БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 9, с. 1335 - 1343

УДК 612.743

НИЗКИЕ ДОЗЫ УАБАИНА И АМФ АКТИВИРУЕМАЯ

ПPОТЕИНКИНАЗА КАК ФАКТОРЫ ПОДДЕРЖАНИЯ

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗА СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ

В.В. Кравцова¹, Н.А. Вильчинская², В.Л. Розломий¹,

Б.С. Шенкман², И.И. Кривой¹*

¹ Cанкт Петеpбуpгcкий гоcудаpcтвенный унивеpcитет,

199034 Cанкт Петеpбуpг, Россия; электронная почта: iikrivoi@gmail.com

² Государственный научный центр Российской Федерации -

Институт медико биологических проблем РАН, 123007 Москва, Россия

Поступила в редакцию 11.02.2019

После доработки 24.05.2019

Принята к публикации 07.06.2019

Различные виды двигательной дисфункции сопровождаются устойчивой деполяризацией мембраны ске

летных мышечных волокон за счет нарушения функционирования Na,K АТФазы. Нами впервые исследо

вана возможность участия в поддержании мышечного электрогенеза эндогенных факторов, уровень кото

рых непосредственно связан с двигательной активностью: уабаина (специфического лиганда Na,K АТФазы)

и АМФ активируемой протеинкиназы (ключевого регулятора мышечного метаболизма). В изолированных

диафрагмальных мышцах крыс после введения уабаина (1 мкг/кг/день в течение 4 х суток) зарегистрирова

на гиперполяризация сарколеммы за счет увеличения электрогенной активности Na,K АТФазы. Гиперпо

ляризация, развивающаяся уже через 15 мин, показана и в острых опытах с добавлением наномолярных

концентраций уабаина в раствор. При увеличении концентрации наружного калия менялся знак действия

уабаина и наблюдалась только деполяризация мембраны. Специфическая субклеточная локализация, нали

чие определенных молекулярных партнеров, а также изменение ионного баланса рассматриваются в каче

стве возможных факторов реализации активирующего Na,K АТФазу действия уабаина. В экспериментах с

превентивным введением AICAR (активатор АМФ активируемой протеинкиназы, 400 мг/кг/день в течение

7 сут) показана стабилизация структуры концевых пластинок и отсутствие деполяризации мембраны кам

баловидной мышцы крысы, вызываемой прекращением двигательной активности. Полученные новые фак

ты могут быть полезными с точки зрения поиска путей коррекции мышечной дисфункции, в том числе на

ее ранних этапах, предшествующих развитию выраженной атрофии.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: скелетная мышца, двигательная активность, уабаин, Na,K АТФаза, АМФ активиру

емая протеинкиназа.

DOI: 10.1134/S0320972519090112

Поддержание определенного уровня мемб

ности сопровождаются устойчивым снижением

ранного потенциала покоя (МПП) является

МПП скелетных мышечных волокон [4-6],

важнейшим условием нормального функциони

причем эта деполяризация обусловлена в основ

рования скелетной мышцы. Даже небольшая,

ном нарушением функционирования Na,K

но длительная деполяризация (гиперполяриза

АТФазы [4, 5, 7, 8]. В скелетной мышце грызу

ция) мембраны может быть критически важна с

нов ко экспрессируются α1 и α2 изоформы ка

точки зрения кинетики потенциал зависимых

талитической и транспортной α субъединицы

Na⁺ каналов и возбудимости сарколеммы [1-3].

Na,K АТФазы, различающиеся локализацией и

В связи с этим необходимо отметить, что раз

функциональной специализацией [9]. При дви

личные формы нарушения двигательной актив

гательной дисфункции преимущественно нару

шается функционирование α2 изоформы Na,K

Принятые сокращения: МПП - мембранный по

АТФазы [7, 8, 10].

тенциал покоя, AMPK - АМФ активируемая протеинки

Среди многочисленных факторов, связан

наза, AICAR - 5 aminoimidazole 4 carboxamide 1 β D

ных с двигательной активностью и способных

ribofuranoside, HS - вывешивание задних конечностей,

нХР - никотиновые холинорецепторы, α БТХ - α бунга

влиять на активность Na,K АТФазы, особое

ротоксин.

место занимает эндогенный аналог уабаина, ко

* Адресат для корреспонденции.

торый синтезируется в коре надпочечников и в

1335

1336

КРАВЦОВА и др.

гипоталамусе. Уабаин является ингибитором

томник лабораторных животных», Рапполово,

Na,K АТФазы, специфическим рецептором для

Ленинградская обл., Россия). В экспериментах

него служат внеклеточные участки α субъеди

использовали химические реактивы и уабаин

ницы Na,K АТФазы [11]. Эндогенный уабаин

(«Sigma», США) и AICAR («Toronto Research

циркулирует в наномолярном диапазоне концен

Chemicals», Канада).

траций [12] и рассматривается в качестве нового

В опытах применяли стандартный метод

гормона [11]. Важно, что уровень эндогенного

внутрибрюшинного ежедневного введения уа

уабаина существенно повышается при мышеч

баина в дозе 1 мкг/кг/день в течение 4 х суток,

ной активности

[13] и, предположительно

что повышает уровень циркулирующего уабаи

действуя через α2 изоформу Na,K АТФазы,

на в сыворотке крови крыс с 0,9 до 1,7 нМ [17].

этот лиганд является регулятором работоспо

Контрольным крысам вводили

0,9% NaCl.

