БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 1, с. 93 - 103

УДК 577.112

ШАПЕРОННАЯ И ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ

АКТИВНОСТИ Skp ИЗ Yersinia pseudotuberculosis*

Е.В. Сидорин**, В.А. Хоменко, Н.Ю. Ким, Т.Ф. Соловьева

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН,

690022 Владивосток, Россия; электронная почта: sev1972@mail.ru

Поступила в редакцию 20.05.2019

После доработки 20.08.2019

Принята к публикации 10.09.2019

Данная работа посвящена изучению шаперонной и иммуноглобулинсвязывающей активностей рекомбинант

ного белка Skp (rSkp) из Yersinia pseudotuberculosis с помощью методов динамического рассеяния света и по

верхностного плазмонного резонанса. В качестве белков субстратов использовали коммерческие образцы

поликлонального IgG человека, а также Fc и Fab фрагменты IgG человека. Было показано, что активность

rSkp сильно зависит от рН среды. Наиболее устойчивые низкомолекулярные комплексы с гидродинамичес

ким радиусом до 10 нм шаперон образует с белками субстратами при кислом значении рН буферного раст

вора. В этих условиях rSkp Y. pseudotuberculosis показывает наибольшую устойчивость к самоассоциации,

максимальную аффинность связывания с IgG человека и его Fc и Fab фрагментами и наиболее эффектив

но препятствует их агрегации, т.е. демонстрирует максимальную шаперонную активность. По мере увеличе

ния рН среды сила взаимодействия rSkp с IgG и его фрагментами снижается, шаперон не может полностью

предотвратить агрегацию белковых субстратов, но значительно замедляет этот процесс. Полученная инфор

мация может представлять практический интерес, поскольку стабильность терапевтических препаратов IgG

является важной проблемой безопасности и эффективности их применения в медицине.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: шаперон Skp, Yersinia pseudotuberculosis, иммуноглобулин G человека, Fc и Fab

фрагменты IgG, белок белковые взаимодействия, динамическое рассеяние света, поверхностный плазмон

ный резонанс.

DOI: 10.31857/S0320972520010078

В современной литературе накоплено боль

тами Skp как шаперона являются белки наруж

шое количество экспериментальных данных о

ной мембраны бактерий. Skp избирательно свя

полифункциональной активности белков. Од

зывает несвернутые белки наружной мембраны,

ним из ярких примеров такого поведения био

когда они после транслокации через плазмати

полимеров является белок шаперон Skp (seven

ческую мембрану перемещаются в периплазму,

teen kilodalton protein), широко представленный

и защищает их от агрегации [5-7]. Кроме того,

в энтеробактериях. Он относится к семейству

Skp также функционирует как шаперон, кото

гомологичных низкомолекулярных белков

рый помогает в сворачивании растворимых бел

(14-20 кДа) с ярко выраженными основными

ков в периплазме бактерий [8]. В этом качестве

свойствами (pI 9-10) [1-4]. Главными субстра

Skp при его коэкспрессии увеличивает выход и

способствует корректному фолдингу экспресси

Принятые сокращения: rSkp - рекомбинантный бе

рованных белков, включая полноразмерные им

лок Skp (seventeen kilodalton protein); IgG - иммуноглобу

муноглобулины (антитела), их Fab фрагменты и

лин G человека; ДРС - динамическое рассеяние света; многочисленные одноцепочечные производные

Z average - средний гидродинамический радиус частиц об

[9-11]. Наряду со способностью взаимодейство

разца (при анализе кумулянтов); R_H - гидродинамический

радиус частиц (при анализе распределения); ППР - поверх

вать с белками наружной мембраны в качестве

ностный плазмонный резонанс; K_D - кинетическая конс

шаперона, белки Skp обладают и другими свой

танта диссоциации комплекса; k_d

- константа скорости ствами, которые могут быть биологически и фи

диссоциации комплекса; k_a - константа скорости ассоциа

зиологически значимыми. Они проявляют ли

ции комплекса; RU - резонансная единица (resonance unit).

пополисахарид и ДНК связывающую актив

* Первоначально английский вариант рукописи опубли

ности [1, 2, 12, 13] и являются хемоаттрактанта

кован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.

bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19

ми для моноцитов и полиморфноядерных лей

150, 02.12.2019.

коцитов [14]. Между Skp и антигеном гистосов

** Адресат для корреспонденции.

местимости человека HLA B27 существует мо

СИДОРИН и др.

лекулярная мимикрия: в их аминокислотных

В качестве буферных систем применяли PBS

последовательностях имеются гомологичные

(10 мМ NaH₂PO₄, 137 мM NaCl, 2 мM KCl, рН 7,4);

участки [15]. Это позволило предположить, что

50 или 100 мМ СH₃COONa/СH₃COOH, рН 5,0

данные белки могут обладать свойствами анти

(буфер А); 50 мМ Tris НСl, pH 7,4 (буфер Б); 50

генов, иммунологически перекрестно реагиру

или 100 мМ Tris НСl, pH 8,0 (буфер В); 50 мМ

ющих с HLA B27. В то же время показано, что

СH₃COONa/СH₃COOH, рН 6,0 (буфер Г).

гомологичные участки в последовательности

Подготовка образцов IgG человека, Fc5 и Fab5

Skp не распознаются гуморальной иммунной

фрагментов IgG человека, rSkp из Y. pseudotuber

системой пациентов с заболеваниями, связан

culosis. С целью подготовки коммерческого об

ными с HLA B27 [16].

разца каждого белка, выбранного в качестве

Ранее нами было показано, что Skp Yersinia

белка субстрата в реакции связывания с Skp

pseudotuberculosis обладает свойством неиммун

Y. pseudotuberculosis, использовали гель фильт

ным способом (минуя антигенсвязывающие

рацию. Навеску каждого лиофилизованного

участки IgG (антител)) связывать IgG человека и

белка растворяли в воде, полученные растворы

кролика как в виде мономера Skp [17], так и в

пропускали через фильтр 0,45 мкм и проводили

форме гомотримера (Skp₃) [18]. С помощью

гель фильтрацию на колонке Superdex

200

компьютерного моделирования были построе

10/300 GL, предварительно уравновешенной

ны модели пространственной структуры Skp,

раствором PBS. Образцы наносили на колонку в

Skp₃ и его комплексов с Fc и Fab фрагментами

объеме 0,25 мл, скорость элюции составляла

IgG1 человека. На основании полученных моде

0,5 мл/мин. Фракции объемом 0,5-0,7 мл, со

лей было выявлено, что наиболее вероятные

державшие белок, собирали и определяли ин

сайты связывания на молекуле иммуноглобули

тенсивность оптического поглощения элюата

на находятся в области Fc и Fab фрагментов.

