БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 9, с. 1289 - 1300
УДК 576.385.5
СТРЕСС ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА,
ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ,
ВЫЗЫВАЕТ СЕЛЕКТИВНЫЙ ОТВЕТ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ*
© 2019
М.С. Вильданова1**, А.А. Саидова1, А.И. Фокин2,
Д.М. Поташникова1, Г.Е. Онищенко1, Е.А. Смирнова1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
биологический факультет, 119991 Москва, Россия;
электронная почта: vch41048@mail.ru
2 Научно(исследовательский институт физико(химической биологии
им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Россия
Поступила в редакцию 22.03.2019
После доработки 27.05.2019
Принята к публикации 27.05.2019
Растительные гормоны могут оказывать цитотоксическое воздействие на клетки человека, а также вызывать
эффекты, не связанные с гибелью, в частности, индуцировать стресс органелл секреторно!синтетической
системы. Целью данной работы являлось исследование возможности активации стресса эндоплазматичес!
кого ретикулума (ЭПР) жасмоновой кислотой (ЖК) и выявление отличий в реакции на действие ЖК куль!
тивируемых иммортализованных нетуморогенных клеток человека HaCaT и клеток эпидермоидной карци!
номы человека А431. Для исследования была использована концентрация ЖК 2 мМ, при которой наблюда!
лось подавление пролиферации в обеих клеточных линиях. Мы исследовали экспрессию генов, ассоцииро!
ванных со стрессом ЭПР (GRP78, ATF4, CHOP), структурное состояние ЭПР и комплекса Гольджи, а также
синтетические процессы в клетках HaCaT, А431 и показали, что в обеих клеточных линиях ЖК вызывала
усиление экспрессии генов стресса ЭПР и гипертрофические изменения комплекса Гольджи. Однако пат!
терн активации генов, ассоциированных со стрессом ЭПР, в этих клеточных линиях различался, а повыше!
ние уровня синтеза инволюкрина наблюдалось только в клетках А431, что может свидетельствовать об ак!
тивации дифференцировки в данном типе клеток. Следовательно, ЖК индуцирует стресс ЭПР в обеих кле!
точных линиях, но у иммортализованных нетуморогенных и опухолевых клеток эпидермального происхож!
дения последствия стресса ЭПР носят селективный характер.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: растительные гормоны, жасмоновая кислота, стресс ЭПР, дифференцировка.
DOI: 10.1134/S0320972519090070
Жасмоновая кислота (ЖК) - член семейства
[5] по отношению ко многим типам опухолевых
жасмонатов, оксилипиновых гормонов стресса,
клеточных линий, а также другие эффекты жас!
продуцируемых клетками водорослей, грибов,
монатов, не связанные с подавлением жизне!
мхов, голосеменных и покрытосеменных расте!
способности и индукцией клеточной гибели. Так,
ний в ответ на абиотический и биотический
например, производное жасмонатов - (3!гид!
стрессовые факторы [1, 2]. Показаны селектив!
рокси!2!пентилциклопентил)!уксусная кисло!
ная цитотоксичность высоких (миллимоляр!
та - индуцировала экспрессию основных про!
ных) концентраций ЖК [3, 4] и ее производных
теогликанов кожи и приводила к улучшению за!
Принятые сокращения: ДТТ - дитиотреитол; ЖК - жасмоновая кислота; ПЦР!РВ - полимеразная цепная реак!
ция в реальном времени; ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия; ЭПР - эндоплазматический ретикулум;
DAPI - 4,6!диамидино!2!фенилиндол гидрохлорид (4,6!diamidino!2!phenylindole hydrochloride); DMSO - диметилсуль!
фоксид (dimethyl sulfoxide); PI - йодид пропидия; TGN - транс!Гольджи!сеть (trans!Golgi network); UPR - ответ на не!
свернутые белки (Unfolded Protein Response).
biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19!088, 05.08.2019.
** Адресат для корреспонденции.
6
1289
1290
ВИЛЬДАНОВА и др.
живления раны с участием первичных керати!
Aldrich», США) в 96°!ном этиловом спирте, не!
ноцитов [6]. Кроме того, жасмонаты могут акти!
обходимый для достижения требуемой конеч!
вировать дифференцировку опухолевых клеток
ной концентрации в среде, и инкубировали в те!
крови человека [7]. Проведенные нами ранее
чение 24 ч. В качестве первого контроля служи!
исследования показали, что такие растительные
ли клетки, культивировавшиеся в стандартных
гормоны, как абсцизовая и гиббереллиновая
условиях, в качестве второго - клетки, культи!
кислоты, вызывают гипертрофические измене!
вировавшиеся в среде с добавлением 96°!ного
ния органелл секреторно!синтетической систе!
этилового спирта в объеме, равном объему до!
мы культивируемых клеток НаСаТ и А431 [8].
бавляемого спиртового раствора ЖК. Экспери!
Было высказано предположение, что наблюдае!
мент ставили по описанной нами ранее схеме
мые изменения могут быть связаны с усилением
[8]. Разницы между контролем и контролем с
секреторной активности и/или индукцией
добавлением этанола обнаружено не было (дан!
стресса эндоплазматического ретикулума
ные не приведены), в связи с этим в разделе «Ре!
(ЭПР), который, в свою очередь, может приво!
зультаты исследования» и на рис. 1 действие ЖК
дить как к гибели, так и к выживанию клеток.
сравнивается только с контролем с добавлением
Целью данной работы являлось исследование
спирта. Аналогично во всех последующих экс!
возможности активации стресса ЭПР жасмоно!
периментах ставили два контроля (без добавле!
вой кислотой и выявление отличий в реакции на
ния спирта и с добавлением спирта в объеме,
действие ЖК культивируемых иммортализован!
равном объему раствора ЖК), и в связи с отсут!
ных нетуморогенных клеток человека HaCaT и
ствующей или незначительной разницей между
клеток эпидермоидной карциномы человека
контролем и контролем с добавлением этанола
А431.
(данные не приведены) далее в разделе «Резуль!
таты исследования» и на рис. 2-7 действие ЖК
сравнивается только с контролем с добавлением
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
этанола.
Проточная цитофлуориметрия. Для выявле!
Культивирование клеток. В качестве объектов
ния популяций апоптотических и некротичес!
исследования были использованы клетки линии
ких клеток использовали набор реактивов
HaCaT (иммортализованные нетуморогенные
Annexin V!FITC Kit PN IM 2375 («Beckman
кератиноциты человека, Коллекция клеточных
Coulter», Франция). Эксперимент проводили
культур для биотехнологических и биомедицин!
