БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 2, с. 280 - 286

УДК 577.114.5;577.21;579.841

УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ КАПСУЛЬНОГО

ПОЛИСАХАРИДА K32 И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННОГО

КЛАСТЕРА KL32 Acinetobacter baumannii LUH5549*^,**

С.М. Кахилл^1#, Н.П. Арбатский^2#, А.С. Шашков², М.М. Шнейдер³,

А.В. Попова^4,5, Р.М. Хэлл^6#, Дж.Дж. Кенион^1#, Ю.А. Книрель²***^#

¹ Institute of Health and Biomedical Innovation, School of Biomedical Sciences,

Faculty of Health, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

² Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН,

119991 Москва, Россия; электронная почта: yknirel@gmail.com

³ Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия

⁴ Московский физико+технический институт, 141701 Долгопрудный Московской обл., Россия

⁵ ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279 Оболенск Московской обл., Россия

⁶ School of Life and Environmental Sciences, The University of Sydney, Sydney, Australia

Поступила в редакцию 29.10.2019

После доработки 25.11.2019

Принята к публикации 26.11.2019

Капсульный полисахарид (КПС), относящийся к типу К32, выделен из штамма Acinetobacter baumannii

LUH5549, содержащего генный кластер биосинтеза КПС типа KL32. Структура КПС установлена с по"

мощью углеводного анализа, деградации по Смиту, одно" и двумерной спектроскопии ¹H и ¹³C ЯМР. Най"

дено, что КПС типа К32 построен из разветвленных повторяющихся пентасахаридных единиц (К"звеньев),

включающих два остатка β"D"GalpNAc и один остаток β"D"глюкуроновой кислоты (β"D"GlcpA) в основ"

ной цепи и по одному остатку β"D"Glcp и α"D"GlcpNAc в боковой дисахаридной цепи. В соответствии со

структурой КПС генный кластер KL32 включает гены UDP"D"Glc"6"дегидрогеназы (Ugd3), ответственной

за синтез D"GlcA и четырех гликозилтрансфераз, образующих специфические гликозидные связи. Присут"

ствующие в кластере гены, кодирующие ацетилтрансферазу и белок с неизвестной функцией, не участвуют

в биосинтезе КПС. Ранее присутствие генного кластера KL32 обнаружено в штаммах, принадлежащих к

глобальной клональной линии 2 (GC2), тогда как штамм LUH5549 принадлежит к сиквенс"типу ST354, что

свидетельствует о горизонтальном генетическом переносе между этими линиями.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Acinetobacter baumannii, капсула, K"локус, структура полисахарида, глюкуроновая

кислота.

DOI: 10.31857/S0320972520020116

Капсульный полисахарид (КПС) присутству"

неблагоприятных условиях внешней среды,

ет на клеточной поверхности многих патогенных

КПС является одним из основных факторов па"

бактерий, и в том числе нозокомиальных видов

тогенности микроорганизмов [1-4]. Он предс"

Acinetobacter baumannii. Образуя поверхностный

тавляет собой длинную полисахаридную цепь из

слой, защищающий бактерию от иммунного от"

повторяющихся олигосахаридных единиц (К"

вета хозяина, высыхания и выживания в других

звеньев), включающих от 2 до 6 моносахаридных

остатков, соединенных различными гликозид"

ными связями. Биосинтез и экспорт КПС A. bau+

Принятые сокращения: КПС - капсульный полиса"

харид; GlcA - глюкуроновая кислота; KL- К"локус.

mannii контролируется соответствующими гена"

* Первоначально английский вариант рукописи опубли" ми в К"локусе (KL) хромосомы, состав и распо"

кован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

ложение которых изменчивы [5].

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19"307,

К"локус включает оперон генов wza+wzb+wzc,

30.12.2019.

ответственных за экспорт КПС, и область с ге"

** Приложение к статье на английском языке опублико"

нами синтеза специфического К"звена, содер"

вано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте

издательства Springer (https://link.springer.com/journal/

жащую разнонаправленные единицы тран"

10541), том 85, вып. 2, 2020.

