БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 5, с. 704 - 718

УДК 577.124

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ К L АРАБИНОЗЕ ФАКТОР

ТРАНСКРИПЦИИ AraR ОТРИЦАТЕЛЬНО РЕГУЛИРУЕТ

УСТОЙЧИВОСТЬ Mycobacterium smegmatis К ИЗОНИАЗИДУ^*

¹ National Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life

Science and Technology, Huazhong Agricultural University,

Wuhan 430070, China; E mail: lwhlbx@163.com

²State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical

Agro bioresources, College of Life Science and Technology,

Guangxi University, Nanning 530004, China

Поступила в редакцию 09.09.2018

После доработки 06.01.2019

Принята к публикации 24.01.2019

L Арабиноза является важным компонентом клеточной стенки микобактерий. Она участвует в синтезе ара

биногалактана и арабинозы, маннозы и других сахаров, что оказывает влияние на проницаемость клеточ

ной стенки и лекарственную устойчивость. Однако до сих пор неясно, может ли L арабиноза действовать в

качестве эффективной молекулы, влияющей на устойчивость микобактерий к антибиотикам. Также не вы

яснен регуляторный механизм, определяющий ее действие. В настоящей работе нами был охарактеризован

новый транскрипционный фактор AraR из Mycobacterium smegmatis, который реагирует на L арабинозу и ре

гулирует чувствительность микобактерий к изониазиду (INH). Было показано, что AraR специфически рас

познает два консервативных мотива длиной 15 п.н. в вышележащем регуляторном участке арабинозного

оперона, обозначаемого как araR оперон. AraR функционирует как репрессор транскрипции и осуществля

ет отрицательную регуляцию экспрессии оперона. В отличие от действия AraR, сверхэкспрессия araR опе

рона способствует развитию устойчивости микобактерий к INH. Поразительно, что L арабиноза может

действовать в качестве эффективной молекулы и приводить к дерепрессии ингибирования транскрипции

AraR. Штамм с нокаутом AraR был более устойчив к INH, чем штамм дикого типа, в то время как штамм со

сверхэкспрессией AraR был более чувствителен к препарату. Добавление в среду L арабинозы может значи

тельно повышать устойчивость штамма дикого типа, но не оказывает влияние на штамм с нокаутом гена

AraR. Таким образом, в настоящей работе был выявлен новый фактор транскрипции, чувствительный к

L арабинозе, и установлена регуляция его активности при возникновении устойчивости бактерий к анти

биотикам. Эти результаты дают ключ к дальнейшему пониманию механизма регуляции с участием молекул

сахаров и ее взаимосвязи с лекарственной устойчивостью микобактерий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: AraR, микобактерии, L арабиноза, устойчивость к антибиотикам.

DOI: 10.1134/S0320972519050087

В последние годы широкое распространение

востью [2]. Необходимо как можно скорее выя

различных бактерий, устойчивых к антибиоти

вить регуляторные механизмы, лежащие в осно

кам, продолжает угрожать здоровью человека.

ве бактериальной лекарственной устойчивости,

По данным на 2016 г., в мире от туберкулеза,

для последующей разработки новых противоту

вызванного Mycobacterium tuberculosis, страдали

беркулезных препаратов.

10,4 млн человек [1]. Ситуация с туберкулезной

Ранее были опубликованы работы, посвя

инфекцией усложнилась в связи с тем, что пос

щенные исследованию механизмов, обусловли

тоянно образуются новые штаммы возбудителя

вающих возникновение устойчивости микобак

со множественной лекарственной устойчи

терий к действию антибиотиков. У бактерий

Принятые сокращения: AG - арабиногалактан; AraR - транскрипционный фактор из Mycobacterium smegmatis;

CFU - колониеобразующие единицы; EMSA - анализ сдвига электрофоретической подвижности; FITC - флуоресцеин

изотиоцианат; INH - изониазид; LAM - липоарабиноманнан; RT PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транс

крипцией; qRT PCR - количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией;

WT - дикий тип.

* Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте издатель

ства Springer (Link.springer.com), том 84, вып. 5, 2019.

** Адресат для корреспонденции.

704

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

705

широко распространены клеточные стенки, ас

ное влияние на проницаемость клеточной стен

социированные с природными насосами и

ки и лекарственную устойчивость [16, 17].

транспортерами. Эти насосы поддерживают

В целом метаболизм L арабинозы у многих

клеточный гомеостаз и регулируют трансмемб

видов бактерий регулируется арабинозным опе

ранный транспорт лекарственных препаратов [3].

роном [18, 19]. У Bacillus subtilis гены araA, araB и

Показано, что у микобактерий некоторые из

araC кодируют изомеразу L арабинозы, L рибу

этих транспортеров или откачивающих насосов

локиназу, регулятор и L рибулоза 5 фосфат 4 эпи

способствуют повышению устойчивости к изо

меразу соответственно. Продукты генов araN,

ниазиду (INH), рифампицину, тетрациклину и

araP и araQ представляют собой транспортные

другим токсичным соединениям [4-6]. В част

системы, зависимые от связывания с белками [18].

ности, миколовые кислоты являются основны

У Escherichia coli арабинозный оперон включает

ми компонентами клеточной стенки микобак

в себя: AraA (изомераза), AraB (рибулокиназа),

терий, в значительной степени обеспечивающи

AraC (регулятор), AraD (эпимераза) и AraEFGH

ми непроницаемость и устойчивость к антибио

(транспортер для поглощения L арабинозы) [19].

тикам [7, 8]. Изменения компонентов клеточ

В большинстве случаев у бактерий экспрессия

ной стенки могут приводить к снижению про

арабинозного оперона используется для утили

ницаемости для препаратов, поступающих в

зации L арабинозы. Однако нет ответа на воп

клетку. Примером может служить virS регулиру

рос о том, связан ли арабинозный оперон с устой

емая монооксигеназа MymA клеточной стенки,

чивостью к антибиотикам.

которая поддерживает синтез миколовой кисло

В последние годы выявлена взаимосвязь

ты и повышает целостность клеточной стенки.

между регуляцией транскрипции генов, связан

Мутации в virS-mymA приводят к увеличению

ных с синтезом клеточной стенки, и лекарствен

проницаемости клеточной стенки и диффузии

ной устойчивостью микобактерий [20, 21]. Од

препаратов внутрь клетки [9, 10]. У Mycobacterium

нако оставалось неизвестным, может ли L ара

smegmatis фосфатаза фосфолипидов Ms6402 ре

биноза выступать в качестве эффективной мо

гулирует синтез D арабинозы, а также арабино

лекулы, и каким образом она играет роль в ини

галактана (AG). Изменение уровня экспрессии

циировании механизма регуляции лекарствен

Ms6402 влияет на устойчивость микобактерий

ной устойчивости микобактерий. В настоящей ра

или чувствительность к противотуберкулезным

боте нами был охарактеризован в клетках M. smeg

препаратам [11]. Кроме того, блокирование взаи

matis новый отвечающий на L арабинозу фактор

модействий лекарств и белков мишеней и мо

транскрипции AraR, который регулирует экс

дификация самого препарата либо его непосред

прессию арабинозного оперона и чувствитель

ственной мишени также приводят к формирова

ность к антибиотикам. Полученные нами ре

нию лекарственной устойчивости [12, 13]. На

зультаты могут способствовать пониманию ме

пример, метилтрансфераза Rv0560c может на

ханизма формирования устойчивости микобак

прямую модифицировать лекарственные препа

терий к действию антибиотиков.

