БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 8, с. 1147 - 1153

УДК 577.25

ЭКСПРЕССИЯ мРНК ЦИТОКИНОВ Il1b, Il6,

Il10, Tnf, Cx3cl1, Tgfb1 В ТКАНИ МОЗГА:

МЕТОДИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО

ВКЛАДА мРНК КЛЕТОК КРОВИ

В УСЛОВИЯХ ПЕРФУЗИИ И БЕЗ НЕЕ*

А.А. Квичанский, М.Н. Волобуева, Ю.С. Спивак,

Л.В. Третьякова, Н.В. Гуляева**, А.П. Большаков

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН,

117485 Москва, Россия; электронная почта: nata_gul@mail.ru

Поступила в редакцию 21.03.2019

После доработки 04.05.2019

Принята к публикации 05.05.2019

Цитокины являются важными регуляторами функций мозга как в норме, так и в патологических условиях.

Эти белки могут быть синтезированы резидентными клетками центральной нервной системы (эндотелием

сосудов, клетками, формирующими гематоэнцефалический барьер и клетками, находящимися в паренхи$

ме центральной нервной системы), клетками в просвете кровеносных сосудов или приходить с кровотоком.

Соотношение количества цитокинов, синтезируемых внутри центральной нервной системы и попадающих

в нее из внешних источников в различных условиях, остается малоизученным. В данной работе был иссле$

дован вклад мРНК из нерезидентных клеток в формирование общего пула мРНК следующих генов: Tnf,

Il1b, Il6, Il10, Cx3cl1 и Tgfb1 в неокортексе, гиппокампе, твердой и мягкой оболочках мозга, а также сосудис$

том сплетении крыс. Кроме того, по экспрессии генов$маркеров (Ncf1, Tbx21, Foxp3, RORγс) была оценена

представленность различных популяций резидентных и нерезидентных клеток иммунной системы - воз$

можных источников мРНК цитокинов. Обнаружено, что отмывание крови с помощью транскардиальной

перфузии приводит к снижению уровня мРНК Tnf в неокортексе и гиппокампе, а также снижению уровня

мРНК Il1b, Il6 и Il10 в твердой мозговой оболочке. Уровень мРНК других исследованных генов в остальных

структурах оставался неизменным. Полученные данные свидетельствуют о том, что мРНК Tnf, Il1b, Il6 и

Il10, присутствующая в крови, может вносить существенный вклад в пул мРНК этих цитокинов в тканях

ЦНС и оболочек головного мозга, поэтому предварительная перфузия ткани мозга является необходимой

стадией экспериментального дизайна для получения корректных результатов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитокины, Il1b, Il6, Il10, Tnf, Cx3cl1, Tgfb1, перфузия, гиппокамп, неокортекс.

DOI: 10.1134/S0320972519080074

Нейровоспалением называют специфиче$

В качестве стандартных маркеров активации

скую форму воспалительного процесса, харак$

нейровоспаления используют повышение

терного для центральной нервной системы. Та$

экспрессии мРНК провоспалительных цитоки$

кая реакция впервые была описана как возника$

нов (Il1b, Il6, Tnf), основными продуцентами

ющая в ответ на различные повреждения мозга,

которых в мозге являются клетки микроглии [2].

в т.ч. в результате травмы, действия токсикан$

Кроме того, важную роль в регуляции реакции

тов, гипоксии и инфекций. Однако позже было

нейровоспаления играет баланс между концент$

показано, что процессы, характерные для ней$

рациями про$ и противовоспалительных цито$

ровоспаления, наблюдаются также и в норме, в

кинов [3]. Было показано, что мРНК Il10 и ци$

т.ч. при нормальной синаптической пластич$

токинов семейства TGFβ (Tgfb1, Tgfb2, Tgfb3),

ности и нейрогенезе, что указывает на их исход$

которые принято считать противовоспалитель$

но адаптивную роль [1].

ными медиаторами, присутствуют в различных

клетках центральной нервной системы [2, 4, 5].

