БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 9, с. 1322 - 1334

УДК 612.089:612.014:602.9:577.113.5:575.224

МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ ОДНОНУКЛЕОТИДНОЙ ЗАМЕНЫ с.840С>Т

В 7 М ЭКЗОНЕ ГЕНА SMN2*

К.Р. Валетдинова^1,2,3,4**, В.С. Овечкина^1,2,3,4, С.М. Закиян^1,2,3,4

¹ Федеральный исследовательский центр, Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090 Новосибирск, Россия; электронная почта: valetdinova@bionet.nsc.ru

² Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

630090 Новосибирск, Россия

³ Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина

Минздрава России, 630055 Новосибирск, Россия

⁴ Новосибирский национальный исследовательский государственный университет,

630090 Новосибирск, Россия

Поступила в редакцию 30.04.2019

После доработки 03.06.2019

Принята к публикации 03.06.2019

Технология CRISPR/Cas обладает большими перспективами в отношении лечения многих наследственных

заболеваний. Среди данного типа заболеваний потенциальным кандидатом является спинальная мышечная

атрофия (СМА), причина которой - делеция гена SMN1, кодирующего необходимый для «выживания» мо&

торных нейронов белок SMN. В геноме пациентов присутствует от одной до нескольких копий гена&пара&

лога SMN2, в 7&м экзоне которого локализована однонуклеотидная замена с.840С>Т, приводящая к наруше&

нию сплайсинга и снижению синтеза полноразмерного белка SMN. Целью данной работы было создание и

тестирование разных систем редактирования генов для коррекции однонуклеотидной замены с.840С>Т в

7&м экзоне гена SMN2 в фибробластах, индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) и

предшественниках моторных нейронов (ПМН), полученных от пациента со спинальной мышечной атро&

фией. В эксперименте были использованы плазмидные векторы, обеспечивающие экспрессию компонен&

тов системы CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cpf1, а также плазмида и 90&звенные одноцепочечные олигонуклео&

тиды в качестве донорных молекул. Доставка доноров и плазмид в клетки осуществлялась методом элект&

ропорации. Показано, что при использовании протоспейсера sgRNA_Т2 в фибробластах пациента со СМА

I типа система демонстрирует большую активность по сравнению с sgRNA_T1 (р < 0,05) и sgRNA_Т3 - по

сравнению с sgRNA_Т1 (р < 0,05). При использовании sgRNA_Т1, sgRNA_Т2 и sgRNA_Т3 в культурах па&

циент&специфичных ИПСК и ПМН значимых различий в эффективности редактирования последователь&

ности 7&го экзона гена SMN2 не обнаружено. Наибольшую эффективность в отношении коррекции замены

с.840С>Т в 7&м экзоне гена SMN2 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках и предшествен&

никах моторных нейронов продемонстрировал вектор, экспрессирующий sgRNA_T1, и 90&звенные одноце&

почечные олигонуклеотиды в качестве донорных молекул.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: спинальная мышечная атрофия, индуцированные плюрипотентные стволовые клет&

ки, предшественники моторных нейронов, редактирование генов.

DOI: 10.1134/S0320972519090100

Одним из потенциальных методов терапии

стволовых клетках, с помощью современных

наследственных болезней является коррекция

систем редактирования генов и последующая

мутаций в индуцированных плюрипотентных

аутологичная трансплантация прогениторных

стволовых клетках (ИПСК), полученных из со&

клеток или их дифференцированных производ&

матических клеток пациента или региональных

ных с «исправленным генотипом» в организм

пациента. В настоящее время компаниями

CRISPR Therapeutics и Vertex проводятся клини&

Принятые сокращения: СМА - спинальная мышеч&

ная атрофия, ИПСК -индуцированные плюрипотентные ческие испытания 1/2 фазы, предусматриваю&

стволовые клетки, ПМН - предшественники моторных

щие подобную терапию ex vivo, для таких забо&

нейронов.

леваний, как бета&талассемия и серповидно&

* Первоначально английский вариант рукописи опублико&

клеточная анемия, в ближайшей перспективе -

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 19&137,

миодистрофия Дюшенна и ряд других заболева&

29.07.2019.