раты, что, в конечном итоге, приводит к возник

новению устойчивости M. tuberculosis к антибио

тикам [14].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельного штамма для исследо

вания механизмов регуляции транскрипции ви

Штаммы, плазмиды, ферменты, реагенты.

рулентных видов микобактерий была использо

Штамм Escherichia coli BL21 и вектор pET28a

вана М. smegmatis, являющаяся непатогенной

были приобретены у компании «Novagen», Гер

микобактерией. Уникальная структура клеточ

мания (табл. S1 Приложения); ДНК лигаза Т4,

ной стенки микобактерий наделяет их способ

ДНК полимераза, dNTP и все ферменты рест

ностью противостоять суровым условиям окру

рикции - у «TaKaRa Biotech», Япония. Прайме

жающей среды и, в то же время, обеспечивает их

ры для ПЦР были синтезированы в компании

устойчивость к различным антибиотикам [15].

«Tsingke», Китай (табл. S2 Приложения).

L Арабиноза является второй по распростра

Клонирование гена, экспрессия и очистка ре

ненности альдопентозой после ксилозы у расте

комбинантного белка AraR. Ген araR и другие

ний, а также важным компонентом клеточной

родственные гены из геномной ДНК M. smeg

стенки различных микроорганизмов, влияю

matis mc²155 были амплифицированы с по

щим на широкий спектр физиологических про

мощью ПЦР с использованием эффективных

цессов бактерий. В качестве важного компонен

праймеров (табл. S2 Приложения). Эти гены были

та клеточной стенки микобактерий L арабиноза

клонированы в экспрессионные векторы pET28a

участвует в синтезе AG, липоарабиноманнана

и pMV261. Для экспрессии рекомбинантного

(LAM) и других сахаров, оказывает существен

белка плазмидой pET28a araR трансформирова

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

706

ZHOU и др.

ли клетки штамма BL21 Е. coli. Экспрессионные

вали в 100 мкл ТЕ буфера (20 мМ Tris HCl, рН 7,8;

штаммы культивировали в среде LB при 37 °C до

10 мМ ЭДТА; 0,5% SDS). Затем комплексы раз

достижения OD₆₀₀ 0,6. Затем в культуру добавля

рушали в течение 6 ч при 65 °С. Образцы ДНК

ли 0,3 мМ изопропил в D 1 тиогалактопирано

исходных образцов и преципитированных анти

зида, и штаммы культивировали в течение 6 ч

телами комплексов хроматина очищали и ана

при 25 °С. Клетки собирали, белки очищали на

лизировали с помощью ПЦР.

Ni²⁺ аффинных колонках, как описано ранее [22].

Футпринтинг с использованием ДНКазы I. Про

Элюат диализовали в течение ночи и хранили

моторную область araR оперона длиной 399 п.н.

при -80 °С.

амплифицировали методом ПЦР с использова

Бактериальный одногибридный анализ. Бакте

нием эффективных праймеров, меченных FITC.

риальный одногибридный анализ проводили,

Амплифицированный продукт очищали с по

как описано ранее [23]. Комбинированный про

мощью набора для очистки ДНК («BioFlux») и

мотор аraR клонировали в вектор pBXcmT, аraR -

затем подвергали связыванию с белком, как и в

в вектор pTRG («Stratagene», США). Селектив

случае EMSA. Более подробно этот метод был

ная среда для скрининга методом бактериально

описан ранее [25] и выполнен с некоторыми из

го одногибридного анализа в планшете содер

менениями. Все реакционные смеси были под

жала 16 мкг/мл стрептомицина, 15 мкг/мл тет

вергнуты расщеплению ДНКазой I (1 ед; «Fer

рациклина, 34 мкг/мл хлорамфеникола, 30 мкг/мл

mentas China Co.», Китай) в течение 3 мин при

канамицина и 20 мМ 3 АТ (3 амино 1,2,4 триа

37 °C. Полученные данные анализировали с ис

зол).

пользованием ДНК анализатора 37030XL фир

Анализ сдвига электрофоретической подвиж

мы «Applied Biosystems» (произведен компанией

ности (EMSA). Субстраты ДНК для проведения

«Tsingke», Китай).

анализа амплифицировали с помощью ПЦР с

Количественная ПЦР в реальном времени с

геномной ДНК M. smegmatis mc²155 с использо

обратной транскрипцией (RT qPCR). Выделение

ванием эффективных праймеров или прайме

мРНК из клеток Msm/pMV261, Msm/pMV261 araR,

ров, синтезированных в компании «Tsingke»,

Msm/WT и Msm/araR::hyg проводили с по

Китай (табл. S2 Приложения). Фрагмент ДНК

мощью набора RNApure Kit («Zomanbio», Китай)

метили FITC для проведения конкурентного

согласно инструкции производителя. При про

анализа ДНК. Реакционная смесь (20 мкл) со

ведении ПЦР с обратной транскрипцией (RT

держала Tris HCl (рН 8,0), 10 мм MgСl₂, 50 мм

PCR - reverse transcription polymerase chain reac

NaСl; белок; фрагмент ДНК; ddH₂O и 2,5% гли

tion) использовали геноспецифичные праймеры

церина. Субстраты ДНК инкубировали совмест

(табл. S2 Приложения), кДНК первой цепи син

но с белком при комнатной температуре в тече

тезировали с помощью набора RT PCR Kit

ние 25 мин. Затем смеси подвергали нативному

(«Aidlab», Китай) согласно инструкции произ

электрофорезу в 5% ном ПААГ. Результаты

водителя. Количественную ПЦР в реальном вре

электрофореза визуализировали с помощью

мени (qPCR - quantitative real time PCR) прово

сканера Typhoon («GE Healthcare»).

дили, используя 20 мкл реакционной смеси,

Иммунопреципитация хроматина. Анализ им

состоявшей из 10 мкл 2× SYBR qPCR Mix Kit

мунопреципитации хроматина (ChIP) проводи

(«Aidlab», Китай), 200 нM каждого праймера и

ли, как описано ранее, с некоторыми изменени

2 мкл образца кДНК из RT PCR. Каждую реак

ями [24]. Клетки M. smegmatis mc²155 выращива

цию проводили 3 раза. Амплификацию и обна

ли до достижения OD₆₀₀ ~ 1,0…1,2 в 100 мл сре

ружение продуктов осуществляли с помощью

ды 7H9. Затем клетки фиксировали в 1% ном

прибора CFX96 («Bio Rad», США) согласно

формальдегиде в течение 30 мин. Процесс фик

следующему протоколу: 95 °C - 5 мин, затем

сации останавливали добавлением 0,125 М гли

40 циклов: 95 °C - 15 с, 60 °С - 15 с, 72 °C - 45 с;

цина на 5 мин. Клетки собирали и ресуспенди

кривая плавления 55-99 °С, шаг 0,5 °С за 10 с;

ровали в 1 мл Tris буфера (20 мм Tris HCl, рН 7,5;

25 °С - 5 мин. Полученные данные анализиро

150 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; 0,1% Triton Х 100).

вали с помощью CFX Manager, версия 2.1 («Bio

Затем клетки подвергали обработке ультразву

Rad», США). Специфичность амплификации

ком на льду, центрифугировали и собирали су

оценивали путем анализа кривой плавления.

пернатант. К образцам добавляли специфичес

Уровни экспрессии генов нормализовали отно

кие антитела или преиммунную сыворотку при

сительно уровня транскриптов гена sigA [26].