согласно протоколу производителя: клетки, пе!
ских исследований (общебиологического и био!
реведенные в суспензию, окрашивали йодидом
медицинского направления) Института биоло!
пропидия (PI) и аннексином V из расчета 2,5 и
гии развития им. Н.К. Кольцова РАН) и клетки
5 мкл на 100 мкл суспензии соответственно. Об!
линии А431 (эпидермоидная карцинома челове!
разцы анализировали на проточном сортере
ка, Банк клеточных культур Института цитоло!
FACSAria SORP («Beckton Dickinson», США).
гии РАН, Санкт!Петербург). Клетки выращива!
ПЦР в реальном времени (ПЦР5РВ). После!
ли в среде DMEM (Dulbecco Modified Eagle’s
довательности использованных праймеров
Medium; «ПанЭко», Россия) с добавлением 10%
(«Синтол», Россия) приведены в таблице. Экспе!
фетальной сыворотки теленка (FBS; «ПанЭко»,
римент проводили по описанной ранее схеме [13].
Россия), 2 мМ L!глутамина («ПанЭко», Россия)
Трансмиссионная электронная микроскопия.
и 80 мкг/мл антибиотика гентамицина («Белмед!
Клетки фиксировали в течение 30 мин 2,5%!ным
препараты», Белоруссия) в стандартных условиях
глутаровым альдегидом («Ted Pella Inc.», США),
(37 °С, 5% СО2). Клетки отделяли от поверхности
промывали РВS (pH 7,2-7,4) и дополнительно
пластикового сосуда смесью растворов трипсина
контрастировали раствором 1%!ного OsO4 на
(«ПанЭко», Россия) и Версена (0,2%!ный рас!
РВS (pH 7,2-7,4; «Sigma!Aldrich», США) в тече!
твор этилендиаминтетрауксусной кислоты в
ние 1 ч в темноте. Обезвоживание и заключение
фосфатном буфере; «ПанЭко», Россия) в соот!
в эпон 812 («Sigma!Aldrich», США) проводили
ношении 1 : 3, высаживали в 96!луночные план!
по стандартной методике. Ультратонкие срезы
шеты для проведения МТТ!теста или в чашки
залитых в эпон образцов окрашивали 1,5%!ным
Петри со стеклами и выращивали в течение 48 ч.
раствором уранилацетата и цитратом свинца по
Концентрация клеток составляла 100-150 тыс.
Рейнольдсу. Наблюдения проводили с исполь!
на 1 мл среды.
зованием трансмиссионного электронного мик!
МТТ5тест. Для оценки метаболической ак!
роскопа JEM!1011 («JEOL», Япония) с цифро!
тивности и пролиферации клеток с помощью
вой фотокамерой GATAN ES500W, работающей
МТТ!теста через 48 ч после посадки клеток в
под управлением программы Digital Micrograph
каждую лунку добавляли раствор ЖК («Sigma!
GATAN.
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
ИНДУКЦИЯ СТРЕССА ЭПР ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ
1291
Рис. 1. Жизнеспособность клеток НаСаТ и А431 при воздействии жасмоновой кислотой (ЖК). К - контроль. а - Опти!
ческая плотность после инкубации с ЖК (0,1-4,0 мМ); б-д - клеточная гибель в культурах НаСаТ (б, в) и А431 (г, д) без
воздействия и при воздействии 2 мМ ЖК (приведены репрезентативные данные по трем (А431) и пяти (НаСаТ) экспери!
ментам; Q1 - клетки, положительные по PI (некротические, клеточный дебрис); Q2 - клетки, положительные по Annexin V
и PI (на поздних стадиях гибели - постапоптотический некроз, вторичный некроз); Q3 - клетки, отрицательные по
Annexin V и PI (живые клетки); Q4 - клетки, положительные по Annexin V (апоптотические клетки); е - митотический
индекс в клетках НаСаТ и А431 при воздействии ЖК. Приведены средние значения (n = 3…6) и их стандартные отклоне!
ния; * р ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни
Иммуноцитохимия. Для проведения иммуно!
Eclipse Ti!E («Nikon», Япония) с конфокальным
цитохимического окрашивания клетки инкуби!
модулем А1 и объективом Apo TIRF 60×/1,49 oil.
ровали в чашках Петри со стеклами в присут!
Белковый электрофорез и иммуноблоттинг.
ствии ЖК в концентрации 2 мМ в течение 24 ч, а
Клетки лизировали в 2× лизирующем буфере,
затем фиксировали 4%!ным раствором парафор!
мальдегида («MP Biochemical», Франция) в PBS
Последовательности олигонуклеотидных праймеров для
амплификации генов методом ПЦР!РВ
(pH 7,2-7,4) и обрабатывали 0,1%!ным Triton
X!100 («Serva», Германия). Для визуализации
Мишень
Праймеры
Ссылка
клеточных органелл использовали монокло!
нальные антитела мыши к белку аппарата Гольд!
CHOP
5'!AGTCTAAGGCACTGAGCGTATC!3'
[9]
5'!TCTGTTTCCGTTTCCTGGTT!3'
жи 58К (formiminotransferase cyclodeaminase,
FTCD; «Sigma!Aldrich», США); моноклональ!
GRP78
5'!TCTGCTTGATGTGTGTCCTCTT!3'
[10]
ные антитела мыши к инволюкрину («Sigma!
5'!GTCGTTCACCTTCGTAGACCT!3'
Aldrich», США); антитела к IgG мыши, конъю!
АTF4
5'!TGGCTGGCTGTGGATGG!3'
[11]
гированные с Alexa Fluor 488 («Thermo Fisher
5'!TCCCGGAGAAGGCATCCT!3'
Scientific», США). Для визуализации ядер и ми!
тотических фигур использовали краситель DAPI
UBC
5'!ATTTGGGTCGCGGTTCTTG!3'
[12]
(«Sigma!Aldrich», США). Препараты заключали
5'!TGCCTTGACATTCTCGATGGT!3'
в мовиол («Hoechst», Германия). Съемку препа!
HPRT
5'!TGACACTGGCAAAACAATGCA!3'
[12]
ратов проводили с использованием инвертиро!