при 280 нм. Фракции объединяли по результа

Построенные модели свидетельствуют о том,

там Ds Na ПААГ электрофореза и концентри

что взаимодействие сразу двух молекул Skp₃ с

ровали с помощью центрифужных пробирок

молекулой IgG вполне вероятно. Нами было

для концентрирования (диаметр пор 3 кДа). Об

также установлено, что Skp Y. pseudotuberculosis

щее содержание белка в полученных образцах

связывается с порообразующим белком OmpF и

IgG, Fc и Fab фрагментов определяли методом

фосфолипазой А из наружной мембраны этой

Брэдфорд [20] с использованием лизоцима в ка

бактерии [19].

честве калибровочного белка.

Целью данной работы являлось определение

Рекомбинантный белок Skp (rSkp) Y. pseudo*

качественных и количественных характеристик

tuberculosis экспрессировали в E. coli, выделяли

шаперонной и связывающей активностей Skp в

из клеток и очищали, как описано нами ранее

отношении IgG человека и его Fc и Fab фраг

[18]. Концентрацию rSkp Y. pseudotuberculosis оп

ментов при разных значениях pH среды.

ределяли по УФ спектрам в максимуме погло

щения при 280 нм, принимая величину А^{0,1%1 см}

равной 0,185 (Swiss Prot, P31520 и Q667J8).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ds5Na5ПААГ5электрофорез. Электрофорез

проводили в присутствии Ds Na по методу Лэмм

Материалы. В работе использовали Superdex

ли [21]. Все образцы для электрофореза гото

200 10/300 GL («GE Healthcare», США), акрила

вили без прогревания при 100 °С в буфере для

мид («Serva», Германия); центрифужные пробир

образцов, не содержавшем меркаптоэтанол. В

ки для концентрирования с диаметром пор 3 кДа

качестве маркеров использовали набор окра

Amicon Ultra («Merck Millipore», Германия); Ds

шенных белков с молекулярными массами 11,

Na, 96 луночные микропланшеты ProteOn, сен

17, 24, 33, 40, 55, 72, 100 и 130 кДа. Белки, разде

сорный чип GLC («Bio Rad», США); набор ок

ленные в геле, окрашивали раствором кумасси

рашенных белков маркеров («Fermentas», Лит

R 250 в 10% ной уксусной кислоте и 45% ном

ва); кумасси R 250 («Sigma», США); IgG челове

этаноле.

ка и Fc фрагмент IgG человека

(«ICN

Метод динамического рассеяния света (ДРС).

Biomedicals», США); Fab фрагмент IgG человека

Размер частиц, образованных rSkp Y. pseudotu*

(«MP Biomedicals», США); БСА, овальбумин,

berculosis, белками субстратами и их комплекса

химотрипсиноген, миоглобин, цитохром с («ICN

ми с шапероном в растворе, в зависимости от

Biomedicals», США); целлюлозные мембранные

времени инкубации и рН (5,1; 6,7 и 7,9) опреде

фильтры 0,45 мкм («Agilent», США); PBS, рН 7,4

ляли методом ДРС на приборе ZetaSizer Nano

(«Helicon», Россия). Все остальные реактивы

ZS («Malvern», Великобритания), оснащенном

имели квалификацию х.ч. («Реахим», Россия),

He Ne лазером (λ = 633 нм, 4 мВт), при угле

их использовали без дополнительной очистки.

173°. Измерения проводили в кювете 10 × 10 мм

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Skp

при комнатной температуре (20 °С). Время на

sis с IgG человека и его Fc и Fab фрагментами

копления данных составляло 15-30 мин. Перед

использовали метод ППР. Кинетику связывания

определением размеров частиц готовили смесь

rSkp (аналит) с иммобилизованными на поверх

буферных растворов: 0,24 мл PBS + 0,34 мл

ности сенсорного чипа GLC белками субстра

50 мМ буфера А + 0,62 мл либо 100 мМ буфера А

тами (лиганды) определяли с помощью матрич

(рН 5,1), либо 50 мМ буфера Б (рН 6,7), либо

ного биосенсора ProteOn XPR 36 («Bio Rad»,

100 мМ буфера В (рН 7,9). При выполнении

США). Ковалентную иммобилизацию лигандов

экспериментов, в зависимости от задачи иссле

на чипе проводили с использованием набора ре

дования, использовали PBS, содержавший либо

активов Amin Coupling Kit («Bio Rad», США)

IgG

(0,15 мг/мл), либо Fc фрагмент IgG

согласно инструкции производителя. Уровень

(0,12 мг/мл), либо Fab фрагмент IgG (0,12 мг/мл),

связывания лиганда контролировали по изме

а также 50 мМ буфер А, содержавший rSkp

нению сигнала биосенсора (RU - resonance unit,

(0,28 мг/мл).

резонансная единица). Плотность посадки сос

Расчет Z average (среднего гидродинамичес

тавила 1420 RU для IgG, 690 RU для Fc фраг

кого радиуса частиц образца) и R_H (гидродина

мента и 1060 RU для Fab фрагмента IgG. В каче

мического радиуса) частиц при анализе их объ

стве контрольного канала служил канал без им

емного распределения выполняли с помощью

мобилизованного белка. В ходе выполнения

программного обеспечения к прибору (ZetaSizer

экспериментов использовали буферные систе

Nano ZS, «Malvern», Великобритания).

мы: 50 мМ буферы А, Б, В и Г. Концентрацию

Спектры КД. Спектры КД регистрировали на

аналита изменяли в интервале 0,1-5,0 мкМ. В

Chirascan plus CD спектрометре

(«Applied

каждом эксперименте стадии ассоциации и дис

Photophysics», Великобритания) в кварцевых

социации аналита проводили при скорости по

кюветах с длиной оптического пути 0,1 и 1 см

тока 25 мкл/мин в течение 500 с. Все экспери

для съемки спектров в пептидной и ароматичес

менты осуществляли при температуре 25 °С. Ре

кой областях соответственно. В пептидной об

генерацию поверхности сенсорного чипа вы

ласти спектра КД (190-240 нм) рассчитывали

полняли 50 мМ раствором NaOH при скорости

эллиптичность [θ] среднего остатка, принимая

потока 30 мкл/мин в течение 60 с. Для удаления

молекулярную массу последнего равной 110 Да,

возможных артефактов связывания экспери

по формуле:

ментальные данные, полученные на реакцион

ных поверхностях лиганд-аналит, последова

[θ] = [θ]_набл S × 110/(Cd) (град м² дмоль^-1),

тельно обрабатывали путем вычитания резуль

татов, полученных на контрольных поверхнос

где S - чувствительность шкалы прибора; C -

тях (reference surfaces) и при введении буферных

концентрация белка, мг/мл; d - толщина кюве

систем без образцов белка (blank injections).

