БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 1, с. 126 - 138

УДК 577.218

СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ мРНК ГЕНА PTPN11 ПРЕПЯТСТВУЕТ

ИЗМЕНЕНИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ

КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, УСТОЙЧИВОСТЬ К ХИМИОТЕРАПИИ

И ОНКОГЕН ИНДУЦИРУЕМОЕ КЛЕТОЧНОЕ СТАРЕНИЕ,

В ОТВЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ ОНКОГЕНА BRAF V600E

В КЛЕТКАХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА^*,**

Л.В. Путляева^1,2, Д.Э. Демин^1,3, А.Н. Уварова^1,4, Л.С. Зиневич⁵,

М.М. Прокофьева¹, Г.Р. Газизова⁶, Е.И. Шагимарданова⁶, А.М. Шварц¹***

¹ Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН,

119991 Москва, Россия; электронная почта: shvarec@yandex.ru

² Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологии, 121205 Москва, Россия

³ Московский физико4технический институт, 141701 Долгопрудный, Россия

⁴ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119234 Москва, Россия

⁵ Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, Россия

⁶ Институт фундаментальной медицины и биологии,

Казанский федеральный университет, 420008 Казань, Россия

Поступила в редакцию 21.09.2019

После доработки 21.09.2019

Принята к публикации 20.10.2019

Сигнальный путь MAPK (RAS/BRAF/MEK/ERK) представляет собой киназный каскад, участвующий в ре

гуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и выживаемости в ответ на внешние стимулы. В раз

личных опухолях обнаруживается мутация V600E гена BRAF, приводящая к 500× усилению киназной актив

ности BRAF. Однако монотерапия селективными ингибиторами BRAF V600E часто приводит к реактива

ции сигнального каскада MAPK и возникновению резистентности к ингибитору, поэтому разрабатываются

новые мишени для дополнительного ингибирования компонентов аберрантно активированного каскада.

Недавно было обнаружено, что резистентность к ингибиторам онкогена BRAF V600E может быть связана с

активностью тирозинфосфатазы SHP 2, кодируемой геном PTPN11. В данной работе мы проанализирова

ли влияние подавления транскрипции PTPN11 на экспрессию генов, задействованных в регуляции проли

ферации, устойчивости к химиотерапии и онкоген индуцируемого старения (ОИС) клеток, в условиях се

лективного подавления BRAF V600E на модели фолликулярного эпителия щитовидной железы. Было пока

зано, что подавление экспрессии PTPN11 с помощью малых интерферирующих РНК действительно пред

отвращает повышение экспрессии генов CCNA1 и NOTCH4, участвующих в формировании лекарственной

устойчивости опухолей, в ответ на действие вемурафениба. С другой стороны, подавление экспрессии

PTPN11 блокирует активацию транскрипции ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и во

влеченных в процесс ОИС: p21, p15, p16, RB1 и IGFBP7, в ответ на экспрессию онкогена BRAF V600E. Та

ким образом, можно предположить, что фосфатаза SHP 2 может участвовать не только в формировании ле

карственной устойчивости опухолевых клеток, но и в развитие процесса ОИС клетки.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: SHP 2, BRAF V600E, опухоли щитовидной железы, онкоген индуцируемое старение.

DOI: 10.31857/S0320972520010108

Принятые сокращения: EGFR - рецептор эпидермального фактора роста, ОИС - онкоген индуцируемое старе

ние, ЩЖ - щитовидная железа, РВ ПЦР - ПЦР в реальном времени.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/

biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19 271, 02.12.2019.

** Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте изда

тельства Springer (https://link.springer.com/journal/10541), том 85, вып. 1, 2020.

*** Адресат для корреспонденции.

126

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

127

Аберрантная активация сигнального пути

Экспрессия PTPN11 повышена и у пациентов с

RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK каскад) способ

опухолями щитовидной железы, она коррелиру

ствует выживанию и метастазированию клеток

ет с низкой степенью дифференцировки опухо

и является часто встречающимся механизмом

лей, высоким уровнем злокачественности и уве

возникновения и прогрессии рака [1]. Одной из

личением количества метастазов в лимфатичес

наиболее часто встречающихся драйверных му

ких узлах [21]. В той же мере высокий уровень

таций, затрагивающих компоненты данного

экспрессии PTPN11 выявляется в тиреоидных

каскада, является мутация BRAF V600E, встре

опухолевых клеточных линиях SW579, IHH 4,

чающаяся во многих типах рака, в частности,

FTC 133, TPC 1, DRO, TA K и ML 1 [21]. На

рака щитовидной железы (ЩЖ) [2]. В клетках,

мышиной модели легочной аденокарциномы и

содержащих белок BRAF V600E, повышены

клеточных моделях рака прямой кишки было

уровни хромосомной нестабильности и митоти

показано, что ингибирование SHP 2 может пред

ческой активности, а также способность к инва

отвращать реактивацию каскада RAS/RAF/

зии за счет MEK зависимого увеличения

MEK/ERK, опосредованную активацией рецеп

экспрессии матричных металлопротеиназ (на

торов эпидермального фактора роста (EGFR)

пример, MMP 3, MMP 9 и MMP 13). BRAF

[22, 23]. Также известно, что подавление экс

V600E содержащие опухоли имеют более агрес

прессии PTPN11 с помощью антисмысловых

сивный характер [3] и ассоциируются с плохим

олигонуклеотидов замедляет рост опухолевых

ответом на терапию радиоактивным йодом и с

клеток и индуцирует апоптоз в тиреоидной кле

повышенной смертностью пациентов [4]. Учи

точной линии SW579 [21]. В то же время сущест

тывая все вышеописанные данные, в последние

вуют данные и о позитивном, и о негативном

годы BRAF V600E стал основной терапевтичес

влиянии активирующих мутаций PTPN11 на ра

кой мишенью в этих видах рака.

боту сигнального каскада Ras/MAPK у больных

SHP 2, кодируемая геном PTPN11, была

с синдромом Нунана [14]. Существуют данные

первой протеинфосфатазой, идентифицирован

об отсутствии влияния ингибирования экспрес

ной как онкоген [5-7]. Она экспрессируется в

сии PTPN11 с помощью shRNA на рост и проли

различных типах клеток и участвует в онкоген

ферацию опухолевой клеточной линии A2058,

ных процессах при лейкемии, раке груди и лег

содержащей мутацию BRAF V600E [24].

кого, регулируя процессы инвазии, метастази

Недавно было обнаружено, что тирозинфос

рования, апоптоза, онкоген индуцированного

фатаза SHP 2 часто активирована в образцах

старения (ОИС), повреждения ДНК, пролифе

меланомы человека и клеточных линиях мела

рации клеток, прогрессии клеточного цикла и

номы. Также было показано, что SHP 2 участву

лекарственной устойчивости [8, 9]. Активность

ет в активации сигнального каскада RAS/

SHP 2, как полагают, играет важную роль в ак

RAF/MAPK в клетках меланомы, экспрессиру

тивации белков семейства Ras

[10,

11],

ющих мутантный белок NRAS, и в клетках,

JAK/STAT, PI3K/Akt и других компонентов сиг

экспрессирующих BRAF дикого типа (WT), а

нальных каскадов [12].

нокдаун PTPN11 приводит к подавлению деле

Инактивация гена PTPN11 приводит к гибе

ния клеток и активации ERK в линиях клеток

ли в эмбриональном периоде и множественным

меланомы человека WM3211 и MeWo [19].

дефектам развития на стадии гаструляции у раз

Вемурафениб (PLX4032) является низкомо

личных типов организмов - мышей, мух, червей

лекулярным ингибитором BRAF V600E и был

[13]. Также к физиологическим функциям SHP 2

одобрен Управлением США по санитарному

относится регуляция функционирования сиг

надзору для терапии метастатической меланомы

нального пути инсулина [14], участие в развитии

в 2011 году [25]. При терапии меланомы и кар

сердца, и центральной нервной системы [15,

циномы щитовидной железы было обнаружено,

16]. В опухолях различной этиологии роль дан

что вемурафениб индуцирует стимуляцию пере

ной фосфатазы различается в зависимости от

дачи сигнала через рецепторные тирозиновые

стадии и локализации опухоли. SHP 2 выполня

киназы (РТК), что может приводить к быстрой

ет роль опухолевого супрессора при раке печени

реактивации и стимуляции передачи сигнала

[17] и раке кости/хряща [18] и напротив, являет

через EGFR [26, 27]. В свою очередь, тирозин

ся онкогеном при лейкемии, раке легких, груди

фосфатаза SHP 2 участвует в передаче сигнала

и меланоме

[19]. Активирующие мутации

от активированных рецепторов EGF к

PTPN11 были обнаружены в пробах, взятых у

p21^Ras (RASА1), к другим сигнальным молеку

больных с острым миелоидным лейкозом, ра

лам, вследствие чего ингибирование SHP 2 мо

ком желудка, глиобластомой и анапластической

жет уменьшать реактивацию MAPK каскада.