ний. Однако актуальным остается вопрос - на&

** Адресат для корреспонденции.

сколько эффективно использование CRISPR&

1322

КОРРЕКЦИЯ ЗАМЕНЫ с.840С>Т

1323

опосредованных систем в отношении наслед&

Несмотря на то что за последнее десятиле&

ственных болезней центральной нервной систе&

тие было получено много новых знаний, касаю&

мы. Среди данного типа наследственных забо&

щихся патогенеза и молекулярной генетики

леваний особое место занимает спинальная мы&

данного заболевания, патогенетическая терапия

шечная атрофия (СМА). Спинальная мышечная

для СМА появилась относительно недавно. В

атрофия является одним из самых распростра&

2017 году в США и странах ЕС было одобрено

ненных наследственных заболеваний, которые

первое лекарство от СМА, которое представляет

развиваются в детском возрасте, и, соответствен&

собой антисмысловой олигонуклеотид, обеспе&

но, одной из основных причин ранней детской

чивающий модуляцию сплайсинга SMN2 [7].

смертности. Наиболее тяжелая форма данного

Однако для достижения необходимого терапев&

заболевания, СМА I типа, развивается в течение

тического эффекта необходимы постоянные

первых месяцев жизни и приводит к гибели па&

интратекальные инъекции данного препарата,

циентов в течение двух лет [1]. Причиной этого

поскольку с течением времени он разрушается

заболевания в 95% случаев является гомозигот&

клеточными системами. Кроме того, препарат

ная делеция гена SMN1, который кодирует бе&

обеспечивает лишь облегчение симптомов, и

лок SMN, контролирующий различные аспекты

соответственно, некоторое увеличение продол&

метаболизма РНК [2]. Помимо гена SMN1, дан&

жительности жизни пациентов, долговремен&

ный белок синтезируется с высокогомологич&

ные эффекты применения данного препарата не

ной копии - гена SMN2. Таким образом, у паци&

изучены. Единственным потенциальным спосо&

ентов со СМА наблюдается уникальная ситуа&

бом этиотропной терапии данного заболевания

ция, ген SMN1 делетирован или поврежден дру&

на сегодняшний день является коррекция заме&

гой мутацией, однако в геноме присутствует па&

ны с.840С>Т в паралогичном гене.

ралогичный ген SMN2, который по своей нуклео&

Целью данной работы являлось создание и

тидной последовательности практически иден&

тестирование CRISPR&опосредованных систем

тичен SMN1. Различия между этими двумя гена&

для коррекции однонуклеотидной замены

ми сводятся к нескольким однонуклеотидным

с.840С>Т в 7&м экзоне гена SMN2 в фиброблас&

заменам, одна из замен с.840С>Т находится в

тах, индуцированных плюрипотентных стволо&

7&м экзоне и приводит к тому, что большая часть

вых клетках и предшественниках моторных ней&

зрелых транскриптов (~90%) гена SMN2 не со&

ронов. Первоочередной задачей являлось внесе&

держит в своем составе 7&го экзона, в результате

ние двуцепочечного разрыва в непосредственной

с такой мРНК транслируется укороченный не&

близости от данной замены, поскольку для эф&

стабильный белок, не способный исполнять

фективной рекомбинации расстояние между раз&

свои функции [3]. Предложено две гипотезы,

рывом ДНК и участком, в котором локализована

которые объясняют механизм данного наруше&

целевая замена, не должно превышать 20 нуклео&

ния. Первая предполагает, что в результате мута&

тидов [8]. Для этого были подобраны направляю&

ции в 7&м экзоне гена SMN2 прерывается после&

щие РНК для системы CRISPR/Cas9 и CRISPR/

довательность экзонного энхансера сплайсинга,

Cpf1, которые вносят двуцепочечные разрывы

в результате не происходит связывание факто&

максимально близко к целевой замене, обеспе&

ров сплайсинга и распознавание сайтов сплай&

чивая тем самым увеличение частоты гомологич&

синга, следовательно, экзон 7 не включается в

ной рекомбинации. Также был разработан ди&

зрелую мРНК [4]. Вторая гипотеза предполагает,

зайн донорных молекул, включающих как плаз&

что образуется экзонный сайленсер сплайсинга,

мидный вектор с селекционной кассетой, так и

который препятствует включению 7&го экзона в

короткие одноцепочечные олигонуклеотиды.

