbCl₂, CdCl₂, NiCl₂, SnCl₂,

ной смеси (1 мл), содержавшей 50 мМ K фос

CoCl₂, BaCl₂, ZnCl₂ или CaCl₂ до конечной кон

фатный буфер, pH 7,5; 2,5 мМ MgCl₂; 0,3 мМ

центрации 1 мМ. Для изучения термостабиль

NADP⁺ и ~1 мкг фермента. Реакцию начинали

ности аликвоту концентрированного фермента

добавлением малата в конечной концентрации

инкубировали в пробирке Eppendorf при 30, 40,

10 мМ. Активность карбоксилирования пирува

50, 60 и 70 °C от 5 мин до 3 ч. После прогревания

та измеряли по окислению NADPH в 1 мл реак

аликвоту разводили 50× в охлажденном буфере и

ционной смеси, содержавшей 50 мМ Tris HCl

определяли активность при 30 °C. Процент ос

(pH 7,5), 2,5 мМ MgCl₂, 0,25 мМ NADPH, 50 мМ

таточной активности рассчитывали по отноше

KHCO₃, 25 мМ пирувата натрия и ~9 мкг белка.

нию к активности непрогретого фермента. Для

Способность МФ декарбоксилировать окса

определения оптимальной температуры измеря

лоацетат тестировали двумя методами. I) Спект

ли скорость реакции при 10-70 °C. При опреде

рофотометрически по уменьшению поглощения

лении K_mактивность измеряли, варьируя суб

оксалоацетата при 280 нм [14] в реакционной

страты в диапазоне концентраций 0,156-10 мМ

смеси, содержавшей 50 мМ K фосфатный буфер

(малат), 0,0047-0,25 мМ (NADP⁺), 1,56-25 мМ

(pH 7,5) или MES NaOH (рН 5,0), 2,5 мМ

(пируват), 0,0156-0,375 мМ (NADPH). Значе

MgCl₂, 1-10 мМ оксалоацетата и 50 мкг МФ в

ния кажущихся K_mи V_max рассчитывали с по

присутствии или отсутствии 0,1 мМ NADP⁺ или

мощью программы SigmaPlot (версия 10). Кон

NADPН. II) Образование пирувата в данной ре

центрацию белка определяли модифицирован

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

МАЛИК ФЕРМЕНТ У Methylosinus trichosporium

535

ным методом Лоури, как описано в работе

Shacterle и Pollack [16]. Скорости окисления и

образования NADPH регистрировали при 340 нм

на спектрофотометре UV 1700 («Shimadzu»,

Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение и очистка малик фермента. Ген dme,

кодирующий предполагаемый малик фермент в

последовательности генома Ms. trichosporium,

экспрессировали в клетках E. coli BL21 (DE3).

Рекомбинантный белок из клеточного экстрак

та E. coli очищали аффинной металл хелатной

хроматографией в одну стадию. Ds Na ПААГЭ

белка выявил одну полосу, соответствующую

молекулярной массе ~80 кДа, которая согласу

ется с теоретически рассчитанной (81,5 кДа)

(рис. 2). Согласно электрофорезу, в неденатури

рующих условиях масса белка составляет 480 кДа,

что указывает на его гексамерную организацию.

Ранее у микробных малик ферментов были вы

явлены димерные, тетрамерные и октамерные

формы. NADP⁺-МФ из E. coli, а также NADP⁺-

МФ и NAD(P)⁺-МФ из Sinorhizobium meliloti

представлены гомооктамерами [17, 18], тогда

как NADP⁺-МФ из Bradyrhizobium japonicum -

димером или тетрамером в зависимости от зна

чений рН (8,0 и 7,2 соответственно) [19].

Каталитические свойства. Малик фермент

катализировал декарбоксилирование малата до

пирувата с использованием в качестве кофакто

ра NADP⁺, но не NAD⁺, активность декарбок

силирования оксалоацетата не обнаружена. Ак

тивность фермента полностью зависела от одно

Рис. 2. Ds Na ПААГЭ малик фермента Ms. trichosporium (1)

и двухвалентных катионов: K⁺(или NH₄₊) и

и МФ1 (N концевой фрагмент МФ Ms. trichosporium) (2).