крупноклеточной лимфомой, что и позволило

Согласно некоторым данным, вемурафениб мо

определить PTPN11 как протоонкоген [20].

жет вызывать активацию SHP 2 и реактивацию

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

128

ПУТЛЯЕВА и др.

передачи сигнала через MEK ERK при наличии

тализованных клеток эпителия ЩЖ Nthy ori 3 1

экспрессии фактора роста гепатоцитов (HGF) в

(«Sigma», США) выращивали в среде RPMI1640

вемурафениб резистентных клетках [22].

(«ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбрио

Целью данной работы была оценка влияния

нальной телячьей сыворотки («Biosera», Фран

подавления транскрипции PTPN11 на экспрес

ция), L глютамина (2 мМ), смеси пенициллина

сию генов, задействованных в регуляции проли

(100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), а так

ферации, устойчивости к химиотерапии и ОИС

же с добавлением пирувата натрия (1 мМ). На

клеток в условиях селективного подавления

основе данной линии были получены 2 клеточ

BRAF V600E. Для определения групп генов,

ных линии - деривата - трансдуцированные

экспрессия которых меняется наиболее выра

двумя разными вариантами лентивирусных век

женно в данном эксперименте, был проведен

торов: исходным вектором LeGO iPuro2 и векто

транскриптомный анализ. На основе данного

ром iPuro2 BRAF V600E, несущим драйверную

анализа был выбран ряд генов, задействованных

онкогенную мутацию V600E гена BRAF человека.

в регуляции клеточного цикла и реализации

Вирусные частицы были получены, как описано

программы клеточного старения, и для них был

в статье Prokofjeva et al. [29]. Селекцию трансду

произведен анализ экспрессии с помощью ко

цированных клеток на пуромицине (финальная

личественной ПЦР в реальном времени (РВ

концентрация 1 мкг/мл) проводили в течение

ПЦР). В результате данной работы мы обнару

7 дней. Изменение транскрипционной програм

жили, что подавление экспрессии гена PTPN11

мы клетки после встраивания целевых генов до

с помощью малых интерферирующих РНК

полнительно подтверждали с помощью РВ ПЦР

(миРНК, siRNA) снижает влияние экспрессии

с использованием праймеров CCND1 F/R,

онкогена BRAF V600E на транскрипцию ряда

PAPSS2 F/R, FBLN1 F/R, (таблица), а также с

генов, участвующих в регуляции клеточного

помощью анализа данных экспрессионного про

цикла. В частности, подавление транскрипции

филирования.

PTPN11 препятствует повышению экспрессии

Подавление экспрессии гена PTPN11 и селек

(в ответ на действие BRAF V600E и/или вемура

тивное подавление BRAF V600E. Для ингибиро

фениба) генов, вовлеченных в онкоген индуци

вания BRAF V600E использовали селективный

рованное старение: RB1, p21, p15, p16 и IGFBP.

ингибитор - вемурафениб (PLX4032, «Selleck»,

Это позволяет предполагать, что тирозинфос

США) в концентрации 1 мкM. Подавление гена

фатаза SHP 2 участвует в индукции ОИС клетки

PTPN11 в клетках Nthy ori 3.1 и Nthy ori 3.1/

и, возможно, за счет этого выполняет функцию

BRAF V600E проводили с помощью малых ин

опухолевого супрессора.

терферирующих РНК, для трансфекции ис

пользовали реагент RNAiMAX («Thermo fisher

scientific», США) согласно протоколу произво

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

дителя. В случае совместного использования

миРНК добавлялись через 72 ч после добавле

Клонирование лентивирусных векторов, со

ния вемурафениба. Для нокдауна гена PTPN11

держащих кодирующую последовательность гена

использовали ранее опубликованные последо

BRAF с мутацией V600E. Для клонирования гена

вательности миРНК и последовательности со

BRAF, содержащего онкогенную мутацию

ответствующих контрольных sсRNA

[30]

V600E, 5′ конец гена BRAF вырезали из коммер

(табл. S1 Приложения).

чески доступной плазмиды pBABE Puro

Выделение РНК, синтез кДНК и количествен

BRAF(V600E) («Addgene», США) [28] по сайтам

ная РВ ПЦР. Суммарная РНК из клеточных ли

рестрикции BamHI и MunI, а 3′ конец ампли

ний Nthy ori 3 1 и Nthy ori 3 1/BRAF V600E бы

фицировали с помощью ПЦР, используя прай

ла выделена с использованием реагента Trizol

меры BRAF in Mun F и BRAF Not R (табли

(«Invitrogen», США) согласно инструкции про

ца). В качестве вектора использовали коммер

изводителя. Реакцию обратной транскрипции

чески доступную плазмиду LeGO iPuro2, содер

проводили с использованием 2 мкг тотальной

жащую ген устойчивости к пуромицину

РНК при помощи набора MMLV RT Kit («Евро

(«Lentiviral Gene Ontology Vectors», Германия). В

ген», Россия). Количественный ПЦР анализ

последовательность плазмиды заранее вводили

проводили, как описано в статье Schwartz et al.

сайты рестрикции BamHI (5′ конец) и NotI

[31]. Последовательности праймеров приведены

(3′ конец) для клонирования в лентивирусный

в соответствующем разделе таблицы.

вектор. Последовательности всех использован

Вестерн блот анализ. Вестерн блот анализ

ных в работе праймеров приведены в таблице.

проводили, как описано в статье Afanasyeva et al.

Работа с клеточной линией и трансдукция ленти

[32]. Лизаты клеток смешивали в соотношении

вирусными векторами. Клеточную линию иммор

3/1 с 4× буфером Лэммли, инкубировали 5 мин

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

129

Последовательности использованных в работе праймеров

Название праймера

5′ 3′ последовательность праймеров

Описание

PTPN11 F

5′

CGGTGAATGACTTTTGGCGG 3′

праймеры для анализа

PTPN11 R

5′

GTTCCTAACACGCATGACGC 3′

экспрессии PTPN11

PTPN11siRNA F

5′

GGAGAACGGUUUGAUUCUUTT 3′

РНК олигонуклеотиды с двумя

PTPN11siRNA R

5′

AAGAAUCAAACCGUUCUCCTCtt 3′

дезоксирибонуклеотидами на

3′ конце, используемые для

получения siRNA

PTPN11scRNA F

5′

AGUACAGCAAACGAUACGGtt 3′

РНК олигонуклеотиды с двумя

PTPN11scRNA R

5′

CCGUAUCGUUUGCUGUACUtt 3′

дезоксирибонулеотидами на

3′ конце, используемые для

получения scRNA

bACT F

5′

TGCGTGACATTAAGGAGAAG 3′

праймеры для анализа

bACT R

5′

GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT 3′

экспрессии β актина

GAPDH F

5′

CAAGGTCATCCATGACAACTTTG 3′

праймеры для анализа

GAPDH R

5′

GGCCATCCACAGTCTTCTGG 3′

экспрессии GAPDH

CCND1 F

5′

GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3′

праймеры для анализа

CCND1 R

5′

TGTGAGGCGGTAGTAGGACA 3′

экспрессии CCND1

PAPSS2 F

5′

TGCACTTTGACACCCTGCT 3′

праймеры для анализа

PAPSS2 R

5′

CAGCGTTCCTCTTTTCTGTGT 3′

экспрессии PAPSS2

FBLN1 F

5′

ATCAGAAGGACTGCTCGCTG 3′

праймеры для анализа

FBLN1 R

5′

ATGGCAGCACCTCTTCACAA 3′

экспрессии FBLN1

BRAF in Mun F

5′

TGATGATGAGAGGTCTAATCCCAGAGTG 3′

праймеры для клонирования

BRAF Not R

5′

TTTTGCGGCCGCTCAGTGGACAGGAAACGCACCA 3′

C конца BRAF(V600E)

P21 F

5′

ACTCTCAGGGTCGAAAACGG 3′

праймеры для анализа

P21 R

5′

GATGTAGAGCGGGCCTTTGA 3′

экспрессии p21

MAPK3 F

5′

CACCCTGGAAGCCATGAGAG 3′

праймеры для анализа

MAPK3 R

5′

TGGCGGAGTGGATGTACTTG 3′

экспрессии MAPK3 (ERK1)

