БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 7, с. 912 - 922

УДК 57.085.23

ТЕСТ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ PD 1 И PD L1,

ОСНОВАННАЯ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ

АНТИ CD3/АНТИ TAA АНТИТЕЛ

М.Ю. Пучкова^1,2, В.М. Екимова¹, Ю.И. Басовский^1,2, В.В. Соловьев^1,2*

¹ BIOCAD, 142380 Любучаны, Россия;

электронная почта: solovyevvv@biocad.ru

² Пущинский государственный естественно'научный институт,

142290 Пущино, Россия

Поступила в редакцию 22.02.2019

После доработки 17.04.2019

Принята к публикации 18.04.2019

Использование ингибиторов взаимодействия PD 1/PD L1 называют революцией в терапии онкологичес

ких заболеваний. На 2018 год более 100 антител против PD 1 и PD L1 находятся на различных этапах раз

работки, зарегистрированы более 2000 клинических исследований с их применением. Характеризация та

ких антител требует использования тест системы, позволяющей определять их биологическую активность.

Работа посвящена созданию клеточного теста для анализа активности антител против PD 1 и PD L1. Мы

рассмотрели и сравнили несколько подходов для создания репортерной системы на основе двух клеточных

линий с использованием суперантигенов, растворимых анти CD3 антител, трансмембранных анти CD3

антител, химерных антигенных рецепторов (CAR) и биспецифических анти CD3/анти TAA антител. По ре

зультатам экспериментов было предложено использовать систему на основе биспецифических анти

CD3/анти TAA антител, имеющую преимущества перед другими исследованными подходами. Тест систе

ма была охарактеризована, а также показана возможность ее использования для тестирования препаратов

антител против PD 1 и PD L1. Предложенная система может быть полезной при разработке новых терапев

тических агентов и способов их тестирования.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: функциональный клеточный тест, PD 1, PD L1, анти CD3/анти TAA.

DOI: 10.1134/S0320972519070030

Рецептор запрограммированной клеточной

сигнальные каскады, на которые он влияет, но

смерти 1 (PD 1) - белок, присутствующий пре

последовательность молекулярных взаимодей

имущественно на активированных T лимфоци

ствий, определяющих его активность, четко не

тах. Взаимодействие PD 1⁺ лимфоцитов с клет

определена [4, 5]. Такой механизм ингибирова

ками, несущими его природные лиганды PD L1

ния иммунного ответа служит защитой от чрез

или PD L2 (лиганды рецептора запрограммиро

мерной активации Т лимфоцитов и развития

ванной клеточной смерти 1 и 2), блокирует ак

аутоиммунных реакций, но в то же время может

тивацию лимфоцитов [1, 2]. Это происходит

препятствовать развитию иммунного ответа на

вследствие образования комплекса PD 1 со сво

опухолевые клетки [6].

им лигандом, что вызывает ингибирование

Блокирование взаимодействия PD 1/PD L1,

CD3 зависимой активации Т клетки [3]. Извест

но не PD 1/PD L2 с целью отмены негативной

ны белки, с которыми взаимодействует PD 1, и

иммунной регуляции является одной из наибо

Принятые сокращения: PD 1 - рецептор запрограммированной клеточной смерти 1; PD L1 и PD L2 - лиганды

рецептора запрограммированной клеточной смерти 1; TCR - T клеточный рецептор; FLuc - люцифераза светлячка;

IL 2 - интерлейкин 2; NFAT - ядерный фактор активированных T лимфоцитов; scFv - одноцепочечный вариабельный

фрагмент; GFP - зеленый флуоресцентный белок; tmaCD3 - трансмембранные антитела против CD3; CTLA4 - цитоток

сический Т лимфоцит ассоциированный белок 4; HER2 - рецептор эпидермального фактора роста человека 2; NF κB -

ядерный фактор энхансера легкой цепи активированных B лимфоцитов; MHC - главный комплекс гистосовместимос

ти; CAR - химерный антигенный рецептор; CAR T - Т клетки, презентирующие химерные антигенные рецепторы;

TAA - опухоль ассоциированный антиген человека 1; SEB - стафилококковый энтеротоксин Б; NFAT TRE - тран

скрипционный регуляторный элемент NFAT; EC50 - полуэффективная концентрация.

* Адресат для корреспонденции.

912

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ PD 1/PD L1

913

лее успешных стратегий борьбы с рядом онко

контаминации микоплазмами набором VenorTM

логических заболеваний [6-9]. За открытие и

GeM Mycoplasma Detection Kit, PCR based

исследование рецептора PD 1 в

2018 году

(«Sigma Aldrich», США).

японский ученый T. Honjo стал лауреатом Нобе

Создание генетических конструкций. Плазмид

левском премии по физиологии или медицине

ный вектор pOGI_NFAT FLuc создан на основе

за «открытие терапии онкологических заболева

вектора pOGI («BIOCAD», Россия), он содержит

ний путем ингибирования негативной иммун

ген, кодирующий люциферазу светляка Photinus

ной регуляции» [1, 8, 10]. В 2014 году были заре

pyralis (FLuc), под контролем минимального

гистрированы первые терапевтические антитела

промотора интерлейкина 2 (IL 2), содержащего

против PD 1, в 2016 - против PD L1 [11]. К кон

3 копии последовательностей, связывающих

цу 2018 года зарегистрировано >2000 клиничес

ядерный фактор активированных T лимфоци

ких исследований препаратов, блокирующих

тов (NFAT), а также экспрессионную кассету с

взаимодействие PD 1/PD L1 [12].