M - маркеры молекулярной массы, кДа

Mn²⁺ (или Mg²⁺) (табл. 1). В то же время NaCl в

концентрации 50 мМ на 40% ингибировал его

активность в присутствии 50 мМ KCl, а донором

СО₂ для карбоксилирования пирувата служил

Таблица 1. Влияние катионов K⁺, NH₊, Na⁺ (в концентрации

KHCO₃, но не NaHCO₃. Фермент активен в ши

50 мМ) и двухвалентных металлов (1 мМ) на активность

рекомбинантного малик фермента из Ms. trichosporium

роких диапазонах pH (6,0-9,0) и температуры

(20-70 °C) с максимальной активностью при pH

Катионы

Активность, %

7,0 и 65 °C. MФ проявлял умеренную термоста

бильность: активность фермента не снижалась

Без добавления катионов

< 0,01

после выдерживания белка 3 ч при 30-40 °C, но

K⁺

8,2 ± 0,4

двукратно снижалась в результате прогревания

Na⁺

< 0,01

1 ч при 50 °C и на 80 % после 5 мин прогревания

NH₄

20 ± 2

при 60 °C.

Mg²⁺

3,1 ± 0,3

Зависимость активности малик фермента от

K⁺, Mg²⁺

100 ± 2,8

концентрации субстратов подчинялась кинети

Na⁺, Mg²

4,2 ± 0,3

ке Михаэлиса-Ментен. При 30 °C и оптималь

NH₄₊, Mg²⁺

115,2 ± 6,3

ном pH значения кажущихся K_m составили

K⁺, Mn²⁺

123,3 ± 8, 1

2,7 ± 0,3 мМ для малата, 64 ± 9 мкМ - для

K⁺, Co²⁺

73,8 ± 5,6

NADP⁺, 6,0 ± 0,8 мМ - для пирувата и 47 ± 4 мкМ -

K⁺, Na⁺, Mg²⁺

59,9 ± 4,2

для NADPH. Фермент проявлял в 4,7 раза более

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

536

РОЗОВА и др.

высокую активность в направлении декарбокси

Влияние C концевого домена малик фермента

лирования малата, по сравнению с карбокси

на активность. В аминокислотной последова

лированием пирувата (табл. 2). Судя по значе

тельности MФ Ms. trichosporium, состоящего из

ниям k_cat/K_m, эффективность фермента в реак

437 а.о., обнаружен N концевой фрагмент, го

ции декарбоксилирования на порядок превы

мологичный малик ферментам (MФ1), и протя

шала эффективность в реакции карбоксилиро

женный C концевой домен из 322 а.о., соответ

вания. Гидроксипируват в концентрации 1 мМ

ствующий фосфоацетилтрансферазам (EC 2.3.1.8).

ингибировал активность МФ на 45% (табл. 3).

Сходная аминокислотная последовательность

Наибольший ингибирующий эффект оказывал

ранее описана у NADP⁺ зависимых малик фер

ацетил CоА (0,1 мМ), в присутствии которого

ментов ряда бактерий, таких как E. coli и Sinor-

остаточная активность составила 24%. ATP и

hisobium meliloti, а также растений [17, 18, 20].

PPi в концентрации 2 мМ ингибировали актив

Клонированием N и C концевых последо

ность на 50%, которая, однако, полностью вос

вательностей ДНК получены и очищены два от

станавливалась при увеличении концентрации

дельных белка: MФ1 и предполагаемая фосфо

Mg²⁺ в реакционной смеси до 5 мМ. В присут

ацетилтрансфераза. Удельная активность MФ1 в

ствии Mn²⁺ ионы Cd²⁺ практически полностью

направлении декарбоксилирования и карбокси

ингибировали активность МФ (5,9% остаточ

лирования были, соответственно, 12 и 1,6 Е/мг

ной активности), а ионы Sn²⁺ снижали актив

белка. При этом значения кажущихся K_m для уг

ность фермента на 31%. Остальные тестиро

леродных субстратов выше у MФ1, по сравне

ванные металлы (см. «Методы исследования»)

нию с исходным двудоменным белком (табл. 2).