ты, см. В ароматической области спектра КД

Дальнейший анализ сенсограмм проводили с

(240-320 нм) рассчитывали молярную эллип

помощью программного обеспечения ProteOn

тичность [θ]_М, принимая молекулярную массу

Manager 3.0 («Bio Rad», США).

белка равной 16,1 кДа. Для снятия спектров КД

rSkp при разных значениях pH среды белок пе

реводили в составные буферные растворы со

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

значениями рН 5,1; 6,7 и 7,9, как описано выше.

Определение олигомерной структуры rSkp

Влияние pH среды на агрегацию Skp Y. pseudo

Y. pseudotuberculosis. Подтверждение олигомер

tuberculosis. Наши наблюдения показали, что

ной структуры rSkp Y. pseudotuberculosis прово

rSkp Y. pseudotuberculosis может длительное вре

дили в нативных условиях с помощью FPLC

мя храниться в буферных растворах с низкими

хроматографа («Amersham Pharmacia Biotech»,

значениями рН (4,0-5,0), сохраняя иммуногло

США) в буфере А методом гель фильтрации на

булинсвязывающую активность, но достаточно

колонке Superdex 200 10/300 GL, как описано

быстро (в течение недели) агрегирует и выпада

нами ранее [18]. Колонку предварительно ка

ет в осадок при нейтральных и основных значе

либровали с помощью белков с известными мо

ниях pH. Поэтому перед изучением шаперон

лекулярными массами: БСА - 67, овальбумин -

ной и иммуноглобулинсвязывающей активнос

45, химотрипсиноген - 24, миоглобин - 18, ци

тей Skp Y. pseudotuberculosis методом динамичес

тохром с - 13 кДа. Относительная ошибка опре

кого рассеяния света (ДРС) было исследовано

деления молекулярной массы составила 7%.

поведение rSkp в растворах в зависимости от

Метод поверхностного плазмонного резонанса

значения рН и времени инкубации. Получен

(ППР). Для получения количественных харак

ные результаты представлены на рис. 1 и в

теристик взаимодействия Skp Y. pseudotuberculo*

табл. 1.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

СИДОРИН и др.

Рис. 1. Объемное распределение по размеру частиц rSkp Y. pseudotuberculosis: а - в буфере с pH 5,0, инкубация в течение

6 дней (сплошная толстая линия); в буфере с pH 6,7, инкубация в течение 4 ч (сплошная тонкая линия) и 24 ч (пунктир

ная линия); б - в буфере с pH 7,9, инкубация в течение 1 ч (сплошная толстая линия), 4 ч (сплошная тонкая линия) и 24 ч

(пунктирная линия)

По данным метода ДРС, rSkp в 50 мМ нат

Пространственная структура rSkp. Влияние

рий ацетатном буфере (рН 5,0) имел в течение

рН на структуру белка изучали с помощью КД

шести дней мономодальное распределение с

спектроскопии и ДРС. Спектры КД rSkp в бу

преимущественным содержанием частиц с R_H и

ферных растворах с рН 5,0; 6,7 и 7,9 в дальней

Z average, равными 3,8 и 6,4 нм соответственно

УФ области имеют одинаковую интенсивность

(рис. 1, а; табл. 1). Подобное распределение час

сигнала и форму с минимумами при 208 и 222 нм,

тиц шаперона по R_H также наблюдалось в тече

что указывает на преобладание в белке α струк

ние первых 4 ч в растворах с нейтральным и ще

туры (рис. 2, а). Спектры остаются неизменны

лочным значениями рН, но при этом величина

ми при инкубации белка в растворе в течение

Z average образцов резко возрастала (табл. 1),

первых 24 ч (1, 4 и 24 ч). При дальнейшей выде

что свидетельствует о начале процесса самоассо

ржке rSkp (72 ч) при рН 5,0 характеристики

циации белка. Дальнейшая инкубация растворов

спектра практически не изменяются, а при

в течение 24 ч приводила к еще большему увели

рН 6,7 и 7,9 заметно уменьшается амплитуда

чению Z average и появлению изменений в рас

спектров при сохранении их формы, что может

пределении частиц по размерам: в растворе с

быть связано с присутствием в растворе белко

рН 6,7 преимущественно сохранялись мелкие

вых агрегатов, которые не определяются мето

частицы (3,6 нм), в то время как в буфере с

дом КД спектроскопии [22].

рН 7,9 частиц с R_H < 200 нм не наблюдалось

Спектры КД rSkp в ближней УФ области

(рис. 1, б). Таким образом, можно сделать вывод

были использованы для выявления возможных

о том, что при изменении значений рН среды от

трансформаций в третичной структуре белка

кислых к щелочным наблюдаются самоассоциа

при изменении рН среды (рис. 2, б). Как изве

ция и агрегация rSkp Y. pseudotuberculosis, и ско

стно, спектры в области 260-320 нм обусловле

рость этих процессов увеличивается с возраста

ны ароматическими аминокислотами. Зрелый

нием рН в направлении к изоэлектрической точ

Skp имеет два остатка Tyr и четыре остатка Phe

ке белка (pI 9,33).

на мономер, часть из которых находится в

конформационно гибкой области молекулы

(α спиральный домен в форме щупалец) [18,

Таблица 1. Средние значения гидродинамических радиусов

) rSkp Y. pseudotuberculosis в водных раство

(Z average и R_H

23]. Как видно на рис. 2, б, наибольшую ампли

рах при разных значениях pH и сроках инкубации

туду и наиболее выраженную тонкую структу

Значение рН

Время

Z average, нм

R_H, нм

ру (пики при 260 и 270 нм, характерные для

инкубации

Phe, и при 278 и 285 нм, относящиеся к Tyr)

имеет спектр белка в буфере с рН 5,0. При рН

5,0

6 дней

6,4

3,8

6,7 наблюдаются небольшие изменения в

6,7

4 ч

61,1

3,7

спектре: немного уменьшается величина сиг

24 ч

341,2

3,5

нала и высота пиков. Возрастание рН до 7,9

приводит к изменению знака спектра, дальней

7,9

1 ч

155,3

4,0

шему уменьшению его амплитуды и сглажива

4 ч

153,9

4,6

24 ч

382,6

319,2

нию при сохранении характеристических пи

ков. Увеличение времени инкубации белка от 1

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Skp

до 72 ч не приводит к существенным изменени

взаимодействия и агрегации молекул IgG

ям в спектрах.