геном устойчивости к гигромицину [14, 15].

Для характеризации терапевтических препа

Плазмидные вектора pSX_tmaCD3, pSX_PD 1

ратов необходим метод определения их биоло

и pSX_PD L1 созданы на основе вектора pSX

гической активности. Такой метод, в идеале,

(«BIOCAD», Россия). pSX_tmaCD3 содержит

должен отражать механизм действия и позво

ген, кодирующий антитело OKT3 в формате од

лять количественно сравнивать препараты меж

ноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv),

ду собой [13]. Известные на сегодня подходы

слитое с трансмембранным доменом рецептора

либо ограничены патентами, либо основаны на

тромбоцитарного фактора роста, под контролем

использовании первичных клеток человека, что

цитомегаловирусного (CMV) промотора, а так

делает их неудобными и плохо воспроизводи

же экспрессионную кассету с геном устойчивос

мыми. Поэтому целью данной работы стала раз

ти к пуромицину. pSX_PD 1 содержит ген, ко

работка оригинальной системы тестирования

дирующий PD 1 человека, под контролем CMV

антител к PD 1 и PD L1, лишенной указанных

промотора, а также экспрессионную кассету с

недостатков.

геном устойчивости к генетицину (неомицину).

pSX_PD L1 содержит ген, кодирующий PD L1

человека, под контролем CMV промотора, а так

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

же экспрессионную кассету с геном устойчивос

ти к генетицину (неомицину).

Материалы. В работе использовали реакти

Создание стабильных клеточных линий. Кле

вы: среды DMEM/F12 и RPMI 1640 («ПанЭко»,

точную линию Jurkat NFAT FLuc создали путем

Россия); инактивированная эмбриональная

электропорации клеток Jurkat вектором pOGI_

бычья сыворотка («Gibco», США); классиче

NFAT FLuc с последующей селекцией клеток на

ские моноклональные антитела против PD 1 че

гигромицине Б. Из них отобрали резистентные

ловека (aPD 1), PD L1 человека (aPD L1), ци

клоны, показавшие максимальное увеличение

тотоксического Т лимфоцит ассоциированного

экспрессии люциферазы при добавлении aCD3.

белка 4 (CTLA4) человека (aCTLA4), рецептора

Клеточную линию Jurkat NFAT FLuc PD 1

эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)

создали электропорацией клеток Jurkat NFAT FLuc

(aHER2), биспецифические моноклональные

вектором pSX_PD 1 с последующей селекцией

антитела против CD3 человека и опухоль ассо

на генетицине. Целевые клоны отбирали по

циированного антигена человека 1 (aCD3/aTAA1)

максимальному содержанию PD 1 на поверх

и 2 (aCD3/aTAA2) («BIOCAD», Россия); мыши

ности клеток, которое определяли с помощью

ные моноклональные антитела против CD3 че

проточного цитофлуориметра Guava

12HT

ловека, клон HIT3a («BD», США); набор для де

(«Millipore», США) после окрашивания клеток

текции активности люциферазы ONE Glo

aPD 1.

(«Promega», США); стафилококковый энтеро

Клеточную линию Raji PD L1 создали элект

токсин Б (SEB) («Toxin Technology», США).

ропорацией клеток Raji вектором pSX_PD L1 с

Клеточные линии. Клетки Jurkat, Raji и CHO K1

последующей селекцией на генетицине. Целе

культивировали при 37 °С в атмосфере с 5% CO₂

вые клоны отбирали по максимальному содер

в соответствующей питательной среде с добав

жанию PD L1 на поверхности клеток, которое

лением 10% эмбриональной бычьей сыворотки,

определяли методом проточной цитофлуори

в случае клеток Jurkat, Raji - в среде RPMI 1640,

метрии после окрашивания клеток aPD L1.

в случае CHO K1 - в среде DMEM/F12. Все

Клеточную линию Jurkat NFAT FLuc PD 1

клеточные линии, использованные для инжене

CAR создали трансдукцией клеток Jurkat NFAT

рии, а также полученные на их основе репортер

FLuc PD 1 лентивирусными частицами, коди

ные линии, были протестированы на отсутствие

рующими химерный антигенный рецептор

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

914

ДОРОНИН и др.

(CAR), соединенный пептидным линкером T2A

Аппроксимацию и построение графиков

с зеленым флуоресцентным белком (GFP)

проводили в программном пакете SigmaPlot,

(«BIOCAD», Россия). Пул клеток анализирова

(SYSTAT Software). Из аппроксимирующего

ли на наличие GFP позитивных клеток методом

уравнения кривой определяли параметр полу

проточной цитофлуориметрии.

эффективной концентрации (EC50). Измерения

Клеточную линию CHO PD L1 tmaCD3 соз

всех экспериментальных точек проводили как

дали трансфекцией клеток CHO K1 вектором

минимум в двух повторах. Точки, приведенные

pSX_PD L1 и pSX_tmaCD3 с последующей се

на рисунках, соответствуют среднему значению

лекцией на генетицине и пуромицине. Клоны

по всем повторам, планки погрешностей, при

скринировали с помощью флуоресцентно ме

веденные на рисунках, - значениям стандарт

ченных антител против PD L1 и Fc фрагмента

ного отклонения для соответствующих повто

антител человека методом проточной цитофлуо

ров.