CCNA1 F

5′

TAGGGCTGCTAACTGCAAATGG 3′

праймеры для анализа

CCNA1 R

5′

CCGGTGTCTACTTCATACACATCC 3′

экспрессии CCNA1

CCND2 F

5′

ATCCGCAAGCATGCTCAGAC 3′

праймеры для анализа

CCND2 R

5′

GCTCAGTCAGGGCATCACAA 3′

экспрессии CCND2

CCNG2 F

5′

GCCCAGAACCTCCACAACAG 3′

праймеры для анализа

CCNG2 R

5′

GGTGCACTCTTGATCACTGG 3′

экспрессии CCNG2

CDKN1C F

5′

AAGAGATCAGCGCCTGAGAAG 3′

праймеры для анализа

CDKN1C R

5′

TGGGCTCTAAATTGGCTCACC 3′

экспрессии CDKN1C

Notch4 F

5′

GGAGGAAGAAGAGGGGCAGT 3′

праймеры для анализа

Notch4 R

5′

CCCTCTGGGTCTGACCACT 3′

экспрессии Notch4

CCNC F

5′

AGTTATTGCCACTGCTACGGT 3′

праймеры для анализа

CCNC R

5′

AGCAGCAGCAATCAATCTTGT 3′

экспрессии CCNC

CCNB2 F

5′

AGTTCCAGTTCAACCCACCAA 3′

праймеры для анализа

CCNB2 R

5′

TTGCAGAGCAAGGCATCAGA 3′

экспрессии CCNB2

DUSP6 F

5′

ACCTGGAAGGTGGCTTCAGT 3′

праймеры для анализа

DUSP6 R

5′

GCACTATTGGGGTCTCGGTC 3′

экспрессии DUSP6

Mek1 F

5′

ATGCCCAAGAAGAAGCCGAC 3′

праймеры для анализа

Mek1 R

5′

GCTCTAGCTCCTCCAGCTTC 3′

экспрессии Mek1

9 БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

130

ПУТЛЯЕВА и др.

Окончание таблицы

P15 F

5′ GGGAAAGAAGGGAAGAGTGTCGTT 3′

праймеры для анализа

P15 R

5′ GCATGCCCTTGTTCTCCTCG 3′

экспрессии p15

P16 F

5′ GGGGGCACCAGAGGCAGT 3′

праймеры для анализа

P16 R

5′ GGTTGTGGCGGGGGCAGTT 3′

экспрессии p16

IGFBP7 F

5′ GGCATGGAGTGCGTGAAGAG 3′

праймеры для анализа

IGFBP7 R

5′ CTTGCTGACCTGGGTGATGG 3′

экспрессии IGFBP7

LeGO BRAF F

5′ TTCACCGCAGTGCATCAGAA 3′

праймеры для анализа

LeGO BRAF R

5′ AAACGCACACCGGCCTTATT 3′

экспрессии лентивирусного

вектора, содержащего ген

BRAF V600E

IL8 F

5′ ACCACCGGAAGGAACCATCT 3′

праймеры для анализа

IL8 R

5′ GAATTCTCAGCCCTCTTCAA 3′

экспрессии IL8

VEGFA F

5′ CTTGCCTTGCTGCTCTACCT 3′

праймеры для анализа

VEGFA R

5′ GCAGTAGCTGCGCTGATAGA 3′

экспрессии VEGFA

RB1 F

5′ GGACCGAGAAGGACCAACTG 3′

праймеры для анализа

RB1 R

5′ CTTCTGGGTCTGGAAGGCTG 3′

экспрессии RB1

IL6 F

5′ CATCCTCGACGGCATCTCA 3′

праймеры для анализа

IL6 R

5′ CAGGCAAGTCTCCTCATTGAA 3′

экспрессии IL6

при 95 °С и вносили в 10% ный ПААГ из расче

там кДНК были лигированы адаптеры, после

та 30 мкг белка на лунку. Анализ фосфорилиро

чего библиотеки были баркодированы, ампли

ванного варианта белка Erk1/2 проводили с ис

фицированы и очищены на магнитных части

пользованием антител Phospho p44/42 MAPK

цах. Все вышеперечисленные этапы были вы

(Erk1/2) (Thr202/Tyr204) («Cell signaling», США)

полнены с помощью набора реагентов NEBNext

в разведении 1 : 2000 согласно протоколу произ

Ultra II Directional RNA Library preparation kit for

водителя; в качестве вторичных антител были

Illumina («New England Biolabs», Англия). Кон

использованы конъюгированные с пероксида

центрацию библиотеки измеряли на флуори

зой хрена антитела козы к IgG кролика

метре Qubit 3.0 («Invitrogen», США), качество

(«Thermo Scientific», США) в разведении

библиотеки было проверено на Bioanalyser 2100

1 : 30 000. Для анализа содержания тотального

(«Agilent technologies», США). Перед секвениро

Erk1/2 использовали антитела p44/42 MAPK

ванием количество молекул библиотеки было

(Erk1/2) («Cell signaling», США) в разведении

валидировано с помощью РВ ПЦР при исполь

1 : 2000 и вторичные антитела козы к IgG мыши,

зовании 2,5× реакционной смеси для PCR PB с

конъюгированные с пероксидазой («Thermo

EVA Green («Синтол», Россия) и праймеров для

Scientific», США) в разведении 1 : 30 000.

адаптеров Illumina («Евроген», Россия). Далее с

Анализ транскриптома клеток. Тотальные РНК

учетом эффективной концентрации библиотека

клеточных линий Nthy ori 3 1 и Nthy ori 3 1/

была разведена до 2 нМ и смешана в пул в соот

BRAF V600E были получены, как описано вы

ветствии с ожидаемой глубиной секвенирова

ше. Из 400 нг тотальной РНК была выделена

ния. Секвенирование было выполнено на плат

мРНК с помощью набора реагентов NebNext

форме HiSeq 2500 («Illumina», Германия) в ре

PolyA mRNA Isolation Module («New England

жиме одноконцевых чтений длиной 57 п.н. с по

Biolabs», Англия). Полученная мРНК была

мощью набора HiSeq SR Cluster Kit v4 cBot и

фрагментирована (14 мин при 94 °С) в присут

HiSeq SBS Kit V4 50 cycle kit («Illumina», Герма

ствии случайных праймеров. На матрице фраг

ния). Исходные данные доступны на ресурсе

ментов мРНК была произведена обратная тран

SRA ncbi.nlm.nih.gov/sra/ (номер проекта

скрипция и синтезирована кДНК. После этого

PRJNA529086). Результаты были обработаны

проводили очистку продуктов реакции на маг

при помощи программы Trimmomatic для обрез

нитных частицах AMPure XP

(«Beckman

ки чтений [33], программы STAR для картирова

Coulter», США). Далее к полученным фрагмен

ния чтений на референсную последователь

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

131

ность человека (релиз GRCh38) [34] и алгоритма

MAPK) [41] и его фосфорилированной изофор

FeatureCounts для подсчета чтений для генов

мы - pErk - в клеточных линиях Nthy ori 3 1 и

[35]. Вышеописанные расчеты были выполнены

Nthy ori 3 1/BRAF V600E и показано, что в кле

с помощью оборудования ЦКП «Геном» http://

точной линии, содержащей мутацию V600E, ко

www.eimb.ru/rus/ckp/ccu_genome_c.php. Число

личество фосфорилированного белка Erk (pErk)

прочтений в каждом образце было нормализо

возрастает (рис. 1, г).

вано с помощью алгоритма DESeq2 [36]. Значе

Мы также провели сравнение полученных

ние корреляции определяли, как линейный ко

нами данных транскриптомного анализа кле

эффициент корреляции Пирсона (r Пирсона).

точных линий Nthy ori 3 1 и Nthy ori 3 1/BRAF

Для анализа дифференциальной экспрессии

V600E с аналогичными исследованиями, опуб

были выбраны гены, уровень мРНК которых из

ликованными ранее [42]. Корреляция тран

менялся в два и более раз. Для расчета обогаще

скриптомных данных, полученных для опубли

ния функциональных групп дифференциально

кованного ранее списка генов и созданной нами

экспрессируемыми генами использовали сервис

клеточной линии Nthy ori/BRAF V600E, равна

Metascape [37].

0,76, что демонстрирует достаточно высокую

степень схожести результатов.

Таким образом, полученные данные свиде

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

тельствуют о том, что созданная нами клеточная

линия Nthy ori/BRAF V600E, стабильно

Экспрессия гена BRAF с мутацией V600E в

экспрессирующая онкоген BRAF V600E, демон

клетках Nthy ori 3 1 активирует внутриклеточные

стрирует все признаки онкоген опосредуемого

сигнальные каскады RAS RAF MEK ERK. Для

изменения транскрипционной программы

исследования влияния фосфатазы SHP 2 на

клетки.