5'! GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT!3'
ванного флуоресцентного микроскопа Axiovert
200M («Carl Zeiss Inc.», Германия; объективы
GAPDH
5'!TGCACCACAACTGCTTAGC!3'
[12]
PlanApo 20× и 63×/1,4 oil), снабженного черно!
5'!GGCATGGACTGTGGTCATGAG!3'
белой цифровой камерой Carl Zeiss AxioCam и
YWHAZ
5'!ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA!3'
[12]
программным обеспечением AxioVision
3.1
5'!CCGCCAGGACAAACCAGTAT!3'
(«Carl Zeiss Inc.», Германия); микроскопа Nikon
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
6*
1292
ВИЛЬДАНОВА и др.
содержавшем 200 мМ Tris!HCl, 400 мМ β!мер!
Protein Synthesis HCS Assay («Thermo Fisher
каптоэтанола («Bio!Rad», США), 4% додецил!
Scientific», США) по описанной нами ранее схе!
сульфата натрия (SDS;
«Serva», Германия),
ме [8]. В качестве контроля для ингибирования
0,01% бромфенолового синего и 40% глицерина
синтеза белка использовали обработку цикло!
(«PanReac», Испания). Полученный лизат инку!
гексимидом («Sigma!Aldrich», США) в концент!
бировали при 100 °С в течение 10 мин. Электро!
рации 1,5 мМ в течение 1,5 ч.
форетическое разделение белков проводили в
Обработка данных. Обработку и коррекцию
камере для вертикального электрофореза Mini!
полученных изображений проводили в прог!
Protean Tetra Vertical Electrophoresis Cell («Bio!
рамме ImageJ (National Institutes of Health,
Rad», США). Использовали нижний 10%!ный
США). Для оценки интенсивности белкового
разделяющий ПААГ (акриламид : N,N'!мети!
синтеза использовали плагин, написанный
ленбисакриламид в соотношении 30 : 0,8; «Bio!
д.б.н. И.И. Киреевым (лаборатория электрон!
Rad», США), верхний 4%!ный концентрирую!
ной микроскопии, НИИФХБ им. А.Н. Белозер!
щий ПААГ («Bio!Rad», США) и Tris!глициновый
ского). Для статистической обработки данных в
электродный буфер, pH 8,3 («Bio!Rad», США).
контроле и в опытной группе был использован
Для контроля разделения наносили белковый
U!критерий Манна-Уитни (непараметричес!
маркер PageRuler Plus Prestained 10-250 kDa
кий). Различия считали статистически досто!
Protein Ladder
(«Thermo Fisher Scientific»,
верными при p < 0,01.
США). Электрофоретическое разделение бел!
ков проводили в TGB!буфере («Bio!Rad», США)
при следующих характеристиках электрическо!
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
го поля: в концентрирующем геле - сила тока
20 мА, в разделяющем геле - сила тока 30 мА
Определение действующей концентрации ЖК.
при напряжении 210 В.
Исследование влияния ЖК в концентрациях
Полусухой перенос белков на мембрану
0,1-4,0 мМ (время инкубации 24 ч) на метабо!
PVDF («GE Нealthcare», США) осуществляли в
лическую активность клеток НаСаТ и А431 бы!
камере для переноса белков Trans!Blot SD
ло проведено с помощью МТТ!теста. Установ!
Semy!Dry Transfer Cell («Bio!Rad», США), за!
лено, что при концентрациях 1, 2 и 4 мМ наблю!
полненной буфером для переноса белков, со!
далось снижение оптической плотности раство!
державшим 47,9 мM Tris!base, 38,6 мM глицина,
ра формазана в клетках НаСаТ - на 17, 30 и 45%
0,0385% SDS, 20% метанола. Перенос проходил
и клетках А431 - на 15, 43 и 53% соответственно
при напряжении 100 В и силе тока 100 мА в те!
(рис. 1, а). При более низких концентрациях
чение 30 мин. Затем мембрану PVDF инкубиро!
ЖК в обеих клеточных линиях достоверных от!
вали в 2%!ном BSA («Sigma!Aldrich», США),
личий выявлено не было. Следовательно, клет!
разведенном в PBS, в течение 30 мин. Далее в
ки НаСаТ и А431 на действие ЖК в концентра!
раствор вносили антитела, разведенные в PBS:
ции от 1 мМ и выше реагируют сходным обра!
антитела к инволюкрину добавляли до разведе!
зом, но при концентрациях 2 и 4 мМ снижение
ния 1 : 2000, антитела к β!актину, конъюгиро!
метаболической активности было более выра!
ванные с пероксидазой хрена («Abcam», Вели!
женным у опухолевых клеток.
кобритания), - до разведения 1 : 50 000; инку!
Снижение метаболической активности, вы!
бацию с антителами проводили в течение 18 ч.
являемое с помощью МТТ!теста, может быть
Мембрану промывали в буфере PBST (PBS и
связано как с активацией клеточной гибели, так
0,1%!ный Tween 20; «Helicon», Россия). Вто!
и с подавлением пролиферации. Поэтому мы
ричные антитела кролика к IgG мыши, конъю!
исследовали клеточную гибель при воздействии
гированные с пероксидазой хрена, разводили в
2 мМ ЖК методом проточной цитофлуоримет!
PBST (1 : 10 000) и инкубировали в течение
рии при мечении аннексином V и йодидом про!
1,5 ч, после чего снова промывали в PBST. Для
пидия (PI) (рис. 1, б-д). В контрольных клетках
выявления окрашивания использовали систему
НаСаТ количество живых клеток (не окрашен!
Amersham ECL Prime («GE Нealthcare», США),
ных аннексином V и PI) составляло 89,3%; кле!
основанную на детекции излучения, обуслов!
ток, меченных аннексином V, - 9,3%; клеток,
ленного окислением люминола, катализируе!
меченных PI, - 0,1%; клеток, имеющих обе мет!
мым пероксидазой, и систему гель!документи!
ки, - 1,3% (рис. 1, б). При действии ЖК в кле!
рования ChemiDoc MP System
(«Bio!Rad»,
точной популяции НаСаТ эти процентные соот!
США).
ношения практически не изменяются (8,4; 0,1 и
Оценка интенсивности общего белкового син5
1,2% соответственно; рис. 1, в). В контрольных
теза. Эксперимент ставили с использованием
клетках А431 количество живых клеток состав!
набора реактивов Click!iT AHA Alexa Fluor 488
ляло 94,4%; клеток, меченных аннексином V, -
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
ИНДУКЦИЯ СТРЕССА ЭПР ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ
1293
2,3%, клеток, меченных PI, - 1% и клеток, име!