[28-30] и факторов, влияющих на эти процессы

Согласно результатам ДРС, в интервале рН

[31-34], представляет не только фундаменталь

5,0-8,0 наблюдается симметричное мономо

ный, но и прикладной интерес при разработке

дальное распределение rSkp с небольшой шири

лекарственных препаратов. В данной работе мы

ной и R_H, равным (3,7 ± 0,3) нм (рис. 1). Как

наблюдали агрегацию IgG, Fc и Fab фрагмен

видно на рис. 2, в, рекомбинантный белок элю

тов при переводе из PBS в буферные растворы с

ируется с колонки Superdex 200 10/300 GL в ви

меньшей ионной силой с кислым, нейтральным

де одного симметричного пика, который соот

или основным значениями pH. Исследуемые

ветствует белку с кажущейся молекулярной мас

белки демонстрировали увеличение Z average,

сой (45,2 ± 3,0) кДа и, следовательно, тример

ширины распределения по размерам (мульти

ной форме шаперона [18].

модальное распределение) и относительного со

Таким образом, увеличение рН от 5,0 до 7,9

держания (%) частиц с R_H > 10 нм. На рис. 3

не оказывает влияния на вторичную и олигомер

приведены диаграммы относительного содер

ную структуру rSkp, но, возможно, вызывает не

жания (%) частиц при их объемном распределе

которую дестабилизацию третичной структуры.

нии по размеру (R_H) и Z average частиц, образо

Влияние rSkp на агрегацию IgG и его фрагмен5

ванных белками субстратами при разной дли

тов при разных значениях pH среды. В качестве

тельности их инкубации в растворах при трех

белков субстратов для связывания с шапероном

значениях рН (5,1; 6,7 и 7,9 соответственно) в

rSkp использовали коммерческие образцы по

отсутствие (рис. 3, а-в) и в присутствии rSkp

ликлонального IgG, Fc и Fab фрагменты IgG.

Y. pseudotuberculosis (рис. 3, г-е).

Перед проведением экспериментов исследуе

Как можно видеть из диаграмм, IgG, Fc и

мые белки дополнительно очищали с помощью

Fab фрагменты агрегируют с разной скоростью

гельпроникающей хроматографии на колонке

в зависимости от значения рН среды. При кис

Superdex 200 10/300 GL, уравновешенной раст

лых и щелочных значениях pH (рис. 3, а, в) ско

вором PBS. По данным ДРС, образец иммуно

рость агрегации исследуемых белков намного

глобулина в PBS имел мономодальное объемное

выше, чем в нейтральной среде (рис. 3, б), при

распределение по размерам, R_H составлял (5,6 ±

этом в кислых условиях она максимальна.

± 0,5) нм, что согласуется с размером мономера

Рост относительного содержания мелких

IgG, приведенным в литературе [24-27], и вели

частиц с R_H менее 10 и 200 нм при увеличении

чину Z average, равную 17 нм. Образцы Fc и

времени выдерживания в кислых растворах до

Fab фрагментов IgG также демонстрировали

24 ч и более (рис. 3, а), вероятно, связан с обра

мономодальное объемное распределение по

зованием крупных седиментирующих агрегатов,

размерам и имели величины Z average 14 и 11 нм

которые выпадают в осадок из раствора и не

соответственно и R_H (3,3 ± 0,3) нм, одинаковые

учитываются при анализе.

для обоих белков.

C целью изучения возможных шаперонных

В последние годы большое внимание уде

свойств rSkp Y. pseudotuberculosis в отношении

ляется изучению стабильности биофармацев

IgG и его фрагментов, т.е. его способности пред

тических препаратов на основе биологически

отвращать агрегацию исследуемых белков, об

активных белков. Одним из таких белков, по

разуя с ними растворимые комплексы, в раство

лучивших широкое применение в медицине,

ры иммуноглобулинов с разными значениями

является IgG. Изучение различных аспектов

рН добавляли шаперон в молярном соотноше

Рис. 2. Спектры КД rSkp в дальней (а) и ближней (б) областях УФ спектра при значениях pH среды 5,0 (1), 6,7 (2) и 7,9 (3)

в течение 1 ч (сплошная линия) и 72 ч (пунктирная линия). Гель фильтрация rSkp (в) на колонке Superdex 200 HR в 50 мМ

натрий ацетатном буфере, pH 5,0

7 БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Skp

нии Skp₃: IgG (8 : 1) и Skp₃: Fc или Fab фраг

По своим шаперонным свойствам Skp имеет

менты IgG (3,5 : 1) (в расчетах использовали мо

сходство с недавно открытыми гомодимерными

лекулярную массу тримера Skp₃). По данным

шаперонами HdeA и HdeB, которые обеспечива

ДРС, в присутствии rSkp скорость процессов са

ют устойчивость Escherichia coli к кислотному

моассоциации и агрегации белков субстратов

стрессу [38, 39]. Эти шапероны, подобно Skp, на

существенно снижалась: рост относительного

ходятся в периплазме, имеют небольшую моле

содержания (%) частиц с R_H > 10 нм и значений

кулярную массу, являются АТФ независимыми

Z average образцов заметно замедлялся (рис. 3,

и защищают белки периплазмы от разворачива

г-е). В проведенных экспериментах наблюда

ния и агрегации в кислых условиях. Они активи

лось значительное влияние рН среды на прояв

руются при низких значениях рН и функциони

ление rSkp шаперонной активности. В случае

руют в форме частично развернутых мономеров.

кислого значения рН раствора (в условиях наи

В то же время Skp при кислых значениях рН, как

большей стабильности rSkp) шаперон образо

было показано, сохраняет нативную вторичную

вывал с белками устойчивые (до 48 ч) низкомо

и олигомерную структуру. Однако для того чтобы

лекулярные комплексы с R_H до

10 нм

однозначно говорить о различии между выше

(99,5-99,8%; рис. 3, г). В растворах с нейтраль

названными шаперонами по свойствам и меха

ным и щелочным значениями рН (6,7 и 7,9) ша

низму действия, необходимо изучить шаперон

перонная активность rSkp заметно снижалась

ную активность и структуру Skp при более низ

(рис. 3, д, е). При этих значениях рН достаточно

ких значениях рН (< 5), при которых HdeA и

высокое (98,2-99,8%) относительное содержа

HdeB активны и функционируют.