транскрипционную программу в опухолях щито

Подавление экспрессии гена PTPN11 умень

видной железы, содержащих онкогенную мута

шает экспрессию генов, участвующих в ОИС и ак

цию BRAF V600E, использовали ранее создан

тивации сигнальных путей MAPK и P13K AKT в

ную нами клеточную линию, стабильно экспрес

клетках, экспрессирующих BRAF V600E. Для

сирующую онкоген BRAF V600E. Для ее созда

сравнения совместного и раздельного использо

ния была использована клеточная линия фолли

вания селективного ингибитора BRAF V600E и

кулярного эпителия человека Nthy ori

3 1,

подавления экспрессии PTPN11 на экспресси

трансдуцированная лентивирусным конструк

онный профиль клеток эпителия щитовидной

том LeGO iPuro2 BRAF V600E (см. раздел «Ме

железы, содержащих мутацию BRAF V600E, был

тоды исследования»). Экспрессия лентивирус

произведен нокдаун гена PTPN11 на клеточных

ной мРНК, содержащей последовательность ис

линиях Nthy ori 3 1 и Nthy ori 3 1/BRAF V600E

следуемого онкогена, была подтверждена с по

с помощью малых интерферирующих РНК. Эф

мощью РВ ПЦР (рис. 1, а).

фективность подавления экспрессии PTPN11

Полученную клеточную линию Nthy ori/

была измерена с помощью метода количествен

BRAF V600E охарактеризовали с помощью ана

ной РВ ПЦР в исследуемых клеточных линиях.

лиза экспрессии ключевого эффектора MAP

Видно, что происходит существенное подавле

киназного каскада и PI3K AKT сигнального пу

ние экспрессии SHP 2 в случае обоих дериватов

ти, гена циклина D1 (CCND1) [38-40], экспрес

данной клеточной линий (рис. 2).

сия которого активирована в BRAF V600E со

Для изучения возможной роли SHP 2 в мо

держащих опухолях, а также анализа экспрессии

дуляции ответа исследуемых клеток на вемура

3′ фосфоаденозин 5′ фосфосульфат синтетазы

фениб мы провели анализ транскриптомов об

2 (PAPSS2) и фибулина 1 (FBLN1), экспрессия

разцов с нормальной и подавленной экспресси

которых в опухолях ЩЖ с данной мутацией

ей гена PTPN11, а также с воздействием вемура

значительно снижена (по результатам анализа

фениба и без него (результаты представлены в

публично доступных данных транскриптомного

табл. S1 Приложения). В результате проведен

профилирования [39] (рис. 1, б)). Нами было

ного анализа были получены группы генов, ре

показано, что экспрессия мутантной формы

гуляция которых в наибольшей степени меня

BRAF V600E приводила к умеренному повыше

лась при данных воздействиях. В ответ на воз

нию экспрессии CCND1 (примерно в 2-2,5 раза

действие вемурафениба в клетках, экспрессиру

по сравнению с нетрансфецированными клет

ющих онкоген BRAF V600E, можно отметить

ками), и к выраженному снижению экспрессии

выраженное изменение уровня мРНК генов, от

PAPSS2 и FBLN1 (рис. 1, в). Также было произ

носящихся к группам «внеклеточный матрикс»

ведено измерение количества ключевого эле

(группы 1 и 3), «клеточный ответ на воздействие

мента MAPK каскада, белка Erk1/2 (p44/42

ионов кальция» (группа 4) и «ответ на ксеноби

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

132

ПУТЛЯЕВА и др.

Рис. 1. a - Экспрессия лентивирусной мРНК, кодирующей онкоген BRAF V600E, нормализованная на уровень экспрес

сии GAPDH (ось ординат). По оси абсцисс указаны разные варианты исследуемых клеток, исходные клетки «Nthy ori 3.1»

и «Nthy ori 3.1 BRAF V600E» клетки, экспрессирующие данный онкоген. Указаны средние значения по 3 м независимым

измерениям ± SEM. * - Достоверные отличия между указанными значениями (р значение < 0,05 по критерию Стьюден

та). б - Экспрессионный профиль генов CCND1, PAPSS2, FBLN1 в нормальной ткани ЩЖ и опухоли ЩЖ, содержащей

мутацию BRAF V600E, по данным транскриптомного анализа (GEO dataset ID - GSE27155 [37]). Приведены уровни

экспрессии, нормированные на средние значения экспрессии соответствующих генов в нормальной ткани ЩЖ (ось ор

динат). Указаны средние значения для каждого типа опухоли ± SEM. * - Достоверные отличия между указанными значе

ниями (р значение < 0,05 по критерию Стьюдента). в - Экспрессионный профиль генов CCND1, PAPSS2, FBLN1 в не

трансфецированных клетках «Nthy ori 3.1» и в клетках с оверэкспрессией исследуемого онкогена «Nthy ori 3.1 BRAF

V600E», по данным РВ ПЦР (ось ординат). Нормализация на уровень экспрессии GAPDH и экспрессию мРНК соответ

ствующего гена в нетрансфецированных клетках Nthy ori 3.1. Указаны средние значения по 3 м независимым измерени

ям ± SEM. * - Достоверные отличия между указанными значениями (р значение < 0,05 по критерию Стьюдента). г - Вес

терн блот анализ фосфорилирования белка Erk1/2 (p44/42 MAPK). Справа показан результат анализа на фосфорилиро

ванный Erk1/2, слева - на общий. В обоих случаях приведен контроль нанесения (окраска мембраны красителем Понсо

S). На графике указано относительное значение роста общего и фосфорилированного Erk1/2 в клетках, экспрессирующих

BRAF V600E, относительно исходных клеток Nthy ori 3.1. Средние значения по 3 м независимым измерениям ± SEM.

* - Достоверные отличия между указанными значениями (р значение < 0,05 по критерию Стьюдента)

отики первой фазы» (группа 5) (рис. S1 а, в

мурафениба и коротких интерферирующих

Приложении). Подавление экспрессии гена

РНК к гену PTPN11 снижение уровня экспрес

PTPN11 приводило к изменению экспрессии ге

сии последнего было недостаточным, чтобы в

нов, относящихся к группам «хронический вос

полной мере оценить влияние данных воздей

палительный процесс» (группа 2), «клеточный

ствий на транскриптом. В связи с этим на осно

ответ на воздействие кортикостероидов» (груп

вании анализа других образцов был отобран ряд

па 3) и «позитивная регуляция секреции IL8»

генов, задействованных в процессах клеточного

(группа 4) (рис. S1 b, в Приложении). К сожале

роста, выживания и чувствительности к химио

нию, в образце с одновременным действием ве

терапии. Прежде всего, мы обратили внимание

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

133

на выраженное влияние подавления экспрессии

нирует как важный элемент регуляции ОИС.

гена PTPN11 на экспрессию IL8, а также ряда

Любопытно, что добавление селективного ин

других провоспалительных и ростовых факто

гибитора BRAF V600E - вемурафениба - само

ров. Изменение уровня мРНК этих генов харак

по себе повышает экспрессию генов p15 и р16

терно для клеток, находящихся в состоянии он

даже в клетках, не содержащих онкоген, однако

коген индуцированного старения [43]. Кроме

этот эффект также пропадает в случае нокдауна

того, данное воздействие привело к изменению

PTPN11 (рис. 3).

экспрессии ряда ключевых факторов развития

Также мы показали, что введение мутации

ОИС (IL8, p15, p16, p21 и IGFBP7). Так фактор

BRAF V600E увеличивает экспрессию ряда ге

p21 способен осуществлять остановку клеточ

нов, участвующих в активации сигнальных пу

ного цикла в двух фазах (G1 и G2) за счет инги

тей MAPK и P13K AKT при агрессивном фено

бирования циклин зависимой киназы 1А [41,

типе опухоли: Notch4 [44], MAPK3 (ERK1),

42]. Фактор p16 оказывает воздействие через

MEK1, а также многих представителей семей

сигнальный путь pRb, подавляя действие цик

ства циклинов (гены CCNB2, CCNC и CCNA1).