Особая роль принадлежит системе фракталкина

* Первоначально английский вариант рукописи опублико$

(CX3CL1). Этот цитокин синтезируется преиму$

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 19$086,

щественно нейронами в центральной нервной

10.06.2019.

системе [2] и регулирует миграцию макрофагов

** Адресат для корреспонденции.

в центральную нервную систему и их превраще$

1147

1148

КВИЧАНСКИЙ и др.

ние в микроглию, особенно в ходе формирова$

ния. Вышеизложенное стимулировало проведе$

ния мозга. В свою очередь, в зрелом мозге фрак$

ние данного методического исследования.

талкин является противовоспалительным меди$

В работе изучено влияние удаления крови из

атором, обеспечивающим отрицательную об$

сосудов головного мозга крысы и его оболочек

ратную связь от нейронов к микроглии [6]. Из$

на относительное количество мРНК основных

мерение экспрессии мРНК генов различных

цитокинов, принимающих участие в регуляции

про$ и противовоспалительных цитокинов ши$

нейровоспаления. Кроме того, исследовали

роко применяется для изучения развития ней$

влияние перфузии на относительное количество

ровоспалительной реакции.

мРНК генов$маркеров субпопуляций клеток

Ткани оболочек головного мозга могут яв$

иммунной системы, наиболее важных для регу$

ляться важным источником цитокинов в ло$

ляции нейровоспаления в тканях мозга и его

кальном кровотоке, поскольку в них находится

оболочек.

большое количество клеток иммунной системы;

кроме того, через них проходят кровеносные со$

суды, питающие мозг. Показано, что твердая

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

оболочка является важной частью т.н. «глимфа$

тической системы», ответственной, в том числе,

Экспериментальные процедуры. В работе были

и за регуляцию взаимодействия иммунной и

использованы крысы линии Wistar мужского по$

нервной систем [7]. В свою очередь, в субарах$

ла из питомника «Столбовая» Московской об$

ноидальном пространстве проходят основные

ласти, массой 250-300 г. Протокол эксперимента

вены и артерии, отвечающие за кровоснабжение

был одобрен этической комиссией ИВНДиНФ

мозга, там же расположены венозные синусы, с

РАН. Крысы из экспериментальной группы бы$

которыми ассоциированы клетки иммунной

ли анестезированы инъекцией 10%$ного (w/v)

системы, регулирующие многие функции мозга

хлоралгидрата («Sigma», США) в дозе 9 мл/кг ве$

[8]. Сосудистое (хороидное) сплетение является

са крысы, после чего они были подвергнуты

еще одной анатомической структурой мозга, ко$

транскардиальной перфузии ледяным фосфат$

торую населяют клетки иммунной системы, ре$

но$солевым буфером (0,01 M, pH 7,4) («Пан$

гулирующие многие процессы в центральной

Эко», Россия) в течение 20 мин. В момент вскры$

нервной системе [9].

тия правого предсердия отбирали пробу крови

По отношению к центральной нервной сис$

(100 мкл). По окончании перфузии, крысы были

теме цитокины могут иметь как эндогенное

декапитированы, был извлечен головной мозг,

(синтезируются резидентными клетками в тка$

затем мозг был охлажден в ледяном фосфатно$

нях мозга), так и экзогенное происхождение

солевом буфере, после чего на положенной на

(синтезируются нерезидентными клетками в

лед фильтровальной бумаге были быстро препа$

просвете сосудов или вообще вне центральной

рированы образцы тканей неокортекса, гиппо$

нервной системы). Несмотря на то, что мРНК

кампа, твердая оболочка головного мозга, совме$

цитокинов в мозге синтезируется как паренхим$

стно мягкая и паутинная оболочки, прилежащие

ными, так и кровяными клетками, в подавляю$

к коре, мягкая и паутинная оболочки, прилежа$

щем большинстве экспериментов по измерению

щие к гиппокампу, сосудистое сплетение (схема

экспрессии цитокинов в головном мозге априо$

эксперимента представлена на рис. 1). Крысам

ри предполагается, что основным источником

контрольной группы были проведены те же ма$

цитокинов в ткани мозга является именно па$

нипуляции, включая подготовку к транскарди$

ренхима, а не клетки крови. При этом ранее не

альной перфузии, но без ее проведения.

