БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 4, с. 571 - 579

УДК 577.214

σ²⁴ СУБЪЕДИНИЦА РНК ПОЛИМЕРАЗЫ Escherichia coli

СПОСОБНА ВЫЗЫВАТЬ ПАУЗЫ ТРАНСКРИПЦИИ in vitro*

А.В. Кульбачинский, И.В. Петушков**

Институт молекулярной генетики Российской академии наук,

123182 Москва, Россия; электронная почта: telomer1@rambler.ru

Поступила в редакцию 02.11.2018

После доработки 05.12.2018

Принята к публикации 12.12.2018

Бактерия Escherichia coli имеет семь σ факторов, которые связываются с кор ферментом РНК полимеразы

(РНКП) и обеспечивают узнавание разных групп промоторов. Ранее было показано, что σ⁷⁰ и σ³⁸ субъеди

ницы могут также взаимодействовать с элонгационным комплексом (ЭК) и вызывать паузы транскрипции,

узнавая последовательности ДНК, которые напоминают -10 элемент промотора. В данной работе исследо

вана способность σ³², σ²⁸ и σ²⁴ субъединиц вызывать паузы транскрипции in vitro в реконструированных ЭК,

содержащих соответствующие консенсусные -10 элементы. Показано, что σ²⁴ субъединица способна вы

зывать паузу транскрипции в зависимости от наличия -10 элемента. Формирование паузы подавляется

Gre факторами транскрипции. Обнаружено, что некоторые природные промоторы содержат потенциаль

ные сигналы σ²⁴ зависимых пауз в начале транскрибируемой области. Это позволяет предположить, что та

кие паузы могут играть регуляторную роль в транскрипции.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: паузы транскрипции, РНК полимераза, альтернативные σ факторы, Gre белки.

DOI: 10.1134/S0320972519040109

σ Субъединица РНК полимеразы (РНКП)

пы [2, 5]. Главная σ⁷⁰ субъединица E. coli отно

играет ключевую роль в инициации транскрип

сится к 1 й группе и состоит из 4 х консерватив

ции, обеспечивая узнавание различных классов

ных районов σ1, σ2, σ3 и σ4 и неконсервативно

промоторов. У всех известных бактерий имеется

го региона (НР) между σ1 и σ2. σ Субъединицы

одна главная σ субъединица (σ⁷⁰ у E. coli), ответ

2 й группы произошли в результате независи

ственная за транскрипцию генов домашнего хо

мых дупликаций генов у различных бактерий [6].

зяйства [1, 2]. Альтернативные σ субъединицы

У E. coli ко 2 й группе относится σ³⁸ субъедини

могут узнавать промоторы, которые значитель

ца; она утратила σ1 и НР. Выравнивание амино

но отличаются от последовательностей, узнава

кислотных последовательностей районов σ2, σ3

емых главной σ субъединицей, и контролируют

и σ4, а также анализ структуры промоторного

экспрессию генов в ответ на изменения в окру

комплекса показывают значительное сходство

жающей среде и стрессовые факторы. E. coli

между σ⁷⁰ и σ³⁸ субъединицами, что позволяет

имеет 6 альтернативных σ субъединиц, которые

им узнавать очень похожие промоторы [2, 7, 8].

делятся на 2 семейства: σ⁷⁰ и σ⁵⁴ семейство [2,

Данная субъединица нужна для транскрипции

3]. В первое семейство входят σ⁷⁰, σ³⁸, σ³², σ²⁸, σ²⁴

генов во время стационарной фазы, участвует в

и σ¹⁹ субъединицы. Ко второму относится един

ответе на некоторые виды стресса (осмотичес

ственная σ⁵⁴ субъединица, которая значительно

кий шок, повышение температуры), а также от

отличается от остальных по структуре и меха

вечает за экспрессию значительной части ге

низму действия и требует для инициации тран

нов при низкой температуре [9, 10]. 3 я группа

скрипции участия белка активатора и затрат

σ субъединиц является гетерогенной и включа

АТФ [4]. Внутри σ⁷⁰ семейства выделяют 4 груп

ет несколько подгрупп [6]. У E. coli к ней отно

сятся σ³²и σ²⁸ субъединицы, их доменная орга

Принятые сокращения: РНКП - РНК полимераза; низация аналогична σ³⁸ субъединице, но они

ЭК - элонгационный комплекс.

значительно отличаются от нее по первичной

* Первоначально английский вариант рукописи опублико

структуре и узнают промоторы с другой после

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

довательностью [11, 12]. σ³² Cубъединица узна

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 18 301,

11.02.2019.

ет промоторы генов, которые участвуют в ответе

** Адресат для корреспонденции.

на тепловой шок [13, 14]. σ²⁸ Cубъединица

571

572

ШИКАЛОВ и др.

участвует в транскрипции генов, необходимых

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

для формирования жгутиков [15-17]. Уровень

экспрессии этой субъединицы также влияет на

Реактивы. В работе использовали следующие

формирование биопленок [18].

реактивы: Тris, акриламид, N,N' метиленбисак

Представители 4 й группы σ субъединиц со

риламид, мочевина, имидазол, хлорид магния,

держат лишь домены σ2 и σ4, которые необхо

хлорид натрия, хлорид калия, фенилметилен

димы для узнавания -10 и -35 элементов про

сульфонилфторид (все производства компании

мотора соответственно [1, 2, 6]. У E. coli есть два

«Sigma», США, чистота >99%), ЭДТА («Диаэм»,

представителя этого семейства: σ²⁴ и σ¹⁹. σ²⁴ Субъ

Россия, >99,2%), изопропил β D 1 тиогалакто

единица инициирует транскрипцию генов в от

пиранозид («Thermo Fisher Scientific», Литва,

вет на тепловой шок и на появление белков с

чистота

>99%), дигидрофосфат калия («Roth»,

неправильной укладкой в периплазматическом

Германия), гидрофосфат калия («Roth»), лизо

пространстве [19-21], а также способствует ус

цим («Amresco», США, ultra pure), нуклеозидт

тойчивости бактерий к ионам меди, цинка и

рифосфаты («Illustra», Великобритания, >98%).