риметрии. Целевые клоны отбирали по макси

Исследование стабильности образцов aPD 1 и

мальному содержанию PD L1 и трансмембран

aPD L1. По 50 мкл исходных растворов aPD 1 и

ных aCD3 (tmaCD3) на поверхности клеток, ко

aPD L1 (c концентрацией 25 мг/мл) инкубиро

торое определяли методом проточной цитофлуо

вали в микропробирках объемом 200 мкл в

риметрии окрашиванием клеток aPD L1 и анти

ПЦР амплификаторе («Bio Rad», США) в тече

телами против Fc фрагмента антител человека.

ние 1 ч при указанных температурах. Исследова

Функциональные тесты. Тесты проводили в

ние проводили как описано в разделе «Функцио

белых культуральных 96 луночных планшетах

нальные тесты».

для работы с люминесценцией («SPL Life Scien

Исследование линейного диапазона тест сис

ces», Республика Корея). Если не указано дру

темы. Для сравнения ожидаемой и эксперимен

гое, суспензия содержала 50 000 клеток Jurkat

тально определенной активности aPD 1 и

NFAT FLuc PD 1 и 25 000 клеток Raji PDL1 на

aPD L1 готовили разведения данных препара

лунку и aCD3/aTAA1 в концентрации 1 нг/мл.

тов в концентрациях 200, 140, 70 и 50% относи

В случае замены клеток Jurkat NFAT FLuc PD 1

тельно концентрации стандартного образца,

клетками Jurkat NFAT FLuc PD 1 CAR их коли

максимальная конечная концентрация которо

чество также составляло 50 000 клеток на лунку.

го в тесте составляла 100 мкг/мл, его активность

В случае замены клеток Raji PD L1 клетками

принимали за 100%. Исследование проводили,

Raji, либо CHO PD L1 tmaCD3, их количество

как описано в разделе «Функциональные тес

также составляло 25 000 клеток на лунку. Конеч

ты». Экспериментально определенную актив

ный объем клеточной суспензии в лунке состав

ность рассчитывали, как отношение экспери

лял 100 мкл, все компоненты суспензии готови

ментально определенной EC50 стандарта к экс

ли в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбрио

периментально определенной EC50 для данной

нальной бычьей сыворотки. После добавления

концентрации, умноженное на 100%.

всех компонентов планшеты инкубировали в те

чение 16 ч при 37 °С в атмосфере с 5% CO₂, да

лее измеряли интенсивность люминесценции в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

лунках с использованием набора ONE Glo и

планшетного ридера SPARK 20M («Tecan»,

Создание клеточных линий. Для функцио

Швейцария).

нальных клеточных тестов предпочтительно ис

Обработка данных. Для построения кривых

пользование иммортализованных клеточных

зависимости величины активации клеток от

линий, позволяющих избежать проблем с точ

концентрации указанного в эксперименте анти

ностью и воспроизводимостью результатов,

тела использовали 4 х параметрическую логис

присущих методам анализа c использованием

тическую аппроксимирующую функцию. Урав

первичных клеток [16]. Также это позволяет при

нение функции выглядит следующим образом:

помощи методов генной и клеточной инжене

рии создавать клетки с необходимым феноти

пом.

Система для анализа биологической актив

ности aPD 1 или aPD L1 должна состоять из

эффекторных PD 1⁺ клеток и PD L1. Функция

PD 1 опосредованного ингибирования CD3 за

где x - концентрация антитела, в нг/мл; max -

висимой активации подразумевает, что эффек

верхняя асимптота; min - нижняя асимптота;

торная клеточная линия должна иметь функцио

Hillslope - параметр кривизны; EC50 - значение

нальный CD3 комплекс на поверхности. Для

полуэффективной концентрации, в нг/мл.

оценки уровня CD3 зависимой активации и

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ PD 1/PD L1

915

степени ее ингибирования удобно использовать

Были созданы также две PD L1⁺ клеточные

репортерную систему, например, на основе ис

линии - Raji PD L1 и CHO PD L1 tmaCD3.

пользования фермента люциферазы. PD 1 при

Выбор способа активации эффекторных клеток.

взаимодействии с PD L1 способен подавлять

Помимо эффекторных клеток тест система долж

NFAT и NF κB (ядерный фактор энхансера лег

на включать в себя PD L1 и активатор CD3. На

кой цепи активированных B лимфоцитов) сиг

иболее физиологичным является использование

нальные каскады, активируемые CD3 [17]. Ис

PD L1⁺ клеток в качестве носителя PD L1.

пользование NFAT сигнального пути предпоч

Мы рассмотрели несколько вариантов акти

тительнее, т.к. NF κB сигнальный путь имеет

вации CD3, которые могут быть использованы в

множество других способов активации, т.е. яв

тест системе (рис. 1):

ляется менее специфичным маркером CD3 за

1. Взаимодействие T клеточного рецептора

висимой активации [18-20].

(TCR) со специфичным ему комплексом пептида и

Предъявленным требованиям удовлетворяет

главного комплекса гистосовместимости (MHC)

человеческая клеточная линия Т клеточного

является способом активации, наиболее близким к

происхождения Jurkat, которая более 30 лет ус

природному механизму действия (рис. 1, а) [23].

пешно используется в исследовании процессов

2. Суперантигены способны одновременно свя

CD3 зависимой активации [21, 22]. На ее осно

зывать β цепь TCR с MHC класса 2 (MHC II),

ве в рамках данной работы создали стабильную

что имитирует узнавание TCR комплекса MHC/

клеточную линию Jurkat NFAT FLuc PD 1,

пептид (рис. 1, б) [24]. В качестве примера супер

экспрессирующую ген, кодирующий PD 1, и со

антигена в работе использовали SEB.