Таким образом, МТТ!тест, проточная ци!
ющих обе метки, - 2,3% (рис. 1, г). После инку!
тофлуориметрия и подсчет митотического ин!
бации с ЖК количество живых клеток А431 сос!
декса показали, что при концентрации 2 мМ
тавляло 89,7%; клеток, меченных аннексином V, -
ЖК снижение жизнеспособности не связано с
5,5%; клеток, меченных PI, - 2,4%; клеток, име!
массовой гибелью клеток. Данная концентра!
ющих обе метки, - 2,4% (рис. 1, д). Поэтому
ция была использована для исследования влия!
снижение метаболической активности, выяв!
ния ЖК на секреторно!синтетическую систему.
ленное с помощью МТТ!теста в обеих клеточ!
Детекция стресса ЭПР. С помощью ПЦР!РВ
ных линиях, вероятнее всего, связано с подавле!
мы исследовали уровень экспрессии мРНК ге!
нием пролиферации.
нов, ассоциированных со стрессом ЭПР: GRP78
Подсчет числа митотических клеток показал,
(binding immunoglobulin protein/78!kDa glucose!
что в контрольной популяции клеток НаСаТ бы!
regulated protein), ATF4 (activating transcription
ло 2,45% митозов, а при инкубации с ЖК -
factor 4) и CHOP (C/EBP homologous protein). В
1,21% митозов (рис. 1, е). В клетках А431 число
качестве положительного контроля был исполь!
митозов составляло 3,57% и снижалось при
зован ДТТ - активатор стресса ЭПР. В клетках
действии ЖК до 2,47% (рис. 1, е). Следователь!
HaCaT ДТТ стимулировал усиление экспрессии
но, ЖК в концентрации 2 мМ индуцирует по!
всех изученных генов, и наиболее значительное
давление пролиферации в 2 раза в клетках
повышение наблюдалось для генов GRP78 и
HaCaT и в 1,4 раза в клетках А431.
CHOP (рис. 2, а). ЖК также повышала уровень
Рис. 2. Активация стресса ЭПР в клетках НаСаТ и А431 при воздействии жасмоновой кислотой (ЖК). а, б - Уровень
экспрессии мРНК генов GRP78, ATF4 и CHOP, ассоциированных с активацией стресса ЭПР, в клетках НаСаТ и А431 при
воздействии ЖК. К - контроль, ДТТ - дитиотреитол. Приведены средние значения, полученные по трем повторностям
в двух независимых экспериментах, и их стандартные отклонения; * р ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни; в-д - ЭПР в
клетках НаСаТ при воздействии ЖК: в - контроль, г и д - ЖК; в-д - ТЭМ, стрелки указывают на цистерны ЭПР, мас!
штабный отрезок - 2 мкм
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
1294
ВИЛЬДАНОВА и др.
экспрессии всех изученных генов в данных
с помощью трансмиссионной электронной
клетках, однако это повышение было менее вы!
микроскопии.
раженным, чем при действии ДТТ для GRP78 и
Структурное состояние ЭПР. Исследование
CHOP (рис. 2, а). В клетках А431 ДТТ стимули!
ультраструктуры ЭПР в клетках HaCaT и А431
ровал усиление экспрессии генов ATF4 и CHOP,
при действии ЖК показало, что по сравнению с
в то время как для GRP78 активация была на
контролем увеличение объема цистерн ЭПР
низком уровне (рис. 2, б). При действии ЖК бы!
наблюдается только в клетках HaCaT (рис. 2,
ло выявлено значительное усиление экспрессии
в-д), в то время как в клетках А431 таких приз!
только для ATF4 (сравнимое с тем, которое наб!
наков выявлено не было (данные не приведе!
людалось при действии ДТТ), а для GRP78 и
ны). Следовательно, такие морфологические
СHOP уровень экспрессии оставался на уровне
признаки стресса ЭПР, как набухание цистерн,
контрольных клеток (рис. 2, б).
проявляются только в иммортализованных ке!
Таким образом, анализ экспрессии генов,
ратиноцитах.
активируемых при стрессе ЭПР, показал, что
Структурное состояние комплекса Гольджи.
ЖК индуцирует стресс ЭПР в обеих клеточных
Далее мы исследовали состояние следующего
линиях, но пути индукции носят разный харак!
компартмента секреторно!синтетической систе!
тер. Поскольку одним из морфологических кри!
мы клеток, связанного с ЭПР, - комплекса
териев стресса ЭПР может быть набухание и
Гольджи. Иммуноцитохимическое выявление
расширение цистерн ЭПР [14, 15], мы исследо!
комплекса Гольджи с помощью антител к белку
вали состояние цистерн ЭПР при действии ЖК
р58К показало, что после инкубации с ЖК в
Рис. 3. Комплекс Гольджи в клетках НаСаТ при воздействии жасмоновой кислотой (ЖК): а, в - контроль; б, г, д - обра!
ботка ЖК; а, б - иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к белку 58К; масштабный отрезок - 10 мкм;
в-д - ТЭМ, стрелки указывают на транс!часть аппарата Гольджи и TGN; масштабный отрезок - 1 мкм
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
ИНДУКЦИЯ СТРЕССА ЭПР ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ
1295
Рис. 4. Комплекс Гольджи в клетках А431 при воздействии жасмоновой кислотой (ЖК): а, в - контроль; б, г, д - обработ!
ка ЖК; а, б - иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к белку 58К, масштабный отрезок - 10 мкм;
в-д - ТЭМ, стрелки указывают на транс!часть аппарата Гольджи и TGN, масштабный отрезок - 1 мкм
клетках НаСаТ (рис. 3, а, б) и в клетках А431
Стресс ЭПР приводит к различным послед!
(рис. 4, а, б) происходило набухание комплекса
ствиям, способствующим выживанию или гибе!
Гольджи, что может быть связано как с гипертро!
ли клеток; в физиологических условиях он мо!
фическими изменениями всего комплекса, так и
жет запускать дифференцировку [16], в т.ч. кера!
его отдельных компартментов. Далее было про!
тиноцитов [17]. Поэтому далее мы исследовали
ведено исследование с помощью электронной
уровень синтеза маркера дифференцировки ке!
микроскопии, которое продемонстрировало, что
ратиноцитов инволюкрина в клетках НаСаТ и
комплекс Гольджи в клетках НаСаТ и А431 был
А431 при действии ЖК.