кадмия [22]. Самая маленькая σ¹⁹ субъединица

Для экспрессии белков использовали антибио

ответственна за транспорт ионов железа при его

тики канамицин и ампицилин («Синтез», Рос

дефиците в клетке [23].

сия) и рифампицин («Sigma»).

Согласно классическим представлениям, во

Выделение белков. Кор фермент РНК поли

время ухода РНКП с промотора происходит

меразы (РНКП) E. coli, содержащий шесть ос

диссоциация σ субъединицы. Однако много

татков гистидина на N конце β' субъединицы,

численные исследования последних лет показа

выделяли из штамма E. coli BL21(DE3), несуще

ли, что это не так: σ⁷⁰ субъединица может оста

го экспрессионную плазмиду pVS10, содержа

ваться связанной с РНКП и в процессе элонга

щую гены всех субъединиц кор фермента под

ции транскрипции [24-29]. Более того, σ⁷⁰ субъ

контролем промоторов РНКП бактериофага Т7.

единица может повторно присоединяться к сво

Экспрессию, разрушение клеток и хроматогра

бодному элонгационному комплексу (ЭК) [30-34].

фическую очистку фермента проводили по

Наличие σ субъединицы позволяет ЭК узнавать

опубликованной ранее методике [45].

мотивы в ДНК, напоминающие последователь

Гены rpoH и rpoF (кодируют σ³² и σ²⁸ субъе

ности ключевых элементов промотора, что при

диницы соответственно) клонировали в вектор

водит к паузам транскрипции [35, 36]. Было по

pET29 по участкам узнавания эндонуклеаз рест

казано, что для формирования паузы наиболее

рикции NdeI и XhoI. Полученные плазмиды

важным является присутствие в транскрибируе

pET29_rpoH и pET29_rpoF использовали для

мой ДНК -10 подобного элемента, который,

трансформации штамма E. coli 3013 («New England

как и в случае промоторов, узнается районом σ2

Biolabs», США). Ночную культуру (500 мкл) сеяли

в составе нематричной цепи ДНК [30, 36-39].

в 500 мл среды LB с канамицином (50 мкг/мл) и

Кроме того, в образование пауз могут вносить

хлорамфениколом (25 мкг/мл, для поддержания

вклад -35 подобные элементы, а также после

плазмиды pLys, которая имеется в штамме E. coli

довательности около 3' конца РНК, способствую

3013), растили до достижения А₆₀₀ 0,6. Далее в

щие обратному смещению ЭК по матрице ДНК

среду вносили ИПТГ до концентрации 1 мМ.

в противоположном относительно хода тран

При экспрессии σ³² субъединицы через 30 мин

скрипции направлении. Все эти нуклеотидные

после внесения ИПТГ в среду добавляли риф

последовательности (при их наличии) формиру

ампицин (для предотвращения транскрипции

ют сигнал паузы в транскрибируемой области

генов шаперонов, которые препятствуют выпа

[40-42]. Показано, что σ⁷⁰ зависимые паузы мо

дению целевого белка в тельца включения) до

гут наблюдаться при транскрипции как фаго

концентрации 150 мкг/мл. Индукцию проводи

вых, так и бактериальных генов [30, 36, 38, 43],

ли в течение 2 ч при температуре 22 °С. Клетки

но их функциональная роль в большинстве слу

осаждали центрифугированием. Из клеток вы

чаев остается неизвестной (обзоры [35, 44]).

деляли тельца включения как было описано ра

Недавно нами было продемонстрировано,

нее [46]. После ренатурации белковую смесь

что не только σ⁷⁰, но и σ³⁸ субъединица способна

очищали путем анионообменной хроматографии

вызывать остановки транскрипции, для чего не

на колонке MonoQ объемом 1 мл («GE Health

обходимо наличие -10 подобного элемента [34].

care»). Колонка была предварительно уравнове

Способны ли остальные σ субъединицы вызы

шена буфером следующего состава: 40 мМ Тris

вать паузы транскрипции, неизвестно. Целью дан

HCl, pH 7,9, 5% ный глицерин, 1 мМ динатрие

ной работы явилось исследование способности

вой соли ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ. Белковую смесь

альтернативных σ³², σ²⁸ и σ²⁴ субъединиц вызы

наносили на колонку со скоростью 0,5 мл/мин.

вать паузы транскрипции в системах in vitro.

Элюцию проводили буфером аналогичного сос

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

σ²⁴ ЗАВИСИМЫЕ ПАУЗЫ ТРАНСКРИПЦИИ

573

тава со скоростью 1 мл/мин с линейным гради

при 37 °С. Далее добавляли нематричную цепь

ентом NaCl от 120 до 600 мМ в течение 90 мин

ДНК до конечной концентрации 1 мкМ и инку

[47]. Пик элюции σ³² субъединицы пришелся на

бировали 15 мин при 37 °С. Препарат делили на

17-22 мин, σ²⁸ субъединицы - на 38-43 мин.

две части. К одной части прибавляли σ субъеди

Эти фракции были собраны и сконцентрирова

ницу до конечной концентрации 2,5 мкМ и ин

ны с помощью системы для ультрафильтрации

кубировали 10 мин при 37 °С, ко второй - ана

Amicon Ultra 4 Ultracel 10K («Merc Millipore»,

логичное количество буфера для хранения бел

США).

ков (40 мM Тris HCl, pH 7,9, 100 мM NaCl, 50% ный

Ген rpoE (кодирует σ²⁴ субъединицу) клони

глицерин). Далее собранный ЭК разбавляли

ровали в вектор pLATE52

(«Thermo Fisher

предварительно прогретым до 37 °С буфером ТК

Scientific») по протоколу производителя. Полу

в 10 раз, отбирали аликвоту для приготовления

ченным вектором трансформировали штамм

контрольного образца. Если реакцию проводи

E. coli BL21(DE3). Клетки выращивали в 500 мл

ли в присутствии транскрипционных факторов

среды LB, содержащей 20 мл аминопептида и

GreA или GreB, их вносили в реакционную

200 мкг/мл ампициллина. Индукцию проводили

смесь до концентрации 1 мкМ. Реакцию иници

путем добавления ИПТГ до концентрации 1 мМ.