собности скелетной мышцы [14]. Хотя уабаин

В части опытов уабаин в концентрациях

является специфическим ингибитором Na,K

5-100 нМ добавляли в омывающий изолиро

АТФазы, для ряда клеток показана способность

ванную мышцу раствор.

уабаина активировать Na,K АТФазу при субна

В хронических экспериментах с применени

номолярных концентрациях, сопоставимых с

ем AICAR (5 aminoimidazole 4 carboxamide 1

уровнем его эндогенного аналога [15-19]. Что

β D ribofuranoside) крысы были разделены на

касается скелетной мышцы, такая способность

четыре группы: контрольная и две группы крыс,

уабаина влиять на Na,K АТФазу исследована не

которых подвергали вывешиванию задних ко

была.

нечностей (hindlimb suspension, HS) в течение 12

Другим фактором, непосредственно связан

ч традиционным способом [27]. Одну группу пе

ным с мышечной активностью, является АМФ

ред вывешиванием подвергали обработке

активируемая протеинкиназа (AMP activated

AICAR (400 мг/кг/день) - группа (HS+AICAR),

protein kinase, AMPK). В камбаловидной мышце

другая группа получала такой же объем физио

крысы снижение уровня фосфорилирования

логического раствора (0,9% NaCl) - группа HS.

AMPK [20-22], сопровождающееся снижением

Контрольные животные получали только инъ

электрогенной активности α2 изоформы Na,K

екции физиологического раствора. AICAR или

АТФазы [8], наблюдается уже в первые сутки

физиологический раствор вводили внутрибрю

двигательной разгрузки, и оба эти феномена от

шинно раз в день в течение 7 суток, как описано

носятся к наиболее ранним событиям, предше

ранее [20]. Четвертая группа - полностью интакт

ствующим развитию атрофии. Важно отметить,

ные животные. Поскольку само по себе введе

что в скелетной мышце AMPK, ключевой регу

ние физиологического раствора никак не влия

лятор мышечного метаболизма [23], влияет так

ло на изучаемые характеристики, данные по ин

же и на активность Na,K АТФазы [24, 25].

тактным крысам не приводятся.

Хотя способность эндогенного уабаина и

Сразу после выделения исследуемую мышцу

AMPK влиять на активность Na,K АТФазы из

с отрезком нерва помещали в эксперименталь

вестна, возможная роль этих факторов в поддер

ную камеру с физиологическим раствором сле

жании МПП скелетных мышечных волокон ра

дующего состава (в мМ): NaCl - 137; KCl - 5;

нее не была исследована. Изучению этого воп

CaCl₂ - 2; MgCl₂ - 2; NaHCO₃ - 24; NaH₂PO₄ - 1;

роса посвящена данная работа. В опытах с хро

глюкоза - 11; pH - 7,4. Раствор постоянно аэри

ническим введением крысам экзогенного уабаи

ровали карбогеном

(95% O₂

+ 5% CO₂).

на моделировали условия повышения уровня

В опытах с регистрацией МПП использовали

циркулирующего эндогенного уабаина. Были

проточный раствор (температура 28 °С). Перед

проведены также хронические эксперименты на

началом эксперимента мышцы выдерживали в

крысах с применением фармакологического

этих условиях в течение 60 мин. Величину МПП

агента AICAR, что, по ряду данных, активирует

регистрировали внутриклеточно с помощью

АМРК и препятствует структурным нарушени

стеклянных микроэлектродов с внутренними

ям нервно мышечного соединения и развитию

капиллярами BF150 110 10 («Sutter Instrument,

симптомов мышечной атрофии [20,26].

Co.», USA), изготовленных на микрокузнице

Sutter P 97 («Sutter Instrument, Co.», USA).

В каждой мышце регистрировали МПП в 25-30

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

волокнах в постсинаптическом и внесинапти

ческом районах сарколеммы, как описано ранее

Работа была проведена на изолированных

[2]. Каждое значение представляет собой ре

нервно мышечных препаратах камбаловидной

зультат измерений МПП не менее чем в 100 во

и диафрагмальной (левая полу диафрагма)

локнах 4-6 диафрагмальных мышц и в 150 во

мышц самцов крыс Wistar весом 190-210 г («Пи

локнах

6-8 камбаловидных мышц. Общий

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

ВЛИЯНИЕ УАБАИНА И AICAR НА МЫШЕЧНЫЙ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ

1337

электрогенный вклад α1 и α2 изозимов Na,K

была зафиксирована гиперполяризация внеси

АТФазы определяли как разницу между исход

наптической мембраны величиной 3,3 ± 0,5 мВ

ным значением МПП и через 30 мин действия

(p < 0,01) по сравнению с контрольными мыш

500 мкМ уабаина [5].

цами (рис. 1, а). В постсинаптическом районе

В части опытов на камбаловидной мышце

сарколеммы, напротив, наблюдали деполяриза

оценивали локализацию никотиновых холино

цию мембраны величиной 3,0 ± 0,6 мВ (p < 0,01)

рецепторов (нХР). Эти опыты проводили при

(рис. 1, б). Чтобы выяснить причину таких изме

температуре 22 °С с использованием меченого

нений МПП, электрогенную активность Na,K

α бунгаротоксина (α БТХ, tetramethylrho

АТФазы в этих же мышцах оценивали по изме

damine α bungarotoxin) («Biotium», USA), как

нению величины МПП через 30 мин после до

описано ранее [28]. Для получения изображе

бавления в омывающий раствор уабаина в кон

ний применяли конфокальную систему Leica

центрации 500 мкМ, полностью блокирующей

TCS SP5 с объективом 63× и числовой аперту

активность обеих изоформ Na,K АТФазы. Такая

рой 1,30 («Leica», Germany); обработку изобра

оценка показала, что у крыс, хронически полу

жений проводили с помощью программы Image

чавших уабаин, электрогенная активность

Pro software («Media Cybernetics Inc.», USA).