лин зависимых киназ, что приводит к останов

Также было отмечено увеличение экспрессии не

ке клеточного цикла в фазе G1 [44], а фактор

гативного регулятора гиперактивации BRAF -

p15 реализует остановку пролиферации через

DUSP6 [45, 46]. Стоит отметить, что для выше

путь TGF β, его мишенями также являются

перечисленных генов использование вемурафе

циклин зависимые киназы (CDK4 и CDK6)

ниба зачастую усиливало эффект введения он

[45]. В свою очередь, для белка IGFBP7 показа

когена BRAF V600E, который затем нивелиро

на ключевая роль BRAF в ингибировании сиг

вался при подавлении PTPN11 (гены Notch4,

нального пути BRAF MEK ERK и активации

CCNA1, DUSP6 и др.). Известно, что гены Notch4

программы ОИС в невусе, содержащем мута

и CCNA1 участвуют в развитии лекарственной

цию V600E гена BRAF [46].

устойчивости при лечении рака груди [47] и ра

Таким образом, в результате анализа тран

ка яичников [48]. Также известно, что при повы

скриптома было обнаружено изменение

шении уровня экспрессии CCNA1 повышается

экспрессии этих генов, а также других, непосред

ственно задействованных в регуляции пролифе

рации и выживания клеток. Верификация изме

нения экспрессии ряда генов, задействованных

в данных процессах, была проведена с помощью

количественной РВ ПЦР в нескольких допол

нительных экспериментах (рис. 3).

Согласно полученным данным, экспрессия

ряда факторов участвующих в развитии онкоген

индуцируемого старения (p15, p16, p21 и IGFBP7)

повышена в клеточной линии Nthy ori 3 1/

BRAF V600E по сравнению с исходными им

мортализированными клетками фолликулярно

го эпителия ЩЖ (линия Nthy ori 3 1) (рис. 3).

Также экспрессия онкогена BRAF V600E приво

дит к повышению уровня РНК, кодирующих

белки IL6, IL8 и VEGFA, повышенная секреция

которых характерна для клеток, находящихся в

состоянии ОИС [43] (рис. S2 в Приложении).

Это говорит в пользу нашего предположения о

том, что экспрессия данных генов вызвана на

Рис. 2. Подавление экспрессии гена PTPN11 с помощью

личием в клетке онкогена BRAF V600E. Также

малых интерферирующих РНК в нетрансфецированных

было показано, что нокдаун гена PTPN11 значи

клетках «WT» и в клетках с оверэкспрессией исследуемого

онкогена «BRAF V600E», подвергнутых обработке вемура

тельно уменьшает экспрессию регуляторов

фениба (+вем) и без обработки. Клетки, обработанные

ОИС (RB1, P15, p16, p21 и IGFBP7) и генов

миРНК к гену PTPN11, обозначены «SI»; клетки, обрабо

ОИС ассоциированного секреторного профиля

танные контрольными РНК, обозначены «SC». Приведен

(IL6, IL8 и VEGFA), приближая их экспрессию в

относительный уровень экспрессии гена, нормализованно

го на экспрессию гена GAPDH (ось ординат). Указаны сред

клетках Nthy ori 3 1/BRAF V600E к уровню в

ние значения по двум независимым экспериментам ± SEM.

исходных клетках (рис. 3 и рис. S2 в Приложе

* - Достоверное отличие от образца, трансфецированного

нии). Исходя из этих данных, можно предполо

контрольными (scrambled) scРНК (р значение < 0,05 по

жить, что тирозинфосфатаза SHP 2 функцио

критерию Стьюдента)

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

134

ПУТЛЯЕВА и др.

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии ряда генов после подавления экспрессии гена PTPN11 с помощью миРНК

и/или селективного ингибирования BRAF V600E с использованием вемурафениба. По оси абсцисс указаны разные вари

анты исследуемых клеток, исходные клетки «WT» и клетки, экспрессирующие исследуемый онкоген «BRAF V600E», не

обработанные или обработанные вемурафенибом (+вем). Клетки, обработанные миРНК к гену PTPN11, обозначены

«SI», клетки, обработанные контрольными РНК, обозначены «SC». Приведены уровни экспрессии генов, нормализован

ные на экспрессию гена GAPDH (ось ординат). * - Означает достоверное отличие от образца, трансфецированного конт

рольными (scrambled) РНК (scRNA) (р значение < 0,05 по критерию Стьюдента)

частота развития острого лимфобластного лей

тальной аденокарциноме, раке молочной желе

коза в мышиной модели [49], а высокий уровень

зы [50] и аденоме гипофиза [51]. Подавление

экспрессии CCNB2 и CCNC может наблюдаться

экспрессии гена PTPN11 приводит к снижению

при развитии различных опухолей: колорек

влияния BRAF V600E на экспрессию генов цик

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

135

линов CCNA1, CCNB2 и CCNC и гена Notch4,

подавление компонентов каскада RAS/RAF/

что указывает на неоднозначную роль фосфота

MEK/ERK. С другой стороны, согласно полу

зы SHP 2 в развитии опухолей с мутацией BRAF

ченным нами данным фосфатаза SHP 2 играет

V600E.

важную роль в активации транскрипции фак

торов p15, p16, p21, RB1 и IGFBP7, участвующих

в ОИС, вызванной экспрессией BRAF V600E,

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

причем вемурафениб может удваивать ингиби

рующий эффект от подавления экспрессии

Нарушение пути передачи сигналов RAS/

PTPN11 в случае генов p15 и IGFBP7.

RAF/MEK/ERK характерно для многих типов

Таким образом, согласно нашему предполо

человеческих опухолей. Система контроля ак

жению, фосфатаза SHP 2 может играть важную

тивности компонентов MAPK каскада строит

роль в регуляции MAPK каскада и как фактор,

ся на негативной обратной связи между сами

передающий сигнал от EGFR, HER2 и др., и как

ми компонентами каскада. При нормальной

важный фактор, участвующий в негативной ре

активации данного каскада последовательно

гуляции каскада при нарушении его работы.

активируется ряд его элементов, однако при

Этим может объясняться двоякое влияние дан

появлении конститутивно активного участни

ной фосфатазы на процессы онкогенеза в зави

ка каскада (например, BRAF V600E) или при

симости от наличия или отсутствия мутаций

ингибировании какого то элемента каскада

компонентов MAPK каскада и компонентов

механизмы обратной связи могут соответ

ОИС, а также в зависимости от используемой

ственно блокировать или реактивировать про

терапии. Данные, представленные в этой статье,

хождение сигнала по каскаду. Мы предполага

указывают на возможные неоднозначные по

ем, что SHP 2 может играть важную роль в по

следствия подавления SHP 2 в клетках консти

добной регуляции данного каскада: с одной

тутивно активных участников каскада RAS/

стороны, участвовать в реактивации пролифе

RAF/MEK/ERK. С одной стороны, блокировка

рации в случае ингибирования определенных

данной фосфатазы позволяет предотвращать ре

элементов, а с другой стороны, подавлять деле

активацию пролиферации клеток в ответ на ис

ние клеток, экспрессирующих конститутивно

пользование ингибиторов отдельных компонен

активный компонент каскада. Так было пока

тов каскада, с другой - подавление SHP 2 мо

зано, что единичное терапевтическое ингиби

жет привести к активации пролиферации кле

рование одного компонента MAPK каскада

ток из за нарушения ОИС.

при опухолях различной этиологии (например,

MEK или RAF) приводит к повышению

экспрессии различных рецепторных тирозин

Финансирование. Исследование выполнено

киназ и, как следствие, возникновению адап

при финансовой поддержке Российского фонда

тивной устойчивости опухоли к ингибитору

фундаментальных исследований в рамках науч

[52-55]. Однако комбинация ингибиторов

ного проекта № 18 315 00171 мол_а; лентиви

против SHP 2 и ALK или MEK позволяет эф

русный вектор, содержащий ген BRAF V600E и

фективно подавлять рост опухолевых клеток с

данные для рис. 1, получены при финансовой

нарушенной регуляцией ALK [56] и RAS [57].

поддержке Российского научного фонда (грант

Полученные нами данные о роли SHP 2 в регу

№ 16 15 10423).

ляции транскрипции генов (Notch4, CCNA1),

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

связанных с активацией опухолевого роста в

них нет конфликта интересов.

ответ на экспрессию онкогена BRAF V600E в

Соблюдение этических норм. Настоящая

присутствии вемурафениба, также указывают

статья не содержит каких либо исследований с

на способность SHP 2 участвовать в реактива

участием людей в качестве объектов исследова

ции регуляции пролиферации клеток в ответ на

ний или с использованием животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Burotto, M., Chiou, V.L., Lee, J.M., and Kohn, E.C.

Mesa, C. Jr., Mirza, M., Mitsutake, N., Sartor, M.,

(2014) The MAPK pathway across different malignancies:

Medvedovic, M., Tomlinson, C., Knauf, J.A., Weber, G.F.,

a new perspective, Cancer, 120, 3446-3456, doi: 10.1002/

and Fagin, J.A.