покачивании в течение 3 ч при 4 °С. Иммунопре

Степень изменения уровня экспрессии рассчи

ципитацию образовавшихся комплексов прово

тывали с помощью метода 2-ΔΔCt [27]. Для ста

дили с помощью 20 мкл 50% ной белок А агаро

тистической обработки полученных результа

зы в течение 1 ч при 4 °С. Иммунные комплексы

тов использовали двусторонний критерий Стью

осаждали центрифугированием и ресуспендиро

дента.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

707

Анализ активности β галактозидазы. Опреде

выявлено каких либо заметных различий в кри

ление активности β галактозидазы проводили с

вых роста этих штаммов. В то же время при до

целью выявления регуляторной активности AraR.

бавлении 6 мкг INH в культуральную среду рост

Нами были сконструированы рекомбинантные

штамма со сверхэкспрессией araR замедлялся в

плазмиды pMV261 Ms1712p lacZ и pMV261

сравнении с контрольным штаммом дикого типа,

Ms6769p lacZ, которыми были трансформиро

тогда как в этих условиях рост мутантного штамма

ваны штаммы дикого типа и мутантный штамм

с делецией гена araR (Msm araR::hyg/pMV261)

ΔaraR. Все штаммы выращивали в среде 7H9

значительно улучшался (рис. 1, b).

при 37 °C до достижения OD₆₀₀ 0,8-1,2. Измере

ние активности β галактозидазы проводили, как

описано ранее [28].

Построение кривых роста микобактерий и изу

чение влияния антибиотиков на рост микобакте

×1

×10

×100

×1000

рий. Штаммы с рекомбинантным геном araR

выращивали в среде 7H9 при 37 °C до значений

OD₆₀₀ 1,5-1,7. Затем каждую культуру разводили

Msm/pMV261

no dgug

в 100 мл свежеприготовленной среды 7H9, со

державшей INH и L арабинозу. Исходное значе

Msm/

ние OD₆₀₀ составляло 0,1. Далее культуры инку

pMV261 araR

бировали при 37 °C и покачивании (160 об/мин).

В различные моменты времени на планшеты на

×1

×10

×100

×1000

носили последовательные разведения образцов

для определения CFU (colony forming units).

Msm/pMV261

Аликвоты отбирали в указанные моменты вре

2 μg/ml INH

мени.

Msm/

pMV261 araR

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Msm/pMV261

AraR осуществляет отрицательную модуляцию

Msm araR::hyg/pMV261

чувствительности M. smegmatis к изониазиду. Ис

Msm/pMV261 araR

пользуя стратегию, сходную с опубликованной

8,8

Msm araR::hyg/pMinD araR

ранее [29], нами был проведен скрининг библио

8,4

теки экспрессируемых регуляторных факторов

6 μg/ml INH

M. smegmatis. Эта библиотека содержит ~500 фак

8,0

торов транскрипции, каждый из которых повы

шенно экспрессируется под сильным промото

7,6

ром hsp60 [29]. Был успешно выделен фактор

7,2

транскрипции, входящий в семейство LacI и ко

дируемый геном Ms1708, и обозначен как AraR

6,8

(рис. S1 Приложения). Как показано на рис. 1, a,

штамм со сверхэкспрессией araR при помеще

Time, h

нии на планшет был более чувствителен к INH в

сравнении со штаммом дикого типа, содержа

Рис. 1. AraR опосредует чувствительность M. smegmatis к

щим пустую плазмиду pMV261 (рис. 1, a, ниж

изониазиду (INH). a - Чувствительность к INH штамма со

няя панель). Поэтому можно предположить, что

сверхэкспрессией araR. Клетки штамма со сверхэкспрес

сверхэкспрессия araR вызывает ингибирование

сией araR и штамма дикого типа разводили последователь

роста рекомбинантного штамма микобактерий

но в 10 раз с получением четырех концентраций, равные

на планшете, содержащем INH.

количества клеточной культуры помещали в ячейки план

шета 7H10 в отсутствии (верхняя панель) или в присут

Далее мы построили кривые роста микобак

ствии 2 мкг/мл INH (нижняя панель); b - определение

терий и получили подтверждение регуляторного

влияния AraR на чувствительность клеток M. smegmatis к

влияния AraR на чувствительность M. smegmatis

INH. Штаммы M. smegmatis с повышенной экспрессией araR,

к INH. Так, были впервые получены мутантный

с удаленным геном araR и его комплементарные штаммы

культивировали в среде 7H9 и определили кривые их роста.

штамм с делецией гена araR (Msm araR::hyg/

Столбики ошибок представляют собой стандартное откло

pMV261) и комплементарный ему штамм (Msm

нение (SD) при трех биологических повторах; * p

0,05

araR::hyg/pMinD araR). Как показано на рис. S2

(статистически значимые различия между рекомбинант

Приложения, в отсутствии препарата не было

ными штаммами и штаммами дикого типа)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

708

ZHOU и др.

Таким образом, эти результаты свидетель

(рис. 2, b, правая панель). В то же время не было

ствуют о том, AraR осуществляет отрицательную

обнаружено различий в росте этих двух штам

модуляцию чувствительности клеток M. smeg

мов при культивировании в отсутствии INH

matis к INH.

(рис. 2, b, левая панель).

Экспрессия araR оперона вносит вклад в ус

В целом повышенная экспрессия araR опе

тойчивость микобактерий к изониазиду. Ген аraR

рона вносит вклад в устойчивость микобактерий

локализован в вышележащем участке кластера

к INH, что прямо противоположно действию

генов Ms1708-1715 генома M. smegmatis, кото

AraR.

рый обозначается как araR оперон (рис. 2, a),

AraR специфически связывается с вышележа

кодирующий оперон арабинозы. Чтобы проана

щей последовательностью araR оперона. Обрат

лизировать регуляторный путь, с помощью ко

ный эффект регулятора AraR на его оперон

торого AraR оказывает влияние на устойчивость

предполагает, что AraR оказывает прямое регу

к INH, нами был сконструирован штамм со

лирующее действие на экспрессию araR оперо

сверхэкспрессией araR оперона кластера генов

на. Чтобы проверить это предположение, мы

(Msm/pMV261 Ms1709-1715) и проведено срав

сначала с помощью метода бактериального од

нение роста клеток этого штамма и штамма ди

ногибридного анализа изучили возможность

кого типа в присутствии и в отсутствии препара

связывания AraR с вышележащей регуляторной

та. Как показано на рис. 2, b, число колоний

последовательностью длиной 399 п.н. (Ms1712p)

штамма со сверхэкспрессией кластера генов

между Ms1712 и Ms1713. Как показано на рис. 3, a,

превышало (статистически значимые различия)

штамм, служащий в качестве положительного

число колоний штамма дикого типа в три раз

контроля, продемонстрировал активный рост,

личных момента времени (28, 32 или 36 ч) при

однако штамм, использующийся в качестве от

добавлении в культуральную среду 6 мкг INH

рицательного контроля, и самоактивирующий

Regulatory sequence (Ms1712p)

399 bp

AraR

Ms1709 Ms1710 Ms1711 Ms1712

Ms1713

Ms1714 Ms1715

Msm/pMV261

Msm/pMV261 Ms1709-1715

9,0

no dgug

6 μg/ml INH

8,5

8,0

7,5

Time, h

Рис. 2. Влияние генов araR оперона на чувствительность микобактерий к изониазиду (INH). a - Распределение araR и со

седних к нему генов в геноме M. smegmatis; b - влияние сверхэкспрессии генов araR оперона на устойчивость клеток