Na,K АТФазы во внесинаптическом районе

Статистическую обработку проводили с по

мембраны возрастала (p < 0,01) до -19,5 ± 0,5 мВ

мощью программы Origin (ORIGIN Pro 8 soft

по сравнению с контролем: -16,1 ± 0,5 мВ.

ware). В тексте и на рисунках приведены сред

В постсинаптическом районе, наоборот, наблю

ние значения ± стандартная ошибка (mean ±

далось снижение (p < 0,05) электрогенной ак

± SE).

тивности Na,K АТФазы с -19,0 ± 0,5 мВ в конт

роле до -17,4 ± 0,5 мВ (рис. 1, в и г). Важно, что

полное ингибирование Na,K АТФазы уабаином

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

в концентрации 500 мкМ во всех случаях вызы

вало деполяризацию мембраны до одного и того

Хроническое введение уабаина. В изолиро

же уровня около -62 мВ (рис. 1, а и б). Посколь

ванных диафрагмальных мышцах крыс, полу

ку в отсутствии электрогенного транспорта этот

чавших инъекции уабаина в течение 4 х суток,

уровень МПП в основном определяется прони

Рис. 1. Влияние хронического введения уабаина в дозе 1 мкг/кг в течение 4 х суток на электрогенез мышечных волокон

изолированной диафрагмы крысы во внесинаптическом (а, в) и постсинаптическом (б, г) районах мембраны. а и б - Ве

личины МПП в контрольных и опытных мышцах, вертикальными стрелками отмечены величины МПП через 30 мин

после добавления в раствор 500 мкМ уабаина; в и г - электрогенные вклады Na,K АТФазы в МПП. * р < 0,05 и ** р < 0,01

по сравнению с соответствующим контролем

9 БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

1338

КРАВЦОВА и др.

Рис. 2. Регистрация МПП во внесинаптическом районе мембраны мышечных волокон диафрагмы крысы в опытах с до

бавлением разных концентраций уабаина и/или К⁺ в омывающий раствор. а - Влияние уабаина на МПП при 5 мМ К⁺ в

растворе. Белый столбец - величина МПП через 60 мин действия уабаина (20 нМ) на фоне 6 мМ К⁺. б - Динамика изме

нения МПП при действии уабаина (20 нМ) на фоне разных концентраций наружного К⁺ (момент замены раствора отме

чен вертикальной стрелкой). * р < 0,05 и ** р < 0,01 по сравнению с контролем (без уабаина)

цаемостью мембраны и ионными градиентами

ны, соответствующую эффекту 100 нМ уабаина

(уравнение Goldman-Hodgkin-Katz), можно по

(рис. 2, а). При увеличении концентрации К⁺ до

лагать, что хронические инъекции уабаина не

10 мМ уабаин также вызывал только деполяри

влияли на эти параметры.

зацию (рис. 2, б). Этот результат соответствует

Таким образом, изменения МПП, наблюдае

хорошо известной высокой степени зависимос

мые у крыс, хронически получавших уабаин,

ти связывания уабаина с Na,K АТФазой от кон

объясняются скорее соответствующими изме

центрации наружного К⁺ [29]. Отметим, что

нениями электрогенной активности Na,K

сходную ситуацию наблюдали при исследова

АТФазы, нежели другими факторами.

нии одного из эндогенных модуляторов Na,K

В острых опытах с добавлением уабаина в

АТФазы, который активировал Na,K АТФазу

концентрациях 5-20 нМ в омывающий изоли

при концентрации К⁺ 0,3 мМ, но ингибировал

рованную мышцу раствор (60 мин инкубации)

при концентрации К⁺ 2,5 мМ [30]. Механизм та

наблюдали аналогичную по величине гиперпо

кой реверсии знака действия уабаина неизвес

ляризацию внесинаптической мембраны, кон

тен. Вполне вероятно, что имеют значение ка

центрации 50-100 нМ вызывали деполяриза

кие то особенности конформации Е2 Р, где и

цию (рис. 2, а). Гиперполяризация при действии

происходит конкуренция между уабаином и К⁺.

уабаина в концентрации 20 нМ полностью раз

Мы считаем этот факт весьма важным, посколь

вивалась уже через 15 мин и оставалась стабиль

ку он дополнительно подтверждает вовлечение

ной в течение 60 мин (рис. 2, б). Отметим, что в

Na,K АТФазы в реализацию гиперполяризую

этих опытах гиперполяризацию наблюдали при

щего действия уабаина.

концентрациях значительно превышающих

Учитывая накопление К⁺ в синаптических

уровень эндогенного уабаина [12]. Однако надо

щелях [31] и в Т системе [9] скелетных мышеч

иметь в виду, что эффективность наномолярных

ных волокон при активности, данный фактор

концентраций уабаина может существенно уси

можно расценивать как потенциальный модуля

ливаться при увеличении времени их действия

тор эффектов низких концентраций уабаина.

[19]. Поэтому эффекты кратковременного до

Различная концентрация К⁺ в различных по

бавления уабаина в раствор можно, в опреде

ультраструктуре межклеточных пространствах

ленных пределах, расценивать как моделирова

может быть причиной противоположных эф

ние условий хронического повышения уровня

фектов хронически действующего уабаина в

циркулирующего уабаина.