не оказывали значительного эффекта на актив

В отличие от полноразмерного белка, ацетил

ность МФ.

СоА не влиял на активность МФ1, тогда как ин

Таблица 2. Кинетические параметры малик фермента Ms. tri-

Таблица 3. Активность малик фермента Ms. trichosporium

chosporium и его N концевого фрагмента (МФ1)

OB3b в присутствии некоторых метаболитов

Параметры

MФ

MФ1

Эффектор

Остаточная

(Концентрация)

активность, %

М.м. (число

480 (80 × 6)

90 (45 × 2)

Без эффектора

100

субъединиц), кДа

Оксалоацетат (1 мМ)

97 ± 3

V_max, Е/мг белка

36 ± 2

12,0 ± 0,3

Изоцитрат (1 мМ)

98 ± 4

(малат → пируват)

Цитрат (1 мМ)

84 ± 4

V_max, Е/мг белка

8,0 ± 0,4

1,60 ± 0,03

α Кетоглутарат (1 мМ)

103 ± 1

(пируват → малат)

Сукцинат

(1 мМ)

97 ± 1

Глутамат (1 мМ)

110 ± 1

Ингибиторы,

0,2 мМ Ацетил

1 мМ Гидро

(остаточная

СоА (24%), 1 мМ

ксипируват

Фосфоенолпируват (1 мМ)

98 ± 2

активность, %)

Гидроксипируват

(64%)

Пируват (1 мМ)

104 ± 2

(55%)

Гидроксипируват (1 мМ)

55 ± 3

Кm

Серин (1 мМ)

97 ± 3

Аспартат (1 мМ)

108 ± 2

Малат, мМ

3,0 ± 0,3

4,0 ± 0,3

Глюкоза (5 мМ)

93 ± 2

NADP⁺, мкМ

64 ± 9

н.о.

Глюкозо 6 фосфат (5 мМ)

89 ± 3

Фруктоза (5 мМ)

93 ± 2

Пируват, мМ

6,0 ± 0,8

11 ± 1

Фруктозо 6 фосфат (5 мМ)

93 ± 1

NADPH, мМ

47 ± 4

н.о.

Фруктозо 1,6 бисфосфат (5 мМ)

80 ± 1

ATP (2 мМ)

47 ± 4

k_{cat малат}, 1/мин

ATP (2 мМ), MgCl₂ (5 мМ)

89 ± 3

k_cat/K

малат,

0,3

ADP (2 мМ)

96 ± 3

1/(мМ × мин)

AMP (2 мМ)

103 ± 1

k_{cat пируват}, 1/мин

0,1

PPi (2 мМ)

46 ± 2

PPi (2 мМ), MgCl₂ (5 мМ)

89 ± 3

k_cat/K_{пируват},

0,6

0,01

1/(мМ × мин)

CoA (0,1 мМ)

94 ± 2

Acetyl CoA (0,2 мМ)

24 ± 3

н.о. - не определяли.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

МАЛИК ФЕРМЕНТ У Methylosinus trichosporium

537

гибирующий эффект гидроксипирувата сохра

акций декарбоксилирования и карбоксилирова

нялся и для N концевого фрагмента. Ни пол

ния практически одинакова. Также как NADP⁺-

ный «химерный» белок, ни фосфоацетилтранс

МФ из Clostridium thermocellum [21] и Thermococcus

феразный домен не катализировали перенос

kodakaraensis [5], МФ из Ms. trichosporium не де

ацетильных групп и образование CoA SH из

карбоксилирует оксалоацетат.

ацетил CoA.