скрипции. В К"локусе находятся гены синтеза

*** Адресат для корреспонденции.

простых сахаров, инициации синтеза К"звена

^# Авторы внесли равный вклад в работу.

(itr), переноса углеводных остатков (gtr), транс"

280

КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД A. baumannii

281

локации (wzx) и полимеризации (wzy) К"звена, а

Анализ моносахаридов. Образец КПС (0,5 мг)

также присоединения ацетильной или пируват"

гидролизовали 2М CF₃CO₂H (120 °C, 2 ч), моно"

ной групп (atr/ptr) в случае их присутствия.

сахариды анализировали в виде ацетатов полио"

Ранее была исследована организация генных

лов [16] методом ГЖХ на хроматографе Maestro

кластеров KL изолятов из коллекции Трауба, ко"

(Agilent 7820, Москва, Россия) на колонке

торая была использована для разработки ориги"

0,32 мм × 20 м с фазой HP"5 в температурном

нальной схемы серотипирования A. baumannii [6,

режиме от 160 °C (1 мин) до 290 °C с градиентом

7]. Однако эти генные кластеры изначально бы"

7 °C мин^-1. Глюкуроновую кислоту идентифи"

ли описаны как кодирующие биосинтез полиса"

цировали с помощью углеводного анализатора

харидов (PSgc) с использованием традиционной

Biotronik LC 2000 (Германия), используя колон"

систематической номенклатуры. В настоящее

ку (7 × 0,4 см) с анионитом DA×8 (Durrum,

время структура многих КПС из различных изо"

США), 5 мМ K"фосфатный буфер pH 3 и K"би"

лятов установлена и показано, что их состав и

цинхонинат для детекции.

конфигурация сахаров коррелирует с составом

Деградация по Смиту. Образец КПС (12 мг)

генного кластера KL [8-12]. В связи с этим ан"

окисляли NaIO₄ (29 мг в 1,5 мл воды, 20 °C, 72 ч)

нотация генных кластеров PSgc была пересмот"

в темноте, восстанавливали NaBH₄ (30 мг, 24 ч,

рена [8-14] и приведена в соответствие с более

16 °C), раствор упаривали, борную кислоту уда"

удобной и уже широко распространенной систе"

ляли трехкратным упариванием с 10% AcOH в

мой номенклатуры генных кластеров биосинтеза

MeOH и продукты разделяли на колонке (108 ×

КПС A. baumannii [5]. В данной работе мы уста"

1,2 см) с гелем Sephadex G"25 в воде с детекти"

новили структуру КПС еще одного штамма

рованием с помощью дифференциального реф"

(LUH5549) из коллекции Трауба, генный кластер

рактометра. Полимерную фракцию гидролизо"

которого ранее обозначался как PSgc21.

вали 2% AcOH (100 °С, 2 ч), продукты фракцио"

нировали на той же колонке и получали моди"

фицированный КПС (2,6 мг).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Спектроскопия ЯМР. Перед съемкой спект"

ров ЯМР образцы дважды лиофилизовали из

Культивирование бактерий. Штамм A. bauman+

99,9% D₂O и исследовали в виде раствора в

nii LUH5549 из коллекции W.H. Traub (Institut für

99,95% D₂O при 65 град. C. В качестве внутрен"

Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Univer

него стандарта для калибровки использовали

sität des Saarlandes, Саарленд, Германия) был лю"

Na"3"триметилсилилпропаноат"2,2,3,3"d₄ (δ_H

безно предоставлен профессором Peter Reeves.

0,0, δ_C -1,6). Спектр ¹³C ЯМР регистрировали на

Бактерии культивировали в среде 2TY в течение

приборе Bruker DRX"500, двумерные экспери"

ночи, клетки отделяли центрифугированием

менты ЯМР были проведены на спектрометре

(10 000 g, 20 мин), промывали Na"фосфатным

Bruker Avance II 600 MHz (Германия) с исполь"

буфером pH 7,4, суспендировали в смеси ацетон"

зованием стандартного программного обеспече"

вода (7 : 3 v/v), осаждали и высушивали.

ния компании «Bruker». В эксперименте ¹³C

Выделение капсульного полисахарида. КПС

ЯМР релаксационная задержка составляла 3 с.