производили сравнения вклада паренхимных и

Выделение РНК и обратная транскрипция.

кровяных клеток в уровень мРНК цитокинов в

Препарированные ткани и пробы крови помеща$

мозге. Это сравнение может оказаться важным

ли в пробирки, содержащие 500 мкл реактива для

для интерпретации получаемых данных, по$

выделения РНК ExtractRNA («Евроген», Рос$

скольку уровень экспрессии мРНК провоспали$

сия). Выделение РНК проводили в соответствии

тельных цитокинов в мозге сравнительно низок

с рекомендациями производителя. Для удаления

(особенно в нормальных условиях), и примесь

следов геномной ДНК проводили обработку

крови может существенно повышать измеряе$

проб РНК ДНКазой I («Thermo Scientific», США)

мый экспериментально уровень экспрессии этих

в соответствии с рекомендациями производите$

генов. Потенциальная контаминация кровью

ля. Обратную транскрипцию проводили при по$

образцов ткани мозга может влиять на регистри$

мощи набора реактивов MMLV RT kit («Евро$

руемые значения экспрессии мРНК цитокинов,

ген», Россия) используя ингибитор РНКаз RNase

их соотношение и тем самым вносить непред$

Inhibitor, Murine («New England Biolabs, США») в

сказуемую погрешность в результаты исследова$

соответствии с рекомендациями производите$

БИОХИМИЯ том 84 вып. 8 2019

ВКЛАД КЛЕТОК КРОВИ В ЭКСПРЕССИЮ мРНК ЦИТОКИНОВ В МОЗГЕ

1149

нию со средним значением в контрольной груп$

пе, исключали из исследования (средние значе$

ния в группах представлены в табл. 1).

Праймеры, использованные в работе

(табл. 2), подбирали к последовательностям

мРНК из базы данных NCBI при помощи прог$

раммного пакета PrimerSelect (DNASTAR

Lasergene). В качестве нормировочных генов ис$

пользовали гены выбранные по данным тран$

скриптомного анализа [14].

Анализ данных. Экспрессию генов анализи$

ровали по методу EΔΔCt. Данные в табл. 1 пред$

ставлены в виде mean ± SD. Данные на графиках

представлены в виде сгруппированных точечных

Рис. 1. Схема эксперимента

диаграмм. Достоверность различий между груп$

пами выявляли по методу Манна-Уитни в паке$

те Statistica 10. Во всех группах n ≥ 6.

лей. Использовали эквимолярную смесь случай$

ного декапраймера и олиго(dT)₁₅ праймера («Ев$

роген», Россия), концентрация каждого прайме$

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ра в реакционной системе составляла 1 мкМ.

После обратной транскрипции полученный про$

В неокортексе и гиппокампе было выявлено

дукт разводили 8× деионизованной водой.

снижение относительного количества мРНК Tnf

ПЦР «в реальном времени». Относительное

в результате транскардиальной перфузии (рис. 2,

количество мРНК целевых генов исследовали

а и б), хотя относительное количество мРНК

при помощи станции для ПЦР «в реальном вре$

других потенциально экзогенных цитокинов, а

мени» Bio$Rad CFX$384 («Bio$Rad», США) с ис$

также генов$маркеров моноцитов и Т$хелперов в

пользованием готовой смеси для ПЦР

неокортексе и гиппокампе не изменялось (табл. 3).

qPCRmix$HS SYBR+LowROX («Евроген», Рос$

В твердой оболочке головного мозга мы обнару$

сия) в соответствии с рекомендациями произво$

жили снижение относительного количества

дителей. Относительное количество мРНК вы$

мРНК генов Il1b, Il6 и Il10 под действием перфу$

сокопредставленных генов провоспалительных

зии (рис. 2, в-д), однако, не было обнаружено

цитокинов (Il1b, Il6, Tnf) и противовоспалитель$

изменений уровня мРНК генов$маркеров кле$

ных цитокинов (Tgfb1 и фракталкина), маркера

точных субпопуляций (табл.3).