Активность МФ из Ms. trichosporium ингиби

Белок MФ1 имел молекулярную массу 90 кДа,

ровали интермедиаты серинового пути ассими

что соответствовало димерной структуре, тогда

ляции углерода - гидроксипируват и ацетил

как фосфоацетилтрансферазный фрагмент -

CоА. Обычно на активность бактериальных ма

гексамер с молекулярной массой 210 кДа. Оче

лик ферментов влияют интермедиаты ЦТК.

видно, C концевые 322 а.о. ответственны за оп

Малат, сукцинат и фумарат активировали, но

тимальную олигомеризацию малик фермента.

ацетил CоА ингибировал NAD(Р)⁺ зависимый

Аналогичное предположение было сделано для

фермент из Sinorizobium meliloti, тогда как

двух малик ферментов из Sinorhisobium meliloti [17].

NADР⁺-МФ не подвергался какой либо регу

Фосфоацетилтрансферазная активность не бы

ляции [25]. Активность NADР⁺-МФ из E. coli

ла обнаружена ни для одного из изученных «хи

ингибировали фумарат, оксалоацетат и ацетил

мерных» малик ферментов.

CоА, а глутамат, аспартат, глюкозо 6 фосфат и

ацетилфосфат активировали этот фермент [18].

Малик фермент из Ms. trichosporium состоит

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

из двух фрагментов, причем N концевой поли

пептид, полученный как самостоятельный бе

В данной работе мы впервые охарактеризо

лок, имел пониженную активность и не ингиби

вали малик фермент из облигатного метанотро

ровался в присутствии ацетил СоА. Поскольку

фа Ms. trichosporium. Фермент принадлежит к

укороченная версия малик фермента (в отсут

группе NADP⁺ зависимых малик ферментов.

ствие С концевого фрагмента), в отличие от

Для проявления его активности необходимы ио

полноразмерного белка, имела структуру диме

ны двухвалентных металлов (Mn²⁺ или Mg²⁺) и

ра, но не гексамера, предположена роль С кон

одновалентные катионы (K⁺ или NH₊), при

цевой последовательности в оптимальной кон

этом ионы Na⁺ оказывали ингибирующий эф

фигурации фермента. Принимая во внимание

фект. Активация катионами NH₊свойственна

отсутствие ингибирования ацетил СоА актив

как NADP⁺ зависимым малик ферментам (на

ности «химерного» NADР⁺ зависимого малик

пример, MФ из Clostridium thermocellum) [21], так

фермента из Sinorizobium meliloti, влияние до

и NAD⁺ зависимым (из Streptococcus bovis) [22].

полнительного фрагмента на взаимодействие с

Однако в случае NAD⁺-MФ из S. bovis ионы K⁺

эффектором у малик ферментов требует даль

имели лишь небольшой стимулирующий эф

нейших исследований.

фект. В литературе не найдены сведения об ин

Согласно кинетическим свойствам, малик

гибирующем влиянии ионов Na⁺на активность

фермент из Ms. trichosporium более эффективно

малик ферментов.

катализирует реакцию декарбоксилирования, по

Подобно другим NADP⁺ зависимым малик

сравнению с реакцией карбоксилирования, поэ

ферментам, МФ из Ms. trichosporium катализиру

тому его можно рассматривать как «липогенный»

ет обратимую реакцию, при этом активность

фермент, осуществляющий наработку NADPH,

карбоксилирования пирувата существенно ни

необходимых для синтеза жирных кислот и сте

же, чем декарбоксилирование малата. Кроме то

роидов. Такая функция была предположена для

го, фермент из Ms. trichosporium имеет высокую

ряда бактериальных NADP⁺-МФ [1, 2, 26].