держащую в геноме репортерный ген, кодирую

3. Растворимые активирующие антитела

щий люциферазу светляка под контролем

против CD3ε наиболее часто используют для ак

NFAT чувствительного промотора.

тивации CD3 (рис. 1, в) [25].

Рис. 1. Способы активации CD3 для системы тестирования ингибиторов взаимодействия PD 1/PD L1. а - Эффекторная

клетка имеет TCR, специфичный к комплексу пептид/MHC клетки мишени. Их взаимодействие приводит к CD3 зави

симой активации эффекторной клетки. б - Суперантиген связывает TCR эффекторной клетки и MHC II антигенпрезен

тирующей клетки, имитируя взаимодействие TCR/MHC. в - Растворимые aCD3ε при взаимодействии с CD3 эффектор

ной клетки вызывают ее CD3 зависимую активацию. г - Трансмембранные aCD3ε, представленные на клетке активато

ре, при контакте с эффекторной клеткой взаимодействуют с CD3 эффекторных клеток и вызывают в их CD3 зависимую

активацию. д - В эффекторной клетке, имеющей CAR против TAA, содержащий сигнальный домен CD3ζ, при контакте

с TAA⁺ клеткой мишенью активируются CD3 зависимые сигнальные каскады. е - При контакте клетки мишени с эф

фекторной клеткой связанное с TAA биспецифическое антитело против CD3 и TAA связывается с CD3 эффекторной

клетки, что приводит к ее CD3 зависимой активации.

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

916

ДОРОНИН и др.

4. Трансмембранные антитела против CD3ε,

пают биспецифическим антителам по абсолют

представленные на клетках мишенях, обычно

ной и относительной активации и не рассматри

используют в описанных тест системах для

вались в дальнейших исследованиях. Также су

aPD 1 и aPD L1 (рис. 1, г) [17, 26-28].

перантигены являются токсинами, что делает их

5. CAR⁺ эффекторные клетки могут оказать

использование нежелательным, если есть аль

ся интересной альтернативой для тестирования

тернативные варианты [34].

aPD 1 и aPD L1. Внутриклеточная часть CAR

Интересно, что добавление клеток Raji в

обычно включает в себя сигнальный домен

систему, включающую в себя только эффектор

CD3ζ, который обеспечивает активацию сиг

ные клетки и растворимые aCD3, повышает

нальных каскадов, аналогично полноразмерно

уровень экспрессии гена люциферазы в эффек

му CD3 комплексу (рис. 1, д) [29, 30]. Есть сооб

торных клетках. Это может быть связано с по

щения об усилении эффекта CAR T терапии

вышением активации с помощью aCD3 за счет

при ее совмещении с блокаторами PD 1/PD L1

их взаимодействия с Fc рецепторами клеток

[31].

Raji [35].

6. Биспецифические aCD3/aTAA являются

Преимущество растворимых активаторов

еще одним вариантом активации CD3 (рис. 1, е)

CD3 по сравнению с трансмембранными акти

[32].

вирующими молекулами заключается в возмож

Активация, опосредованная взаимодействи

ности подбора их оптимальной концентрации,

ем TCR с комплексом MHC/пептид, сложна с

что делает систему более гибкой (рис. 3). Мак

точки зрения практической реализации относи

симальную кратность увеличения интенсивнос

тельно других подходов и далее рассматриваться

ти люминесценции при добавлении aPD 1 на

в данной работе не будет [33].

блюдали в диапазоне 0,1-1 нг/мл для обоих

Для определения оптимального варианта ак

aCD3/aTAA. Для экспериментов использовали

тивации CD3 при разработке тест системы сна

концентрацию aCD3/aTAA 1 нг/мл, при кото

чала мы сравнили только растворимые актива

рой сохраняется максимальный уровень отно

торы: aCD3, aCD3/aTAA1, aCD3/aTAA2 и SEB

сительной активации и наблюдаются более вы

(рис. 2). Активаторы CD3 оценивали по двум

сокие абсолютные значения интенсивности лю

параметрам: абсолютная активация (интенсив

минесценции.

ность люминесценции образца в системе, содер

Далее мы сравнили 4 тест системы, основан

жащей эффекторные клетки, клетки мишени,

ные на одном из следующих вариантов активации:

активатор и aPD 1) и относительная активация

(отношение интенсивности люминесценции

образцов, содержащих эффекторные клетки,

клетки мишени, активатор и aPD 1, к интен

сивности люминесценции аналогичных образ

цов, не содержащих aPD 1). Абсолютная акти

вация тест системы на основе aCD3/aTAA1 и

aCD3/aTAA2 примерно в 2-3 раза больше, чем

на основе aCD3 и SEB. При этом стоит отме

тить, что концентрации aCD3 и SEB, использу

емые в исследовании, превышают концентра

цию биспецифических антител 1000× и 100× со

ответственно. Растворимые aCD3, в отличие от

других описанных выше активаторов CD3, вы

зывают активацию всех эффекторных клеток, а

не только тех, которые непосредственно взаи

модействуют с клетками мишенями. При ис

пользовании PD L1⁺ клеток мишеней опосре

дованное PD 1 подавление CD3 зависимой ак

Рис. 2. Сравнение эффективности CD3 зависимой стиму

тивации происходит не во всех эффекторных

ляции NFAT сигнального каскада растворимыми активи

клетках. Это приводит к повышению фонового

рующими агентами. Суспензию, состоявшую из указанной

уровня сигнала в системе и, как следствие, низ

комбинации клеток Jurkat NFAT FLuc PD 1 (J PD 1), Raji

кому значению относительной активации. От

(R), Raji PD L1 (R PD L1), инкубировали в присутствии

одного из активирующих агентов в указанной концентра

носительная активация для тест системы с ис

ции, а также в присутствии (+aPD 1), либо в отсутствии

пользованием aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 сос

(-aPD 1) aPD 1 в концентрации 50 мкг/мл. Эффектив

тавляет примерно 5-6 раз, aCD3 - 1,5 раза,

ность активации оценивали по уровню синтеза люцифера

SEB - 2 раза. Таким образом, aCD3 и SEB усту

зы путем измерения люминесценции

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ PD 1/PD L1

917

Рис. 3. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали сус

пензию клеток Jurkat NFAT FLuc PD 1 (Jurkat PD 1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1)