представлен в виде близко расположенных сто!
Уровень синтеза инволюкрина. При иммуно!
пок, имеющих характерную полярность (рис. 3, в;
цитохимическом окрашивании с использовани!
рис. 4, в). Стопки располагались в околоядерной
ем антител к инволюкрину в клетках линии
области. После инкубации с ЖК в клетках обеих
НаСаТ было обнаружено слабое диффузное ок!
линий цистерны транс!части стопок были рас!
рашивание цитоплазмы. Определенные клетки,
ширенными, а TGN!компартмент представлен
преимущественно собранные в островки или
гетерогенными по размеру, но достаточно круп!
единичные отростчатые клетки, значительно
ными везикулами (рис. 3, г, д; рис. 4, г, д).
отличались по яркости окрашивания цитоплаз!
Полученные результаты указывают на то,
мы (рис. 5, а, б, отмечено стрелками). Подсчет
что при действии ЖК наблюдаются гипертро!
числа таких ярко окрашенных клеток показал,
фические изменения комплекса Гольджи в обе!
что их количество не превышало 6% (рис. 5, в).
их клеточных линиях, что наряду с данными о
После действия ЖК характер окрашивания кле!
расширении цистерн ЭПР в клетках НаСаТ мо!
точной популяции не менялся (рис. 5, б).
жет свидетельствовать о протекании процессов,
Иммуноцитохимическое окрашивание с ис!
ассоциированных со стрессом ЭПР.
пользованием антител к инволюкрину клеток
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
1296
ВИЛЬДАНОВА и др.
А431 показало, что на фоне слабого диффузного
ток, прикрепленных к субстрату (рис. 5, е). При
окрашивания цитоплазмы выявлялись структу!
действии ЖК мы наблюдали увеличение числа
ры, по морфологии соответствующие комплек!
таких клеток до 3% (рис. 5, ж).
су Гольджи (рис. 5, г). В то же время не более чем
Далее с помощью вестерн!блоттинга мы
в 1% от всей клеточной популяции наблюдалось
провели исследование уровня содержания ин!
яркое диффузное окрашивание цитоплазмы,
волюкрина в лизатах клеток HaCaT и А431 до и
как в клетках НаСаТ (рис. 5, д, е; отмечено
после инкубации с ЖК. Как показано на рис. 6,
стрелками). Такие клетки часто формировали
ЖК не оказывала влияния на уровень синтеза
островки, которые располагались поверх кле!
инволюкрина в клетках НаСаТ, в то время как в
Рис. 5. Инволюкрин в клетках НаСаТ и А431 при воздействии жасмоновой кислотой (ЖК): а-в - НаСаТ; г-ж - А431;
а, в - контроль; б, д, е - ЖК; а, б, г-е - иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к инволюкрину, стрел!
ки указывают на клетки с ярким диффузным окрашиванием (островки или одиночные клетки с отростками), масштаб!
ный отрезок - 10 мкм; в - доля клеток НаСаТ с ярким диффузным окрашиванием антителами к инволюкрину; ж - доля
клеток А431 с ярким диффузным окрашиванием антителами к инволюкрину. Приведены средние значения (n = 3) и их
стандартные отклонения; * р ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
ИНДУКЦИЯ СТРЕССА ЭПР ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ
1297
Рис. 6. Содержание инволюкрина в клетках НаСаТ и А431. а - Содержание инволюкрина; 1, 3 - контроль; 2, 4 - ЖК;
б - относительное содержание инволюкрина; приведены средние значения (n = 3…4) и их стандартные отклонения;
* р ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни
клетках А431 после инкубации с ЖК содержа!
вативный ответ UPR (Unfolded Protein
ние инволюкрина возрастало в 2,7 раза.
Response), в ходе которого происходят подавле!
Повышение содержания маркера дифферен!
ние трансляции и одновременно дополнитель!
цировки, выявленное в опухолевых клетках, мо!
ная активация синтеза шаперонов, включая
жет вносить вклад в синтетическую активность
GRP78, помогающая эукариотическим клеткам
клеток. В связи с этим следующим этапом рабо!
восстанавливать баланс сворачивания в ЭПР
ты стало исследование уровня общего белкового
[17, 18]. При активации стресса ЭПР и UPR
синтеза в клетках НаСаТ и А431.
GRP78 отделяется от белков PERK, ATF6, IRE1,
Определение уровня общего белкового синте5
которые, в свою очередь, активируют ряд транс!
за. Для того чтобы выяснить, влияет ли ЖК на
крипционных факторов, в т.ч. компоненты
биосинтетические процессы в клетках, мы
PERK!пути - ATF4 и CHOP. Индуктор стресса
провели сравнение уровня общего белкового
ЭПР ДТТ, использованный в данной работе в
синтеза в контрольных клетках, при действии
качестве положительного контроля, повышал
1,5 мМ ингибитора белкового синтеза цикло!
уровень фосфорилированного eIF2α - компо!
гексимида (ЦГ) и 2 мМ ЖК. Полученные дан!
нента PERK!пути UPR, который может приво!
ные указывают на то, что после инкубации с
дить как к адаптации клеток после стресса, так и
ЖК интенсивность флуоресценции, а следова!
к развитию апоптоза [19]. Поскольку ни в одном
тельно, и интенсивность белкового синтеза, в
клетках НаСаТ повышалась в 1,8 раза, а в клет!
ках А431 - в 4 раза (рис. 7). Сходные данные
были получены нами ранее и для другого расти!
тельного гормона (абсцизовой кислоты) в клет!
ках А431 [8].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведенные исследования показали, что
ЖК стимулирует подавление пролиферации в
клетках обеих линий, а также активацию генов
GRP78, ATF4 и CHOP в клетках НаСаТ и гена
ATF4 в клетках А431. Белок GRP78 - шаперон
люмена ЭПР, который в норме инактивирует
трансмембранные рецепторы ЭПР - киназы
PERK (PKR!like eukaryotic initiation factor 2α
Рис. 7. Интенсивность общего белкового синтеза в клетках
kinase), IRE1 (inositol!requiring enzyme 1α) и
НаСаТ и А431 при действии ЖК; К - контроль, ЦГ - цикло!
гексимид. Приведены средние значения (n = 3…6) и их стан!