M. smegmatis к действию INH. Число колоний определяли в три определенных момента времени (28, 32 и 36 ч) в присут

ствии 6 мкг/мл INH и в его отсутствии. Столбики ошибок представляют разброс значений, полученных в результате трех

биологических повторов. Значения p были рассчитаны с использованием непарного двухвыборочного t критерия Стью

дента с помощью программы GraphPad Prism 5; ** p < 0,01 (статистически значимые различия между двумя группами)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

709

ся контрольный штамм, содержащий либо

арабинозного оперона. Затем мы подтвердили

AraR, либо только ДНК, не росли на среде, ис

это наблюдение in vivo на клетках M. smegmatis с

пользованной для проведения скрининга. Это

помощью метода иммунопреципитации хрома

указывает на то, что репортерная система рабо

тина (ChIP). Как показано на рис. 3, b, мишень

тает хорошо. Удивительно, но репортерный

для действия белка AraR, промотор (Ms1712p),

штамм, который содержал AraR и его ДНК ми

может специфически быть возвращена в натив

шень (Ms1712p), продемонстрировали хороший

ное состояние с помощью антител против AraR

рост на той же среде, что указывает на наличие

(левая панель, дорожка 2). Напротив, промотор

взаимодействия AraR с промотором (Ms1712p)

отрицательного контроля (Ms6769p) не может

CK+

CK-

pTRG araR/

pBX Ms1712p

Lanes

pTRG/

pBX Ms1712p

Ms1712p

pTRG araR/

pBX

Ms6769p

pTRG araR/

pBX Ms6769p

ChIP in M. smegmatis

ChIP in araR deleted strains

pTRG/

pBX Ms6769p

AraR (0,15 μM)

Unlabelled

AraR (0-0,2 μМ)

Ms6769p

Ms1712p

Ms6769p

Lanes

DNA/Protein complex

DNA substrate

Рис. 3. Определение взаимодействия между AraR и Ms1712p. a - Бактериальный одногибридный анализ. Котрансфор

манты, содержащие плазмиды pTRG araR/pBX Ms1712p, продемонстрировали хороший рост на культуральной среде, ис

пользованной для проведения скрининга. Котрансформанты, содержащие плазмиды pTRG Rv3133/pBX Rv2031p (поло

жительный контроль, СК+), также хорошо росли на этой среде, однако штамм, содержащий плазмиды pTRG/pBX, рос

плохо (отрицательный контроль, СК-); b - иммунопреципитация хроматина (ChIP) с использованием преиммунной (P)

или иммунной сыворотки (I), полученной против AraR. В качестве отрицательных контролей использовали штамм с де

лецией гена araR (правая панель) и промотор Ms6769p; c - определение сдвига электрофоретической подвижности

(EMSA). Специфическая ДНК связывающая активность AraR относительно промоторной ДНК Ms1712p наблюдалась

при инкубации Ms1712p ДНК субстрата с увеличивающимися количествами AraR (дорожки 2-4). Немеченый Ms1712p

(дорожки 8-10) конкурировал с меченым Ms1712p за связывание с белком AraR, в то время как немеченый Ms6769p кон

курировать не смог (дорожки 11-13)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

710

ZHOU и др.

быть восстановлен в таких условиях. Кроме то

CACA), локализованный в вышележащем регу

го, специфичность действия антител против

ляторном участке арабинозного оперона.

AraR была подтверждена с помощью штамма с

AraR осуществляет отрицательную регуляцию

делецией AraR (правая панель).

экспрессии арабинозного оперона. Обратный эф

Далее мы провели эксперименты по опреде

фект регуляторного белка AraR на его оперон

лению сдвига электрофоретической подвиж

означает, что AraR осуществляет отрицательную

ности (EMSA), чтобы подтвердить связывание

регуляцию экспрессии araR оперона. Чтобы

очищенного белка AraR с Ms1712p in vitro. Как

подтвердить это предположение, мы сначала

показано на рис. 3, c, при инкубации увеличива

сконструировали ряд плазмид, экспрессирую

ющихся количеств AraR (0; 0,05; 0,1; 0,2 мкM) с

щих только lacZ или промотор lacZ, и измерили

промотором мишенью в геле наблюдается уве

активность β галактозидазы. Плазмида с силь

личение количества комплексов белка и ДНК

ным промотором hsp60 была использована в ка

(дорожки 1-4). Напротив, не наблюдалось об

честве положительного контроля (CK+). Как

разования комплексов белка с ДНК в случае не

показано на рис. 5, a в сравнении с беспромо

гативного промотора Ms6769p (дорожка 6). Спе

торной плазмидой (CK-), экспрессия lacZ была

цифичность связывания AraR с Ms1712p также

сильной, что указывает на хорошую работу ре

была подтверждена с помощью конкурентного

портерной системы. Интересно, что экспрессия

метода. Удивительно, что немеченый Ms1712p

lacZ была значительно повышена в мутантном

может конкурентно ингибировать связывание

штамме M. smegmatis с делецией гена araR в

AraR с меченым Ms1712p (дорожки 8-10), в то

сравнении со штаммом дикого типа, который

время как немеченый Ms6769p не ингибировал

содержал целевой промотор (Ms1712p). Не было

взаимодействие между AraR и его промотором

выявлено значимых различий между штаммом

(Ms1712p; дорожки 11-13).

дикого типа M. smegmatis и мутантным штаммом

В целом эти результаты свидетельствуют о

с делецией гена araR, содержащим неродствен

том, что AraR может специфически связываться

ный промотор (Ms6769p). Эти результаты свиде

с вышележащим регуляторным участком араби

тельствуют в пользу того, что AraR осуществляет

нозного оперона.

отрицательную регуляцию экспрессии araR опе

AraR распознает консервативный мотив после

рона. Дальнейшие подтверждения этого вывода

довательности. Метод футпринтинга с использо

получены с помощью RT qPCR. Как показано

ванием ДНКазы I был использован для карти

на рис. 5, b, уровень экспрессии арабинозного

рования ДНК мотива, с которым связывается

оперона (Ms1707, Ms1709-1714) был значитель

AraR. Когда возрастающие количества белка

но повышен (p < 0,05) в мутантном штамме с де

AraR (0; 0,1; 0,2 мкM) инкубировали с ДНКазой I

лецией гена araR в сравнении со штаммом дико

и ДНК субстратами (Ms1712p), два участка, со

го типа.

держащие последовательности GAATGTTAAC

В целом AraR функционирует в качестве инги

GATCACATCT и TTCTGTGAGCGTTAACATCA,

битора и осуществляет отрицательную регуляцию

эффективно защищались белком AraR (рис. 4, a).

экспрессии арабинозного оперона у M. smegmatis.

Защищенные участки ДНК включали области

L Арабиноза ингибирует активность AraR. AraR

-270…-289 и -125…-144 в цепи ДНК (рис. 4, b).

регулирует экспрессию генов, ассоциированных

Удивительно, но два связывающих участка со

с метаболизмом арабинозы, что подразумевает

держали обратную комплементарную последо

способность AraR к ответу на сигнал, опосредо

вательность (ATGTTAACGCTCACA и TGTGA

ванный арабинозой. Для проверки этого пред

GCGTTAACAT). Это указывает на то, что AraR

положения нами методом EMSA была изучена

распознает специфически повторяющийся мо

возможность L арабинозы оказывать влияние

тив последовательности в разных цепях ДНК.