K_mдля пирувата (~6 мМ) относительно его фи

У Ms. trichosporium малат образуется в резуль

зиологических концентраций. Хотя содержание

тате карбоксилирования фосфоенолпирувата вы

пирувата в клетках данного метанотрофа может

сокоактивной ФЕП карбоксилазой [8] и восста

достигать высоких значений (>1 мМ) [23], эта

новления образующегося оксалоацетата NADH

концентрация все же не поддерживает эффек

зависимой малатдегидрогеназой [7]. Последую

тивную ассимиляцию CO₂. Высокие значения

щее декарбоксилирование малата малик фермен

кажущейся K_m к пирувату обнаружены для

том приводит к синтезу NADPH (рис. 1). В ре

NADP⁺-МФ из E. coli и Corynebacterium gluta-

зультате работы трех перечисленных ферментов

micum (6,21 и 13,8 соответственно) [18, 24]. Инте

ФЕП трансформируется в пируват, что сопро

ресно, что лишь у фермента из гипертермофиль

вождается потреблением NADH и образованием

ной археи Thermococcus kodakaraensis K_m к пиру

NADPH:

вату ниже, чем к малату (7,3 и 16,9 соответствен

но) [5], хотя каталитическая эффективность ре

ФЕП + NADH + NADP⁺ → Пируват + NAD⁺ + NADPH.

6 БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

538

РОЗОВА и др.

В случае функционирования пируват фос

формирования системы внутрицитоплазмати

фатдикиназы (ID 2507410009), может происхо

ческих мембран, где происходит окисление ме

дить регенерация ФЕП с затратой молекулы

тана мембранной метанмонооксигеназой.

ATP и образованием PPi и AMP с суммарной ре

акцией футильного цикла:

Финансирование

Работа выполнялась при финансовой под

NADH + NADP⁺ + ATP + Pi →

держке РНФ (грант № 18 14 00326).

NADPH + NAD⁺ + AMP + PPi.

Благодарности

Авторы выражают благодарность компании

Замена ATP на PPi в данном цикле коррели

Евроген за синтез олигонуклеотидов.

рует с важной метаболической ролью PPi у мета

нотрофов

[27]. У Ms. trichosporium синтез

Конфликт интересов

NADPH может также осуществлять NADP⁺ за

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

висимая изоцитратдегидрогеназа [8]. Тем не ме

интересов.

нее функция малик фермента, как дополни

тельного источника NADPH, не представляется

Соблюдение этических норм

избыточной, поскольку у данного метанотрофа

Настоящая статья не содержит описания ка

имеются высокие потребности в NADPH, кото

ких либо исследований с участием животных

рый необходим для синтеза жирных кислот и

или людей в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Chang, G.G., and Tong, L. (2003) Structure and function

11. Kalyuzhnaya, M., Khmelenina, V.N., Kotelnikova, S.,

of malic enzymes, a new class of oxidative decarboxylases,

Holmquist, L., Pedersen, K., and Trotsenko, Y.A. (1999)

Biochemistry, 42, 12721-12733, doi: 10.1021/bi035251+.

Methylomonas scandinavica sp. nov., a new methanotrophic

Sauer, U., and Eikmanns, B.J. (2005) The PEP-pyru

psychrotrophic bacterium isolated from deep igneous rock

vate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux

ground water of Sweden, Syst. Appl. Microbiol., 22,

distribution in bacteria, FEMS Microbiol. Rev., 29,

565-572, doi: 10.1016/S0723 2020(99)80010 1.

765-794, doi: 10.1016/j.femsre.2004.11.002.

12. Reshetnikov, A.S., Rozova, O.N., Khmelenina, V.N.,

Viljoen, M., Subden, R.E., Krizus, A., and Van Vuuren, H.J.

Mustakhimov, I.I., Beschastny, A.P., Murrell, J.C., and

(1994) Molecular analysis of the malic enzyme gene

Trotsenko, Y.A. (2008) Characterization of the pyrophos

(mae2) of Schizosaccharomyces pombe, Yeast, 10, 613-624,

phate dependent 6 phosphofructokinase from Methylococcus

doi: 10.1002/yea.320100506.

capsulatus Bath, FEMS Microbiol. Lett., 288, 202-210,

Liguori, M., Tessarolo, D., Abbruzzese, C., and

doi: 10.1111/j.1574 6968.2008.01366.x.