выделяли из бактериальных клеток (1,1 г) вод"

Время спиновой стабилизации и время смеши"

но"фенольной экстракцией [15]. Экстракт диа"

вания в экспериментах TOCSY и ROESY состав"

лизовали без разделения слоев, нерастворимые

ляло 60 и 150 мсек, соответственно. Для опти"

примеси отделяли центрифугированием, раст"

мизации эксперимента ¹H,¹³C HMBC использо"

вор обрабатывали

50%"ным раствором

вали задержку 60 мсек для развития многосвязе"

CCl₃COOH при 4 °C, осадок (белки и нуклеино"

вых корреляций. Другие параметры ЯМР были

вые кислоты) удаляли центрифугированием,

установлены, как описано ранее [8]. Для полу"

раствор диализовали против дистиллированной

чения и обработки данных ЯМР использовали

воды, лиофилизовали и получили неочищен"

программу BrukerTopSpin 2.1.

ный КПС (370 мг). Очистку КПС (120 мг) про"

Биоинформатика. Данные коротких ридов ге"

водили нагреванием в 2% AcOH (100 °C, 2 ч) с

номной последовательности штамма LUH5549

последующим отделением примесей центрифу"

получены из архива коротких ридов (SRA, но"

гированием и фракционированием с помощью

мер доступа DRS005644) и собраны в контиги с

гель"проникающей хроматографии на колонке

использованием программы SPAdes [17]. Ген"

(60 × 2,5 см) с гелем Sephadex G"50 в 0,1% AcOH,

ный кластер KL32 идентифицирован между ге"

используя для детектирования дифференциаль"

нами fkpA и lldP и повторно аннотирован в соот"

ный рефрактометр («Knauer», Германия). Высо"

ветствии с раннее описанной номенклатурой

комолекулярную фракцию лиофилизовали и

[5]. Базы данных CAZy (http://www.cazy.org/)

получали очищенный КПС (27 мг).

[18] и Pfam (https://pfam.xfam.org) [19] исполь"

9 БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020

282

КАХИЛЛ и др.

зованы для соотнесения кодируемых белков с их

UDP"D"GalpNAc. Рядом с геном galU находится

биосинтетическими функциями. Собранная

ген itrA2, который отвечает за инициацию син"

последовательность и обновленная аннотация

теза К"звена путем присоединения первого ос"

доступны в базе данных GenBank под номером

татка К"звена (D"GalpNAc) к липиду"перенос"

доступа KC526897.2. Полная геномная последо"

чику на внутренней мембране бактерии [21].

вательность использована для установления

Центральная область KL32 включает четыре

сиквенс"типа в соответствии со схемой MLST

предсказанных гена гликозилтрансфераз (gtr67,

Института Пастера для A. baumannii

gtr68, gtr69, gtr70), необходимых для образования

(https://pubmlst. org/bigsdb?db=pubmlst_abauman"

гликозидных связей в К"звене, ген ацетилтранс"

nii_pasteur_seqdef).

феразы (atr9) и ген, кодирующий белок с неуста"

новленной функцией (Оrf).

В центральной области кластера присутству"

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ет также ген типа udg (udg3), который по данным

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

базы данных GenPept (номер доступа

AHB32286.1) только на 20% идентичен (74%

Последовательность генов в геномном клас"

покрытия) продукту гена ugd (GenPept, номер

тере PSgc21 КПС A. baumannii LUH5549, доступ"

доступа AHB32291.1), расположенного в генном

ная в базе данных GenBank под номером досту"

модуле синтеза сахаров и предположительно от"

па KC526897.1, является неполной ввиду отсут"

вечающего за превращение UDP"D"Glcp в

ствия генов экспорта КПС (wza+wzb+wzc), что

UDP"D"GlcA [5]. Хотя ген ugd является общим

свидетельствует о потенциальной проблеме ка"

для всех генных кластеров A. baumannii, его роль

чества сборки генома. Поскольку последова"

в синтезе КПС пока не установлена. Белок Ugd3

тельность изначально была собрана в контиги

также на 27% идентичен (на 71% гомологичен)

из коротких ридов с использованием програм"