на ДНК связывающую активность AraR. Как

Дальнейшие исследования методом EMSA

показано на рис. 6, a, при добавлении возраста

подтверждают значимость этого мотива для спе

ющих количеств L арабинозы (0, 1, 2 и 4 мМ) в

цифического распознавания белком AraR. Как

реакционные смеси при проведении EMSA от

показано на рис. 4, c, AraR не может связывать

четливо наблюдается соответствующее сниже

ся с укороченными фрагментами ДНК, в кото

ние количества сместившихся ДНК субстратов

рых отсутствуют обратные комплементарные

(дорожки 6-8), что указывает на то, что L ара

мотивы последовательности (дорожки 5-8 и

биноза может ингибировать ДНК связываю

17-20). Напротив, AraR может связываться с

щую активность AraR. В то же время не наблю

укороченными фрагментами ДНК, которые со

далось изменений в количестве сместившихся

держат эти мотивы (дорожки 9-16 и 21-24).

ДНК субстратов (дорожки 10-12), когда в ка

В целом AraR может распознавать повторяю

честве потенциально эффективной молекулы

щийся мотив длиной 15 п.н. (ATGTTAACGCT

использовалась D ксилоза.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

711

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

2000

1000

AraR (0 μM)

2000

1000

AraR (0,1 μM)

2000

AraR (0,2 μM)

1000

Ms1712 start codon

Ms1713 start codon

100

200

300

399

Ms1712

S1 100 bp

S2 100 bp

S3 100 bp

S4 100 bp

S5 200 bp

Ms1712p

DNA substrates

AraR (0-0,2 μM)

Lanes 1

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

DNA/Protein

complex

DNA substrate

Рис. 4. Определение связывающего мотива последовательности для AraR внутри вышележащего участка оперона. а - Экс

перименты по футпринтингу с ДНКазой I. Определяли степень защиты промотора Ms1712 от расщепления ДНКазой с

помощью увеличивающихся количеств AraR (0-0,2 мкМ). Защищенные участки выделены красными рамками; b - харак

теристика последовательности и структуры защищаемого участка ДНК. Стартовый трансляционный кодон Ms1712 выде

лен жирным шрифтом; c - определение ДНК связывающей активности AraR по отношению к ДНК субстратам по сдвигу

электрофоретической подвижности (EMSA) в присутствии или отсутствии мотива.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: www.elibrary.ru

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

713

AraR (0,15 μМ)

AraR (0-0,15 μM)

L AraR (0-4 mM) D Xyl (0-4 mM)

Lanes

DNA/Protein complex

DNA substrate

Reporter cassette

β galactosidase activity

(Miller Unit)

Msm/WT

Msm/WT + 10 mM L Ara

Msm/WT + 10 mM D Xyl

828,7 ± 33,6

816,3 ± 109,0

793,9 ± 84,9

15,8 ± 3,0

19,4 ± 0,8

11,3 ± 2,2

218,3 ± 2,7

387,7 ± 10,7

226,6 ± 4,4

18,9 ± 1,4

22,6 ± 1,9

8,4 ± 1,8

200

400

600

800

1000

Expression level in Msm/pMV261

Expression level in Msm/pMV261 araR

Expression level in Msm/pMV261 araR + 10 mM L Ara

300

250

200

150

2,0

1,5

1,0

0,5

Рис. 6. Влияние L арабинозы на ДНК связывающую активность и регуляцию AraR. а - Определение сдвига электрофо

ретической подвижности (EMSA). FITC меченный Ms1712p инкубировали с AraR (0,15 мкM) в присутствии L арабино

зы (L Ara; 0-4 мM; дорожки 5-8) или D ксилозы (D Xyl; дорожки 9-12). Свободный ДНК субстрат и комплекс

«ДНК-белок» обозначены в правой части; b - определение активности β галактозидазы в присутствии 10 мМ L Ara или

D Xyl. В качестве положительного контроля использовали hsp60 lacZ, в качестве отрицательных контролей - нулевой

промотор lacZ и Ms6769p lacZ. Для штамма дикого типа и штамма с делецией гена araR была определена активность β га

лактозидазы, которая приведена в виде единиц Миллера (правая панель). Столбики ошибок представляют разброс значе

ний, полученных в результате трех биологических повторов; ** p

0,01 (статистически значимые различия между двумя

группами); с - результаты RT qPCR. Штамм со сверхэкспрессией гена аraR выращивали в среде 7H9 в присутствии 10 мМ

L Ara. Уровни экспрессии генов нормализовали против гена sigA как инвариантного транскрипта. Столбики ошибок

представляют разброс значений, полученных в результате трех биологических повторов. ** p < 0,05 (статистически значи

мые различия между двумя группами)

8 БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

714

ZHOU и др.

Далее нами были получено подтверждение

Таким образом, L арабиноза может высту

ингибирования L арабинозой активности AraR

пать в качестве эффективного ингибитора ак

с использованием метода определения актив

тивности фактора транскрипции AraR.

ности β галактозидазы. Как показано на рис. 6, b,

L Арабиноза нейтрализует отрицательную ре

рекомбинантные штаммы, содержащие плазми

гуляцию фактором транскрипции AraR чувстви

ды, экспрессирующие только lacZ или совмест

тельности микобактерий к изониазиду. AraR осу

но промотор и lacZ, культивировались в трех

ществляет отрицательную модуляцию чувстви

различных средах в присутствии и в отсутствии

тельности клеток M. smegmatis к INH, а L араби

L арабинозы. Следует обратить внимание, что

ноза ингибирует активность AraR, что предпо

при культивировании клеток в среде с 10 мМ

лагает способность L арабинозы к нейтрализа

L арабинозой экспрессия lacZ была значитель

ции регуляторой роли AraR в устойчивости к

но повышена в штамме дикого типа, но не в му

INH. Как показано на рис. 7, a, при добавлении

тантном штамме с удаленным геном araR (рис. S3

INH штамм дикого типа растет лучше (статисти

Приложения). При росте в среде с добавлением

чески значимые различия) в присутствии 10 мM

10 мM D ксилозы изменений не наблюдалось

L арабинозы, чем в присутствии D ксилозы. В то

(рис. 6, b). Эти результаты свидетельствуют о

же время не было обнаружено заметных разли

том, что арабиноза специфически ингибирует

чий в росте мутантного штамма с делецией гена

активность AraR.

araR в присутствии или в отсутствии L арабино

Этот вывод далее был подтвержден с помощью

зы при добавлении INH (рис. 7, b).

метода RT qPCR. Как показано на рис. 6, c, уро

Эти результаты означают, что L арабиноза мо

вень экспрессии генов araR оперона был значи

жет нейтрализовать отрицательную регуляцию фак

тельно снижен у Msm/pMV261 araR в сравне

тором транскрипции AraR чувствительности мико

нии с Msm/pMV261. Однако снижение экспрес

бактерий к INH, что согласуется с нашей моделью.

сии генов мишеней у Msm/pMV261 araR возвра

щалось в норму, когда в культуральную среду до

бавляли 10 мМ L арабинозу. Эти результаты

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

указывают на то, что арабиноза может нейтра

лизовать ингибиторную активность AraR. Напро

L Арабиноза является важным компонентом

тив, D ксилоза не проявляет такой регулятор

клеточной стенки микобактерий, вовлеченным

ной роли в тех же условиях.