транскрипционный фактор ATF6 (activating
дартные отклонения; * р ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни.
transcription factor 6). Стресс ЭПР, связанный с
Фоновое свечение клеток при действии циклогексимида
накоплением неправильно уложенных белков в
обусловлено отсутствием его влияния на белковый синтез
его люмене, активирует эволюционно!консер!
в митохондриях
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
1298
ВИЛЬДАНОВА и др.
типе клеток не наблюдалось значительной кле!
Гольджи (что, возможно, обусловлено связыва!
точной гибели, вероятно, ответ на вызванный
нием инволюкрина с отходящими от транс!час!
ЖК стресс ЭПР в обеих клеточных линиях явля!
ти аппарата Гольджи везикулами). Это объясня!
ется адаптивным.
ется тем, что в отличие от клеток НаСаТ в клет!
Стресс ЭПР на морфологическом уровне в
ках А431 понижена активность трансглутамина!
некоторых случаях сопровождается гипертро!
зы, осуществляющей связывание инволюкрина
фией цистерн ЭПР, что было показано в данной
с белками плазматической мембраны, в связи с
работе для клеток НаСаТ. Можно предполо!
чем эти клетки не достигают стадии терминаль!
жить, что расширение транс!части комплекса
ной дифференцировки даже в условиях, способ!
Гольджи в обоих типах клеток также является
ствующих данному процессу (повышенный уро!
его следствием. Белковый поток связывает меж!
вень Ca2+) [22]. Кроме того, после инкубации с
ду собой ЭПР и комплекс Гольджи, следователь!
ЖК достоверно увеличивается число клеток ли!
но, подавление трансляции и накопление не!
нии А431 с диффузным, т.е. нормальным, окра!
правильно свернутых белков при стрессе ЭПР
шиванием, что свидетельствует о нормализации
может приводить к изменениям в комплексе
фенотипа патологически измененных клеток.
Гольджи, в т.ч. проявляющимся на ультраструк!
Возможно, это связано с усилением синтеза ин!
турном уровне. Возможно, что этим объясняет!
волюкрина и/или усилением активности транс!
ся расширение цистерн транс!части комплекса
глутаминазы. Данные вестерн!блоттинга под!
Гольджи, наблюдаемое в обоих типах клеток. С
тверждают тот факт, что ЖК повышает уровень
другой стороны, не исключено, что подобные
содержания инволюкрина в опухолевых клетках,
морфологические изменения в ультраструктуре
и, вероятно, этот процесс вносит вклад в усиле!
комплекса Гольджи могут быть связаны с усиле!
ние белкового синтеза, регистрируемое в этих
нием секреторной активности клеток (в пользу
клетках. Ранее Rosdy et al. показали, что эпидер!
чего свидетельствуют данные об усилении ин!
мальный фактор роста усиливает накопление
тенсивности общего белкового синтеза как в
инволюкрина в клетках А431 и вместе с этим по!
клетках НаСаТ, так и в А431, и усилении
давляет их пролиферацию [22]. Подобные эф!
экспрессии шаперона GRP78 в клетках НаСаТ)
фекты продемонстрированы и для вещества тер!
или повышением продукции органелл эндосом!
бинафин (действующий компонент известного
но!лизосомного компартмента.
лекарственного препарата «Ламизил»): в клетках
В то же время были выявлены отличия в ре!
А431 тербинафин вызывает дифференцировку,
акции клеток НаСаТ и А431 на действие ЖК. В
связанную с экспрессией инволюкрина и сопро!
клетках А431 индуцированный ЖК стресс ЭПР
вождающуюся блокировкой клеточного цик!
сопровождается повышением уровня синтеза
ла [24].
инволюкрина - маркера дифференцировки ке!
Существует широкий спектр структурно раз!
ратиноцитов. Физиологический стресс ЭПР в
нообразных агентов (Са2+, форболовый эфир,
кератиноцитах поддерживает гомеостаз эпидер!
окадаевая кислота, полифенолы зеленого чая),
мального барьера и приводит к терминальной
которые активируют экспрессию генов инво!
дифференцировке [17, 20], в ходе которой клетки
люкрина в эпителии по сходному механизму -
проходят процессы замены внутриклеточного со!
путем взаимодействия с каскадом MAPK (mito!
держимого белками цитоскелета (кератин 1, 2, 10)
gen!activated protein kinases) [25]. МАРК - се!
и сшивки белков (инволюкрин, лорикрин и др.)
рин/треониновые киназы, играющие ключевую
на периферии клеток для формирования водо!
роль в передаче сигнала от клеточной поверх!
непроницаемой оболочки [21]. Инволюкрин
ности к ядру; у млекопитающих они подразде!
синтезируется в цитозоле, но затем прикрепля!
ляются на ERK (extra!cellular signal regulated pro!
ется к белкам плазматической мембраны с по!
tein kinase), JNK (c!Jun N!terminal kinase) и р38
мощью трансглутаминазы [22, 23]. В ходе нашей
МАРК
[23]. Вышеупомянутый механизм
работы с помощью иммуноцитохимического ок!
экспрессии генов инволюкрина в эпителии зак!
рашивания мы показали, что в клетках НаСаТ и
лючается в усилении активности p38δ и умень!
А431 локализация инволюкрина значительно
шении активности ERK1/2 [25]. Показано, что в
различается: в линии НаСаТ диффузно окраше!
результате активации МАР!киназного пути под
ны все клетки (что, по всей видимости, отражает
действием метилжасмоната происходит индук!
нормальное расположение белка под плазмати!
ция дифференцировки клеток миелоидной лей!
ческой мембраной), тогда как в линии А431 диф!
кемии человека HL!60 в моноциты и грануло!
фузное окрашивание имеет лишь малая часть
циты [26], а также активация MAP!киназ JNK и
популяции, а в остальных клетках инволюкрин
p38 в клетках Т!лимфобластной лейкемии чело!
выявляется в связи со структурами в цитоплаз!
века Моlt!4 и лимфоцитах периферической кро!
ме, по морфологии соответствующими аппарату
ви человека [27]. Интересно, что ДТТ также мо!
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
ИНДУКЦИЯ СТРЕССА ЭПР ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТОЙ
1299
жет активировать JNK и p38 через IRE1α!путь
ны в дальнейших исследованиях, направленных
[28] и PERK!путь стресса ЭПР [29]. Возможно,
на изучение влияния растительных гормонов на
что показанное нами подавление пролиферации
клетки животных и человека, включая разработ!
под действием ЖК в обеих клеточных линиях, а
ку подходов к противоопухолевой терапии, свя!