ировали добавлением смеси всех NTP и MgCl₂

Клетки собирали центрифугированием и сус

до конечной концентрации 100 мкМ и 10 мМ,

пендировали в буфере для лизиса (50 мМ калий

соответственно, и останавливали через фикси

фосфатный буфер, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 1 мМ

рованные интервалы времени добавлением

MgCl₂, 0,1 мМ фенилметиленсульфонилфторид,

0,2 мг/мл лизоцим, 80 ед. акт. ДНКазы I («Thermo

Fisher Scientific»). σ²⁴ Субъединицу выделяли из

клеточного лизата с помощью Co²⁺ аффинной

хроматографии на колонке HiTrap TALON crude

объемом 1 мл («GE Healthcare», США). Колонку

уравновешивали буфером следующего состава:

50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,4, 500 мМ

NaCl, 1 мМ MgCl₂. Клеточный лизат наносили

на колонку со скоростью 0,5 мл/мин, затем ко

лонку промывали 5 мл буфера. Целевой белок

элюировали аналогичным буфером, но с 200 мМ

имидазола. Факторы GreA и GreB выделяли из

растворимой фракции клеточных белков как

описано ранее [48]. Чистота всех белковых пре

паратов превышала 98%, выход белков состав

лял от одного до нескольких миллиграммов.

Транскрипция in vitro. Для изучения способ

ности альтернативных σ субъединиц вызывать

паузы транскрипции ЭК получали методом

сборки из олигонуклеотидов и кор фермента

РНКП. Олигодезоксирибонуклеотиды и олиго

рибонуклеотиды были синтезированы на фир

мах «ДНК синтез» (Россия) или «Евроген» (Рос

сия) (см. последовательности на рис. 1 и 2). Ра

Рис. 1. Анализ формирования пауз транскрипции с участи

ем σ³² и σ²⁸ субъединиц. а - Структура ЭК, использован

диоактивная метка была введена на 5' конец

ных в экспериментах. Показан -10 элемент (выделен ро

РНК олигонуклеотида с помощью Т4 полинук

зовым цветом), ожидаемое положение паузы транскрип

леотидкиназы («New England Biolabs») в присут

ции (голубой цвет), а также обычное расположение старто

ствии [γ³²P]ATP (согласно протоколу произво

вой точки транскрипции относительно -10 элемента в

дителя). Меченую РНК (конечная концентрация

промоторах (желтый цвет). Нуклеотиды, добавляемые к

3' концу исходной РНК в ходе транскрипции, показаны

250 нМ) смешивали с матричной цепью ДНК

серым; б - анализ продуктов транскрипции, синтезируе

(2,5 мкМ) в буфере TK (40 мM Тris HCl, pH 7,9,

мых в использованных ЭК в зависимости от присутствия

40 мM КCl). Образец прогревали при 65 °С в те

σ28 и σ32 субъединиц. Приведена электрофореграмма

чение 3 мин и затем охлаждали до 20 °С со ско

РНК продуктов, разделенных в 15% ном ПААГ в денату

рирующих условиях. Указано положение исходной РНК

ростью 1 °С/мин. После гибридизации олиго

(20 нт), РНК в положении паузы (25 нт) и полноразмерно

нуклеотидов препарат разбавляли в три раза бу

го продукта (ПП, 52 нт).

фером TK и добавляли кор фермент РНКП до кон

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в элект

центрации 190 нМ. Смесь инкубировали 15 мин

ронной версии статьи на сайте: www.elibrary.ru

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

574

ШИКАЛОВ и др.

следующие задачи: 1) получить очищенные пре

параты исследуемых σ субъединиц, 2) методом

сборки in vitro получить ЭК, содержащие потен

циальные сигналы пауз для этих субъединиц,

3) изучить влияние σ субъединиц на синтез РНК

в таких комплексах. Для этого нами был предло

жен подход с использованием ЭК, собранных из

синтетических олигонуклеотидов и содержащих

консенсусные промоторные элементы для каж

дой из альтернативных σ субъединиц. Анало

гичный подход был ранее успешно применен

для изучения формирования пауз с участием σ⁷⁰

и σ³⁸ субъединиц РНКП E. coli [33, 34].

На первом этапе работы были клонированы

гены всех исследуемых субъединиц, затем экс

прессировали их в клетках E. coli и получили

данные белки в очищенном виде. Контрольные

эксперименты показали, что все три σ субъеди

ницы обладают транскрипционной активностью

и способны осуществлять промотор специфи

ческую инициацию транскрипции в составе хо

лофермента РНКП (данные не приведены).

Формирование пауз транскрипции было ис

следовано в системе in vitro с использованием

реконструированных ЭК, полученных из синте

тических олигонуклеотидов и кор фермента

РНКП. Каждый из комплексов содержал после

Рис. 2. Анализ формирования σ²⁴ зависимойпаузы. a - Струк

довательности консенсусного -10 элемента для

тура ЭК; б - aнализ продуктов транскрипции в ЭК, содер

одной из трех субъединиц (Cons σ²⁸, Cons σ³²,

жащих консенсусный -10 элемент и -10 элемент с заме

Cons σ²⁴, рис. 1, а и рис. 2, а) [11, 12, 49]. Ранее

ной динуклеотида ТС на AG ( 10М). Электрофореграмма

РНК продуктов, разделенных в 15% ном ПААГ в денату

при исследовании σ⁷⁰ и σ³⁸ зависимых пауз бы

рирующих условиях. Указано положение исходной РНК

ло показано, что -10 подобный элемент при уз

(20 нт), РНК в положении основного продукта паузы (25 нт)

навании сигнала паузы находится на том же рас

и полноразмерного продукта (ПП 52 нт). На гистограмме

стоянии от 3' конца РНК, что и расстояние

показана эффективность формирования паузы (доля РНК

продуктов, соответствующих паузе, относительно общего

между -10 элементом и стартом транскрипции

количества удлиненной РНК в процентах). Каждый стол

в промоторных комплексах [33, 34]. При этом

бец в диаграмме соответствует дорожке в геле.