в синтез AG и LAM [17, 30]. Однако до сих пор

Msm/pMV261

Msm araR::hyg/pMV261

Msm/pMV261 + 10 mМ L Ara

Msm araR::hyg/pMV261 + 10 mМ L Ara

Msm/pMV261 + 10 mМ D Xyl

Msm araR::hyg/pMV261 + 10 mМ D Xyl

8,5

6 μg/mI INH

8,0

7,5

Time, h

Рис. 7. Влияние L арабинозы на чувствительность M. smegmatis к изониазиду (INH). Штамм дикого типа (a) и штамм с де

лецией гена araR (b) выращивали на среде 7H9 с добавлением 6 мкг/мл INH в присутствии 10 мМ L арабинозы (L Ara)

или D ксилозы (D Xyl). Число колоний определяли в три момента времени (16, 20 и 24 ч). Столбики ошибок представля

ют разброс значений, полученных в результате трех биологических повторов. ** p < 0,01 (статистически значимые разли

чия между двумя группами); ns - отсутствие статистически значимых различий между двумя группами

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

715

неясно, способна ли L арабиноза действовать в

Другим интересным результатом данной ра

качестве эффективной молекулы, и может ли

боты является тот факт, что запускаемый араби

запускаемая сахарами регуляция оказывать вли

нозой механизм регуляции связан с формирова

яние на лекарственную устойчивость микобак

нием устойчивости микобактерий к действию

терий. В настоящей работе нами был охаракте

антибиотиков. Как важный компонент клеточ

ризован белок AraR как новый отвечающий на

ной стенки, L арабиноза участвует в процессе

L арабинозу фактор транскрипции в клетках

синтеза AG и LAM, что может влиять на прони

M. smegmatis. L Арабиноза может действовать в

цаемость клеточной мембраны у микобактерий.

качестве эффективной молекулы, способной

В настоящей работе нами было показано, что

отменять подавление ингибирования фактором

L арабиноза может целенаправленно оказывать

транскрипции AraR экспрессии арабинозного

воздействие на активность AraR и далее регули

оперона, принимающего участие в регуляции

ровать экспрессию кластера генов транспорта

чувствительности микобактерий к INH. Полу

ABC (Ms1709-1712), который включает в себя

ченные в настоящей работе результаты предос

гены, ассоциированные с транспортом и мета

тавляют новую информацию, необходимую для

болизмом L арабинозы. AraR функционирует

понимания взаимосвязей между запускаемым

как репрессор транскрипции и осуществляет от

арабинозой механизмом регуляции и формиро

рицательную регуляцию экспрессии оперона.

ванием у микобактерий устойчивости к действию

Удивительно, что L арабиноза способна подав

антибиотиков.

лять транскрипционное ингибирование AraR.

В последние годы во многих работах было

У Corynebacterium glutamicum AraR также действу

показано, что сахара могут служить в качестве

ет как репрессор транскрипции генов araBDA,

сигнальных молекул, участвующих в регуляции

araE и galM araR, а L арабиноза снижает ДНК

внутриклеточного метаболизма у различных ви

связывающую активность AraR [34]. Эти резуль

дов бактерий. Например, в случае штамма E. coli

таты согласуются с нашими экспериментальны

O157:H7 в качестве сигнальной молекулы, участ

ми данными. Кроме того, полученные нами ре

вующей в процессе регуляции luxS ассоци

зультаты также показывают, что регуляция в ря

ированной экспрессии генов и влияющей на ви

ду «арабиноза - AraR - арабинозный оперон»

рулентность бактерий, выступает глюкоза [31].

связана с формированием устойчивости мико

У Bacillus subtilis и Caulobacter crescentus опосре

бактерий к действию антибиотиков. До сих пор

дованный ксилозой сигнал может регулировать

о подобных результатах для других бактерий не

экспрессию многих генов через направленное

сообщалось.

воздействие на фактор транскрипции XylR [32, 33].

Изониазид - один из препаратов первой ли

Интересно, что L арабиноза может также высту

нии при лечении туберкулеза. Фактически он

пать в качестве сигнальной молекулы, осущест

является предшественником лекарственного

вляющей положительную регуляцию экспрес

средства, активируемым пероксидазой KatG.

сии генов метаболизма и транспорта L арабино

В результате активации образуется комплекс

зы у Corynebacterium glutamicum, E. сoli и Bacillus

«INH-NAD», который ингибирует InhA, еноил

subtilis [19, 34, 35]. В то же время имеется лишь

ACP редуктазу системы синтазы жирных кислот

небольшое количество работ, посвященных

II типа. Это приводит к ингибированию био

функциям простых сахаров как сигнальных мо

синтеза миколовой кислоты в клеточной стенке

лекул в клетках микобактерий, и возможные

и к гибели бактериальной клетки [37]. К настоя

сигнальные пути до сих пор не охарактеризова

щему времени предложено несколько основных

ны. Несмотря на предположение о действии

механизмов устойчивости микобактерий к дейст

AraR в качестве вероятного отрицательного ре

вию INH [38]. Например, было показано, что

гулятора арабинозного оперона у M. smegmatis [36],

мутации в генах katG и inhA ассоциированы с

необходимы дополнительные эксперименталь

устойчивостью к INH [39, 40]. Оперон iniBAC

ные доказательства того, действительно ли AraR

кодирует у микобактерий гены, ассоциирован

напрямую осуществляет регуляцию соответ

ные с выкачивающим насосом, и обеспечивает

ствующих генов и ответ на L арабинозу. В насто

их устойчивость к INH [41]. Он также имеет от

ящей работе был выявлен новый фактор транс

ношение к инактивации цитохрома P450, что

крипции AraR, который в клетках M. smegmatis

приводит к возникновению устойчивости к

отвечает на опосредованный L арабинозой сиг

действию INH [42, 43]. Однако в настоящей ра

нал и осуществляет отрицательную регуляцию

боте не было обнаружено различий в уровне

экспрессии арабинозного оперона. Это первая

экспрессии генов, таких как katG, inhA, iniBAC, и

работа, в которой продемонстрирована роль

цитохрома P450 у штамма со сверхэкспрессией

L арабинозы в качестве сигнальной молекулы у

гена araR и штамма дикого типа (рис. S4 Прило

микобактерий.

жения). На этом основании можно предполо

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

716

ZHOU и др.

жить, что AraR осуществляет отрицательную ре

механизма возникновения устойчивости к анти

гуляцию устойчивости клеток M. smegmatis к

биотикам у микобактерий.

INH без участия описанных выше механизмов.

Таким образом, результаты нашей работы могут

Финансирование. Работа выполнена при под

способствовать пониманию механизма форми

держке Национальной R&D программы Китая

рования устойчивости к антибиотикам у мико

(National Key R&D Program of China;

бактерий.

2017YFD0500300), Национального фонда естест

В целом полученные нами данные свиде

венных наук Китая (National Natural Science

тельствуют в пользу модели, согласно которой

Foundation of China;

31730005,

31670075 и

AraR в ответ на сигнал L арабинозы способству

31870036) и Программы стажировок Chang Jiang

ет экспрессии арабинозного оперона и синтезу

(Chang Jiang Scholars Program; предоставлена

компонентов клеточной стенки, таких как AG и

Z. G. He).

LAM [17, 30], вызывая тем самым изменения

Вклад авторов. W. Li спланировал и коорди

проницаемости клеточной стенки. В конечном

нировал выполнение работы; L. Zhou и W. Li

итоге, все это влияет на устойчивость бактерий к

проводили эксперименты. Все авторы внесли

изониазиду. Очевидно, что в будущем необходи

вклад в интерпретацию результатов и формули

мо провести дополнительные исследования для

ровку выводов. W. Li, Z. G. He и L. Zhou интер

выявления механизма, лежащего в основе регу

претировали результаты и написали текст статьи.