другому белку типу Ugd (Ugd2), найденному в

мы Velvet 2.0 [7], короткие риды (SRA, номер

центральной области генных кластеров KL20 и

доступа DRS005644) были вновь собраны в кон"

KL21. В соответствии с наличием Ugd2

тиги, используя программу SPAdes. Полная пос"

(GenPept, номера доступа AUG44319.1 и

ледовательность фрагмента геномного кластера

AIT56461.1), КПС K20 и K21 содержат D"GlcpA

между консервативными генами fkpA и lldP,

[22]. Присутствие гена ugd3 в центральной об"

фланкирующими К"локус, оказалась на 99,56%

ласти KL32 предполагает, что КПС K32 также

идентичной установленной ранее последова"

содержит D"GlcA.

тельности генного кластера KL32 штамма

КПС выделяли из клеток бактерии A. bau+

A. baumannii BAL_058 (GenBank, номер доступа

mannii LUH5549 водно"фенольной экстракцией

KT359615.1), выделенного во Вьетнаме [20]. Со"

с последующей очисткой нагреванием в 2%

ответственно, генный кластер LUH5549 пере"

HOAc для расщепления липополисахаридов с

именован в KL32, и его гены обозначены в соот"

короткими углеводными цепями и гель"прони"

ветствии с принятой системой номенклатуры

кающей хроматографией на геле Sephadex G"50.

[5]. Обновленная последовательность и аннота"

Анализ углеводов, содержащихся в КПС, в виде

ция доступны в базе данных GenBank (номер

ацетатов альдитолов методом ГЖХ показал на"

доступа KC526897.2).

личие Glc, GlcNAc и GalNAc в соотношении

Генный кластер KL32 (рис. 1) включает гены

1 : 1,6 : 1,8. Кроме того, с помощью жидкостной

wzy и wzx, ответственные за процессинг К"звена,

анионообменной хроматографии идентифици"

модуль генов galU, ugd, gpi, gne1, pgm, отвечаю"

рована GlcA. Абсолютная конфигурация саха"

щих за синтез UDP"производных сахаров,

ров не определялась химическим методом, но

включая UDP"D"Glcp, UDP"D"GlcpNAc и

следовала из генетических данных (см. ниже).

Рис. 1. Генный кластер биосинтеза КПС Acinetobacter baumannii KL32. Стрелки показывают направление транскрипции по

данным базы данных GenBank (номер доступа KC526879.2). Гены гликозилтрансфераз (gtr) окрашены в светло"серый

цвет, ген инициирующей трансферазы (itrA2) - в черный цвет. Роль генов, окрашенных в темно"серый цвет, в биосинте"

зе КПС K32 не установлена

БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020

КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД A. baumannii

283

Химические сдвиги ¹H и ¹³C ЯМР (м.д.)

Моносахаридные остатки

C"1

C"2

C"3

C"4

C"5

C"6

H+1

H+2

H+3

H+4

H+5

H+6

КПС

→3)"β"D"GalpNAc"(1→

104,1

52,5

81,3

69,2

75,9

62,6

4,54

3,83

3,89

4,06

3,59

3,74; 3,82

→4)"β"D"GlcpA"(1→

105,3

73,5

75,2

81,2

74,8

172,1

4,58

3,40

3,64

3,84

4,01

→3,4)"β"D"GalpNAc"(1→

102,9

52,8

79,0

74,9

77,0

61,6

4,53

4,06

3,84

4,22

3,73

3,64; 3,68

→6)"α"D"GlcpNAc"(1→

98,3

55,3

71,9

70,9

72,0

69,3

4,86

3,90

3,87

3,71

4,34

4,06; 4,32

β"D"Glcp"(1→

104,0

74,5

77,2

71,2

77,2

62,4

4,47

3,35

3,49

3,40

3,43

3,72; 3,91

МПС

→3)"β"D"GalpNAc"(1→

103,7

52,4

81,1

69,1

76,0

62,3

4,58

3,97

3,85

4,12

3,64

3,76; 3,78

→4)"β"D"GlcpA"(1→

105,4

73,9

75,1

81,1

77,9

4,50

3,36

3,57

3,76

3,68

→3)"β"D"GalpNAc"(1→

102,3

52,4

80,7

69,3

76,0

62,3

4,51

3,95

3,80

4,16

3,70

3,77; 3,81

Примечание. Химические сдвиги ¹H ЯМР выделены курсивом; химические сдвиги N"ацетильных групп: δ_H 1,96"2,06,

δ_C 23.3"24.0 (Me) и 175.3"175.5 (CO).