сама пауза наблюдается на несколько нуклеоти

С цветным вариантом рис. 2 можно ознакомиться в элект

дов ниже по ходу транскрипции из за того, что

ронной версии статьи на сайте www.elibrary.ru

РНКП после узнавания сигнала паузы некото

рое время продолжает синтез РНК. В связи с

стоп буфера. Продукты транскрипции разделя

этим, положение 3' конца РНК относительно

ли в 15% ном ПААГ (19 : 1) в денатурирующих

-10 подобных мотивов в реконструированных

условиях, визуализировали с помощью сканера

ЭК соответствовало расстоянию между -10 эле

Typhoon 9500. Эффективность образования пау

ментом и стартом транскрипции в природных

зы рассчитывали для каждой временной точки

промоторах исследуемых альтернативных σ субъ

как отношение продуктов в состоянии паузы к

единиц (рис. 1, а и 2, а, стандартное расположе

суммарному количеству продуктов в состоянии

ние стартовой точки транскрипции относитель

паузы и продуктов большей длины. Качествен

но -10 элемента показано желтым). Кроме того,

ные эксперименты выполняли два раза, для ко

в ожидаемом месте паузы (обозначено голубым

личественных расчетов 3-5 раз.

цветом на рис. 1, а и рис. 2, а) эти комплексы со

держали последовательность, которая благопри

ятна для обратного смещения ЭК. Как было по

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

казано ранее, такая последовательность являет

ся важной составляющей сигнала паузы [41]. За

Для того, чтобы понять, способны ли альтер

основу был взят участок из начала транскриби

нативные σ³², σ²⁸ и σ²⁴ субъединицы вызывать

руемой области промотора lacUV5, который вы

паузы транскрипции, в работе были поставлены

зывает сильную σ⁷⁰ зависимую паузу [30, 33, 38].

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

σ²⁴ ЗАВИСИМЫЕ ПАУЗЫ ТРАНСКРИПЦИИ

575

Сборку комплексов проводили в следующем

личия в -10 подобного элементе динуклеотида

порядке: вначале с использованием синтетичес

TC. Роль этих нуклеотидов понятна со структур

ких олигонуклеотидов получали РНК ДНК гиб

ной точки зрения. Согласно имеющимся дан

рид, который затем инкубировали с кор фер

ным о пространственной структуре комплекса

ментом РНКП, после чего к полученному про

σ²⁴ субъединицы с одноцепочечным ДНК оли

дукту добавляли избыток нематричной цепи

гонуклеотидом, который имитирует нематрич

ДНК, что приводит к формированию полноцен

ную цепь промотора, остатки ТС -10 элемента

ного ЭК [33, 34].

образуют многочисленные специфические кон

На рис. 1, б представлена электрофореграм

такты с остатками района 2 σ²⁴ субъединицы [51].

ма разделения продуктов транскрипции, синте

Весьма вероятно, что эти же взаимодействия

зируемых в реконструированных ЭК, содержа

приводят к узнаванию сигнала паузы.

щих консенсусные -10 элементы для σ³² и σ²⁸

Ранее было показано, что при образовании

субъединиц. Можно видеть, что заметная часть

σ⁷⁰ и σ³⁸ зависимых пауз ЭК переходит в сме

исходной РНК удлиняется ферментом, что го

щенное состояние, в котором дальнейшее при

ворит об успешной сборке ЭК. В случае обоих

соединение нуклеотидов невозможно [30, 33,

ЭК даже в отсутствии σ субъединиц с низкой

38, 41, 52]. Это происходит за счет того, что при

эффективностью наблюдается пауза транскрип

узнавании сигнала паузы σ субъединица взаи

ции, которая, по видимому, определяется осо

модействует с ДНК, а РНКП продолжает вклю

бенностями последовательности ДНК в этом

чение нуклеотидов. В результате формируется

участке [33, 41, 42, 50]. В то же время добавление

малоустойчивый напряженный комплекс, кото

σ²⁸ и σ³² субъединиц не приводит к усилению

рый может изомеризоваться путем смещения в

пауз транскрипции: бóльшая часть активных

обратном направлении. Результатом такого пе

комплексов проходит область ожидаемой паузы

ремещения является выход 3' конца РНК из ак

и доходит до конца матрицы, синтезируя полно

тивного центра, что приводит к остановке тран

размерный продукт длиной 52 нуклеотида (часть

продуктов имеют меньшую длину, вероятно из

за преждевременной остановки ЭК при прибли

жении к концу матрицы). Следовательно, эти

две σ субъединицы не способны к формирова

нию σ зависимых пауз в исследуемых модель

ных системах.

Для σ²⁴ субъединицы был использован ана

логичный подход. Как можно видеть на рис. 2, б,

в отсутствии σ²⁴ субъединицы наблюдаются не

значительные паузы и большинство транскрип

ционных комплексов синтезируют полнораз

мерные продукты или останавливаются за не

сколько нуклеотидов до конца матрицы. Добав

ление σ²⁴ субъединицы приводит к значитель

ному увеличению количества РНК продуктов

размером 23 и 25 нт, которые соответствуют па

узе транскрипции. Остановка транскрипции

происходит со значительно большей эффектив

ностью, чем в эксперименте в отсутствие σ фак

тора (~40 и 7% соответственно).

Для того, чтобы понять, связана ли наблюда

емая остановка транскрипции с имеющимся в

ЭК 10 подобным элементом (консенсус GTCAAA,

[49]), мы провели в нем замену наиболее кон

сервативных нуклеотидов TC на AG (ЭК

10М,

рис. 3, а). Как можно видеть, в таком ЭК проис

ходит некоторое увеличение эффективности об

разования паузы в отсутствие σ субъединицы.

Рис. 3. Влияние Gre факторов на эффективность форми

В то же время, добавление σ²⁴ субъединицы в

рования σ²⁴ зависимой паузы. Все обозначения соответ

данном случае не приводит к увеличению эф

ствуют рис. 2.

фективности образования паузы (рис. 3, б). Та

С цветным вариантом рис. 3 можно ознакомиться в элект

ким образом, формирование паузы требует на

ронной версии статьи на сайте: www.elibrary.ru

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

576

ШИКАЛОВ и др.