Giacanelli, M. (1995) NAD⁺/NADP⁺ dependent malic

13. Slater, G.G. (1969) Stable pattern formation and determi

enzyme: evidence of a NADP⁺ preferring activity in human

nation of molecular size by pore limit electrophoresis,

skeletal muscle, Biochem. Mol. Med., 56, 14-18, doi: 10.

Anal. Chem., 41, 1039-1041, doi: 10.1021/ac60277a003.

1006/bmme.1995.1050.

14. Sender, P.D., Martin, M.G., Peiru, S., and Magni, C.

Fukuda, W., Ismail, Y.S., Fukui, T., Atomi, H., and

(2004) Characterization of an oxaloacetate decarboxylase

Imanaka, T. (2005) Characterization of an archaeal malic

that belongs to the malic enzyme family, FEBS Lett., 570,

enzyme from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus

217-222, doi: 10.1016/j.febslet.2004.06.038.

kodakaraensis KOD1, Archaea, 1, 293-301, doi: 10.1155/

15. Bock, A.K., Glasemacher, J., Schmidt, R., and Schonheit, P.

2005/250757.

(1999) Purification and characterization of two extremely

Trotsenko, Y.A. and Murrell, J.C. (2008) Metabolic aspects

thermostable enzymes, phosphate acetyltransferase and

of aerobic obligate methanotrophy, Adv. Appl. Microbiol.,

acetate kinase, from the hyperthermophilic eubacterium

63, 183-229, doi: 10.1016/S0065 2164(07)00005 6.

Thermotoga maritima, J. Bacteriol., 181, 1861-1867.

Rozova, O.N., Khmelenina, V.N., Bocharova, K.A., Mustak

16. Shacterle, G.R., and Pollack, R.L. (1973) A simplified

himov, I.I., and Trotsenko, Y.A. (2015) Role of NAD⁺

method for quantitative assay of small amounts of protein in

dependent malate dehydrogenase in the metabolism of

biological material, Anal. Biochem., 51, 654-657, doi: 10.

Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and Methylosinus tri-

1016/0003 2697(73)90523 X.

chosporium OB3b, Microorganisms, 3, 47-59, doi: 10.3390/

17. Mitsch, M.J., Voegele, R.T., Cowie, A., Osteras, M., and

microorganisms3010047.

Finan, T.M. (1998) Chimeric structure of the NAD(P)⁺

Matsen, J.B., Yang, S., Stein, L.Y., Beck, D., and Kalyuzh

and NADP⁺ dependent malic enzymes of Rhizobium

naya, M.G. (2013) Global molecular analyses of methane

(Sinorhizobium) meliloti, J. Biol. Chem., 273, 9330-9336,

metabolism in methanotrophic Alphaproteobacterium,

doi: 10.1074/jbc.273.15.9330.

Methylosinus trichosporium OB3b. Part I: transcriptomic study,

18. Bologna, F.P., Andreo, C.S., and Drincovich, M.F. (2007)

Front. Microbiol., 4, 40, doi: 10.3389/fmicb.2013.00040.

Escherichia coli malic enzymes: two isoforms with substan

Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии,

tial differences in kinetic properties, metabolic regulation,

Изд во ГЕОС, Москва.

and structure, J. Bacteriol., 189, 5937-5946, doi: 10.1128/

10.

Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:

JB.00428 07.

a laboratory manual, 3rd Edn., Cold Spring Harbor Labo

19. Chen, F., Okabe, Y., Osano, K., and Tajima, S. (1997)

ratory Press, N.Y.

Purification and characterization of the NADP malic

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

МАЛИК ФЕРМЕНТ У Methylosinus trichosporium

539

enzyme from Bradyrhizobium japonicum A1017, Biosci.

Metabolomics and ¹³C labeling study, Front. Microbiol., 4,

Biotech. Biochem., 61, 384-386, doi: 10.1271/bbb.61.384.

70, doi: 10.3389/fmicb.2013.00070.