моноцитов (Ncf1) [10] нормировали на среднее

Полученные данные говорят о том, что в пе$

геометрическое экспрессии мРНК генов Ywhaz

реднем мозге и в твердой оболочке мРНК зна$

и Hprt1. Экспрессию низкопредставленных ге$

чительной части иммунных медиаторов синте$

нов: противовоспалительного цитокина - Il10 и

набора маркеров лимфоцитов: Tbx21 (Th1$лим$

Таблица 1. Влияние перфузии на относительное количест$

фоцитов [11]), Foxp3 (Treg$лимфоцитов [12]),

во мРНК гена Alas2

RORγc (Th17$лимфоцитов [13]) оценивали отно$

сительно мРНК Osbp1 после 5× концентрирова$

Без перфузии

После перфузии

ния кДНК преципитацией при помощи изопро$

панола с гликогеном («Thermo Scientific», США)

Неокортекс

0,4320 ± 0,2708

0,0053 ± 0,0077

в качестве соосадителя. Данная манипуляция

Гиппокамп

0,0058 ± 0,0030

0,0002 ± 0,0001

позволила повысить концентрацию целевой

кДНК в реакционной системе и уменьшила слу$

Оболочки

0,4285 ± 0,2879

0,0034 ± 0,0042

чайную ошибку метода. Для оценки качества

неокортекса

ДНКазной обработки для всех проб и генов ста$

Оболочки

0,4396 ± 0,3842

0,0029 ± 0,0036

вили в одной повторности отрицательный конт$

гиппокампа

роль с продуктом ДНКазной обработки. Для

оценки качества перфузии использовали мРНК

Твердая оболочка

5,0629 ± 6,2582

0,1130 ± 0,0807

Alas2 (маркера эритроцитов), относительное ко$

личество которой нормировали на экспрессию

Сосудистое

0,0125 ± 0,0087

0,0001 ± 0,0001

сплетение

мРНК генов Ywhaz и Hprt1. Пробы из перфузи$

рованных крыс, в которых относительное коли$

Кровь

135,9542 ± 38,6557

102,2964 ± 62,9552

чество мРНК Alas2 снизилось <10× по сравне$

БИОХИМИЯ том 84 вып. 8 2019

1150

КВИЧАНСКИЙ и др.

Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных в работе

Последовательности праймеров (5'-3')

Название праймера

Прямой

Обратный

Il1b

TCTGTGACTCGTGGGATGAT

CACTTGTTGGCTTATGTTCTGTC

Il6

GCCACTGCCTTCCCTACTTCAC

GACAGTGCATCATCGCTGTTCATAC

Tnf

GTCCAACTCCGGGCTCAGAAT

ACTCCCCCGATCCACTCAG

Hprt1

CGTCGTGATTAGTGATGATGAAC

CAAGTCTTTCAGTCCTGTCCATA

Ywhaz

TTGAGCAGAAGACGGAAGGT

GAAGCATTGGGGATCAAGAA

Cx3cl1

ATCACCACCATCACCACCAAC

GAGGAACACTTTAAACCCTCACAGA

Il10

GACAATAACTGCACCCACTTCC

GCATCACTTCTACCAGGTAAAACTTG

Foxp3

GGCCGGGACCTGCGAAGTG

GGGTGTGGCCATGTGCGTCTA

ROR?c

TGCTGTTAAGAGGATGAAGATGGTG

GGTACAATTGGAGGCTGCTGAA

Tbx21

CTGGAGCCCACGAGCCATTACA

CTTCCCACACTGCACCCACTTG

Ncf1

CTGCAGCAAAGGACAGGACTG

GGGTCATGGCCAACAGGTT

Osbp1

TCCGGGAGACTTTACCTTCACTT

GTGTCACCCTCTTATCAACCACC

Таблица 3. Влияние перфузии на относительное количество мРНК генов цитокинов и маркеров клеточных субпопуляций