постсинаптической и внесинаптической облас

Важно отметить, что при увеличении концен

тях мембраны, наблюдаемых в наших опытах.

трации К⁺ в растворе с 5 мМ до 6 мМ уабаин

Уабаин является специфическим ингибито

(20 нМ) вызывал уже деполяризацию мембра ром Na,K АТФазы, однако ряд данных свиде

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

ВЛИЯНИЕ УАБАИНА И AICAR НА МЫШЕЧНЫЙ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ

1339

тельствует о способности уабаина в сверхнизких

концентрациях активировать Na,K АТФазу

[15-19, 32]. Поэтому наблюдаемая нами в хро

нических и острых опытах гиперполяризация

внесинаптической мембраны может быть след

ствием активирующего Na,K АТФазу действия

уабаина в наномолярных концентрациях. Меха

низм этого эффекта остается неясным. Одна из

возможностей заключается в функциональном

взаимодействии Na,K АТФазы с такими моле

кулярными партнерами, как NHE 1 (sodium/

hydrogen exchanger 1) [17] и AT1R (angiotensin

receptor type I) [18]. В частности, предполагает

Рис. 3. Влияние хронического введения AICAR на МПП

ся, что связывание уабаина может усиливать

мышечных волокон камбаловидной мышцы крысы во вне

транслокацию Na,K АТФазы из внутриклеточ

синаптическом (а) и постсинаптическом (б) районах

мембраны. Контроль - крысы, получавшие инъекции

ного пула в плазматическую мембрану [18]. По

NaCl; HS - крысы после 12 ч вывешивания с инъекциями

добный механизм может действовать в условиях

NaCl; HS+AICAR - крысы после 12 ч вывешивания с инъек

хронических инъекций уабаина. Однако в ост

циями NaCl и AICAR. ** р < 0,01 и *** р < 0,001 по сравне

рых опытах гиперполяризация мембраны пол

нию с соответствующей группой животных

ностью развивалась уже через 15 мин действия

уабаина (рис. 2, б). Это время представляется

слишком коротким, чтобы реализовались такие

гиперполяризующие эффекты уабаина наблю

более длительные процессы, как интернализа

даются нами только во внесинаптической об

ция и транслокация Na,K АТФазы [33, 34].

ласти мембраны.

Эффекты наномолярных концентраций уа

Хроническое введение AICAR. В этих опытах

баина могут быть обусловлены изменением со

было установлено, что введение AICAR препят

отношения внутриклеточных концентраций

ствует развитию деполяризации внесинаптичес

Na⁺ и K⁺ [35]. В связи с этим отметим, что акти

кой области мышечной мембраны камбаловид

вирующие эффекты уабаина были показаны

ной мышцы крысы, наблюдаемой через 12 ч разг

преимущественно в интактных клетках, причем

рузки. После применения AICAR мембрана была

наблюдали активацию как α1 [16-19], так и α2

гиперполяризована на 3,5 ± 0,6 мВ (p < 0,001) по

[15] изозимов Na,K АТФазы. Данные, получен

сравнению с условиями разгрузки (рис. 3, а). Ги

ные на бесклеточных препаратах Na,K АТФазы,

перполяризацию наблюдали и в постсинапти

противоречивы: наблюдается как активация

ческой области мембраны (рис. 3, б).

Na,K АТФазы [32], так и ее отсутствие [36, 37].

Число отдельных фрагментов концевых

Если прямое активирующее Na,K АТФазу

пластинок в контроле не изменялось после вы

действие уабаина маловероятно, можно предпо

вешивания, однако площадь фрагментов умень

ложить, что для реализации этого эффекта не

шалась (рис. 4, а-д). Соответственно, общая

обходимы определенные условия, существую

площадь концевых пластинок, оцениваемая как

щие только в интактных клетках. Например,

сумма площадей отдельных фрагментов, после

специфическая субклеточная локализация и на

вывешивания также снижалась (рис. 4, е). Эти

личие определенных молекулярных партнеров,

наблюдения соответствуют данным о дезинте

как это показано для гладкой и сердечной

грации структуры концевых пластинок, наблю

мышц, где эффекты уабаина реализуются в мес

даемой в первые 12 ч вывешивания [22, 28]. В

тах тесного прилегания плазматической мем

условиях введения AICAR число и площадь

браны к саркоплазматическому ретикулуму, ха

фрагментов, а также общая площадь концевых

рактеризующиеся специфической кластериза

пластинок не отличались от контрольных значе

цией α2 изоформы Na,K АТФазы с Na⁺,Са²⁺

ний (рис. 4, г-е). После введения AICAR на

обменником, SERCA, рианодиновыми и IP₃ ре

блюдалось также увеличение уровня относи

цепторами [11]. В скелетной мышце аналогом

тельной флуоресценции α БТХ, что может отра

такого микродомена может быть триадное сое

жать увеличение плотности распределения нХР

динение между Т тубулами и концевыми цис

в мембране. Соответственно возрастала и общая

тернами саркоплазматического ретикулума, где

флуоресценция α БТХ по всей площади конце

локализованы перечисленные выше белки,

вых пластинок (рис. 4, ж и з).

включая Na⁺,Са²⁺ обменник [38] и α2 изофор

АМРК является метаболическим сенсором,

му Na,K АТФазы [9]. Не исключено, что имен

который активируется в условиях сократитель

но по причине такой субклеточной локализации

ной деятельности, когда возрастает потребле

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

1340

КРАВЦОВА и др.

Рис. 4. Влияние хронического введения AICAR на характеристики концевых пластинок камбаловидной мышцы крысы.