Спектры ¹Н и ¹³С (рис. 2) ЯМР КПС вклю"

В спектре ¹Н,¹³С HMBC имелись корреля"

чали сигналы пяти моносахаридных остатков и

ции между аномерными протонами и атомами

трех N"ацетильных групп. Интерпретация

углерода в местах замещения при δ 4,47/69,3;

спектров с помощью двумерных экспериментов

δ 4,53/81,2; δ 4,54/79,0; δ 4,58/81,3 и δ 4,86/74,9,

¹H,¹H COSY,

¹H,¹H TOCSY,

¹H,¹H ROESY,

что указывало на корреляции E H1/D C"6,

¹H,¹³C HSQC и ¹H,¹³C HMBC выявила спино"

С Н1/B С"4, A H"1/С С"3, B H"1/A C"3 и D H"1/

вые системы остатков β"Glc (E), β"GlcA (B),

С С"4, соответственно (рис. S1 Приложения).

α"GlcNAc (D) и двух остатков β"GalNAc (A и

Эти данные, а также данные о корреляции ано"

C), находящихся в пиранозной форме (таблица

мерных протонов с протонами при атомах угле"

1). Из величин констант спин"спинового взаи"

рода гликозилируемых остатков в спектре ¹Н,¹Н

модействия ³J_H,H кольцевых протонов в одно" и

ROESY (рис. S2 Приложения) позволили уста"

двумерных спектрах следовала α"глюкоконфи"

новить типы гликозидных связей и последова"

гурация остатка D, β"глюкоконфигурация ос"

тельность моносахаридов в К"звене.

татков B и E и β"галактоконфигурация остат"

Таким образом, КПС K32 A. baumannii

ков A и C. Конфигурация остатков А, В, С и Е

LUH5549 имеет структуру, представленную на

подтверждена корреляциями H"1/H"5 в спектре

рис. 3, которая, по нашим данным, отличается

ROESY (рис. 3). Сравнение положений низко"

от известных структур бактериальных полисаха"

польных сигналов атомов C"3 остатков C и A

ридов, депонированных в базе данных Bacterial

(δ 79,0 и 81,3), атомов C"4 остатков C и B (δ 74,9

Carbohydrate Structure Database (BCSDB;

и 81,2), а также атома C"6 остатка D (δ 69,3)

http://csdb.glycoscience.ru/bacterial/) [25]. До"

(таблица 1) с таковыми в соответствующих не"

полнительное доказательство структуры КПС

замещенных моносахаридах [23, 24] указывало

получено в результате деградации КПС по Сми"

на места замещения моносахаридных остатков

ту, приведшей к образованию модифицирован"

в К"звене. Химические сдвиги атомов С"

ного полисахарида (МПС). Структура МПС,

2,3,4,5,6 в остатке Е и незамещенной β"глюко"

представленная на рис. 3, установлена теми же

пиранозы [23] близки, что указывало на терми"

методами, что и структура КПС, включая одно"

нальное положение этого остатка.

и двумерную спектроскопию ЯМР (таблица).

БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020

284

КАХИЛЛ и др.

Рис. 2. Спектр ¹³C ЯМР КПС A. baumannii LUH5549. Обозначения сигналов атомов углерода приведены в соответствии с

таблицей и рис. 3

Рис. 3. Структура КПС A. baumannii LUH5549 и МПС, полученного при деградации КПС по Смиту. Гликозилтрансфера"

зы Gtr, полимераза Wzy и инициирующая трансфераза ItrA2 показаны рядом с гликозидными связями, которые они пред"

положительно образуют

КПС К32 построен из повторяющихся пен"

Похожая связь β"D"GalpNAc"(1→3)"D"GalpNAc

тасахаридных К"звеньев, включающих обычные

имеется в КПС К32, и следовательно, Wzy_K32 от"

для бактерий сахара, такие как D"GalpNAc, D"

ветственна за ее образование. Таким образом,

GlcpNAc и D"Glcp, а также D"GlcpA. Ранее мы

построение К"звена начинается с переноса остат"

предположили, что ген ugd, присутствующий в

ка D"GalpNAc A на липид"носитель (рис. 3).