ние образованных в первые 20 мин низкомоле

Кинетические характеристики связывания Skp

кулярных комплексов (R_H до 10 нм) сохранялось

с IgG, Fc5 или Fab5фрагментами при разных значе5

в течение первых 4-5 ч. Исключение составил

ниях pH среды. Для изучения взаимодействия и

раствор, содержавший шаперон с Fab фрагмен

определения количественных характеристик

том IgG при рН 7,9: образующиеся частицы

связывания Skp с IgG человека и его Fc и Fab

имели R_H в интервале 10-200 нм (100%). Даль

фрагментами при разных значениях pH среды

нейшая инкубация растворов в течение 24 и 48 ч

использовали метод поверхностного плазмон

приводила к значительному увеличению доли

ного резонанса (ППР).

крупных частиц (рис. 3, д, е), размер которых

На рис. 4 представлены сенсограммы (экспе

составлял 10-200 нм и более при рН 6,7 и свыше

риментальные и теоретические) связывания

200 нм (100%) при рН 7,9. Полученные результа

rSkp с IgG человека и его фрагментами при раз

ты говорят о том, что при pH 6,7 и 7,9 rSkp не

ных значениях pH среды. Количественные ха

способен полностью предотвратить самоассо

рактеристики связывания: кинетическая конс

циацию и агрегацию IgG и его фрагментов, но

танта диссоциации комплексов (K_D), главный

может существенно замедлять эти процессы.

параметр, определяющий силу связывания ли

В последнее время появляется все больше

ганд-аналит, константы скорости ассоциации и

данных о том, что нарушения в структуре бел

диссоциации комплексов (k_a и k_d соответствен

ков, вызванные изменениями рН среды, влияют

но) - приведены в табл. 2. Графические данные

на их шаперонную активность [35-37]. Полу

(рис. 4) и значения квадратичных отклонений

ченные результаты также хорошо демонстриру

(χ², табл. 2) свидетельствуют в пользу того, что

ют рН зависимый характер шаперонной актив

использованные для аппроксимации получен

ности rSkp Y. pseudotuberculosis. Наиболее устой

ных результатов модели, согласно которым свя

чивые низкомолекулярные комплексы (R_H до

зывание rSkp с Fc и Fab фрагментами IgG наи

10 нм) между шапероном и IgG, Fc или Fab

лучшим образом соответствует кинетической

фрагментами образуются только при кислых

модели «двух состояний», а с IgG - модели «ге

значениях рН среды. При повышении рН шапе

терогенного лиганда», можно считать удовлет

ронная активность rSkp снижается, и агрегация

ворительными для расчета количественных ха

белков субстратов замедляется незначительно.

рактеристик межмолекулярных взаимодействий

На основании полученных нами данных можно

лиганд-аналит. Анализ связывания rSkp с бел

предложить модель ингибирующего действия

ками субстратами при одной концентрации ша

шаперона на рН индуцированную агрегацию

перона и одном значении pH среды (5,0), но

белков, согласно которой rSkp стабильно связы

разной скорости протока аналита через ячейку

вает белки субстраты при низких значениях рН,

(25, 35 и 45 мкл/мин; рис. 5) показал, что в реак

тем самым предотвращая их необратимую агре

ции лиганд-аналит отсутствуют эффекты, огра

гацию, рН нейтрализация реакционной среды

ничивающие массоперенос.

вызывает медленное высвобождение белков из

Константы диссоциации изученных комп

их комплексов с шапероном.

лексов имеют достаточно низкие значения, что

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

100

СИДОРИН и др.

Таблица 2. Количественные характеристики связывания rSkp с IgG человека, Fc и Fab фрагментами IgG при разных

значениях pH среды

Иммуно

k_a, 1/Ms

k_d, 1/s

K_D1,

k_a2, 1/s

k_d2, 1/s

K_D2,

χ²,

глобулин

k_d/k_a

Fc фрагмент

5,0

(1,10 ± 0,02) × 10⁵

(9,1 ± 0,4) × 10-3

8,0 × 10-8

(2,1 ± 0,1) × 10-3

(6,8 ± 0,7) × 10-4

5,7

IgG

6,0

(5,4 ± 2,5) × 10⁴

(1,4 ± 0,3) × 10-1

2,6 × 10-6

(6,1 ± 1,7) × 10-3

(9,0 ± 0,01) × 10-1

2,1

-2

-7

-3

7,4

(3,0 ± 0,2) × 10⁵

(5,6 ± 0,5) × 10

1,9 × 10

(3,6 ± 0,1) × 10

(2,8 ± 0,3) × 10-4

0,8

−3

-7

-3

8,0

(2,50 ± 0,06) × 10⁴

(7,2 ± 0,4) × 10

2,9 × 10

(2,4 ± 0,1) × 10

(4,4 ± 0,2) × 10-4

2,9

Fab фрагмент

5,0

(7,7 ± 0,3) × 10⁴

(2,4 ± 0,3) × 10-3

3,1 × 10-8

(8,1 ± 1,4) × 10-4

(6,7 ± 1,7) × 10-5

2,1

IgG

6,0

(1,6 ± 0,3) × 10⁵

(1,5 ± 0,4) × 10-1

9,7 × 10-7

(8,2 ± 1,6) × 10-3

(4,400 ± 0,006) × 10-1

2,1

-2

-6

-4

7,4

(5,0 ± 0,6) × 10⁴

(8,5 ± 0,7) × 10

1,7 × 10

(6,5 ± 0,7) × 10

(8,7 ± 3,4) × 10-4

0,9

−3

-7

-3

8,0

(4,10 ± 0,08) × 10⁴

(7,5 ± 0,4) × 10

1,8 × 10

(3,0 ± 0,2) × 10

(6,8 ± 0,4) × 10-4

2,1

IgG

5,0

(1,10 ± 0,01) × 10⁵

(6,1 ± 0,2) × 10-4

5,6 × 10-9

(2,3 ± 0,3) × 10⁵

(1,6 ± 0,07) × 10-2

6,9 × 10-8

2,8

-2

-7

6,0

(1,9 ± 0,1) × 10⁵

(5,1 ± 0,4) × 10

2,6 × 10

(5,0 ± 0,3) × 10

(3,6 ± 0,2) × 10-2

7,1 × 10-8

2,9

−2

-8

7,4

(4,4 ± 0,3) × 10⁵

(1,10 ± 0,03) × 10

2,6 × 10

(9,1 ± 0,6) × 10

(4,4000 ± 0,0005) × 10-3

6,5 × 10-7

2,5

8,0

(4,3 ± 0,3) × 10⁴

(4,7 ± 0,5) × 10-2

1,1 × 10-6

(7,3 ± 0,7) × 10⁴

(7,3 ± 0,8) × 10-2

1,0 × 10-6

6,8

указывает на специфические взаимодействия

прежде всего значительным увеличением ско

между компонентами. Сила связывания rSkp с

рости диссоциации комплексов.