ляции формирования устойчивости к действию

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

антибиотиков, запускаемой арабинозой. Тем не

сутствии конфликта интересов.

менее полученные в настоящей работе результа

Соблюдение этических норм. Настоящая статья

ты могут быть использованы в дальнейших ра

не содержит описания выполненных авторами

ботах, направленных на изучение запускаемого

исследований с участием людей или использо

арабинозой процесса регуляции и выявление

ванием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. World Health Organization (WHO) (2017) Global tuber

and Biqi, F. (2013) Virulence factors of the Mycobacterium

culosis report 2017, World Health Organization, Geneva,

tuberculosis complex, Virulence, 4, 3-66.

p. 1.

11. Jiang, T., Cai, L., Zhao, X., He, L., Ma, Y., Zang, S.,

2. Fonseca, J.D., Knight, G.M., and McHugh, T.D. (2015)

Zhang, C., Li, X., and Xin, Y. (2014) Functional identifi

The complex evolution of antibiotic resistance in

cation of MSMEG_6402 protein from Mycobacterium

Mycobacterium tuberculosis, Int. J. Infect. Dis., 32, 94-100.

smegmatis in decaprenylphosphoryl D arabinose biosyn

3. Nguyen, L. (2016) Antibiotic resistance mechanisms in

thesis, Microb. Pathog., 76, 44-50.

M. tuberculosis: an update, Arch. Toxicol., 90, 1585-1604.

12. Andriole, V.T. (2005) The quinolones: past, present, and

4. Li, X.Z., Zhang, L., and Nikaido, H. (2004) Efflux pump

future, Clin. Infect. Dis., 15, 113-119.

mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smeg

13. Vetting, M.W., Hegde, S.S., Fajardo, J.E., Fiser, A.,

matis, Antimicrob. Agents. Chemother., 48, 2415-2423.

Roderick, S.L., Takiff, H.E., and Blanchard, J.S. (2006)

5. De Rossi, E., Ainsa, J.A., and Riccardi, G. (2006) Role of

Pentapeptide repeat proteins, Biochemistry, 45, 1-10.

mycobacterial efflux transporters in drug resistance, FEMS

14. Warrier, T., Kapilashrami, K., Argyrou, A., Ioerger, T.R.,

Microbiol., 30, 36-52.

Little, D., Murphy, K.C., Nandakumar, M., Park, S.,

6. Louw, G.E., Warren, R.M., Gey van Pittius, N.C.,

Gold, B., Mi, J., Zhang, T., Meiler, E., Rees, M.,

McEvoy, C.R., Van Helden, P.D., and Victor, T.C. (2009)

Somersan Karakaya, S., Porras De Francisco, E., Mar

A balancing act: efflux/influx in mycobacterial drug resis

tinez Hoyos, M., Burns Huang, K., Roberts, J., Ling, Y.,

tance, Antimicrob. Agents. Chemother., 53, 3181-3189.

Rhee, K.Y., Mendoza Losana, A., Luo, M., and Nathan, C.F.

7. Barry, C.E., and Mdluli, K. (1996) Drug sensitivity and

(2016) N methylation of a bactericidal compound as a

environmental adaptation of mycobacterial cell wall com

resistance mechanism in Mycobacterium tuberculosis, Proc.

ponents, Trends Microbiol., 4, 275-281.

Natl. Acad. Sci. USA, 113, 4523-4530.

8. Ojha, A.K., Baughn, A.D., Sambandan, D., Hsu, T.,

15. Johnson, R., Streicher, E.M., Louw, G.E., Warren, R.M.,

Trivelli, X., Guerardel, Y., Alahari, A., Kremer, L., Ja

van Helden, P.D., and Victor, T.C. (2006) Drug resistance

cobs, W.R., Jr., and Hatfull, G.F. (2008) Growth of

in Mycobacterium tuberculosis, Curr. Issues Mol. Biol., 8, 97.

Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic

16. Belanger, A.E., Besra, G.S., Ford, M.E., Mikusova, K.,

acids and harbouring drug tolerant bacteria, Mol.

Belisle, J.T., Brennan, P.J., and Inamine, J.M. (1996)

Microbiol., 69, 164-174.

The embAB genes of Mycobacterium avium encode an

9. Singh, A., Jain, S., Gupta, S., Das, T., and Tyagi, A.K.

arabinosyl transferase involved in cell wall arabinan

(2003) mymA operon of Mycobacterium tuberculosis: its

biosynthesis that is the target for the antimycobacte

regulation and importance in the cell envelope, FEMS

rial drug ethambutol, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,

Microbiol. Lett., 227, 53-63.

11919-11924.

10. Forrellad, M.A., Klepp, L.I., Gioffre, A., Sabio Garcia, J.,

17. Bhat, Z.S., Rather, M.A., Maqbool, M., Lah, H.U.,

Morbidoni, H.R., de la Paz Santangelo, M., Cataldi, A.A.,

Yousuf, S.K., and Ahmad, Z. (2017) Cell wall: a versatile

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

AraR РЕГУЛИРУЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

717

fountain of drug targets in Mycobacterium tuberculosis,

virulence gene expression of Escherichia coli O157:H7,

Biomed. Pharmacother., 95, 1520-1534.

J. Food. Prot., 75, 748.

18.

Sa Nogueira, I., and Mota, L.J. (1997) Negative regula

32.

Gartner, D., Degenkolb, J., Ripperger, J.A., Allmans

tion of L arabinose metabolism in Bacillus subtilis: charac

berger, R., and Hillen, W. (1992) Regulation of the Bacillus

terization of the araR (araC) gene, J. Bacteriol., 179,

subtilis W23 xylose utilization operon: interaction of the

1598-1608.

Xyl repressor with the xyl operator and the inducer xylose,

19.

Schleif, R. (2000) Regulation of the L arabinose operon of

Mol. Gen. Genet., 232, 415-422.

Escherichia coli, Trends. Genet., 16, 559-565.

33.

Stephens, C., Christen, B., Watanabe, K., Fuchs, T., and

20.

Sharma, K., Gupta, M., Pathak, M., Gupta, N., Koul, A.,

Jenal, U. (2007) Regulation of D xylose metabolism in

Sarangi, S., Baweja, R., and Singh, Y. (2006) Transcrip

Caulobacter crescentus by a LacI type repressor, J. Bacte

tional control of the mycobacterial embCAB operon by

riol., 189, 8828-8834.

PknH through a regulatory protein, EmbR, in vivo, J. Bac

34.

Kuge, T., Teramoto, H., Yukawa, H., and Inui, M. (2014)

teriol., 188, 2936-2944.

The LacI type transcriptional regulator AraR acts as an

21.

Li, W., and He, Z.G. (2012) LtmA, a novel cyclic di

L arabinose responsive repressor of L arabinose utiliza

GMP responsive activator, broadly regulates the expres

tion genes in Corynebacterium glutamicum ATCC 31831,

sion of lipid transport and metabolism genes in

J. Bacteriol., 196, 2242-2254.

Mycobacterium smegmatis, Nucleic Acids Res.,

40,

35.

Mota, L.J., Tavares, P., and Sa Nogueira, I. (1999) Mode

11292-11307.

of action of AraR, the key regulator of L arabinose metabo

22.

Wang, Y., Huang, Y., Xue, C., He, Y., and He, Z.G. (2011)

lism in Bacillus subtilis, Mol. Microbiol., 33, 476-489.

A ClpR like regulator specifically recognizes a RecA inde

36.