а-в - Примеры изображений распределения нХР, меченых α БТХ. Масштаб 10 мкм. г-е - Соответственно, число и пло

щадь отдельных фрагментов, а также общая площадь концевых пластинок; ж - уровень относительной и з - общей флуо

ресценции α БТХ по всей площади концевых пластинок. Контроль - крысы, получавшие инъекции NaCl; HS - крысы

после 12 ч вывешивания с инъекциями NaCl; HS+AICAR - крысы после 12 ч вывешивания с инъекциями NaCl и AICAR.

В каждой серии опытов обработано 64-144 изображений концевых пластинок 6-8 мышц у 3-4 крыс. * р < 0,05; ** р < 0,01

и *** р < 0,001 по сравнению с соответствующей группой животных

ние энергии клеткой и увеличивается внутри

В нашей работе впервые получены данные,

клеточное соотношение АМФ/АТФ. Напротив,

свидетельствующие о том, что превентивное

уже в первые сутки вывешивания наблюдается

введение AICAR способно не только стабили

снижение уровня фосфорилирования AMPK в

зировать структуру концевых пластинок, но и

камбаловидной мышце крысы [20, 22]. Сниже

предотвращать деполяризацию мембраны,

ние уровня фосфорилирования AMPK наблю

вызываемую прекращением двигательной ак

дается и в скелетной мышце человека в услови

тивности.

ях сухой иммерсии [39]. В настоящее время

Необходимо отметить, что AICAR традици

AMРK рассматривается в качестве важнейшего

онно применяется в качестве активатора AMPK,

фактора регулирования метаболизма скелет

и к настоящему времени накоплено большое ко

ных мышц, процессов транскрипции, аутофа

личество данных о специфичности этого влия

гии и многих других, включая механизмы под

ния. В частности, показано увеличение уровня

держания структурно функциональной орга

фосфорилирования АМРК в мышцах при при

низации нервно мышечного соединения [26].

менении AICAR у крыс [20] и мышей [41]. Еди

В частности, хорошо известна роль липидов

ничные работы, описывающие не зависимые от

(прежде всего холестерина) в кластеризации

АМРК эффекты AICAR, как правило, не затра

нХР и поддержании целостности структуры

гивают сигнальную регуляцию энергетических

концевой пластинки, которая нарушается в ус

процессов или регуляцию процессов белкового

ловиях двигательной разгрузки [3, 28]. В связи

синтеза [42].

с этим интересны данные о превентивном эф

Хорошо известно, что различные виды на

фекте введения AICAR в течение 7 суток в ус

рушения двигательной активности сопровож

ловиях нарушения липидного обмена при сни

даются снижением величины МПП скелетных

женной двигательной активности крыс [40].

мышечных волокон. Даже относительно не

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

ВЛИЯНИЕ УАБАИНА И AICAR НА МЫШЕЧНЫЙ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ

1341

большая, но длительная деполяризация ведет к

ки зрения поиска путей коррекции мышечной

инактивации Na⁺ каналов и уменьшению воз

дисфункции, в том числе на ее ранних этапах,

будимости мембраны, нарушению генерации и

предшествующих развитию выраженной атро

проведения потенциалов действия, а также к

фии.

нарушению функционирования системы элек

тромеханического сопряжения; гиперполяри

зация мембраны оказывает противоположное

Финансирование. Работа выполнена при под

действие. Нами впервые показано, что низкие

держке Российского научного фонда (грант

дозы уабаина способны гиперполяризовать

№ 18 15 00043).

мембрану скелетных мышечных волокон за

Благодарности. Авторы выражают благодар

счет увеличения электрогенной активности

ность Ресурсному центру «Развитие молекуляр

Na,K АТФазы. Изоформ специфичность учас

ных и клеточных технологий» Санкт Петербург

тия Na,K АТФазы в этих эффектах требует от

ского государственного университета и лично

дельного анализа. Установлено также, что пре

Н.А. Костину за помощь в проведении работ с

вентивное введение AICAR стабилизирует

конфокальной микроскопией.

структуру концевых пластинок и оказывает

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

протектирующее действие в отношении МПП в

них нет конфликта интересов.

условиях двигательной разгрузки. Необходимо

Соблюдение этических норм. Все примени

дальнейшее исследование механизма этого эф

мые международные, национальные и/или инс

фекта AICAR и его специфичности. Получен

титуциональные принципы ухода и использова

ные новые факты могут быть полезными с точ

ния животных были соблюдены.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Filatov, G.N., Pinter, M.J., and Rich, M.M.

(2005)

9. DiFranco, M., Hakimjavadi, H., Lingrel, J.B., and

Resting potential dependent regulation of the voltage sen

Heiny, J.A. (2015) Na,K ATPase α2 activity in mam

sitivity of sodium channel gating in rat skeletal muscle in

malian skeletal muscle T tubules is acutely stimulated by

vivo, J. Gen. Physiol., 126, 161-172, doi: 10.1085/

extracellular K⁺, J. Gen. Physiol.,

146,

281-294,

jgp.200509337.

doi: 10.1085/jgp.201511407.