клетки Raji PD L1 (Raji PD 1). В случае кривой 3 - к клеткам добавляли aPD 1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве ак

тивирующего агента использовали aCD3/aTTA1 (а), либо aCD3/aTАA2 (б). Относительная активация (кривая 4) - отно

шение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.

С цветным вариантом рис. 3 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

двух вариантов aCD3/aTAA, клеток мишеней с

использованием трансмембранных молекул в 2-3

трансмембранным aCD3 или CAR⁺ эффекторных

раза. При этом по относительной активации тест

клеток (рис. 4). По значениям абсолютной актива

система с использованием aCD3/aTAA1 превосхо

ции вариант с использованием CAR⁺ эффектор

дит систему на основе aCD3/aTAA2. На основании

ных клеток ~ 5× превосходит варианты, основан

этих данных aCD3/aTAA1 были выбраны в качест

ные на aCD3/aTAA и клетках мишенях с транс

ве способа активации CD3.

мембранным aCD3. Относительная активация в

Характеризация тест системы. Для доказа

вариантах с aCD3/aTAA превосходит варианты с тельства специфичности выбранной тест систе

Рис. 4. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD 1 в присутствии различных активирующих

агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT FLuc PD 1 (кривые 1-3), либо Jurkat NFAT

FLuc PD 1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В слу

чае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Ре

зультаты приведены в значениях интенсивности люминесценции (а) и единицах относительной активации (б). Относи

тельную активацию определяли как отношение интенсивности люминесценции при данной концентрации aPD 1 к ин

тенсивности люминесценции в варианте без добавления aPD 1 для каждого активатора.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

918

ДОРОНИН и др.

мы мы использовали ее для тестирования aPD 1,

aPD L1, aCTLA4 и aHER2 (рис. 5). В выбранной

тест системе подавление CD3 зависимой акти

вации обеспечивается наличием PD 1 на эффек

торных клетках и PD L1 на клетках мишенях.

Реактивация NFAT зависимой экспрессии гена,

кодирующего FLuc, происходит при добавлении

aPD 1 или aPD L1, но не aCTLA4 или aHER2,

используемых в качестве отрицательного конт

роля. Кривые зависимости интенсивности лю

минесценции образцов от концентрации антител

могут быть описаны 4 х параметрическим логис

тическим уравнением, что позволяет сравнивать

исследуемые препараты по значениям EC50.

Для определения способности тест системы

различать препараты ингибиторов PD 1/PD L1

Рис. 5. Исследование специфичности репортерной систе

с различной активностью мы использовали пре

мы. В клеточном тесте использовали aPD 1 (1), либо aPD

параты aPD 1 и aPD L1, которые были подверг

L1 (2), либо aCTLA4 (3), либо aHER2 (4) в указанных кон

центрациях. Исследование проводили согласно методике,

нуты термическому стрессу (рис. 6). Наблюдает

описанной в разделе «функциональные тесты».

ся прямая зависимость между значениями EC50

С цветным вариантом рис. 5 можно ознакомиться в элект

и температуры, при которой были проинкуби

ронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

рованы препараты. Таким образом система спо

journal/biokhsm/

собна различать препараты aPD 1 и aPD L1 с

различным уровнем активности и может быть

успешно использована для определения их ста

200% относительно стандарта, активность кото

бильности.

рого принимали за 100% (рис. 7). Показано, что

Тест система может быть использована, если

их активность в эксперименте схожа с ожидае

активность исследуемого образца совпадает с

мой. Система является линейной в диапазоне

диапазоном, в котором система сохраняет ли

50-200% относительно активности стандарта

нейную зависимость [13]. Для определения ли

для aPD 1 и aPD L1.

нейности тест системы в диапазоне 50-200%

были использованы препараты aPD 1 и aPD L1

В ходе данной работы разработана тест сис

с ожидаемой активностью 50, 70, 100, 140 и тема для определения биологической активнос

Рис. 6. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD 1 и aPD L1. В кле

точном тесте использовали aPD 1 (а), либо aPD L1 (б), исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при темпе

ратуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1-3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование

проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».

С цветным вариантом рис. 6 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ PD 1/PD L1

919

Рис. 7. Исследование линейного диапазона тест системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной ак

тивности aPD 1 (а) и aPD L1 (б). Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций

50-200% относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную

активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концент

рации, умноженное на 100%.