(2006) Conditional activation of

cncr.28864.

RET/PTC3 and BRAFV600E in thyroid cells is associated

Davies, H., Bignell, G.R., Cox, C., Stephens, P., Edkins, S.,

with gene expression profiles that predict a preferential role

et al. (2002) Mutations of the BRAF gene in human can

of BRAF in extracellular matrix remodeling, Cancer Res.,

cer, Nature, 417, 949-954, doi: 10.1038/nature00766.

66, 6521-6529, doi: 10.1158/0008 5472.CAN 06 0739.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

136

ПУТЛЯЕВА и др.

Long, G.V., Menzies, A.M., Nagrial, A.M., Haydu, L.E.,

16.

Qu, C.K., Shi, Z.Q., Shen, R., Tsai, F.Y., Orkin, S.H., and

Hamilton, A.L., Mann, G.J., Hughes, T.M., Thompson, J.F.,

Feng, G.S. (1997) A deletion mutation in the SH2 N

Scolyer, R.A., and Kefford, R.F. (2011) Prognostic and

domain of Shp 2 severely suppresses hematopoietic cell

clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in

development, Mol. Cell. Biol., 17, 5499-5507.

metastatic melanoma, J. Clin. Oncol., 29, 1239-1246,

17.

Bard Chapeau, E.A., Li, S., Ding, J., Zhang, S.S.,

doi: 10.1200/JCO.2010.32.4327.

Zhu, H.H., Princen, F., Fang, D.D., Han, T., Bailly

Loh, M.L., Vattikuti, S., Schubbert, S., Reynolds, M.G.,

Maitre, B., Poli, V., Varki, N.M., Wang, H., and

Carlson, E., Lieuw, K.H., Cheng, J.W., Lee, C.M., Stokoe, D.,

Feng, G.S. (2011) Ptpn11/Shp2 acts as a tumor suppressor

Bonifas, J.M., Curtiss, N.P., Gotlib, J., Meshinchi, S., Le

in hepatocellular carcinogenesis, Cancer Cell,

19,

Beau, M.M., Emanuel, P.D., and Shannon, K.M. (2004)

629-639, doi: 10.1016/j.ccr.2011.03.023.

Mutations in PTPN11 implicate the SHP 2 phosphatase in

18.

Yang, W., Wang, J., Moore, D.C., Liang, H., Dooner, M.,

leukemogenesis, Blood, 103, 2325-2331, doi: 10.1182/

Wu, Q., Terek, R., Chen, Q., Ehrlich, M.G., Quesenberry, P.J.,

blood 2003 09 3287.

and Neel, B.G. (2013) Ptpn11 deletion in a novel progeni

Mohi, M.G., Williams, I.R., Dearolf, C.R., Chan, G.,

tor causes metachondromatosis by inducing hedgehog sig

Kutok, J.L., Cohen, S., Morgan, K., Boulton, C.,

nalling, Nature, 499, 491-495, doi: 10.1038/nature12396.

Shigematsu, H., Keilhack, H., Akashi, K., Gilliland, D.G.,

19.

Hill, K.S., Roberts, E.R., Wang, X., Marin, E., Park, T.D.,

and Neel, B.G. (2005) Prognostic, therapeutic, and mech

Son, S., Ren, Y., Fang, B., Yoder, S., Kim, S., Wan, L.,

anistic implications of a mouse model of leukemia evoked

Sarnaik, A.A., Koomen, J.M., Messina, J.L., Teer, J.K.,

by Shp2 (PTPN11) mutations, Cancer Cell, 7, 179-191,

Kim, Y., Wu, J., Chalfant, C.E., and Kim, M. (2019)

doi: 10.1016/j.ccr.2005.01.010.

PTPN11 plays oncogenic roles and is a therapeutic target

Tartaglia, M., Mehler, E.L., Goldberg, R., Zampino, G.,

for BRAF wild type melanomas, Mol. Cancer Res., 17,

Brunner, H.G., Kremer, H., van der Burgt, I., Crosby, A.H.,

583-593, doi: 10.1158/1541 7786.MCR 18 0777.

Ion, A., Jeffery, S., Kalidas, K., Patton, M.A.,

20.

Zhan, Y., Counelis, G.J., and O’Rourke, D.M. (2009) The

Kucherlapati, R.S., and Gelb, B.D. (2001) Mutations in

protein tyrosine phosphatase SHP 2 is required for

PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP 2,

EGFRvIII oncogenic transformation in human glioblas

cause Noonan syndrome, Nat. Genet., 29, 465-468,

toma cells, Exp. Cell Res., 315, 2343-2357, doi: 10.1016/

doi: 10.1038/ng772.

j.yexcr.2009.05.001.

Chan, G., Kalaitzidis, D., and Neel, B.G. (2008) The tyro

21.

Hu, Z.Q., Ma, R., Zhang, C.M., Li, J., Li, L., Hu, Z.T.,

sine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer, Cancer

Gao, Q.I., and Li, W.M. (2015) Expression and clinical

Metastasis Rev., 27, 179-192, doi: 10.1007/s10555 008

significance of tyrosine phosphatase SHP2 in thyroid car

9126 y.

cinoma, Oncol. Lett., 10, 1507-1512, doi: 10.3892/

Chan, R.J., and Feng, G.S. (2007) PTPN11 is the first

ol.2015.3479.

identified proto oncogene that encodes a tyrosine phos

22.

Prahallad, A., Heynen, G.J., Germano, G., Willems, S.M.,

phatase, Blood, 109, 862-867, doi: 10.1182/blood 2006

Evers, B., Vecchione, L., Gambino, V., Lieftink, C.,

07 028829.

Beijersbergen, R.L., Di Nicolantonio, F., Bardelli, A., and

10.

Li, S.M. (2016) Биологические функции SHP2 при за

Bernards, R. (2015) PTPN11 is a central node in intrinsic

болеваниях человека, Мол. Биол. (Москва), 50, 27-33,

and acquired resistance to targeted cancer drugs, Cell Rep.,

doi: 10.7868/S0026898416010110.

12, 1978-1985, doi: 10.1016/j.celrep.2015.08.037.

11.

Matozaki, T., Murata, Y., Saito, Y., Okazawa, H., and

23.

Schneeberger, V.E., Ren, Y., Luetteke, N., Huang, Q.,

Ohnishi, H. (2009) Protein tyrosine phosphatase SHP 2: a

Chen, L., Lawrence, H.R., Lawrence, N.J., Haura, E.B.,

proto oncogene product that promotes Ras activation,

Koomen, J.M., Coppola, D., and Wu, J. (2015) Inhibition

Cancer Sci.,

100,

1786-1793, doi:

10.1111/j.1349

of Shp2 suppresses mutant EGFR induced lung tumors in

7006.2009.01257.x.

transgenic mouse model of lung adenocarcinoma,

12.

Zhang, S.Q., Tsiaras, W.G., Araki, T., Wen, G.,

Oncotarget, 6, 6191-6202, doi: 10.18632/oncotarget.3356.

Minichiello, L., Klein, R., and Neel, B.G.

(2002)

24.

Chen, Y.N., LaMarche, M.J., Chan, H.M., Fekkes, P.,

Receptor specific regulation of phosphatidylinositol 3′

Garcia Fortanet, J., et al. (2016) Allosteric inhibition of

kinase activation by the protein tyrosine phosphatase Shp2,

SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor

Mol. Cell. Biol., 22, 4062-4072.

tyrosine kinases, Nature, 535, 148-152, doi: 10.1038/

13.

Saxton, T.M., Henkemeyer, M., Gasca, S., Shen, R.,

nature18621.

Rossi, D.J., Shalaby, F., Feng, G.S., and Pawson, T. (1997)

25.

Chapman, P.B., Hauschild, A., Robert, C., Haanen, J.B.,

Abnormal mesoderm patterning in mouse embryos mutant

Ascierto, P., et al. (2011) Improved survival with vemu

for the SH2 tyrosine phosphatase Shp 2, EMBO J., 16,

rafenib in melanoma with BRAF V600E mutation, N. Engl.

2352-2364, doi: 10.1093/emboj/16.9.2352.

J. Med., 364, 2507-2516, doi: 10.1056/NEJMoa1103782.

14.

Tajan, M., Batut, A., Cadoudal, T., Deleruyelle, S., Le,

26.