Heiny, J.A., Kravtsova, V.V., Mandel, F., Radzyukevich, T.L.,

10. Kravtsova, V.V., Bouzinova, E.V., Machkov, V.V.,

Benziane, B., Prokofiev, A.V., Pedersen, S.E., Chibalin,

Timonina, N.A., Zakyrjanova, G.F., Zefirov, A.L., and

A.V., and Krivoi, I.I. (2010) The nicotinic acetylcholine

Krivoi, I.I. (2019) Abnormal membrane localization of α2

receptor and the Na,K ATPase α2 isoform interact to reg

isoform of Na,K ATPase in m. soleus of dysferlin deficient

ulate membrane electrogenesis in skeletal muscle, J. Biol.

mice, Bull. Exp. Biol. Med., 166, 593-597, doi: 10.1007/

Chem., 285, 28614-28626, doi: 10.1074/jbc.M110.150961.

s10517 019 04398 z.

Krivoi, I.I., and Petrov, A.M. (2019) Cholesterol and the

11. Blaustein, M.P., Chen, L., Hamlyn, J.M., Leenen, F.H.,

safety factor for neuromuscular transmission, Int. J. Mol.

Lingrel, J.B., Wier, W.G., and Zhang, J. (2016) Pivotal role

Sci., 20, 1046, doi: 10.3390/ijms20051046.

of α2 Na⁺ pumps and their high affinity ouabain binding

Tyapkina, O., Volkov, E., Nurullin, L., Shenkman, B.,

site in cardiovascular health and disease, J. Physiol., 594,

Kozlovskaya, I., Nikolsky, E., and Vyskocil, F.

(2009)

6079-6103, doi: 10.1113/JP272419.

Resting membrane potential and Na⁺,K⁺ ATPase of rat

12. Khalaf, F.K., Dube, P., Mohamed, A., Tian, J., Malhotra, D.,

fast and slow muscles during modeling of hypogravity,

Haller, S.T., and Kennedy, D.J. (2018) Cardiotonic

Physiol. Res., 58, 599-603.

steroids and the sodium trade balance: new insights into

Miles, M.T., Cottey, E., Cottey, A., Stefanski, C., and

trade off mechanisms mediated by the Na⁺/K⁺ ATPase,

Carlson, C.G. (2011) Reduced resting potentials in dystroph

Int. J. Mol. Sci., 19, 2576, doi: 10.3390/ijms19092576.

ic (mdx) muscle fibers are secondary to NF kB dependent

13. Bauer, N., Muller Ehmsen, J., Kramer, U., Hambarchian, N.,

negative modulation of ouabain sensitive Na K pump activi

Zobel, C., Schwinger, R.H., Neu, H., Kirch, U.,

ty, J. Neurol. Sci., 303, 53-60, doi: 10.1016/j.jns.2011.01.015.

Grünbaum, E.G., and Schoner, W. (2005) Ouabain like

Kravtsova, V.V., Timonina, N.A., Zakir’yanova, G.F.,

compound changes rapidly on physical exercise in humans

Sokolova, A.V., Mikhailov, V.M., Zefirov, A.L., and Krivoi, I.I.

and dogs: effects of β blockade and angiotensin converting

(2018) The structural and functional characteristics of the

enzyme inhibition, Hypertension,

45,

1024-1028,

motor end plates of dysferlin deficient mice, Neurochem. J.,

doi: 10.1161/01.HYP.0000165024.47728.f7.

12, 305-310, doi: 10.1134/S1819712418040049.

14. Radzyukevich, T.L., Lingrel, J.B., and Heiny, J.A. (2009)

Kravtsova, V.V., Matchkov, V.V., Bouzinova, E.V., Vasiliev, A.N.,

The cardiac glycoside binding site on the Na,K ATPase α2

Razgovorova, I.A., Heiny, J.A., and Krivoi, I.I. (2015)

isoform plays a role in the dynamic regulation of active

Isoform specific Na,K ATPase alterations precede disuse

transport in skeletal muscle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

induced atrophy of rat soleus muscle, Biomed Res. Int.,

106, 2565-2570, doi: 10.1073/pnas.0804150106.

2015, 720172, doi: 10.1155/2015/720172.

15. Gao, J., Wymore, R.S., Wang, Y., Gaudette, G.R.,

Kravtsova, V.V., Petrov, A.M., Matchkov, V.V., Bouzinova, E.V.,

Krukenkamp, I.B., Cohen, I.S., and Mathias, R.T. (2002)

Vasiliev, A.N., Benziane, B., Zefirov, A.L., Chibalin, A.V.,

Isoform specific stimulation of cardiac Na/K pumps by

Heiny, J.A., and Krivoi, I.I. (2016) Distinct α2 Na,K

nanomolar concentrations of glycosides, J. Gen Physiol.,

ATPase membrane pools are differently involved in early

119, 297-312.

skeletal muscle remodeling during disuse, J. Gen. Physiol.,

16. Saunders, R., and Scheiner Bobis, G. (2004) Ouabain

147, 175-188, doi: 10.1085/jgp.201511494.

stimulates endothelin release and expression in human

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

1342

КРАВЦОВА и др.

endothelial cells without inhibiting the sodium pump, Eur.

29.

Kuntzweiler, T.A., Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1996)

J. Biochem.,

271,

1054-1062, doi:

10.1111/j.1432

Asp⁸⁰⁴ and Asp⁸⁰⁸ in the transmembrane domain of the

1033.2004.04012.x.

Na,K ATPase α subunit are cation coordinating residues,

17.

Holthouser, K.A., Mandal, A., Merchant, M.L.,

J. Biol. Chem.,

271,

29682-29687, doi:

10.1074/

Schelling, J.R., Delamere, N.A., Valdes, R.R. Jr.,

jbc.271.47.29682.

Tyagi, S.C., Lederer, E.D., and Khundmiri, S.J. (2010)

30.

Reines, A., Peaa, C., and Rodriguez de Lores Arnaiz, G.