С цветным вариантом рис. 7 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

Рис. 8. Схема работы тест системы для оценки функциональной активности aPD 1 и aPD L1, основанная на использова

нии бисфецифических aCD3/aTAA. а - Система без добавления ингибиторов взаимодействия PD 1/PD L1. При контак

те эффекторной клетки и клетки мишени aCD3/aTAA, связавшиеся с TAA клетки мишени, взаимодействуют с CD3 эф

фекторной клетки, что активирует ее CD3 зависимый NFAT сигнальный каскад. При этом происходит взаимодействие

PD 1 эффекторной клетки с PD L1 клетки мишени, что ингибирует активацию CD3 зависимого NFAT сигнального кас

када. б - Добавленные в систему aPD 1 или aPD L1 (в) связываются со своей мишенью, что блокирует взаимодействие

PD 1/PD L1 и реактивирует CD3 зависимый NFAT сигнальный каскад.

С цветным вариантом рис. 8 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

920

ДОРОНИН и др.

ти aPD 1 и aPD L1. Система состоит из 3 ком

на основе трансмембранных aCD3 [28]. Но та

понентов (рис. 8):

кой подход был ранее запатентован и имеет ог

- Эффекторная репортерная линия имеет на

раничения для применения [27].

своей поверхности рецептор PD 1 и содержит в

Разработанная нами тест система может

геноме репортерный ген, кодирующий люцифе

быть использована на стадии разработки aPD 1

разу светляка, под контролем NFAT чувстви

и aPD L1 для сравнения кандидатов, оценки их

тельного промотора.

стабильности, а также характеризации серий те

- Клеточная линия, презентирующая на по

рапевтического препарата для подтверждения

верхности PD L1.

их эквивалентности, требующей в большинстве

- Биспецифические aCD3/aTAA, задача ко

случаев соответствия 80-125% активности от

торых - активация CD3 зависимого NFAT сиг

носительно стандартного образца [36].

нального каскада в репортерной клетке, а также

Возможно дополнительное улучшение пара

связывание ее с лиганд презентирующей клет

метров данной тест системы, например, за счет

кой.

снижения фонового сигнала путем использова

В ходе работы сравнили различные способы

ния дестабилизированной версии репортерного

активации CD3. Экспериментально показали,

белка люциферазы [37].

что из всех проверенных вариантов максималь

Представленные сравнительные данные об

ная относительная активация при добавлении

активации CD3 под действием различных акти

aPD 1 наблюдается при использовании биспе

ваторов могут быть полезными при разработке

цифических aCD3/aTAA в качестве активаторов

новых терапевтических агентов и способов их

CD3 (рис. 2, рис. 4). Кроме того, к преимущест

тестирования.

вам их использования можно отнести низкий

С помощью данной тест системы были успеш

фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключе

но отобраны и охарактеризованы кандидаты те

ние дополнительных генно инженерных работ

рапевтических aPD 1 и aPD L1, которые в на

(в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность

стоящее время проходят клинические исследо

(в отличие от суперантигенов).

вания.

Следует отметить, что два из рассмотренных

вариантов активации CD3 в Т клетке являются

оригинальными для решения подобного рода

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

задач и ранее не были описаны. Это использова

сутствии конфликта интересов.

ние биспецифических aCD3/aTAA и CAR.

Соблюдение этических норм. Настоящая

В литературе описана система, позволяющая

статья не содержит описания каких либо ис

определять активность aPD 1 или aPD L1. В ней

следований с участием людей в качестве объек

в качестве активатора CD3 использован подход

тов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K.,

signalosome and downstream signaling to PKCtheta, FEBS

Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N.,

Lett., 547, 37-41, doi: 10.1016/j.febslet.2004.07.083.

Okazaki, T., Byrne, M.C., Horton, H.F., Fouser, L.,

Bardhan, K., Anagnostou, T., Boussiotis, V.A. (2016) The

Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M.,

PD1 : PD L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Imple

Collins, M., Wood, C.R., Honjo, T. (2000) Engagement of

mentation,

Front.

Immunol.,

550,

doi:

the PD 1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family

10.3389/fimmu.2016.00550.

member leads to negative regulation of lymphocyte activa

Arasanz, H., Gato Canas, M., Zuazo, M., Ibanez Vea,

tion, J. Exp. Med., 192, 1027-1034, doi: 10.1084/jem.

M., Breckpot, K., Kochan, G., Escors, D. (2017) PD1 sig

192.7.1027.

nal transduction pathways in T cells, Oncotarget, 8,

Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D.,

51936-51945, doi: 10.18632/oncotarget.17232.

Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A.,

Alsaab, H.O., Sau, S., Alzhrani, R., Tatiparti, K., Bhise,

Nunes, R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A.,

K., Kashaw, S.K., Iyer, A.K. (2017) PD 1 and PD L1

Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N.,

Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immuno

Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H.,

therapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Out

Freeman, G.J. (2001) PD L2 is a second ligand for PD 1

come, Front. Pharmacol., 8, 561, doi: 10.3389/fphar.2017.

and inhibits T cell activation, Nat. Immunol., 2, 261-268,

00561.

doi: 10.1038/85330.

Chen, L., Han, X. (2015) Anti PD 1/PD L1 therapy of

Sheppard, K.A., Fitz, L.J., Lee, J.M., Benander, C.,

human cancer: past, present, and future, J. Clin. Invest.,

George, J.A., Wooters, J., Qiu, Y., Jussif, J.M., Carter, L.L.,

125, 3384-3391, doi: 10.1172/JCI80011.

Wood, C.R., Chaudhary, D. (2004) PD 1 inhibits T cell

Iwai, Y., Ishida, M., Tanaka, Y., Okazaki, T., Honjo, T.,

receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta

Minato, N. (2002) Involvement of PD L1 on tumor cells

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ PD 1/PD L1

921

in the escape from host immune system and tumor

antigens, Annu. Rev. Immunol., 17, 435-466, doi: 10.1146/

immunotherapy by PD L1 blockade, Proc. Natl. Acad. Sci.

annurev.immunol.17.1.435.