Montero Conde, C., Ruiz Llorente, S., Dominguez, J.M.,

Gonidec, S., Saint Laurent, C., Vomscheid, M., Wanecq, E.,

Knauf, J.A., Viale, A., Sherman, E.J., Ryder, M.,

Treguer, K., De Rocca Serra Nedelec, A., Vinel, C.,

Ghossein, R.A., Rosen, N., and Fagin, J.A. (2013) Relief

Marques, M.A., Pozzo, J., Kunduzova, O., Salles, J.P.,

of feedback inhibition of HER3 transcription by RAF and

Tauber, M., Raynal, P., Cave, H., Edouard, T., Valet, P.,

MEK inhibitors attenuates their antitumor effects in

and Yart, A. (2014) LEOPARD syndrome associated

BRAF mutant thyroid carcinomas, Cancer Discov., 3,

SHP2 mutation confers leanness and protection from diet

520-533, doi: 10.1158/2159 8290.CD 12 0531.

induced obesity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

111,

27.

Nazarian, R., Shi, H., Wang, Q., Kong, X., Koya, R.C.,

E4494-E4503, doi: 10.1073/pnas.1406107111.

Lee, H., Chen, Z., Lee, M.K., Attar, N., Sazegar, H.,

15.

Chen, L., Chen, W., Mysliwski, M., Serio, J., Ropa, J.,

Chodon, T., Nelson, S.F., McArthur, G., Sosman, J.A.,

Abulwerdi, F.A., Chan, R.J., Patel, J.P., Tallman, M.S.,

Ribas, A., and Lo, R.S. (2010) Melanomas acquire resis

Paietta, E., Melnick, A., Levine, R.L., Abdel Wahab, O.,

tance to B RAF(V600E) inhibition by RTK or N RAS

Nikolovska Coleska, Z., and Muntean, A.G. (2015) Mutated

upregulation, Nature,

468,

973-977, doi:

10.1038/

Ptpn11 alters leukemic stem cell frequency and reduces the

nature09626.

sensitivity of acute myeloid leukemia cells to Mcl1 inhibition,

28.

Boehm, J.S., Zhao, J.J., Yao, J., Kim, S.Y., Firestein, R.,

Leukemia, 29, 1290-1300, doi: 10.1038/leu.2015.18.

Dunn, I.F., Sjostrom, S.K., Garraway, L.A., Weremowicz, S.,

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

SHP 2 КОНТРОЛИРУЕТ ДЕЛЕНИЕ И СТАРЕНИЕ КЛЕТОК

137

Richardson, A.L., Greulich, H., Stewart, C.J., Mulvey, L.A.,

Priolo, C., Puxeddu, E., Finn, S., Jarzab, B., Hodin, R.A.,

Shen, R.R., Ambrogio, L., Hirozane Kishikawa, T., Hill, D.E.,

Pontecorvi, A., Nose, V., Lawler, J., and Parangi, S. (2010)

Vidal, M., Meyerson, M., Grenier, J.K., Hinkle, G., Root, D.E.,

B Raf(V600E) and thrombospondin 1 promote thyroid

Roberts, T.M., Lander, E.S., Polyak, K., and Hahn, W.C.

cancer progression, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107,

(2007) Integrative genomic approaches identify IKBKE as

10649-10654, doi: 10.1073/pnas.1004934107.

a breast cancer oncogene, Cell,

129,

1065-1079,

41.

Roskoski, R. Jr. (2012) ERK1/2 MAP kinases: structure,

doi: 10.1016/j.cell.2007.03.052.

function, and regulation, Pharmacol. Res., 66, 105-143,

29.

Prokofjeva, M.M., Proshkina, G.M., Lebedev, T.D.,

doi: 10.1016/j.phrs.2012.04.005.

Shulgin, A.A., Spirin, P.V., Prassolov, V.S., and Deyev, S.M.

42.

Kim, B.A., Jee, H.G., Yi, J.W., Kim, S.J., Chai, Y.J., Choi, J.Y.,

(2017) Lentiviral gene delivery to plasmolipin expressing

and Lee, K.E. (2017) Expression profiling of a human thy

cells using Mus caroli endogenous retrovirus envelope pro

roid cell line stably expressing the BRAFV600E mutation,

tein, Biochimie, 142, 226-233, doi: 10.1016/j.biochi.

Cancer Genom. Proteomics, 14, 53-67, doi: 10.21873/

2017.09.004.

cgp.20018.

30.

Liu, Z., Zhao, Y., Fang, J., Cui, R., Xiao, Y., and Xu, Q.

43.

Coppe, J.P., Desprez, P.Y., Krtolica, A., and Campisi, J.

(2017) SHP2 negatively regulates HLA ABC and PD L1

(2010) The senescence associated secretory phenotype:

expression via STAT1 phosphorylation in prostate cancer

the dark side of tumor suppression, Annu. Rev. Pathol., 5,

cells, Oncotarget, 8, 53518-53530, doi: 10.18632/oncotarget.

99-118, doi: 10.1146/annurev pathol 121808 102144.

18591.

44.

Hardy, K.M., Kirschmann, D.A., Seftor, E.A., Margaryan, N.V.,

31.

Schwartz, A.M., Putlyaeva, L.V., Covich, M., Klepikova, A.V.,

Postovit, L.M., Strizzi, L., and Hendrix, M.J.

(2010)

Akulich, K.A., Vorontsov, I.E., Korneev, K.V., Dmitriev, S.E.,

Regulation of the embryonic morphogen Nodal by Notch4

Polanovsky, O.L., Sidorenko, S.P., Kulakovskiy, I.V., and

facilitates manifestation of the aggressive melanoma phe

Kuprash, D.V. (2016) Early B cell factor 1 (EBF1) is criti

notype, Cancer Res., 70, 10340-10350, doi: 10.1158/0008

cal for transcriptional control of SLAMF1 gene in human

5472.CAN 10 0705.

B cells, Biochim. Biophys. Acta,

1859,

1259-1268,

45.

Kim, Y.H., Choi, Y.W., Han, J.H., Lee, J., Soh, E.Y.,

doi: 10.1016/j.bbagrm.2016.07.004.

Park, S.H., Kim, J.H., and Park, T.J. (2014) TSH signaling

32.

Afanasyeva, M.A., Britanova, L.V., Korneev, K.V.,

overcomes B RafV600E induced senescence in papillary

Mitkin, N.A., Kuchmiy, A.A., and Kuprash, D.V. (2014)

thyroid carcinogenesis through regulation of DUSP6,

Clusterin is a potential lymphotoxin beta receptor target

Neoplasia,

16,

1107-1120, doi:

10.1016/j.neo.2014.

that is upregulated and accumulates in germinal centers of

10.005.

mouse spleen during immune response, PLoS One, 9,

46.

Moulana, F.I., Priyani, A.A.H., de Silva, M.V.C., and

e98349, doi: 10.1371/journal.pone.0098349.

Dassanayake, R.S.

(2018) BRAF oncogene induced

33.

Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014) Trimmo

senescence and the role of thyroid stimulating hormone

matic: a flexible trimmer for Illumina sequence data,

signaling in the progression of papillary thyroid carcinoma,

Bioinformatics, 30, 2114-2120, doi: 10.1093/bioinformatics/

Horm. Cancer, 9, 1-11, doi: 10.1007/s12672 017 0315 4.

btu170.

47.

Simões, B.M., O’Brien, C.S., Eyre, R., Silva, A., Yu, L.,

34.

Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J.,

Sarmiento Castro, A., Alferez, D.G., Spence, K.,

Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R.

Santiago Gomez, A., Chemi, F., Acar, A., Gandhi, A.,

(2013) STAR: ultrafast universal RNA seq aligner,

Howell, A., Brennan, K., Ryden, L., Catalano, S., et al.

Bioinformatics, 29, 15-21, doi: 10.1093/bioinformatics/

(2015) Anti estrogen resistance in human breast tumors is

bts635.

driven by JAG1 NOTCH4 dependent cancer stem cell

35.

Liao, Y., Smyth, G.K., and Shi, W. (2014) featureCounts:

activity, Cell Rep., 12, 1968-1977, doi: 10.1016/j.celrep.

an efficient general purpose program for assigning

2015.08.050.

sequence reads to genomic features, Bioinformatics, 30,

48.

Huang, K.C., Yang, J., Ng, M.C., Ng, S.K., Welch, W.R.,

923-930, doi: 10.1093/bioinformatics/btt656.

Muto, M.G., Berkowitz, R.S., and Ng, S.W. (2016) Cyclin

36.

Love, M.I., Huber, W., and Anders, S. (2014) Moderated

A1 expression and paclitaxel resistance in human ovarian

estimation of fold change and dispersion for RNA seq data

cancer cells, Eur. J. Cancer,

67,

152-163,

with DESeq2, Genome Biol., 15, 550, doi: 10.1186/s13059

doi: 10.1016/j.ejca.2016.08.007.

014 0550 8.

49.