Ouabain stimulates Na K ATPase through a sodium/

(2000) Kinetics of Na⁺, K⁺ ATPase inhibition by an

hydrogen exchanger 1 (NHE 1) dependent mechanism in

endogenous modulator (II A), Neurochem. Res., 25,

human kidney proximal tubule cells, Am. J. Physiol. Renal

121-127.

Physiol., 299, F77-F90, doi: 10.1152/ajprenal.00581.2009.

31.

Matyushkin, D.P., Krivoi, I.I., and Drabkina, T.M. (1995)

18.

Ketchem, C.J., Conner, C.D., Murray, R.D., DuPlessis, M.,

Synaptic feed backs mediated by potassium ions, Gen.

Lederer, E.D., Wilkey, D., Merchant, M., and Khundmiri, S.J.

Physiol. Biophys., 14, 369-381.

(2016) Low dose ouabain stimulates Na K ATPase α1 sub

32.

Tverskoi, A.M., Sidorenko, S.V., Klimanova, E.A.,

unit association with angiotensin II type 1 receptor in renal

Akimova, O.A., Smolyaninova, L.V., Lopina, O.D., and

proximal tubule cells, Biochim. Biophys. Acta, 1863,

Orlov, S.N. (2016) Effects of ouabain on proliferation of

2624-2636, doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.07.008.

human endothelial cells correlate with Na⁺,K⁺ ATPase

19.

Klimanova, E.A., Tverskoi, A.M., Koltsova, S.V.,

activity and intracellular ratio of Na⁺ and K⁺, Biochemistry

Sidorenko, S.V., Lopina, O.D., Tremblay, J., Hamet, P.,

(Moscow), 81, 876-883, doi: 10.1134/S0006297916080083.

Kapilevich, L.V., and Orlov, S.N. (2017) Time and dose

33.

Kotova, O., Al Khalili, L., Talia, S., Hooke, C., Fedorova, O.V.,

dependent actions of cardiotonic steroids on transcriptome

Bagrov, A.Y., and Chibalin, A.V. (2006) Cardiotonic

and intracellular content of Na⁺ and K⁺: a comparative

steroids stimulate glycogen synthesis in human skeletal

analysis, Sci. Rep., 7, 45403, doi: 10.1038/srep45403.

muscle cells via a Src and ERK1/2 dependent mecha

20.

Vilchinskaya, N.A., Mochalova, E.P., Nemirovskaya, T.L.,

nism, J. Biol. Chem., 281, 20085-20094, doi: 10.1074/

Mirzoev, T.M., Turtikova, O.V., and Shenkman, B.S.

jbc.M601577200.

(2017) Rapid decline in MyHC I(β) mRNA expression in

34.

Cherniavsky Lev, M., Golani, O., Karlish, S.J., and Garty, H.

rat soleus during hindlimb unloading is associated with

(2014) Ouabain induced internalization and lysosomal

AMPK dephosphorylation, J. Physiol., 595, 7123-7134,

degradation of the Na⁺/K⁺ ATPase, J. Biol. Chem., 289,

doi: 10.1113/JP275184.

1049-1059, doi: 10.1074/jbc.M113.517003.

21.

Vilchinskaya, N.A., Krivoi, I.I., and Shenkman, B.S.

35.

Orlov, S.N., Klimanova, E.A., Tverskoi, A.M.,

(2018) AMP activated protein kinase as a key trigger for

Vladychenskaya, E.A., Smolyaninova, L.V., and Lopina, O.D.

the disuse induced skeletal muscle remodeling, Int. J. Mol.

(2017) Na_i+,K_i+ dependent and independent signaling trig

Sci., 19, 3558, doi: 10.3390/ijms19113558.

gered by cardiotonic steroids: facts and artifacts, Molecules,

22.

Chibalin, A.V., Benziane, B., Zakyrjanova, G.F.,

22, 635, doi: 10.3390/molecules22040635.

Kravtsova, V.V., and Krivoi, I.I. (2018) Early endplate

36.

Cornelius, F., and Mahmmoud, Y.A. (2009) Interaction

remodeling and skeletal muscle signaling events following

between cardiotonic steroids and Na,K ATPase. Effects of

rat hindlimb suspension, J. Cell. Physiol., 233, 6329-6336,

pH and ouabain induced changes in enzyme conforma

doi: 10.1002/jcp.26594.

tion, Biochemistry,

48.

10056-10065, doi: 10.1021/

23.

Hardie, D.G., Schaffer, B.E., and Brunet, A.

(2016)

bi901212r.

AMPK: an energy sensing pathway with multiple inputs

37.

Lopachev, A.V., Lopacheva, O.M., Nikiforova, K.A.,

and outputs, Trends Cell Biol.,

26,

190-201, doi:

Filimonov, I.S., Fedorova, T.N., and Akkuratov, E.E.

10.1016/j.tcb.2015.10.013.

(2018) Comparative action of cardiotonic steroids on intra

24.

Ingwersen, M.S., Kristensen, M., Pilegaard, H.,

cellular processes in rat cortical neurons, Biochemistry

Wojtaszewski, J.F., Richter, E.A., and Juel, C.

(2011)

(Moscow), 83, 140-151, doi: 10.1134/S0006297918020062.

Na,K ATPase activity in mouse muscle is regulated by

38.

Altamirano, F., Eltit, J.M., Robin, G., Linares, N., Ding, X.,

AMPK and PGC 1α, J. Membr. Biol., 242, 1-10,

Pessah, I.N., Allen, P.D., and López, J.R. (2014) Ca²⁺

doi: 10.1007/s00232 011 9365 7.

influx via the Na⁺/Ca²⁺ exchanger is enhanced in malig

25.