U S A, 99, 12293 12297, doi: 10.1073/pnas.192461099.

25.

Tsoukas, C.D., Landgraf, B., Bentin, J., Valentine, M.,

Rozali, E.N., Hato, S.V., Robinson, B.W., Lake, R.A.,

Lotz, M., Vaughan, J.H., and Carson, D.A.

(1985)

Lesterhuis, W.J. (2012) Programmed Death Ligand 2 in

Activation of resting T lymphocytes by anti CD3 (T3)

Cancer Induced Immune Suppression, Clin. Dev.

antibodies in the absence of monocytes, J. Immunol., 135,

Immunol., 2012, 656340, doi: 10.1155/2012/656340.

1719-1723.

10.

Ishida, Y., Agata, Y., Shibahara, K., Honjo, T. (1992)

26.

Leitner, J., Kuschei, W., Grabmeier Pfistershammer, K.,

Induced expression of PD 1, a novel member of the

Woitek, R., Kriehuber, E., Majdic, O., Zlabinger, G.,

immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell

Pickl, W.F., and Steinberger, P. (2010) T cell stimulator

death, EMBO J., 11, 3887-3895, doi: 10.1002/j.1460

cells, an efficient and versatile cellular system to assess the

2075.1992.tb05481.x.

role of costimulatory ligands in the activation of human T

11.

Gong. J., Chehrazi Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. (2018)

cells, J. Immunol. Methods, 362, 131-141, doi: 10.1016/

Development of PD 1 and PD L1 inhibitors as a form of

j.jim.2010.09.020.

cancer immunotherapy: a comprehensive review of regis

27.

Cong, M., Cheng Z.J., Karassina, N., Grailer, J., and Fan,

tration trials and future considerations, J. Immunother.

F. (2015) Systems and methods for assessing modulators of

Cancer, 6, 8, doi: 10.1186/s40425 018 0316 z.

immune checkpoints, patent WIPO, WO2016081854.

12.

Tang, J., Yu, J.X., Hubbard Lucey, V.M., Neftelinov, S.T.,

28.

Wang, L., Yu, C., Yang, Y., Gao, K., and Wang, J. (2017)

Hodge, J.P., Lin, Y. (2018) Trial watch: The clinical trial land

Development of a robust reporter gene assay to measure the

scape for PD1/PDL1 immune checkpoint inhibitors, Nat.

bioactivity of anti PD 1/anti PD L1 therapeutic antibo

Rev. Drug Discov., 17, 854-855, doi: 10.1038/nrd.2018.210.

dies, J. Pharm. Biomed. Anal., 145, 447-453, doi: 10.1016/

13.

Rockville, M.D. (2012) United States Pharmacopeia and

j.jpba.2017.05.011.

National Formulary (USP 35 NF 30), United States

29.

Sadelain, M., Brentjens, R., and Riviere, I. (2013) The

Pharmacopeial Convention, 1032, 5160-5174.

basic principles of chimeric antigen receptor design, Cancer

14.

Skerka, C., Decker, E.L., and Zipfel, P.F. (1995) A regula

Discov., 3, 388-398, doi: 10.1158/2159 8290.CD 12 0548.

tory element in the human interleukin 2 gene promoter is a

30.

Irving, B.A., and Weiss, A. (1991) The cytoplasmic domain

binding site for the zinc finger proteins Sp1 and EGR 1,

of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to

J. Biol. Chem., 270, 22500-22506, doi: 10.1074/jbc.

receptor associated signal transduction pathways, Cell, 64,

270.38.22500.

891-901, doi: 10.1016/0092 8674(91)90314 O.

15.

Park, J., Takeuchi, A., and Sharma, S. (1996) Characte

31.

John, L.B., Devaud, C., Duong, C.P., Yong, C.S., Beavis, P.A.,

rization of a new isoform of the NFAT (nuclear factor of

Haynes, N.M., Chow, M.T., Smyth, M.J., Kershaw, M.H.,

activated T cells) gene family member NFATc, J. Biol.

and Darcy, P.K. (2013) Anti PD 1 antibody therapy

Chem., 271, 33705-33716, doi: 10.1074/jbc.271.34.20914.

potently enhances the eradication of established tumors by

16.

Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T.,

gene modified T cells, Clin. Cancer Res., 19, 5636-5646,

and Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA

doi: 10.1158/1078 0432.CCR 13 0458.

effector cells used in in vitro ADCC bioassay: comparison

32.

Nazarian, A.A., Archibeque, I.L., Nguyen, Y.H., Wang, P.,

of primary NK cells with engineered NK 92 and Jurkat T

Sinclair, A.M., and Powers, D.A. (2015) Characterization

cells, J. Immunol. Methods, 441, 56-66, doi: 10.1016/j.jim.

of bispecific T cell Engager (BiTE) antibodies with a high

2016.12.002.

capacity T cell dependent cellular cytotoxicity (TDCC)

17.

Jutz, S., Leitner, J., Schmetterer, K., Doel Perez, I.,

assay, J. Biomol. Screen., 20, 519-527, doi: 10.1177/

Majdic, O., Grabmeier Pfistershammer, K., Paster, W.,

1087057114561405.

Huppa, J.B., and Steinberger, P. (2016) Assessment of cos

33.