скрипции. Для реактивации такого комплекса

единицы, не содержащий большей части района 1

клетки E. coli используют транскрипционные

и района 4, также способен вызывать σ⁷⁰ зави

факторы GreA и GreB, которые способствуют

симые паузы [39]. По аналогии с σ⁷⁰ зависи

расщеплению РНК транскрипта в активном

мыми паузами можно предположить, что фор

центре РНКП [53, 54]. Gre факторы реактиви

мирование σ²⁴ паузы происходит благодаря свя

руют транскрипционные комплексы при фор

зыванию района σ2 с кор ферментом РНКП и с

мировании σ⁷⁰ и σ³⁸ зависимых пауз транскрип

-10 подобным элементом в нематричной цепи

ции [30, 33, 34, 41, 52]. Мы протестировали

ДНК [32].

действие этих факторов на открытую нами паузу.

Известно два механизма возникновения

Как можно видеть на рис. 3, оба белка, GreA и

σ зависимых пауз. В первом случае сигнал паузы

GreB, снижают ее эффективность. Это позволяет

узнает та же молекула σ субъединицы, которая

предполагать, что, как и в случае других σ субъ

участвовала в инициации транскрипции и оста

единиц, при формировании σ²⁴ зависимой пау

лась связанной с РНКП после ухода с промотора

зы комплекс переходит в смещенное состояние.

(действие in cis, рис. 4, а) [37]. В втором случае

σ²⁴ субъединица является первым предста

σ субъединица связывается со свободным ЭК и

вителем 4 й группы σ субъединиц, для которого

вызывает паузы in trans (рис. 4, а). Формирова

показана способность вызывать паузы тран

ние пауз по механизму in trans было показано как

скрипции. Открытая нами пауза похожа по сво

для σ⁷⁰, так и для σ³⁸ субъединицы [30, 31, 33, 34].

им свойствам на исследованные ранее σ⁷⁰ и σ³⁸

Эксперименты, проведенные в данной работе,

зависимые паузы. Это означает, что консерва

были направлены на анализ возможности фор

тивные районы σ1 и σ3, которые отсутствуют у

мирования пауз именно по такому механизму,

σ субъединиц 4 й группы, не являются обяза

при добавлении альтернативных σ субъединиц к

тельными для формирования пауз. Действитель

ЭК, содержащим консенсусные последователь

но, ранее было показано, что фрагмент σ⁷⁰ субъ

ности соответствующих -10 элементов.

Рис. 4. Возможные механизмы формирования пауз транскрипции с участием альтернативных σ субъединиц. а - Схема

образования пауз по механизму in cis, при узнавании сигнала паузы в промотор проксимальной области той же σ субъе

диницей, которая участвовала в узнавании промотора, и in trans, при связывании другой молекулы σ субъединицы со сво

бодным ЭК; б - примеры промоторов, содержащих потенциальные сигналы σ зависимых пауз в начале транскрибируе

мой области. Для каждой из σ субъединиц показаны консенсусные последовательности -35 и -10 элементов, стартовая

точка транскрипции показана полужирным шрифтом.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: www.elibrary.ru

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

σ²⁴ ЗАВИСИМЫЕ ПАУЗЫ ТРАНСКРИПЦИИ

577

В отличие от σ²⁴ субъединицы, σ²⁸ и σ³², кото

Несмотря на то, что σ зависимые паузы отк

рые относятся к 3 й группе σ факторов, не вызы

рыты довольно давно и известны как у фагов,

вают пауз транскрипции в данной модельной

так и у нескольких филогенетически далеких

системе. Использованная концентрация σ субъ

видов бактерий [30, 36, 38, 57], до сих пор неиз

единиц (2,5 мкМ) значительно превышает ранее

вестна их распространенность и функциональ

измеренные значения констант диссоциации для

ное значение при транскрипции генома даже

связывания σ⁷⁰ и σ³⁸ субъединиц с ЭК (~150 и 300

модельных организмов, таких как E. coli [44].

нМ соответственно) [34]. Также это сопоставимо

Имеются лишь приблизительные оценки, что

или даже больше концентрации факторов σ²⁸ и

σ⁷⁰ зависимые паузы происходят при транскрип

σ³² в клетке [55, 56]. Понять, почему в отличие от

ции ~10-20% оперонов [43, 58]. Однако многие

других σ субъединицы 3 й группы не вызывают

гены транскрибируются при участии альтерна

паузу транскрипции, сложно из за отсутствия

тивных σ субъединиц, что говорит о том, что

данных о структуре холофермента РНКП с этими

частота встречаемости таких пауз может быть

альтернативными σ субъединицами. Известно,

недооценена. Ранее было продемонстрировано,

что сигнал σ⁷⁰ зависимых пауз включает не толь

что главная σ⁷⁰ субъединица способна связы

ко -10 подобный элемент, но и последователь

ваться с ЭК после инициации транскрипции хо

ность РНК ДНК гибрида, а также может быть

лоферментом РНКП, содержащим альтернатив

дополнен -35 подобным элементом [40, 42, 50].

ную σ²⁸ субъединицу (рис. 4, а) [31]. Поскольку

Возможно, что для формирования пауз тран

нами показано, что вызывать паузы транскрип

скрипции σ²⁸ и σ³² субъединицами нужны до

ции способны несколько альтернативных σ фак

полнительные последовательности ДНК, кото

торов, смена σ субъединиц может увеличивать

рые отсутствуют в использованных ЭК.

многообразие пауз транскрипции, а значит, по

Важной задачей дальнейших исследований

тенциально расширяет возможность тонкой ре

является изучение способности альтернативных

гуляции экспрессии генов.

σ факторов вызывать паузы транскрипции при

промотор зависимой инициации транскрипции.

Анализ известных промоторов σ³², σ²⁸и σ²⁴ пока

Финансирование

зывает, что некоторые из них содержат в начале

транскрибируемой области последовательности,

Работа выполнена при финансовой поддержке

которые близки к консенсусу -10 элемента для

РНФ (грант 16 14 10377).