зрелую мРНК [5]. В силу нестабильности данно&

го района, количество копий гена SMN2 может

значительно варьировать. Чем больше копий

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

SMN2 в геноме, тем больше полноразмерного

белка, и, соответственно, легче проявление

Плазмидные конструкции. Карты плазмид&

симптомов заболевания. Было показано, что

ных векторов pX552_miCMV_Puro_SMN,

число копий гена SMN2 коррелирует с тяжестью

pUC19_SMN2_contr и pUC19_SMN2_mut были

СМА [6]. Большинство пациентов со спиналь&

построены с помощью программного обеспече&

ной мышечной атрофией I типа имеют две ко&

ния SnapGene. Для сборки использовали ампли&

пии гена SMN2, больные СМА II типа имеют

фицированные фрагменты ДНК генов SMN1 и

три копии гена SMN2, при СМА III типа обна&

SMN2, фрагменты

615-818 п.н. плазмиды

руживается три или четыре копии SMN2.

pcDNA

3.1(&)

(«Invitrogen», США),

6775-

В группе условно здоровых людей в среднем

7374 п.н. плазмиды w&159&1, которая была лю&

присутствует 1-2 копии гена SMN2.

безно предоставлена E. Campeau и P.Kaufman

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

1324

ВАЛЕТДИНОВА и др.

(Addgene plasmid

17481).

Плазмиды

Сортировка клеток. Сортировку клеток про&

pSpCas9(BB)&2A&GFP (pX458) и pY010 любезно

водили на приборе S3e Cell Sorter («Bio&Rad»,

предоставлены F. Zhang (Addgene plasmid

США) через 48 ч после трансфекции.

# 48138 и # 69982), pTE4560 любезно предостав&

Выделение ДНК и ПЦР. Выделение геном&

лена E. Welker (Addgene plasmid # 107526). Ампли&

ной ДНК проводили с помощью Quick&DNA

фикацию фрагментов ДНК проводили с приме&

Miniprep Kit («Zymo Research», США), очистку

нением полимеразы Phusion Hot Start II

продуктов ПЦР осуществляли с использовани&

(«Thermo Fisher Scientific», США) на амплифи&

ем набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit

каторе С&1000 («Bio&Rad», США). Праймеры ис&

(«Zymo Research», США). Амплификацию фраг&

пользованные в работе, указаны в табл. 1. Сбор&

ментов ДНК проводили с применением набора

ку плазмид осуществляли с применением клас&

BioMaster HS&Taq PCR&Color 2x («Biolabmix»,

сических методов молекулярного клонирова&

Россия) на амплификаторе С&1000. Условия

ния, а также с использованием метода Golden

проведения ПЦР: 95 °С - 5 мин, 35 циклов:

Gate («NEB», США). Плазмидные клоны секве&

95 °С - 30 c, 59 °С - 30 с, 72 °С - 30 с, далее

нировали на автоматическом секвенаторе ABI

72 °С - 5 мин. Праймеры указаны в табл.1.

3130XL Genetic Analyser («Applied Biosystems»,

Выделение РНК и ПЦР в реальном времени.

США) в центре коллективного пользования «Ге&

РНК из культур клеток выделяли с помощью

номика» СО РАН. Выделение плазмидной ДНК

TRIzol Reagent

(«Thermo Fisher Scientific»,

осуществляли с помощью PureLink High Pure

США), согласно инструкции производителя.

Plasmid Midiprep («Invitrogen», США).

Синтез кДНК проводили с использованием

Дизайн направляющих РНК и донорных моле

Super Script III Reverse Transcriptase («Thermo

кул. Дизайн направляющих РНК и донорных

Fisher Scientific», США). ОТ&ПЦР в реальном

молекул осуществлялся с помощью онлайн&ре&

времени проводили с использованием BioMaster

сурса http://benchling.com.