Versteven, M., Van den Bergh, J.M.J., Broos, K., Fujiki, F.,

timulation and coinhibition in a triple parameter T cell

Campillo Davo, D., De Reu, H., Morimoto, S., Lecocq, Q.,

reporter line: simultaneous measurement of NF кB,

Keyaerts, M., Berneman, Z., Sugiyama, H., Van Tendeloo,

NFAT and AP 1, J. Immunol. Methods, 430, 10-20,

V.F.I., Breckpot, K., and Lion, E. (2018) A versatile T cell

doi: 10.1016/j.jim.2016.01.007.

based assay to assess therapeutic antigen specific PD 1

18.

Pahl, H.L. (1999) Activators and target genes of Rel/NF

targeted approaches, Oncotarget, 9, 27797-808, doi: 10.

kappaB transcription factors, Oncogene, 18, 6853-6866,

18632/oncotarget.25591.

doi: 10.1038/sj.onc.1203239.

34.

Miethke, T., Wahl, C., Heeg, K., Echtenacher, B.,

19.

Rao, A., Luo, C, and Hogan, P.G. (1997) Transcription

Krammer, P.H., and Wagner, H. (1992) T cell mediated

factors of the NFAT family: regulation and function, Annu.

lethal shock triggered in mice by the superantigen staphy

Rev. Immunol., 15, 707-747, doi: 10.1146/annurev.immu

lococcal enterotoxin B: critical role of tumor necrosis fac

nol.15.1.707.

tor, J. Exp. Med., 175, 91-98, doi: 10.1084/jem.175.1.91.

20.

Vaeth, M., and Feske, S. (2018) NFAT control of immune

Krutmann, J., Kirnbauer, R., Kock, A., Schwarz, T.,

function: New Frontiers for an Abiding Trooper,

Schopf, E., May, L.T., Sehgal, P.B., and Luger, T.A. (1990)

F1000Res., 7, 260, doi: 10.12688/f1000research.13426.1.

Cross linking Fc receptors on monocytes triggers IL 6

21.

Abraham, R.T., and Weiss, A. (2004) Jurkat T cells and

production. Role in anti CD3 induced T cell activation,

development of the T cell receptor signalling paradigm,

J. Immunol., 145, 1337-1342.

Nat. Rev. Immunol., 4, 301-308, doi: 10.1038/nri1330.

36.

Kaushal, N., Singh, S.K., Gulati, M., Vaidya, Y., and

22.

Mege, D., Di, Bartolo, V., Germain, V., Tuosto, L.,

Kaushik, M. (2016) Study of regulatory requirements for

Michel, F., and Acuto, O. (1996) Mutation of tyrosines

the conduct of bioequivalence studies in US, Europe,

492/493 in the kinase domain of ZAP 70 affects multiple

Canada, India, ASEAN and SADC countries: Impact on

T cell receptor signaling pathways, J. Biol. Chem., 271,

generic drug substitution, JAPS, 6, 206-222, doi: 10.7324/

32644-32652, doi: 10.1074/jbc.271.51.32644.

JAPS.2016.60430.

23.

Davis, M.M., and Bjorkman, P.J. (1988) T cell antigen

37.

Voon, D.C., Subrata, L.S., Baltic, S., Leu, M.P., Whiteway, J.M.,

receptor genes and T cell recognition, Nature, 334,

Wong, A., Knight, S.A., Christiansen, F.T., and Daly, J.M.

395-402, doi: 10.1038/334395a0.

(2005) Use of mRNA and protein destabilizing elements

24.

Li, H., Llera, A., Malchiodi, E.L., and Mariuzza, R.A.

to develop a highly responsive reporter system, Nucleic

(1999) The structural basis of T cell activation by super

Acids Res., 33, e27, doi: 10.1093/nar/gni030.

3 БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019

922

ДОРОНИН и др.

T CELL REDIRECTING BISPECIFIC ANTIBODIES BASED

BIOASSAY FOR EVALUATION OF PD 1/PD L1

INHIBITORS ACTIVITY

A. N. Doronin^1,2, A. A. Gordeev^1,2, A. E. Kozlov¹, I. A. Smirnova¹,

M. Yu. Puchkova^1,2, V. M. Ekimova¹, Y. I. Basovskiy^1,2, and V. V. Solovyev^1,2*

¹ BIOCAD, 142380 Lyubuchany, Russia; E'mail: solovyevvv@biocad.ru

² Pushchino State Institute of Natural Sciences, 142290 Pushchino, Russia

Received February 22, 2019

Revised April 17, 2019

Accepted April 18, 2019

PD 1/PD L1 inhibitor based therapy was called a revolution in cancer therapy. By the end of 2018, more than 100

anti PD 1 and anti PD L1 antibodies are at various phases of development, and more than 2000 clinical trials with

their use have been registered. Characterization of such antibodies requires bioassay to determine their activity. This

article is devoted to the development of a cell based assay for analyzing the activity of anti PD 1 and anti PD L1

antibodies. We have compared several approaches for development of a reporter system using two cell lines. Effector

cells activation in these approaches was based on superantigens, soluble anti CD3 antibodies, transmembrane anti

CD3 antibodies, chimeric antigen receptors (CARs) or bispecific anti CD3/anti TAA antibodies. Based on the

results, it was proposed to use a system involving bispecific anti CD3/anti TAA antibodies, which has advantages over

other approaches. The assay was characterized, and the possibility of its use for testing activity of anti PD 1 and anti

PD L1 antibodies was shown. The proposed system may be useful for development of new therapeutic agents and

methods for their testing.

Keywords: bioassay, PD 1, PD L1, T cell redirecting bispecific antibodies

БИОХИМИЯ том 84 вып. 7 2019