Ген

Структура

Il1b

Il6

Tnf

Tgfb1

Cx3cl1

Il10

Ncf1

Foxp3

RORγc

Tbx21

Неокортекс

↓p< 0,05

ниже

порога

детекции

Гиппокамп

↓p< 0,05

ниже

порога

детекции

Оболочки

ниже

неокортекса

порога

детекции

Твердая

↓p< 0,05

ниже

оболочка

порога

детекции

Оболочки

ниже

гиппокампа

порога

детекции

Сосудистое

↓p< 0,05

ниже

↑p < 0,05

сплетение

порога

детекции

Кровь

= Достоверных различий не выявлено.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 8 2019

1152

КВИЧАНСКИЙ и др.

зируется в резидентных клетках. В то же время,

мозговых оболочек и сосудистого сплетения

снижение уровня мРНК Tnf в неокортексе и

вносит значимый вклад в представленность

гиппокампе и мРНК Il1b, Il6 и Il10 в твердой

мРНК генов различных иммунных медиаторов

оболочке свидетельствует о том, что нерезидент$

и маркеров клеточных субпопуляций в тканях

ные клетки вносят значительный вклад в пул

головного мозга и его оболочек. Этот вклад не$

мРНК указанных генов в этих структурах. Ана$

одинаков для различных генов и может быть

лиз уровня маркеров моноцитов (Ncf1) и неко$

специфичен для различных анатомических

торых типов Т$клеток (Tbx21, Foxp3, RORγc) по$

структур. В общем случае предсказать вклад эк$

казал, что перфузия не приводит к значимым

зогенных клеток в общий пул мРНК генов им$

изменениям относительного уровня маркеров

мунных регуляторов не представляется возмож$

этих клеточных субпопуляций. Возможно, ис$

ным, тем более что в различных нормальных

точником мРНК цитокинов, удаленных при

и патологических условиях этот вклад может

перфузии, являются клетки крови, не входящие

быть неодинаков. В связи с этим необходимо

ни в одну из исследованных групп клеток, на$

рекомендовать проводить перфузию лаборатор$

пример, нейтрофилы или Th2$лимфоциты.

ных животных в качестве важной стадии перед

В сосудистом сплетении, напротив, было об$

забором биологического материала при иссле$

наружено снижение относительного количества

дованиях реакции нейровоспаления в мозге и

мРНК Foxp3 (рис. 2, е), но не было выявлено из$

его оболочках методом ПЦР «в реальном време$

менений относительного количества Il10 - ос$

ни».

новного цитокина Treg$лимфоцитов [15]. Веро$

ятно, сосудистое сплетение содержит достаточно

большое число резидентных клеток, экспресси$

Финансирование. Работа поддержана Рос$

рующих Il10, поэтому удаление Treg$лимфоци$

сийским фондом фундаментальных исследова$

тов из сосудов хороидного сплетения не влияет

ний (грант № 18$015$00314).

на уровень этого цитокина. Парадоксальным об$

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

разом в сосудистом сплетении мы обнаружили

них нет конфликта интересов.

повышение относительного количества РНК ге$

Соблюдение этических норм. Все принятые

на Tbx21 в результате перфузии (рис. 2, ж).

международные, национальные и/или институ$

Таким образом, мы показали, что присут$

циональные принципы ухода и использования

ствие клеток крови в образцах ткани мозга, животных были соблюдены.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Estes, M.L., and McAllister, A.K. (2014) Alterations in

PPAR$γ agonist neuroprotective treatment in the MPTPp

immune cells and mediators in the brain: it’s not always

mouse model of progressive Parkinson’s disease,

neuroinflammation! Brain Pathol.,

24,

623-630,

Neurobiol. Dis., 71, 280-291, doi: 10.1016/j.nbd.2014.

doi: 10.1111/bpa.12198.

08.011.