Benziane, B., Bjornholm, M., Pirkmajer, S., Austin, R.L.,

nant hyperthermia skeletal muscle, J. Biol. Chemi., 289,

Kotova, O., Viollet, B., Zierath, J.R., and Chibalin, A.V.

19180-19190, doi: 10.1074/jbc.M114.550764.

(2012) Activation of AMP activated protein kinase stimu

39.

Vilchinskaya, N.A., Mirzoev, T.M., Lomonosova, Y.N.,

lates Na⁺,K⁺ ATPase activity in skeletal muscle cells,

Kozlovskaya, I.B., and Shenkman, B.S. (2015) Human

J. Biol. Chem., 287, 23451-23463, doi: 10.1074/jbc.M111.

muscle signaling responses to 3 day head out dry immer

331926.

sion, J. Musculoskelet. Neuronal Interact., 15, 286-293.

26.

Cervero, C., Montull, N., Tarabal, O., Piedrafita, L.,

40.

Ruegsegger, G.N., Sevage, J.A., Childs, T.E., Grigsby, K.B.,

Esquerda, J.E., and Caldero, J. (2016) Chronic treatment

and Booth, F.W. (2017) 5 Aminoimidazole 4 carboxam

with the AMPK agonist AICAR prevents skeletal muscle

ide ribonucleotide prevents fat gain following the cessation

pathology but fails to improve clinical outcome in a

of voluntary physical activity, Exp. Physiol.,

102,

mouse model of severe spinal muscular atrophy, Neuro

1474-1485, doi: 10.1113/EP086335.

therapeutics, 13, 198-216, doi: 10.1007/s13311 015 0399 x.

41.

Kjobsted, R., Treebak, J.T., Fentz, J., Lantier, L., Viollet, B.,

27.

Morey Holton, E., Globus, R.K., Kaplansky, A., and

Birk, J.B., Schjerling, P., Björnholm, M., Zierath, J.R.,

Durnova, G. (2005) The hindlimb unloading rat model: lit

and Wojtaszewski, J.F. (2015) Prior AICAR stimulation

erature overview, technique update and comparison with

increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an

space flight data, Adv. Space Biol. Med., 10, 7-40.

AMPK dependent manner, Diabetes, 64, 2042-2055,

28.

Petrov, A.M., Kravtsova, V.V., Matchkov, V.V., Vasiliev, A.N.,

doi: 10.2337/db14 1402.

Zefirov, A.L., Chibalin, A.V., Heiny, J.A., and Krivoi, I.I.

42.

Meley, D., Bauvy, C., Houben Weerts, J.H.,

(2017) Membrane lipid rafts are disturbed in the response

Dubbelhuis, P.F., Helmond, M.T., Codogno, P., and

of rat skeletal muscle to short term disuse, Am. J. Physiol.

Meijer, A.J. (2006) AMP activated protein kinase and the

Cell Physiol., 312, C627-C637, doi: 10.1152/ajpcell.

regulation of autophagic proteolysis, J. Biol. Chem., 281,

00365.2016.

34870-34879.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019

ВЛИЯНИЕ УАБАИНА И AICAR НА МЫШЕЧНЫЙ ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ

1343

LOW OUABAIN DOSES AND AMP ACTIVATED PROTEIN KINASE

AS SUPPORTING FACTORS FOR SKELETAL MUSCLE ELECTROGENESIS

V. V. Kravtsova¹, N. A. Vilchinskaya², V. L. Rozlomii¹, B. S. Shenkman², and I. I. Krivoi¹*

¹ Department of General Physiology, St. Petersburg State University,

199034 St. Petersburg, Russia; E mail: iikrivoi@gmail.com

² Myology Laboratory, Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences, 123007 Moscow, Russia

Received February 11, 2019

Revised May 24, 2019

Accepted June 7, 2019

Various types of disorders of motor activity are accompanied by steady depolarization of the membrane of skeletal

muscle fibers due to the disruption of the functioning of Na,K ATPase. We first studied the possibility of participat

ing in the maintenance of muscle electrogenesis of endogenous factors directly related to motor activity, i.e., ouabain

(a specific ligand of Na,K ATPase) and AMP activated protein kinase (a key regulator of muscle metabolism). After

4 day intraperitoneal administration of ouabain (1 μg/kg daily), a hyperpolarization of sarcolemma was registered in

isolated rat diaphragm muscles due to an increase in the electrogenic activity of Na,K ATPase. Hyperpolarization,

which develops already after 15 min, is also shown in experiments with the addition of nanomolar concentrations of

ouabain into the solution with immersed isolated muscle. An increase in the concentration of external potassium

reversed the vector of ouabain action, and only membrane depolarization was observed. Specific subcellular localiza

tion, the presence of certain molecular partners, as well as a change in the ionic balance are considered as possible

factors for the realization of the activation of Na,K ATPase by ouabain. In experiments with 7 day preventive AICAR

(an activator of AMP activated protein kinase, 400 mg/kg daily) administration, the stabilization of the endplate

structure and the absence of depolarization of rat m. soleus membrane caused by cessation of motor activity have been

shown. The obtained facts can be useful for searching for new ways to correct muscle dysfunction, including early

stages, prior to the development of severe atrophy.

Keywords: skeletal muscle, motor activity, ouabain, Na,K ATPase, AMP activated protein kinase

БИОХИМИЯ том 84 вып. 9 2019