данных субъединиц (рис. 4, б). Можно предпо

ложить, что при транскрипции промотор прок

Благодарности

симальных участков на таких матрицах могут воз

никать σ зависимые паузы по механизму in cis,

Авторы благодарят И. Арцимович за предос

за счет того, что σ субъединицы остаются свя

тавленную плазмиду (pVS10), А. Огиенко за тес

занными с РНКП после инициации транскрип

тирование активности σ²⁸ субъединицы, а также

ции. Не исключено, что σ²⁸ и σ³² зависимые пау

рецензентов за ценные замечания по редактиро

зы могут быть детектированы в дальнейшем в та

ванию рукописи.

кой экспериментальной системе. Кроме того,

интересной задачей является исследование вли

Конфликт интересов

яния температуры на формирование пауз при

инициации транскрипции с участием σ³² субъ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

единицы, так как эта σ субъединица участвует в

по вопросам финансирования и другим вопро

транскрипции генов при тепловом шоке.

сам при исполнении данной работы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Feklistov, A., Sharon, B.D., Darst, S.A., and Gross, C.A.

Zhang, N., Darbari, V.C., Glyde, R., Zhang, X., and

(2014) Bacterial sigma factors: a historical, structural, and

Buck, M. (2016) The bacterial enhancer dependent RNA

genomic perspective, Annu. Rev. Microbiol., 68, 357-376,

polymerase, Biochem. J., 473, 3741-3753, doi: 10.1042/

doi: 10.1146/annurev micro 092412 155737.

BCJ20160741C.

Gruber, T.M., and Gross, C.A. (2003) Multiple sigma sub

Lonetto, M., Gribskov, M., and Gross, C.A. (1992) The

units and the partitioning of bacterial transcription space,

sigma 70 family: sequence conservation and evolutionary

Annu. Rev. Microbiol., 57, 441-466, doi: 10.1146/annurev.

relationships, J. Bacteriol., 174, 3843-3849, doi: 10.1128/

micro.57.030502.090913.

jb.174.12.3843 3849.1992.

Paget, M.S. (2015) Bacterial sigma factors and anti sigma

Iyer, L.M., and Aravind, L. (2012) Insights from the archi

factors: structure, function and distribution, Biomolecules,

tecture of the bacterial transcription apparatus, J. Struct.

5, 1245-1265, doi: 10.3390/biom5031245.

Biol., 179, 299-319, doi: 10.1016/j.jsb.2011.12.013.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

578

ШИКАЛОВ и др.

Maciag, A., Peano, C., Pietrelli, A., Egli, T., De Bellis, G.,

23.

Angerer, A., Enz, S., Ochs, M., and Braun, V. (1995)

and Landini, P. (2011) In vitro transcription profiling of the

Transcriptional regulation of ferric citrate transport in

sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re definition

Escherichia coli K 12. Fecl belongs to a new subfamily of

of the sigmaS regulon and identification of sigmaS specific

sigma 70 type factors that respond to extracytoplasmic

promoter sequence elements, Nucleic Acids Res., 39,

stimuli, Mol. Microbiol., 18, 163-174.

5338-5355, doi: 10.1093/nar/gkr129.

24.

Bar Nahum, G., and Nudler, E. (2001) Isolation and char

Liu, B., Zuo, Y., and Steitz, T.A. (2016) Structures of E.

acterization of sigma(70) retaining transcription elonga

coli sigmaS transcription initiation complexes provide new

tion complexes from Escherichia coli, Cell, 106, 443-451,

insights into polymerase mechanism, Proc. Natl. Acad. Sci.

doi: 10.1016/S0092 8674(01)00461 5.

USA, 113, 4051-4056, doi: 10.1073/pnas.1520555113.

25.

Kapanidis, A.N., Margeat, E., Laurence, T.A., Doose, S.,

White Ziegler, C.A., Um, S., Perez, N.M., Berns, A.L.,

Ho, S.O., Mukhopadhyay, J., Kortkhonjia, E., Mekler, V.,

Malhowski, A.J., and Young, S. (2008) Low temperature

Ebright, R.H., and Weiss, S. (2005) Retention of transcrip

(23 degrees C) increases expression of biofilm , cold

tion initiation factor sigma70 in transcription elongation:

shock and RpoS#dependent genes in Escherichia coli K 12,

single molecule analysis, Mol. Cell, 20, 347-356, doi: 10.

Microbiology, 154, 148-166, doi: 10.1099/mic.0.2007/

1016/j.molcel.2005.10.012.

012021 0.

26.

Mukhopadhyay, J., Kapanidis, A.N., Mekler, V.,

10.

Battesti, A., Majdalani, N., and Gottesman, S. (2011) The

Kortkhonjia, E., Ebright, Y.W., and Ebright, R.H. (2001)

RpoS mediated general stress response in Escherichia coli,

Translocation of sigma(70) with RNA polymerase during

Annu. Rev. Microbiol., 65, 189-213, doi: 10.1146/annurev

transcription: fluorescence resonance energy transfer assay

micro 090110 102946.

for movement relative to DNA, Cell, 106, 453-463,

11.

Zhao, K., Liu, M., and Burgess, R.R. (2007) Adaptation in

doi: 10.1016/S0092 8674(01)00464 0.

bacterial flagellar and motility systems: from regulon mem

27.

Mooney, R.A., Davis, S.E., Peters, J.M., Rowland, J.L.,

bers to «foraging» like behavior in E. coli, Nucleic Acids

Ansari, A.Z., and Landick, R. (2009) Regulator trafficking

Res., 35, 4441-4452, doi: 10.1093/nar/gkm456.

on bacterial transcription units in vivo, Mol. Cell, 33,

12.

Nonaka, G., Blankschien, M., Herman, C., Gross, C.A.,

97-108, doi: 10.1016/j.molcel.2008.12.021.

and Rhodius, V.A. (2006) Regulon and promoter analysis

28.

Raffaelle, M., Kanin, E.I., Vogt, J., Burgess, R.R., and

of the E. coli heat shock factor, sigma32, reveals a multi

Ansari, A.Z. (2005) Holoenzyme switching and stochastic

faceted cellular response to heat stress, Genes Dev., 20,

release of sigma factors from RNA polymerase in vivo, Mol.

1776-1789, doi: 10.1101/gad.1428206.

Cell, 20, 357-366, doi: 10.1016/j.molcel.2005.10.011.