также дифференцировка в клетках А431 могут
занных с дифференцировкой опухолей эпидер!
происходить через активацию пути PERK-
мального происхождения.
ATF4.
Таким образом, мы выявили общие призна!
ки реакции иммортализованных кератиноцитов
Финансирование. Работа выполнена при под!
и опухолевых клеток человека на действие ЖК
держке Российского фонда фундаментальных
(стресс ЭПР, гипертрофия аппарата Гольджи,
исследований (грант № 19!015!00233) и Прог!
усиление белкового синтеза) и признак, харак!
раммы развития МГУ (комплекс FACSAria
терный только для клеток А431 (повышение со!
SORP).
держания инволюкрина), что, по всей видимос!
Конфликт интересов. Авторы заявляют об от!
ти, обусловлено разницей в паттернах экспрес!
сутствии конфликта интересов.
сии генов!маркеров стресса ЭПР, приводящей к
Соблюдение этических норм. Настоящая
различным последствиям. Полученные данные
статья не содержит описания каких!либо иссле!
свидетельствуют о селективности действия ЖК
дований с участием людей и использованием
на опухолевые клетки и могут быть использова!
животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Wasternack, C., and Hause, B. (2013) Jasmonates: biosyn!
9.
Fu, J., Zhao, L., Wang, L., and Zhu, X. (2015) Expression
thesis, perception, signal transduction and action in plant
of markers of endoplasmic reticulum stress!induced apop!
stress response, growth and development. An update to the
tosis in the placenta of women with early and late onset
2007 review in Annals of Botany, Ann. Bot., 111,
severe pre!eclampsia, Taiwan J. Obstet. Gynecol., 54,
1021-1058, doi: 10.1093/aob/mct067.
19-23, doi: 10.1016/j.tjog.2014.11.002.
2.
Song, S., Qi, T., Wasternack, C., and Xie, D. (2014)
10.
Murugan, D., Lau, Y.S., Lau, C.W., Mustafa, M.R., and
Jasmonate signaling and crosstalk with gibberellin and eth!
Huang, Y.
(2015) Angiotensin
1!7 protects against
ylene, Curr. Opin. Plant Biol., 21, 112-119, doi: 10.1016/
angiotensin II!induced endoplasmic reticulum stress and
j.pbi.2014.07.005.
endothelial dysfunction via Mas receptor, PLoS One, 10,
3.
Fingrut, O., and Flescher, E. (2002) Plant stress hormones
e0145413, doi: 10.1371/journal.pone.0145413.
suppress the proliferation and induce apoptosis in human
11.
Plaisance, V., Brajkovic, S., Tenenbaum, M., Favre, D.,
cancer cells, Leukemia, 16, 608-616, doi: 10.1038/sj.leu.
Ezanno, H., Bonnefond, A., Bonner, C., Gmyr, V., Kerr!
2402419.
Conte, J., Gauthier, B.R., Widmann, C., Waeber, G.,
4.
Rotem, R., Heyfets, A., Fingrut, O., Blickstein, D.,
Pattou, F., Froguel, P., and Abderrahmani, A.
(2016)
Shaklai, M., and Flescher, E. (2005) Jasmonates: novel
Endoplasmic reticulum stress links oxidative stress to
anticancer agents acting directly and selectively on human
impaired pancreatic β!cell function caused by human oxi!
cancer cell mitochondria, Cancer Res., 65, 1984-1993,
dized LDL, PLoS One, 11, e0163046, doi: 10.1371/journal.
doi: 10.1158/0008!5472.CAN!04!3091.
pone.0163046.
5.
Li, J., Chen, K., Wang, F., Dai, W., Li, S., Feng, J., Wu, L.,
12.
Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van
Liu, T., Xu, S., Xia, Y., Lu, J., Zhou, Y., Xu, L., and Guo, C.
Roy, N., De Paepe, A., and Speleman, F. (2002) Accurate
(2017) Methyl jasmonate leads to necrosis and apoptosis in
normalization of real!time quantitative RT!PCR data by
hepatocellular carcinoma cells via inhibition of glycolysis
geometric averaging of multiple internal control genes,
and represses tumor growth in mice, Oncotarget, 8,
Genome Biol., 3, doi: 10.1186/gb!2002!3!7!research0034.
45965-45980, doi: 10.18632/oncotarget.17469.
13.
Potashnikova, D., Gladkikh, A., and Vorobjev, I.A. (2015)
6.
Henriet, E., Jager, S., Tran, C., Bastien, P., Michelet, J.F.,
Selection of superior reference genes’ combination for
Minondo, A.M., Formanek, F., Dalko!Csiba, M., Lortat!
quantitative real!time PCR in B!cell lymphomas, Ann.
Jacob, H., Breton, L., and Vives, R.R. (2017) A jasmonic
Clin. Lab. Sci., 45, 64-72.
acid derivative improves skin healing and induces changes
14.
Mishra, A.R., Zheng, J., Tang, X., and Goering, P.L.
in proteoglycan expression and glycosaminoglycan struc!
(2016) Silver nanoparticle!induced autophagic!lysosomal
ture, Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 1861, 2250-2260,
disruption and NLRP3!Inflammasome activation in
doi: 10.1016/j.bbagen.2017.06.006.
HepG2 cells is size!dependent, Toxicol. Sci.,
150,
7.
Tsumura, H., Akimoto, M., Kiyota, H., Ishii, Y., Ishikura, H.,
473-487, doi: 10.1093/toxsci/kfw011.
and Honma, Y. (2009) Gene expression profiles in differ!
15.
Smith, M., and Wilkinson, S. (2017) ER homeostasis and
entiating leukemia cells induced by methyl jasmonate are
autophagy, Essays Biochem.,
61,
625-635, doi:
similar to those of cytokinins and methyl jasmonate
10.1042/EBC20170092.
analogs induce the differentiation of human leukemia cells
16.
Matsuzaki, S., Hiratsuka, T., Taniguchi, M., Shingaki, K.,
in primary culture, Leukemia, 23, 753-760, doi: 10.1038/
Kubo, T., Kiya, K., Fujiwara, T., Kanazawa, S.,
leu.2008.347.
Kanematsu, R., Maeda, T., Takamura, H., Yamada, K.,
8.
Вильданова М.С., Савицкая М.А., Онищенко Г.Е.,
Miyoshi, K., Hosokawa, K., Tohyama, M., and Katayama, T.