Liao, C., Wang, X.Y., Wei, H.Q., Li, S.Q., Merghoub, T.,

37.

Zhou, Y., Zhou, B., Pache, L., Chang, M., Khodabakhshi, A.H.,

Pandolfi, P.P., and Wolgemuth, D.J. (2001) Altered

Tanaseichuk, O., Benner, C., and Chanda, S.K. (2019)

myelopoiesis and the development of acute myeloid

Metascape provides a biologist oriented resource for the

leukemia in transgenic mice overexpressing cyclin A1,

analysis of systems level datasets, Nat. Commun., 10, 1523,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6853-6858, doi: 10.1073/

doi: 10.1038/s41467 019 09234 6.

pnas.121540098.

38.

Castellone, M.D., De Falco, V., Rao, D.M., Bellelli, R.,

50.

Valladares, A., Hernandez, N.G., Gomez, F.S., Curiel

Muthu, M., Basolo, F., Fusco, A., Gutkind, J.S., and

Quezada, E., Madrigal Bujaidar, E., Vergara, M.D.,

Santoro, M. (2009) The beta catenin axis integrates multi

Martinez, M.S., and Arenas Aranda, D.J. (2006) Genetic

ple signals downstream from RET/papillary thyroid carci

expression profiles and chromosomal alterations in spo

noma leading to cell proliferation, Cancer Res., 69,

radic breast cancer in Mexican women, Cancer Genet.

1867-1876, doi: 10.1158/0008 5472.CAN 08 1982.

Cytogenet., 170, 147-151, doi: 10.1016/j.cancergencyto.

39.

Giordano, T.J., Kuick, R., Thomas, D.G., Misek, D.E.,

2006.06.002.

Vinco, M., Sanders, D., Zhu, Z., Ciampi, R., Roh, M.,

51.

Takashima, S., Saito, H., Takahashi, N., Imai, K., Kudo, S.,

Shedden, K., Gauger, P., Doherty, G., Thompson, N.W.,

Atari, M., Saito, Y., Motoyama, S., and Minamiya, Y.

Hanash, S., Koenig, R.J., and Nikiforov, Y.E.

(2005)

(2014) Strong expression of cyclin B2 mRNA correlates

Molecular classification of papillary thyroid carcinoma: dis

with a poor prognosis in patients with non small cell lung

tinct BRAF, RAS, and RET/PTC mutation specific gene

cancer, Tumour Biol., 35, 4257-4265, doi: 10.1007/

expression profiles discovered by DNA microarray analysis,

s13277 013 1556 7.

Oncogene, 24, 6646-6656, doi: 10.1038/sj.onc.1208822.

52.

Ahmed, T.A., Adamopoulos, C., Karoulia, Z., Wu, X.,

40.

Nucera, C., Porrello, A., Antonello, Z.A., Mekel, M.,

Sachidanandam, R., Aaronson, S.A., and Poulikakos, P.I.

Nehs, M.A., Giordano, T.J., Gerald, D., Benjamin, L.E.,

(2019) SHP2 Drives adaptive resistance to ERK signaling

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020

138

ПУТЛЯЕВА и др.

inhibition in molecularly defined subsets of ERK depen

inhibition in triple negative breast cancer, Cell, 149,

dent tumors, Cell Rep., 26, 65-78 e65, doi: 10.1016/j.celrep.

307-321, doi: 10.1016/j.cell.2012.02.053.

2018.12.013.

55. Karoulia, Z., Wu, Y., Ahmed, T.A., Xin, Q., Bollard, J.,

53.

Corcoran, R.B., Ebi, H., Turke, A.B., Coffee, E.M.,

Krepler, C., Wu, X., Zhang, C., Bollag, G., Herlyn, M.,

Nishino, M., Cogdill, A.P., Brown, R.D., Della Pelle, P.,

Fagin, J.A., Lujambio, A., Gavathiotis, E., and Poulikakos, P.I.

Dias Santagata, D., Hung, K.E., Flaherty, K.T., Piris, A.,

(2016) An integrated model of RAF inhibitor action pre

Wargo, J.A., Settleman, J., Mino Kenudson, M., and

dicts inhibitor activity against oncogenic BRAF signaling,

Engelman, J.A. (2012) EGFR mediated re activation of

Cancer Cell, 30, 485-498, doi: 10.1016/j.ccell.2016.

MAPK signaling contributes to insensitivity of BRAF

06.024.

mutant colorectal cancers to RAF inhibition with vemu

56. Dardaei, L., Wang, H.Q., Singh, M., Fordjour, P., Shaw, K.X.,

rafenib, Cancer Discov., 2, 227-235, doi: 10.1158/2159

et al. (2018) SHP2 inhibition restores sensitivity in ALK

8290.CD 11 0341.

rearranged non small cell lung cancer resistant to ALK

54.

Duncan, J.S., Whittle, M.C., Nakamura, K., Abell, A.N.,

inhibitors, Nat. Med., 24, 512-517, doi: 10.1038/nm.4497.

Midland, A.A., Zawistowski, J.S., Johnson, N.L.,

57. Mainardi, S., Mulero Sanchez, A., Prahallad, A.,

Granger, D.A., Jordan, N.V., Darr, D.B., Usary, J.,

Germano, G., Bosma, A., Krimpenfort, P., Lieftink, C.,

Kuan, P.F., Smalley, D.M., Major, B., He, X., Hoadley, K.A.,

Steinberg, J.D., de Wit, N., Goncalves Ribeiro, S., Nadal, E.,

Zhou, B., Sharpless, N.E., Perou, C.M., Kim, W.Y.,

Bardelli, A., Villanueva, A., and Bernards, R. (2018) SHP2

Gomez, S.M., Chen, X., Jin, J., Frye, S.V., Earp, H.S.,

is required for growth of KRAS mutant non small cell

Graves, L.M., and Johnson, G.L. (2012) Dynamic repro

lung cancer in vivo, Nat. Med., 24, 961-967, doi: 10.1038/

gramming of the kinome in response to targeted MEK

s41591 018 0023 9.

PTPN11 KNOCKDOWN PREVENTS CHANGES IN THE EXPRESSION

OF GENES CONTROLLING CELL CYCLE, CHEMOTHERAPY

RESISTANCE, AND ONCOGENE INDUCED SENESCENCE

IN HUMAN THYROID CELLS OVEREXPRESSING

BRAF V600E ONCOGENIC PROTEIN*^,**

L. V. Putlyaeva^1,2, D. E. Demin^1,3, A. N. Uvarova^1,4, L. S. Zinevich⁵, M. M. Prokofjeva¹,

G. R. Gazizova⁶, E. I. Shagimardanova⁶, and A. M. Schwartz¹***

¹ Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences,

119991 Moscow, Russia; E4mail: shvarec@yandex.ru

² Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology, Moscow, Russia

³ Moscow Institute of Physics and Technology, 141701 Dolgoprudnyi, Moscow Region, Russia

⁴ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 119234 Moscow, Russia

⁵ Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences, 119334 Moscow, Russia

⁶ Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University, 420008 Kazan, Russia

Received September 21, 2019

Revised September 21, 2019

Accepted October 20, 2019

The MAPK (RAS/BRAF/MEK/ERK) signaling pathway is a kinase cascade involved in the regulation of cell prolif

eration, differentiation, and survival in response to external stimuli. The V600E mutation in the BRAF gene has been

detected in various tumors, resulting in a 500 fold increase in the BRAF kinase activity. However, monotherapy with

selective BRAF V600E inhibitors often leads to the reactivation of MAPK signaling cascade and emergence of drug

resistance. Therefore, new targets are being developed for the inhibition of components of the aberrantly activated

cascade. It was recently discovered that resistance to the BRAF V600E inhibitors may be associated with the activity

of the tyrosine phosphatase SHP 2 encoded by the PTPN11 gene. In this paper, we analyzed transcriptional effects of

the PTPN11 gene knockdown and selective suppression of BRAF V600E in a model of thyroid follicular epithelium.

We found that the siRNA mediated knockdown of PTPN11 after vemurafenib treatment prevented an increase in the

expression of CCNA1 and NOTCH4 genes involved in the formation of drug resistance of tumors. On the other hand,

downregulation of PTPN11 expression blocked the transcriptional activation of genes (p21, p15, p16, and IGFBP7)

involved in the cell cycle regulation and oncogene induced senescence in response to the BRAF V600E expression.

Therefore, it can be assumed that SHP 2 participates not only in the drug resistance emergence in cancer cells, but

also in the oncogene induced cell senescence.

Keywords: SHP 2, BRAF V600E, thyroid tumor, oncogene induced senescence

БИОХИМИЯ том 85 вып. 1 2020