13.

Neidhardt, F.C., VanBogelen, R.A., and Lau, E.T. (1983)

29.

Harden, T.T., Wells, C.D., Friedman, L.J., Landick, R.,

Molecular cloning and expression of a gene that cont

Hochschild, A., Kondev, J., and Gelles, J. (2016) Bacterial

rols the high temperature regulon of Escherichia coli,

RNA polymerase can retain sigma70 throughout transcrip

J. Bacteriol., 153, 597-603, doi: 10.1016/0092 8674(83)

tion, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 602-607, doi: 10.

90396 3.

1073/pnas.1513899113.

14.

Grossman, A.D., Erickson, J.W., and Gross, C.A. (1984)

30.

Brodolin, K., Zenkin, N., Mustaev, A., Mamaeva, D., and

The htpR gene product of E. coli is a sigma factor for heat

Heumann, H. (2004) The sigma 70 subunit of RNA poly

shock promoters, Cell, 38, 383-390.

merase induces lacUV5 promoter proximal pausing of trans

15.

Komeda, Y. (1986) Transcriptional control of flagellar ge

cription, Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 551-557, doi: 10.1038/

nes in Escherichia coli K 12, J. Bacteriol., 168, 1315-1318,

nsmb768.

doi: 10.1128/jb.168.3.1315 1318.1986.

31.

Goldman, S.R., Nair, N.U., Wells, C.D., Nickels, B.E.,

16.

Komeda, Y., Kutsukake, K., and Iino, T. (1980) Definition

and Hochschild, A. (2015) The primary sigma factor in

of additional flagellar genes in Escherichia coli, K12,

Escherichia coli can access the transcription elongation

Genetics, 94, 277-290.

complex from solution in vivo, eLife, 4, e10514, doi: 10.

17.

Arnosti, D.N., and Chamberlin, M.J. (1989) Secondary

7554/eLife.10514.

sigma factor controls transcription of flagellar and chemo

32.

Mooney, R.A., Darst, S.A., and Landick, R. (2005) Sigma

taxis genes in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

and RNA polymerase: an on again, off again relationship?

86, 830-834.

Mol. Cell, 20, 335-345, doi: 10.1016/j.molcel.2005.10.015.

18.

Barrios, A.F., Zuo, R., Ren, D., and Wood, T.K. (2006)

33.

Zhilina, E., Esyunina, D., Brodolin, K., and Kulbachin

Hha, YbaJ, and OmpA regulate Escherichia coli K12

skiy, A. (2012) Structural transitions in the transcription

biofilm formation and conjugation plasmids abolish

elongation complexes of bacterial RNA polymerase during

motility, Biotechnol. Bioeng., 93, 188-200, doi: 10.1002/

sigma dependent pausing, Nucleic Acids Res., 40, 3078-3091,

bit.20681.

doi: 10.1093/nar/gkr1158.

19.

Lipinska, B., Sharma, S., and Georgopoulos, C. (1988)

34.

Petushkov, I., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. (2017)

Sequence analysis and regulation of the htrA gene of

Sigma38 dependent promoter proximal pausing by bacte

Escherichia coli: a sigma 32 independent mechanism of

rial RNA polymerase, Nucleic Acids Res., 45, 3006-3016,

heat inducible transcription, Nucleic Acids Res., 16,

doi: 10.1093/nar/gkw1213.

10053-10067.

35.

Perdue, S.A., and Roberts, J.W. (2011) Sigma(70) depen

20.

Wang, Q.P., and Kaguni, J.M. (1989) A novel sigma factor

dent transcription pausing in Escherichia coli, J. Mol. Biol.,

is involved in expression of the rpoH gene of Escherichia

412, 782-792, doi: 10.1016/j.jmb.2011.02.011.

coli, J. Bacteriol., 171, 4248-4253.

36.

Ring, B.Z., Yarnell, W.S., and Roberts, J.W.

(1996)

21.

Rouviere, P.E., De Las Penas, A., Mecsas, J., Lu, C.Z.,

Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma70

Rudd, K.E., and Gross, C.A. (1995) rpoE, the gene encoding

in promoter proximal pausing, Cell, 86, 485-493, doi:

the second heat shock sigma factor, sigma E, in Esche#

10.1016/S0092 8674(00)80121 X.

richia coli, EMBO J., 14, 1032-1042.

37.

Marr, M.T., Datwyler, S.A., Meares, C.F., and Roberts, J.W.

22.

Egler, M., Grosse, C., Grass, G., and Nies, D.H. (2005)

(2001) Restructuring of an RNA polymerase holoenzyme

Role of the extracytoplasmic function protein family sigma

elongation complex by lambdoid phage Q proteins, Proc. Natl.

factor RpoE in metal resistance of Escherichia coli, J. Bac#

Acad. Sci. USA, 98, 8972-8978, doi: 10.1073/pnas.161253298.

teriol., 187, 2297-2307, doi: 10.1128/JB.187.7.22972307.

38.

Nickels, B.E., Mukhopadhyay, J., Garrity, S.J., Ebright, R.H.,

2005.

and Hochschild, A. (2004) The sigma70 subunit of RNA

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019

σ²⁴ ЗАВИСИМЫЕ ПАУЗЫ ТРАНСКРИПЦИИ

579

polymerase mediates a promoter proximal pause at the lac

of Gre factors of Thermus thermophilus, Methods Enzymol.,

promoter, Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 544-550, doi: 10.

371, 219-232, doi: 10.1016/S0076 6879(03)71016 7.

1038/nsmb757.

49.

Rhodius, V.A., Suh, W.C., Nonaka, G., West, J., and

39.

Zenkin, N., Kulbachinskiy, A., Yuzenkova, Y., Mustaev, A.,

Gross, C.A. (2006) Conserved and variable functions of the

Bass, I., Severinov, K., and Brodolin, K. (2007) Region 1,2

sigmaE stress response in related genomes, PLoS Biol., 4,

of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition

e2, doi: 10.1371/journal.pbio.0040002.

of the

10 promoter element, EMBO J., 26, 955-964,

50.

Strobel, E.J., and Roberts, J.W. (2015) Two transcription

doi: 10.1038/sj.emboj.7601555.

pause elements underlie a sigma70 dependent pause cycle,

40.