IgG человека и его фрагментами сильно зависит

В условиях pH среды, близких к нейтраль

от значений pH среды: при pH 5,0 она является

ным (6,0 и 7,4), наблюдаются наибольшие разли

максимальной со всеми белками субстратами и

чия в кинетике образования и распада комплек

значительно уменьшается при увеличении pH

сов rSkp с белками лигандами. Если при увели

(рис. 6, табл. 2). Уменьшение аффинности взаи

чении pH от 6,0 к 7,4 характер изменения k_d

модействия с ростом величины pH обусловлено

комплексов для Fc и Fab фрагментов IgG оди

Рис. 4. Сенсограммы связывания rSkp с IgG (а), Fc фрагментом (б) и Fab фрагментом (в) IgG человека в буферных раст

ворах, pH среды: 5,0 (1), 6,0 (2), 7,4 (3) и 8,0 (4)

Рис. 5. Сенсограммы связывания rSkp с IgG (а), Fc фрагментом (б) и Fab фрагментом (в) IgG человека в натрий ацетат

ном буфере, pH 5,0, при скорости протока аналита 25 (1), 35 (2) и 45 (3) мкл/мин

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Skp

101

Рис. 6. Зависимость K_D комплексов rSkp Y. pseudotuberculosis с IgG и его Fc и Fab фрагментами от pH среды. Взаимодей

ствие шаперона: а - с Fc фрагментом (сплошная линия) и Fab фрагментом (пунктирная линия); б - с IgG человека;

K_D1 - сплошная линия, K_D2 - пунктирная линия

наков (уменьшение в 2,5 и 1,8 раза соответствен

было описано в литературе [41]. На молекуле IgG

но), то k_a для Fc фрагмента увеличивается в 5,6

при pH 8,0 в сравнении с другими значениями pH

раза, а для Fab фрагмента - уменьшается в 3,2

оба сайта связывания демонстрируют самую низ

раза (табл. 2). Это приводит к тому, что в данном

кую аффинность взаимодействия (рис. 6, б;

интервале pH аффинность связывания с Fc

табл. 2), что хорошо согласуется с проявлением

фрагментом возрастает, а с Fab фрагментом -

rSkp низкой шаперонной активности, наблюдае

уменьшается (рис. 6, а). Полученные данные

мой методом ДРС при pH 7,9 (рис. 3, е). Однако

коррелируют с результатами ДРС, согласно ко

это не исключает того, что значения K_Dмогут

торым шаперонная активность rSkp при pH 6,7

быть занижены по причине самоассоциации rSkp.

выше по отношению к Fc фрагменту, чем к Fab

Проведенное исследование показало, что в

фрагменту IgG (рис. 3, д). Возможно, различия

интервале pH 5,0-8,0 максимальную иммуно

между Fc и Fab фрагментами при взаимодей

глобулинсвязывающую и шаперонную актив

ствии с rSkp объясняются тем, что изоэлектри

ности rSkp Y. pseudotuberculosis проявляет в рас

ческие точки этих белков находятся в области

творе с кислым значением pH, при котором он

рН 6,0-7,4, и при этом Fc фрагмент имеет более

наиболее стабилен. По мере увеличения pH сре

низкое значение pI, чем Fab фрагмент [40]. В

ды наблюдается медленная самоассоциация и

случае IgG характер зависимости величин конс

агрегация шаперона, а также заметное сниже

тант диссоциации от pH в интервале 6,0-7,4 для

ние его связывающих свойств.

сайта с K_D1 подобен таковому для Fc фрагмента,

Полученная информация может представлять

а для сайта с K_D2 совпадает с таковым для Fab

практический интерес в связи с тем, что имму

фрагмента (рис. 6, б). Это позволяет предпола

ноглобулины широко используются в медицине

гать, что K_D1 и K_D2 относятся к связыванию rSkp

в качестве эффективных терапевтических препа

с Fc и Fab фрагментами (соответственно) на

ратов для лечения ряда аутоиммунных заболева

иммобилизованном IgG человека.

ний, рака и других патологий. Агрегаты IgG, ко

При увеличении pH среды от 7,4 до 8,0 аф

торые образуются при длительном хранении,

финность взаимодействия rSkp с Fc фрагментом

увеличивают иммуногенность препаратов, а так

остается неизменной, а с Fab фрагментом - уве

же изменяют их физические свойства, в первую

личивается (рис. 6, а, табл. 2). Эти результаты

очередь вязкость. Контроль над агрегацией явля

плохо соответствуют данным ДРС, согласно ко

ется ключом к производству качественных и ста

торым rSkp имеет самую низкую шаперонную ак

бильных биофармацевтических препаратов.

тивность при pH 7,9 (рис. 3, е). Возможно, это яв

ляется результатом занижения значений K_D за

счет быстрой самоассоциации rSkp в качестве

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

аналита в щелочной среде вблизи изоэлектричес

сутствии конфликта интересов.

кой точки (табл. 1). Подобное кажущееся увели

Соблюдение этических норм. Настоящая

чение аффинности, наблюдаемое методом ППР, с

статья не содержит описания каких либо иссле

ростом размеров агрегатов, участвующих в реак

дований с участием людей или использованием

ции лиганд рецепторного взаимодействия, ранее

животных в качестве объектов.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

102

СИДОРИН и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Holck, A., Lossius, I., Aasland, R., Haarr, L., and Kleppe, K.

16.

Lahesmaa, R., Skurnik, M., Vaara, M., Leirisalo

(1987) DNA and RNA binding proteins of chromatin

Repo, M., Nissila, M., Granfors, K., and Toivanen, P.

from Escherichia coli, Biochim. Biophys. Actа, 908,

(1991) Molecular mimickry between HLA B27 and

188-199, doi: 10.1016/0167 4781(87)90058 3.

Yersinia, Salmonella, Shigella and Klebsiella within the

Holck, A., and Kleppe, K. (1988) Cloning and sequencing of

same region of HLA α₁ helix, Clin. Exp. Immunol., 86,

the gene for the DNA binding 17K protein of Escherichia coli,

399-404, doi: 10.1111/j.1365 2249.1991.tb02944.x.