Смирнова Е.А. (2014) Действие растительных гормо!
(2015) Physiological ER stress mediates the differentiation
нов на компоненты секреторного пути нормальных и
of fibroblasts, PLoS One, 10, e0123578, doi: 10.1371/jour!
опухолевых клеток человека, Цитология, 56, 516-525.
nal.pone.0123578.
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
1300
ВИЛЬДАНОВА и др.
17. Sugiura, K.
(2013) Unfolded protein response in ker!
24. Huang, C.!S., Ho, W.!L., Lee, W.!S., Sheu, M.!T.,
atinocytes: impact on normal and abnormal keratinization,
Wang, Y.!J., Tu, S.!H., Chen, R.!J., Chu, J.!S., Chen, L.!C.,
J. Dermatol. Sci., 69, 181-186, doi: 10.1016/j.jdermsci.
Lee, C.!H., Tseng, H., Ho, Y.!S., and Wu, C.!H. (2008)
2012.12.002.
SP1!regulated p27/Kip1 gene expression is involved in
18. Chakrabarti, A., Chen, A.W., and Varner, J.D. (2011)
terbinafine!induced human A431 cancer cell differentia!
A review of the mammalian unfolded protein response,
tion: an in vitro and in vivo study, Biochem. Pharmacol., 75,
Biotechnol. Bioeng.,
108,
2777-2793, doi:
10.1002/
1783-1796, doi: 10.1016/j.bcp.2008.02.005.
bit.23282.
25. Eckert, R.L., Crish, J.F., Efimova, T., and
19. Rozpedek, W., Pytel, D., Mucha, B., Leszczynska, H.,
Balasubramanian S. (2004) Antioxidants regulate normal
Diehl, J.A., and Majsterek, I. (2016) The role of the
human keratinocyte differentiation, Biochem. Pharmacol.,
PERK/eIF2α/ATF4/CHOP signaling pathway in tumor
68, 1125-1131, doi: 10.1016/j.bcp.2004.04.029.
progression during endoplasmic reticulum stress, Curr.
26. Cohen, S., and Flescher, E. (2009) Methyl jasmonate: a
Mol. Med., 16, 533-544.
plant stress hormone as an anti!cancer drug, Phytochemistry,
20. Celli, A., Mackenzie, D.S., Crumrine, D.S., Tu, C.L.,
70, 1600-1609, doi: 10.1016/j.phytochem.2009.06.007.
Hupe, M., Bikle, D.D., Elias, P.M., and Mauro, T.M.
27. Rotem, R., Fingrut, O., Moskovitz, J., and Flescher, E.
(2011) Endoplasmic reticulum Ca2+ depletion activates
(2003) The anti!cancer plant stress!protein methyl jas!
XBP1 and controls terminal differentiation in ker!
monate induces activation of stress!regulated c!Jun N!ter!
atinocytes and epidermis, Br. J. Dermatol., 164, 16-25,
minal kinase and p38 protein kinase in human lymphoid
doi: 10.1111/j.1365!2133.2010.10046.x.
cells, Leukemia, 17, 2230-2234, doi: 10.1038/sj.leu.
21. Eckhart, L., Lippens, S., Tschachler, E., and Declercq, W.
2403107.
(2013) Cell death by cornification, Biochim. Biophys. Acta,
28. Xiang, X.Y., Yang, X.C., Su, J., Kang, J.S., Wu, Y.,
1833, 3471-3480, doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.06.010.
Xue, Y.N., Dong, Y.T., and Sun, L.K. (2016) Inhibition of
22. Rosdy, M., Bernard, B.A, Schmidt, R., and Darmon, M.
autophagic flux by ROS promotes apoptosis during DTT!
(1986) Incomplete epidermal differentiation of A431 epi!
induced ER/oxidative stress in HeLa cells, Oncol Rep., 35,
dermoid carcinoma cells, In Vitro Cell Dev. Biol., 22,
3471-3479, doi: 10.3892/or.2016.4725.
295-300.
29. Liang, S.H., Zhang, W., McGrath, B.C., Zhang, P., and
23. Yamazaki, T., Nakano, H., Hayakari, M., Tanaka, M.,
Cavener, D.R. (2006) PERK (eIF2α kinase) is required to
Mayama, J., and Tsuchida, S. (2004) Differentiation
activate the stress!activated MAPKs and induce the
induction of human keratinocytes by phos!
expression of immediate!early genes upon disruption of
phatidylethanolamine!binding protein, J. Biol. Chem.,
ER calcium homoeostasis, Biochem. J., 393, 201-209, doi:
279, 32191-32195, doi: 10.1074/jbc.M404029200.
10.1042/BJ20050374.
JASMONIC ACID INDUCES ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS
WITH DIFFERENT OUTCOME FOR CULTURED NORMAL
AND TUMOR EPIDERMAL CELLS
M. S. Vildanova1*, A. A. Saidova1, A. I. Fokin2, D. M. Potashnikova1,
G. E. Onishchenko1, and E. A. Smirnova1
1 Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 119991 Moscow, Russia; E(mail: vch41048@mail.ru
2 Belozersky Institute of Physico(Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 119992 Moscow, Russia
Received March 22, 2019
Revised May 27, 2019
Accepted May 27, 2019
Plant hormones may cause cytotoxic effect on human cells and also trigger processes, which are not related to cell
death, for instance, stress of biosynthetic system. The goal of our study was to investigate the activation of endoplas!
mic reticulum (ER) stress by jasmonic acid (JA) and to distinguish the reactions of human cultured immortalized
non!tumorigenic HaCaT cells and human epidermoid carcinoma A431 cells to JA. In experiments 2 mM JA con!
centration was used that suppresses cell proliferation in both cell lines. We analyzed the expression of genes associat!
ed with ER stress (GRP78, ATF4, CHOP), the structure of ER and Golgi complex, and synthetic processes in HaCaT
and A431 cells. In both cell lines, JA upregulated expression of ER stress genes and caused hypertrophic changes in
Golgi complex. However, the activation pattern of ER stress genes in HaCaT and A431 cells was different; in addi!
tion, only tumor A431 cells revealed an increased level of involucrin synthesis, suggesting that JA may activate differ!
entiation in these cells. Thus, JA induces ER stress in both cell lines, but the consequences of ER stress for immor!
talized non!tumorigenic and epidermoid cancer cells are different.
Keywords: plant hormones, jasmonic acid, ER stress, differentiation
БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019