Devi, P.G., Campbell, E.A., Darst, S.A., and Nickels, B.E.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 4374-4380, doi: 10.1073/

(2010) Utilization of variably spaced promoter like ele

pnas.1512986112.

ments by the bacterial RNA polymerase holoenzyme during

51.

Campagne, S., Marsh, M.E., Capitani, G., Vorholt, J.A.,

early elongation, Mol. Microbiol., 75, 607-622, doi: 10.

and Allain, F.H. (2014) Structural basis for

10 promoter

1111/j.1365 2958.2009.07021.x.

element melting by environmentally induced sigma factors,

41.

Perdue, S.A., and Roberts, J.W. (2010) A backtrack inducing

Nat. Struct. Mol. Biol., 21, 269-276, doi: 10.1038/nsmb.2777.

sequence is an essential component of Escherichia coli

52.

Marr, M.T., and Roberts, J.W. (2000) Function of trans

sigma(70) dependent promoter proximal pausing, Mol. Micro#

cription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory

biol., 78, 636-650, doi: 10.1111/j.1365 2958.2010.07347.x.

pause site, Mol. Cell, 6, 1275-1285, doi: 10.1016/S1097

42.

Strobel, E.J., and Roberts, J.W. (2014) Regulation of pro

2765(00)00126 X.

moter proximal transcription elongation: enhanced DNA

53.

Borukhov, S., Sagitov, V., and Goldfarb, A.

(1993)

scrunching drives lambdaQ antiterminator dependent

Transcript cleavage factors from E. coli, Cell, 72, 459-466,

escape from a sigma70 dependent pause, Nucleic Acids

doi: 10.1016/0092 8674(93)90121 6.

Res., 42, 5097-5108, doi: 10.1093/nar/gku147.

54.

Laptenko, O., Lee, J., Lomakin, I., and Borukhov, S.

43.

Deighan, P., Pukhrambam, C., Nickels, B.E., and

(2003) Transcript cleavage factors GreA and GreB act as

Hochschild, A. (2011) Initial transcribed region sequences

transient catalytic components of RNA polymerase,

influence the composition and functional properties of the

EMBO J., 22, 6322-6334, doi: 10.1093/emboj/cdg610.

bacterial elongation complex, Genes Dev., 25, 77-88,

55.

Grigorova, I.L., Phleger, N.J., Mutalik, V.K., and Gross, C.A.

doi: 10.1101/gad.1991811.

(2006) Insights into transcriptional regulation and sigma

44.

Petushkov, I., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. (2017)

competition from an equilibrium model of RNA poly

Possible roles of sigma dependent RNA polymerase pausing

merase binding to DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103,

in transcription regulation, RNA Biol., 14, 1678-1682,

5332-5337, doi: 10.1073/pnas.0600828103.

doi: 10.1080/15476286.2017.1356568.

56.

Jishage, M., Iwata, A., Ueda, S., and Ishihama, A. (1996)

45.

Svetlov, V., and Artsimovitch, I. (2015) Purification of bac

Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in

terial RNA polymerase: tools and protocols, Methods Mol.

Escherichia coli: intracellular levels of four species of sigma

Biol., 1276, 13-29, doi: 10.1007/978 1 4939 2392 2_2.

subunit under various growth conditions, J. Bacteriol., 178,

46.

Pupov, D., Kuzin, I., Bass, I., and Kulbachinskiy, A. (2014)

5447-5451, doi: 10.1128/jb.178.18.5447 5451.

Distinct functions of the RNA polymerase sigma subunit

57.

Zhilina, E., Miropolskaya, N., Bass, I., Brodolin, K., and

region 3,2 in RNA priming and promoter escape, Nucleic

Kulbachinskiy, A. (2011) Characteristics of sigma depen

Acids Res., 42, 4494-4504, doi: 10.1093/nar/gkt1384.

dent pausing in RNA polymerases from E. coli and T. aqua#

47.

Anthony, L.C., Foley, K.M., Thompson, N.E., and

ticus, Biochemistry (Moscow), 76, 1348-1358, doi: 10.1134/

Burgess, R.R. (2003) Expression, purification of, and

S0006297911100038.

monoclonal antibodies to sigma factors from Escherichia

58.

Hatoum, A., and Roberts, J. (2008) Prevalence of RNA

coli, Methods Enzymol., 370, 181-192, doi: 10.1016/S0076

polymerase stalling at Escherichia coli promoters after open

6879(03)70016 0.

complex formation, Mol. Microbiol., 68, 17-28, doi: 10.

48.

Laptenko, O., and Borukhov, S. (2003) Biochemical assays

1111/j.1365 2958.2008.06138.x.

THE σ²⁴ SUBUNIT OF Escherichia coli RNA POLYMERASE

CAN INDUCE TRANSCRIPTIONAL PAUSING in vitro

A. B. Shikalov, D. M. Esyunina, D. V. Pupov, A. V. Kulbachinskiy, and I. V. Petushkov*

Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences,

123182 Moscow, Russia; E#mail: telomer1@rambler.ru

Received November 2, 2018

Revised December 5, 2018

Accepted December 12, 2018

The bacterium Escherichia coli has seven у subunits that bind core RNA polymerase and are necessary for promoter

recognition. It was previously shown that the σ⁷⁰ and σ³⁸ subunits can also interact with the transcription elongation

complex (TEC) and stimulate pausing, by recognizing DNA sequences similar to the

10 element of promoters.

In this study, we analyzed the ability of the σ³², σ²⁸, and σ²⁴ subunits to induce pauses in reconstituted TECs containing

corresponding -10 consensus elements. It was shown that the σ²⁴subunit can induce a transcriptional pause depending

on the presence of -10 element. The pause formation is suppressed by Gre factors suggesting that the paused complex

adopts a backtracked conformation. Some natural promoters contain potential signals of σ²⁴ dependent pauses in the

initially transcribed regions suggesting that such pauses may have regulatory functions in transcription.

Keywords: transcriptional pausing, RNA polymerase, alternative σ factors, Gre proteins

БИОХИМИЯ том 84 вып. 4 2019