Gene, 67, 117-124, doi: 10.1016/0378 1119(88)90014 5.

17.

Сидорин Е.В., Зиганшин Р.Х., Набережных Г.А., Лихац

Koski, P., Rhen, M., Kantele, J., and Vaara, M. (1989)

кая Г.Н., Трифонов Е.В., Анастюк С.Д., Черников О.В.,

Isolation, cloning, and primary structure of a cationic 16

Соловьева Т.Ф. (2009) Белок шаперон Skp из Yersinia

kDa outer membrane protein of Salmonella typhimurium,

pseudotuberculosis обладает способностью связывать

J. Biol. Chem., 264, 18973-18980.

иммуноглобулины G, Биохимия, 74, 501-514.

Koski, P., Hirvas, L., and Vaara, M. (1990) Complete

18.

Сидорин Е.В., Тищенко Н.М., Хоменко В.А., Исаева М.П.,

sequence of the ompH gene encoding the 16 kDa cationic

Дмитренок П.С., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Соловье

outer membrane protein of Salmonella typhimurium, Gene,

ва Т.Ф. (2012) Молекулярное клонирование, выделе

88, 117-120, doi: 10.1016/0378 1119(90)90068 3.

ние и характеристика шаперона Skp из Yersinia pseudo*

De Cock, Y., Schafer, U., Potgeter, M., Demel, R., Muller, M.,

tuberculosis, Биохимия, 77, 1571-1583.

and Tommassen, J. (1999) Affinity of the periplasmic chap

19.

Сидорин Е.В., Сидорова О.В., Тищенко Н.М., Хомен

erone Skp of Escherichia coli for phospholipids, lipopoly

ко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. (2015) Шапе

sacharides and nonnative outer membrane proteins. Role of

ронная активность иммуноглобулинсвязывающего

Skp in the biogenesis of outer membrane protein, Eur. J.

белка Yersinia pseudotuberculosis, Биол. мембр., 32,

Biochem., 259, 96-103, doi: 10.1046/j.1432 1327.1999.00010.x.

217-220, doi: 10.7868/S0233475515030081.

Harms, N., Koningstein, G., Dontje, W., Muller, M.,

20.

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for

Oudega, B., Luirink, J., and de Cock, H. (2001) The early

the quantitation of microgram quantities of protein utiliz

interaction of the outer membrane protein PhoE with the

ing the principle of protein dye binding, Anal. Biochem.,

periplasmic chaperone Skp occurs at cytoplasmic mem

72, 248-254, doi: 10.1006/abio.1976.9999.

brane, J. Biol. Chem., 276, 18804-18811, doi: 10.1074/jbc.

21.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins dur

M011194200.

ing the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature,

Соловьева Т.Ф., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю.

227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

(2012) Биогенез β баррельных интегральных белков на

22.

Ioannou, J.C., Donald, A.M., and Tromp, R.H. (2015)

ружной мембраны бактерий, Биохимия, 77, 1459-1477.

Characterizing the secondary structure changes occurring

Entzminger, K.C., Chang, C., Myhre, R.O., McCallum, K.C.,

in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3

and Maynard, J.A. (2012) The Skp chaperone helps fold

buffer, Food Hydrocolloids, 46, 216-225, doi: 10.1016/

soluble proteins in vitro by inhibiting aggregation,

j.foodhyd.2014.12.027.

Biochemistry, 51, 4822-4834, doi: 10.1021/bi300412y.

23.

Walton, T.A., and Sousa, M.C. (2004) Crystal structure of

Mazor, Y., Van Blarcom, T., Mabry, R., Iverson, B.L., and

Skp, a prefoldin like chaperone that protects soluble and

Georgiou, G. (2007) Isolation of engineered, full length

membrane proteins from aggregation, Mol. Cell, 15,

antibodies from libraries expressed in Escherichia coli, Nat.

367-374, doi: 10.1016/j.molcel.2004.07.023.

Biotechnol., 25, 563-565, doi: 10.1038/nbt1296.

24.

Hawea, A., Kasperb, J.C., Friessb, W., and Jiskoot, W.

10.

Levy, R., Weiss, R., Chen, G., Iverson, B.L., and

(2009) Structural properties of monoclonal antibody aggre

Georgiou, G. (2001) Production of correctly folded Fab

gates induced by freeze-thawing and thermal stress, Eur. J.

antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli trxB

Pharm. Sci., 38, 79-87, doi: 10.1016/j.ejps.2009.06.001.

gor mutants via the coexpression of molecular chaperones

25.

Arosio, P., Barolo, G., Muller Spath, T., Wu, H., and

protein expression and purification, Protein Expr. Purif.,

Morbidelli, M. (2011) Aggregation stability of a mono

23, 338-347, doi: 10.1006/prep.2001.1520.

clonal antibody during downstream processing, Pharm.

11.

Sonoda, H., Kumada, Y., Katsuda, T., and Yamaji, H.

Res., 28, 1884-1894, doi: 10.1007/s11095 011 0416 7.

(2011) Effects of cytoplasmic and periplasmic chaperones

26.

Amani, S., Nasim, F., Khan, T.A., Fazili, N.A., Furkan, M.,

on secretory production of single chain Fv antibody in

Bhat, I.A., Khan, J.M., Khan, R.H., and Naeem, A. (2014)

Escherichia coli, J. Biosci. Bioeng.,

111,

465-470,

Detergent induces the formation of IgG aggregates: a multi

doi: 10.1016/j.jbiosc.2010.12.015.

methodological approach, Spectrochimica Acta A Mol. Biomol.

12.

Geyer, R., Galanos, C., Westphal, O., and Golecki, J. (1979)

Spectrosc., 120, 151-160, doi: 10.1016/j.saa.2013.09.141.

A lipopolysaccharide binding cell surface protein from

27.

Esfandiary, R., Parupudi, A., Casas Finet, J., Gadre, D.,

Salmonella minnesota. Isolation, partial characterization and

and Sathish, H. (2015) Mechanism of reversible self asso

occurrence in different Enterobacteriaceae, Eur. J. Biochem.,

ciation of a monoclonal antibody: role of electrostatic and

98, 27-38, doi: 10.1111/j.1432 1033.1979.tb13156.x.

hydrophobic interactions, J. Pharm. Sci., 104, 577-586,

13.

Holck, A., Lossius, I., Aasland, R., and Kleppe, K. (1987)

doi: 10.1002/jps.24237.

Purification and characterization of the 17 K protein, a

28.