Zeisel, A., Munoz$Manchado, A.B., Codeluppi, S.,

6. Rogers, J.T., Morganti, J.M., Bachstetter, A.D., Hudson, C.E.,

Lonnerberg, P., La Manno, G., Jureus, A., Marques, S.,

Peters, M.M., Grimmig, B.A., Weeber, E.J., Bickford, P.C.,

Munguba, H., He, L., Betsholtz, C., Rolny, C., Castelo$

and Gemma, C. (2011) CX3CR1 deficiency leads to

Branco, G., Hjerling$Leffler. J., and Linnarsson, S. (2015)

impairment of hippocampal cognitive function and synap$

Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hip$

tic plasticity, J. Neurosci., 31, 16241-16250, doi: 10.1523/

pocampus revealed by single$cell RNA$seq., Science, 347,

JNEUROSCI.3667$11.2011.

1138-1142, doi: 10.1126/science.aaa1934.

7. Louveau, A., Herz, J., Alme, M.N., Salvador, A.F.,

Meyer, U., Murray, P.J., Urwyler, A., Yee, B.K.,

Dong, M.Q., Viar, K.E., Herod, S.G., Knopp, J., Setliff, J.C.,

Schedlowski, M., and Feldon, J. (2008) Adult behavioral

Lupi, A.L., Da Mesquita, S., Frost, E.L., Gaultier, A.,

and pharmacological dysfunctions following disruption of

Harris, T.H., Cao, R., Hu, S., Lukens, J.R., Smirnov, I.,

the fetal brain balance between pro$inflammatory and

Overall, C.C., Oliver, G., and Kipnis, J. (2018) CNS lym$

IL$10$mediated anti$inflammatory signaling, Mol.

phatic drainage and neuroinflammation are regulated by

Psychiatry, 13, 208-221, doi: 10.1038/sj.mp.4002042.

meningeal lymphatic vasculature, Nat. Neurosci., 21,

Zhang, Y., Chen, K., Sloan, S.A., Bennett, M.L.,

1380-1391, doi: 10.1038/s41593$018$0227$9.

Scholze, A.R., O’Keeffe, S., Phatnani, H.P., Guarnieri, P.,

8. Filiano, A.J., Gadani, S.P., and Kipnis, J. (2017) How and

Caneda, C., Ruderisch, N., Deng, S., Liddelow, S.A.,

why do T cells and their derived cytokines affect the injured

Zhang, C., Daneman, R., Maniatis, T., Barres, B.A., and

and healthy brain? Nat. Rev. Neurosci., 18, 375-384,

Wu, J.Q. (2014) An RNA$sequencing transcriptome and

doi: 10.1038/nrn.2017.39.

splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the

9. Marques, F., and Sousa, J.C. (2015) The choroid plexus is

cerebral cortex, J. Neurosci.,

34,

11929-11947,

modulated by various peripheral stimuli: implications to

doi: 10.1523/JNEUROSCI.1860$14.2014.

diseases of the central nervous system, Front. Cell.

Pisanu, A., Lecca, D., Mulas, G., Wardas, J., Simbula, G.,

Neurosci., 9, 136, doi: 10.3389/fncel.2015.00136.

Spiga, S., and Carta, A.R. (2014) Dynamic changes in

10. Ding, X., Zhang, M., Gu, R., Xu, G., and Wu, H. (2017)

pro$ and anti$inflammatory cytokines in microglia after

Activated microglia induce the production of reactive oxy$

БИОХИМИЯ том 84 вып. 8 2019

ВКЛАД КЛЕТОК КРОВИ В ЭКСПРЕССИЮ мРНК ЦИТОКИНОВ В МОЗГЕ

1153

gen species and promote apoptosis of co$cultured retinal

tion and associated cytokine gene expression in elicitation

microvascular pericytes, Graefe’s Arch. Clin. Exp.

phase of allergic contact dermatitis, Br. J. Dermatol., 161,

Ophthalmol., 255, 777-788, doi: 10.3389/fncel.2015.00136.

1301-1306, doi: 10.1111/j.1365$2133.2009.09400.x.