Takata, G., Poonperm, W., Rao, D., Souda, A., Nishizaki, T.,

pendent promoter motif and broadly regulates expression

Morimoto, K., and Izumori, K. (2007) Cloning, expres

of DNA damage inducible genes in mycobacteria, J. Biol.

sion, and transcription analysis of L arabinose isomerase

Chem., 286, 31159-31167.

gene from Mycobacterium smegmatis SMDU, Biosci. Bio

23.

Guo, M., Feng, H., Zhang, J., Wang, W., Wang, Y., Li, Y.,

technol. Biochem., 71, 2876-2885.

Gao, C., Chen, H., Feng, Y., and He, Z.G. (2009)

37.

Vilcheze, C., and Jacobs, W.R., Jr. (2007) The mechanism

Dissecting transcription regulatory pathways through a new

of isoniazid killing: clarity through the scope of genetics,

bacterial one hybrid reporter system, Genome Res., 19,

Annu. Rev. Microbiol., 61, 35-50.

1301-1308.

38.

Hazbon, M.H., Brimacombe, M., Bobadilla, del Valle, M.,

24.

Frank, S.R., Schroeder, M., Fernandez, P., Taubert, S.,

Cavatore, M., Guerrero, M.I., Varma Basil, M., Billman

and Amati, B. (2001) Binding of c Myc to chromatin

Jacobe, H., Lavender, C., Fyfe, J., Garcia Garcia, L.,

mediates mitogen induced acetylation of histone H4 and

Leon, C.I., Bose, M., Chaves, F., Murray, M., Eisenach, K.D.,

gene activation, Genes Dev., 15, 2069-2082.

Sifuentes Osornio, J., Cave, M.D., Ponce, de Leon, A.,

25.

Li, W., Li, M., Hu, L., Zhu, J., Xie, Z., Chen, J., and

and Alland, D. (2006) Population genetics study of isoni

He, Z.G. (2018) HpoR, a novel c di GMP effective trans

azid resistance mutations and evolution of multidrug resis

cription factor, links the second messenger’s regulatory

tant Mycobacterium tuberculosis, Antimicrob. Agents Chemo

function to the mycobacterial antioxidant defense, Nucleic

ther., 50, 2640-2649.

Acids Res., 46, 3595-3611.

39.

Zhang, Y., Heym, B., Allen, B., Young, D., and Cole, S.T.

26.

Moker, N., Brocker, M., Schaffer, S., Kramer, R.,

(1992) The catalase peroxidase gene and isoniazid resis

Morbach, S., and Bott, M. (2004) Deletion of the genes

tance of Mycobacterium tuberculosis, Nature, 358, 591-593.

encoding the MtrA MtrB two component system of

40.

Banerjee, A., Dubnau, E., Quemard, A., Balasubrama

Corynebacterium glutamicum has a strong influence on cell

nian, V., Um, K.S., Wilson, T., Collins, D., de Lisle, G.,

morphology, antibiotics susceptibility and expression of

and Jacobs, W.R., Jr. (1994) inhA, a gene encoding a target

genes involved in osmoprotection, Mol. Microbiol., 54,

for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculo

420-438.

sis, Science, 263, 227-230.

27.

Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001) Analysis of rela

41.

Colangeli, R., Helb, D., Sridharan, S., Sun, J., Varma

tive gene expression data using real time quantitative PCR

Basil, M., Hazbon, M.H., Harbacheuski, R., Megjugorac, N.J.,

and the 2-ΔΔCT, Methods, 25, 402-408.

Jacobs, W.R., Jr, Holzenburg, A., Sacchettini, J.C., and

28.

Stover, C.K., de la Cruz, V.F., Fuerst, T.R., Burlein, J.E.,

Alland, D. (2005) The Mycobacterium tuberculosis iniA

Benson, L.A., Bennett, L.T., Bansal, G.P., Young, J.F.,

gene is essential for activity of an efflux pump that confers

Lee, M.H., and Hatfull, G.F. (1991) New use of BCG for

drug tolerance to both isoniazid and ethambutol, Mol.

recombinant vaccines, Nature, 351, 456-460.

Microbiol., 55, 1829-1840.

29.

Rao, M., Liu, H., Yang, M., Zhao, C., and He, Z.G.

42.

Magliozzo, R.S., and Marcinkevicience, J.A.

(1996)

(2012) A copper responsive global repressor regulates

Evidence for isoniazid oxidation by oxyferrous mycobacte

expression of diverse membrane associated transporters

rial catalase peroxidase, J. Am. Chem. Soc.,

118,

and bacterial drug resistance in mycobacteria, J. Biol.

11303-11304.

Chem., 287, 39721-39731.

43.

Wengenack, N.L., Lopes, H., Kennedy, M.J., Tavares, P.,

30.

Brennan, P.J. (2003) Structure, function, and biogenesis of

Pereira, A.S., Moura, I., Moura, J.J., and Rusnak, F.

the cell wall of Mycobacterium tuberculosis, Tuberculosis

(2000) Redox potential measurements of the Mycobacterium

(Edinb), 83, 91-97.

tuberculosis heme protein KatG and the isoniazid resistant

31.

Delcenserie, V., Lapointe, G., Charaslertrangsi, T.,

enzyme KatG (S315T): insights into isoniazid activation,

Rabalski, A., and Griffiths, M.W. (2012) Glucose decreases

Biochemistry, 39, 11508-11513.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019

718

ZHOU и др.

AraR, an L ARABINOSE RESPONDING

TRANSCRIPTION FACTOR, NEGATIVELY

REGULATES THE ISONIAZID RESISTANCE

OF Mycobacterium smegmatis

L. Zhou¹, Z. G. He¹, and W. Li^1,2*

¹ National Key Laboratory of Agricultural Microbiology,

College of Life Science and Technology, Huazhong

Agricultural University, Wuhan 430070, China;

E mail: lwhlbx@163.com

² State Key Laboratory for Conservation and Utilization

of Subtropical Agro bioresources, College of Life Science

and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China

Received September 9, 2018

Revised January 6, 2019

Accepted January 24, 2019

L Arabinose is an important component of mycobacterial cell wall. It participates in synthesis of arabinogalactan and

arabinose, mannose, and other sugars, which has a potential important influence on bacterial cell wall permeability

and drug resistance. However, it remains unclear, whether L arabinose can effectively modulate the mycobacterial

antibiotic resistance, and what is the underlying regulatory mechanism. In this study, we characterized a new transcrip

tion factor AraR in Mycobacterium smegmatis, which responds to L arabinose and regulates the mycobacterial isoni

azid (INH) sensitivity. AraR was shown to specifically recognize two conserved 15 bp motifs within upstream regula

tory region of an arabinose operon, designated as araR operon. AraR functions as a transcriptional repressor and nega

tively regulates expression of the operon. In contrast to the effect of AraR, the overexpression of araR operon con

tributes to the mycobacterial INH resistance. Strikingly, L arabinose can act as an effective molecule and reverse the

transcriptional inhibition caused by AraR. The araR knockout strain was more resistant to INH than wildtype strain,

whereas the araR overexpressing strain was more sensitive to the drug. Addition of L arabinose in culture medium can

significantly enhance the INH resistance of the wildtype strain but not the araR knockout strain. Therefore, our study

identified a new L arabinose responding transcription factor and elucidated its role in regulation of bacterial antibiotic

resistance. These findings provide clues for further understanding of the regulatory role of sugar molecules in relation

with drug resistance in mycobacteria.

Keywords: AraR, mycobacteria, L arabinose, antibiotic resistance

БИОХИМИЯ том 84 вып. 5 2019