Nezlin, R. (2010) Interactions between immunoglobulin G

DNA binding protein from Escherichia coli, Biochim. Biophys.

molecules, Immunol. Lett., 132, 1-5, doi: 10.1016/j.imlet.

Acta, 914, 49-54, doi: 10.1016/0167 4838(87)90160 9.

2010.06.006.

14.

Shrestha, A., Shi, L., Tanase, S., Tsukamoto, M., Nishino, N.,

29.

Joubert, M.K., Luo, Q., Nashed Samuel, Y., Wypych, J.,

Tokita, K., and Yamamoto, T. (2004) Bacterial chaperone pro

and Narhi, L.O. (2011) Classification and characterization

tein, Skp, induces leukocyte chemotaxis via C5a receptor, Am.

of therapeutic antibody aggregates, J. Biol. Chem., 286,

J. Pathol., 164, 763-772, doi: 10.1016/S0002 9440(10)63164 1.

25118-25133, doi: 10.1074/jbc.M110.160457.

15.

Vuorio, R., Hirvas, L., Raybourne, R.B., Yu, D.T.Y., and

30.

Luo, Q., Joubert, M.K., Stevenson, R., Ketchem, R.R.,

Vaara, M. (1991) The nucleotide and deduced amino acid

Narhi, L.O., and Wypych, J. (2011) Chemical modifica

sequence of the cationic 19 kDa outer membrane protein

tions in therapeutic protein aggregates generated under dif

OmpH of Yersinia pseudotuberculosis, Biochim. Biophys.

ferent stress conditions, J. Biol. Chem., 286, 25134-25144,

Acta, 1129, 124-126, doi: 10.1016/0167 4781(91)90226 C.

doi: 10.1074/jbc.M110.160440.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Skp

103

31.

Wang, W. (2005) Protein aggregation and its inhibition in bio

37. Bose, D., Patra, M., and Chakrabarti, A. (2017) Effect of

pharmaceutics, Intern. J. Pharm., 289, 1-30, doi: 10.1016/

pH on stability, conformation, and chaperone activity of

j.ijpharm.2004.11.014.

erythroid & non erythroid spectrin, Biochim. Biophys. Actа

32.

Arosio, P., Rima, S., and Morbidelli, M.

(2013)

Proteins Proteom., 1865, 694-702, doi: 10.1016/j.bba

Aggregation mechanism of an IgG2 and two IgG1 mono

pap.2017.03.012.

clonal antibodies at low pH: from oligomers to larger

38. Malki, A., Le, H. T., Milles, S., Kern, R., Caldas, T.,

aggregates, Pharm. Res., 30, 641-654, doi: 10.1007/

Abdallah, J., and Richarme, G. (2008) Solubilization of

s11095 012 0885 3.

protein aggregates by the acid stress chaperones HdeA and

33.

Gil, D., and Schrum, A.G. (2013) Strategies to stabilize

HdeB, J. Biol. Chem., 283, 13679 -13687, doi: 10.1074/

compact folding and minimize aggregation of antibody

jbc.M800869200.

based fragments, Adv. Biosci. Biotechnol., 4, 73-84,

39. Tapleya, T.L., Korner, J.L., Bargea, M.T., Hupfelda, J.,

doi: 10.4236/abb.2013.44A011.

Schauertec, J.A., Gafnic, A., Jakoba, U., and Bardwella, J.C.A.

34.

Roberts, C.J. (2014) Therapeutic protein aggregation:

(2009) Structural plasticity of an acid activated chaperone

mechanisms, design, and control, Trends Biotechnol., 32,

allows promiscuous substrate binding, Proc. Natl. Acad.

372-380, doi: 10.1016/j.tibtech.2014.05.005.

Sci. USA,

106,

5557-5562, doi:

10.1073/pnas.

35.

Poon, S., Rybchyn, M.S., Easterbrook Smith, S.B.,

0811811106.

Carver, J.A., Pankhurst, G.J., and Wilson, M.R. (2002)

40. Coleman, L., and Mahler, S.M. (2003) Purification of Fab

Mildly acidic pH activates the extracellular molecular

fragments from a monoclonal antibody papain digest by

chaperone clusterin, J. Biol. Chem., 277, 39532-39540,

Gradiflow electrophoresis, Protein Expres. Purif., 32,

doi: 10.1074/jbc.M204855200.

246-251, doi: 10.1016/j.pep.2003.07.005.

36.

Tapley, T.L., Franzmann, T.M., Chakraborty, S., Jakob, U.,

41. Luo, Y., Lu, Z., Raso, S.W., Entrican, C., and Tangarone, B.

and Bardwell, J.C.A. (2010) Protein refolding by pH trig

(2009) Dimers and multimers of monoclonal IgG1 exhibit

gered chaperone binding and release, Proc. Natl. Acad. Sci.

higher in vitro binding affinities to Fcγ receptors, mAbs, 1,

USA, 107, 1071-1076, doi: 10.1073/pnas.0911610107.

491-504.

THE CHAPERONE AND IMMUNOGLOBULIN5BINDING ACTIVITIES

OF Skp PROTEIN FROM Yersinia pseudotuberculosis*

E. V. Sidorin**, V. A. Khomenko, N. Yu. Kim, and T. F. Solov’eva

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far*Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences,

690022 Vladivostok, Russia; E*mail: sev1972@mail.ru

Received May 20, 2019

Revised August 20, 2019

Accepted September 10, 2019

Here, we determined qualitative and quantitative characteristics of the chaperone and immunoglobulin binding activ

ities of recombinant Skp protein (rSkp) from Yersinia pseudotuberculosis using the methods of dynamic light scatter

ing and surface plasmon resonance. Commercial human polyclonal IgG and Fc and Fab fragments of human IgG

were used as substrate proteins. The activity of rSkp strongly depended on the medium pH. The most stable low mole

cular weight complexes with a hydrodynamic radius up to 10 nm were formed by rSkp and protein substrates at acidic

pH values. Under these conditions, rSkp exhibited the lowest propensity to self association and the highest affinity for

human IgG and its Fc and Fab fragments, as well as prevented their aggregation most efficiently (i.e., demonstrated

the maximal chaperone activity). As the medium pH increased, the affinity of rSkp for IgG and its fragments

decreased; rSkp was not able to completely prevent the aggregation of protein substrates, but significantly slowed it

down. The obtained information may be of practical interest, since the stability of therapeutic IgG preparations affects

their safety and efficacy in medical applications.

Keywords: Skp chaperone, Yersinia pseudotuberculosis, human immunoglobulin G, Fc and Fab fragments of IgG, pro

tein-protein interactions, dynamic light scattering, surface plasmon resonance

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020