20. Troconi, M.A., Andreo, C.S., and Drincovich, M.F. (2018)

24. Gourdon, P., Baucher, M. F., Lindley, N.D., and

Chimeric structure of plant malic enzyme family: different

Guyonvarch, A. (2000) Cloning of the malic enzyme gene

evolutionary scenarios for NAD and NADP dependent

from Corynebacterium glutamicum and role of the enzyme

isoforms, Front. Plant Sci., 9, 1-15, doi: 10.3389/fpls.2018.

in lactate metabolism, Appl. Environ. Microbiol., 66,

00565.

2981-2987, doi: 10.1128/AEM.66.7.2981 2987.2000.

21. Taillefer, M., Rydzak, T., Levin, D.B., Oresnik I.J., and

25. Driscollt, B.T., and Finan, T.M. (1997) Properties of

Sparling, R. (2015) Reassessment of the transhydroge

NAD+ and NADP+ dependent malic enzymes of

nase/malate shunt pathway in Clostridium thermocellum

Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti and differential expres

ATCC 27405 through kinetic characterization of malic

sion of their genes in nitrogen fixing bacteroids,

enzyme and malate dehydrogenase, Appl. Environ.

Microbiology, 143, 489-498, doi: 10.1099/00221287 143

Microbiol., 81, 2423-2432, doi: 10.1128/AEM.03360 14.

2 489.

22. Kawai, S., Suzuki, H., Yamamoto, K., Inui, M., Yukawa, H.,

26. Ratledge, C. (2014) The role of malic enzyme as the

and Kumagai, H. (1996) Purification and characterization

provider of NADPH in oleaginous microorganisms: a

of a malic enzyme from the ruminal bacterium Streptococ-

reappraisal and unsolved problems, Biotechnol. Lett., 36,

cus bovis ATCC 15352 and cloning and sequencing of its

1557-1568, doi: 10.1007/s10529 014 1532 3.

gene, Appl. Environ. Microbiol., 62, 2692-2700.

27. Khmelenina, V.N., Rozova, O.N., Akberdin, I.R., Ka

23. Yang, S., Matsen, J.B., Konopka, M., Green Saxena, A.,

lyuzhnaya, M.G., and Trotsenko, Y.A. (2018). Pyrophos

Clubb, J., Sadilek, M., Orphan, V.J., Beck, D. and

phate dependent enzymes in methanotrophs: new findings

Kalyuzhnaya, M.G. (2013) Global molecular analyses of

and views, in Methane biocatalysis: paving the way to sustaina-

methane metabolism in methanotrophic Alphaproteobac

bility (Kalyuzhnaya, M.G., and Xing, X.H., eds) Springer,

terium, Methylosinus trichosporium OB3b. Part II.

International Publishing AG, Switzerland, pp. 83-98.

PROPERTIES OF THE MALIC ENZYME

FROM AEROBIC METHANOTROPH

Methylosinus trichosporium

O. N. Rozova, V. N. Khmelenina*, I. I. Mustakhimov,

S. Y. But, and Yu. A. Trotsenko

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,

Federal Research Center PSCBR, Russian Academy of Sciences,

142290 Pushchino, Moscow Region, Russia;

E-mail: khmelenina@ibpm.pushchino.ru

Received August 14, 2018

Revised December 12, 2018

Accepted December 18, 2018

The recombinant malic enzyme from the aerobic methanotroph Methylosinus trichosporium was obtained by heterolo

gous expression in Escherichia coli and purified by affinity metal chelating chromatography. The homohexameric

enzyme of 6 × 80 kDa catalyzed the reversible reaction of oxidative decarboxylation of malate to pyruvate in the pre

sence of mono and divalent cations and NADP⁺as a cofactor. The k_cat/K_m ratio indicated much higher catalytic effi

ciency of decarboxylation reaction as compared to the pyruvate carboxylation reaction. Analysis of the protein

sequence revealed that the C region of the enzyme contains a large domain homologous to phosphoacetyltransferase

sequence, but neither full chimeric malic enzyme nor the C end fragment obtained as a separate protein possessed

phosphoacetyltransferase activity. This C end domain promoted activity of the malic enzyme.

Keywords: malic enzyme, methanotrophs, Methylosinus trichosporium

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019