11. Ferreira, L., Hamey, F., Teichmann, S.A., Cvejic, A.,

14. Dobryakova, Y. V., Kasianov, A., Zaichenko, M.I.,

Macaulay, I.C., Svensson, V., Labalette, C., and Voet, T.

Stepanichev, M.Y., Chesnokova, E.A., Kolosov, P.M.,

(2016) Single$cell RNA$sequencing reveals a continuous

Markevich, V.A., and Bolshakov, A.P. (2018) Intracerebro$

spectrum of differentiation in hematopoietic cells, Cell

ventricular administration of 192IgG$saporin alters expres$

Rep., 14, 966-977, doi: 10.1016/j.celrep.2015.12.082.

sion of microglia$associated genes in the dorsal but not

12. Prieto Martin, P., Bending, D., Ono, M., Ducker, C.B.,

ventral hippocampus, Front. Mol. Neurosci.,

10,

Crompton, T., and Paduraru, A. (2018) A temporally

doi: 10.3389/fnmol.2017.00429.

dynamic Foxp3 autoregulatory transcriptional circuit con$

15. Williams, A., Zandee, S.E.J., Mair, I., Anderton, S.M.,

trols the effector Treg programme, EMBO J., 37, e99013,

O’Connor, R.A., and Leech, M.D. (2017) IL$10$produc$

doi: 10.15252/embj.201899013.

ing, ST2$expressing Foxp3 + T$cells in multiple sclerosis

13. Zhao, Y., Balato, A., Fishelevich, R., Chapoval, A.,

brain lesions, Immunol. Cell Biol.,

95,

484-490,

Mann, D.L., and Gaspari, A.A. (2009) Th17/Tc17 infiltra$

doi: 10.1038/icb.2017.3.

EXPRESSION OF mRNAs FOR Il1b, Il6, Il10, Tnf,

Cx3cl1, AND Tgfb1 CYTOKINES IN THE BRAIN TISSUES:

ASSESSMENT OF CONTRIBUTION OF BLOOD CELLS

WITH AND WITHOUT PERFUSION

A. A. Kvichansky, M. N. Volobueva, Yu. S. Spivak,

L. V. Tret’yakova, N. V. Gulyaeva*, and A. P. Bolshakov

Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences,

117485 Moscow, Russia; E*mail: nata_gul@mail.ru

Received March 21, 2019

Revised May 4, 2019

Accepted May 5, 2019

Cytokines are important regulators of brain function under both normal and pathological conditions. Cytokines can

be synthesized by resident cells of the central nervous system (CNS) (vascular endothelium, cells of the blood$brain

barrier, parenchymal cells of the CNS) or cells in the lumen of blood vessels, as well as introduced with the blood$

stream. The ratio between the amounts of cytokines synthesized in the CNS and those entering it from external

sources under various conditions remains poorly understood. In this work we studied the contribution of mRNAs from

non$resident cells to the common pool of cytokine mRNAs (Il1b, Il6, Il10, Tnf, Cx3cl1, and Tgfb1) in the rat neo$

cortex, hippocampus, dura matter, pia matter, and choroid plexus. We also evaluated the representation of various

populations of resident and non$resident immune cells based on the expression of marker genes (Ncf1, Tbx21, Foxp3,

RORγc). The removal of blood by transcardial perfusion led to a decrease in the amounts of the TNFα mRNA in the

neocortex and hippocampus and of the Il1b, Il6, and Il10, mRNAs in the dura mater. The mRNA levels of other

cytokines in studied structures were not affected by perfusion. Our findings suggest that mRNAs present in the blood

can make a significant contribution to the mRNA levels of some cytokines in the CNS; therefore, preliminary perfu$

sion of brain tissue is a necessary stage of experimental design for correct estimation of mRNA content in the brain.

Keywords: cytokines, Il1b, Il6, Il10, Tnf, Cx3cl1, Tgfb1, perfusion, hippocampus, neocortex

БИОХИМИЯ том 84 вып. 8 2019