HS&qPCR SYBR Blue 2x («Biolabmix», Россия) на

Культивирование фибробластов, ИПСК. В ра&

амплификаторе LightCycler 480 («Roche», Герма&

боте использовались фибробласты f1SMA и две

ния) в течение 40 циклов. Каждый цикл состоял

линии индуцированных плюрипотентных ство&

из двух стадий: 95 °С - 15 c, 60 °С - 1 мин. Зна&

ловых клеток ICGi005&A и ICGi005&B от паци&

чения C_T были нормализованы на GAPDH с ис&

ента со СМА I типа, охарактеризованные ранее

пользованием ΔΔCT&метода.

[9]. Фибробласты культивировались в среде

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Имму&

DMEM/F&12 с добавлением 10% FBS, 0,1мМ

нофлуоресцентное окрашивание проводили

NEAA, 1 мМ GlutaMax, 100x Pen/Strep («Gibco»,

согласно протоколу: фиксация в 4%&ном раст&

США). Клетки пересаживали в соотношении 1:3

воре формальдегида («Sigma», США) в течение

каждые 5 дней с помощью реагента TrypLE

15 мин при комнатной температуре, пермеаби&

(«Gibco», США). ИПСК культивировали в среде

лизация в 0,5% (v/v) Triton&X100 («Sigma»,

KnockOut DMEM с добавлением 15% KnockOut

США) 30 мин при комнатной температуре, бло&

Serum Replacement,

0,1мМ NEAA,

1 мМ

кировка в 1%&ном BSA («Sigma», США) 30 мин.

GlutaMax,

100x Pen/Strep

(«Gibco», США),

Инкубацию с первичными антителами к OLIG2

2&mercapthoethanol («Sigma», США) и 10 нг/мл

(AB9610, разведение 1:500) («EMD Milipore»,

bFGF («BioLegend», США). Клетки пересажива&

США) проводили в течение 16 ч при 4 °C, со вто&

ли дважды в неделю в соотношении 1:10 с по&

ричными - Alexa Fluor 568 goat anti rabbit IgG

мощью реагента TrypLE.

(H+L) (A11011, разведение 1 : 400) («Thermo

Получение и культивирование ПМН. Диффе&

Fisher Scientific», США) 1,5-2 ч при комнатной

ренцировка ИПСК до стадии предшественни&

температуре. DAPI («Sigma», США) был исполь&

ков моторных нейронов (ПМН) проводили со&

зован для окраски ядер. Анализ препаратов про&

гласно протоколу Du et al., [10] 2014. Клетки пе&

водили на флуоресцентном микроскопе NIS&

ресаживали с помощью фермента Accutase

Elements Eclipse Ti&E («Nikon», Япония).

(«Gibco», США) в соотношении 1:3-1:4 дважды

Анализ целевой и нецелевой активности

в неделю.

CRISPR систем. Оценку эффективности редак&

Трансфекция фибробластов, ИПСК и ПМН.

тирования целевых и нецелевых последователь&

Трансфекцию ИПСК и фибробластов проводи&

ностей CRISPR&системами проводили с по&

ли на приборе Neon Transfection System

мощью алгоритма TIDE (для инсерций/деле&

(«Thermo Fisher Scientific», США) согласно

ций) и TIDER (для однонуклеотидной замены

инструкции производителя. Использовали 5 мкг

с.840С>Т в 7&м экзоне гена SMN2).

плазмидной ДНК на 500 тыс. клеток, или 3 мкг

Статистическая обработка данных. Статисти&

плазмидной ДНК и 2 мкл 100 мкМ донорного

ческая обработка данных проведена в програм&

олигонуклеотида.

ме STATISTIC 10.0 с использованием критерия

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

КОРРЕКЦИЯ ЗАМЕНЫ с.840С>Т

1325

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе

Название

Ген

Последовательность 5'→3', назначение

GA_F2

SMN2

AAGTGATTCTCCTGCCTCAACC

детекция целевой встройки, TIDE, TIDER

GA_R1

SMN2

CACAACCAACCAGTTAAGTATGAG

детекция целевой встройки, TIDE, TIDER

NT1_F

LOC105376917

TAGGTAACACAAAGCTCATCCC