модуле синтеза простых сахаров, не является не"

Сборка К"звена требует участия трех инвер"

обходимым для продуцирования КПС [5], а мо"

тирующих гликозилтрансфераз для образования

носахарид D"GlcA присутствует в КПС A. bau+

трех β"связей и одной гликозилтрансферазы, ра"

mannii, только когда второй ген тип ugd включен

ботающей по механизму с сохранением аномер"

в генный кластер [22]. Соответственно, генный

ной конфигурации, для образования α"связи.

кластер KL32 содержит ген ugd3 в центральной

Эту роль может выполнять только одна гликозил"

области, и, как результат, в структуре КПС типа

трансфераза в генном кластере KL32, а именно

К32 имеется D"GlcA.

Gtr68_K32(GenPept, номер доступа AHB32282.2),

Поскольку в структуре КПС присутствуют два

входящая по базе данных CAZ_y в семейство гли"

остатка D"GalNAc (рис. 3), оставалось неясным

козилтрансфераз GT4, сохраняющих аномерную

какой из них является первым в биологическом

конфигурацию [18]. Следовательно, Gtr68_K32 от"

повторяющемся звене К32, присоединяемым в

вечает за образование связи между остатками

ходе биосинтеза КПС к липиду"носителю про"

α"D"GlсpNAc D и D"GalpNAc C.

дуктом гена itrA2 (GenPept, номер доступа

Функции остальных гликозилтрансфераз в

AHB32289.2). Однако первый остаток мог быть

образовании гликозидных связей определены на

определен путем выяснения типа связи, образуе"

основании гомологии с другими известными

мой полимеразой Wzy_K32, ответственной за связы"

или предполагаемыми гликозилтрансферазами.

вание К"звеньев в единую полисахаридную цепь,

Gtr70_K32 (GenPept, номер доступа AHB32285.1)

т.е. за присоединение первого остатка К"звена к

на 54% идентична WdbN в О"антигенном класте"

последнему остатку. Полимераза Wzy_K32 (GenPept,

ре Escherichia coli O143 (GenPept, номер доступа

номер доступа AHB32283.1) на 28% идентична

STM86374.1), и в структуре полисахарида O143

полимеразе Wzy_K116, кодируемой в генном класте"

имеется связь β"D"GlcpA"(1→3)"D"GlcpNAc

ре A. baumannii KL116 (GenBank, номер доступа

[27]. Похожая связь - β"D"GlcpA"(1→3)"D"

MK399425.1), которая, как недавно установлено,

GalpNAc - есть в КПС K32 (рис. 3), и на основа"

образует связь β"D"GalpNAc"(1→3)"D"Galp [26].

нии этого был сделан вывод, что Gtr70_K32 образу"

БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020

КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД A. baumannii

285

ет эту связь. Гликозилтрансфераза Gtr67_К32

Ранее генный кластер KL32 был обнаружен

(GenPept, номер доступа AHB32281.1) на 27%

в штаммах, принадлежащих к широко распро"

идентична Gtr75_K37, кодируемой в генном клас"

страненной глобальной клональной линии 2

тере A. baumannii KL37 (GenBank, номер доступа

(GC2, эквивалент сиквенс"типа ST2 в схеме

KX712115.1). В соответствии со структурой КПС

MLST института Пастера [20]). В настоящей ра"

К37 [26], Gtr75_K37 катализирует образование свя"

боте исследован штамм A. baumannii LUH5549 с

зи β"D"Glcp"(1→6)"D"GalpNAc. Таким образом,

генным кластером KL32, принадлежащий к

Gtr67_K32предположительно отвечает за образо"

сиквенс"типу ST354, что свидетельствует о

вание похожей связи β"D"Glcp"(1→6)"D"

распространении этого генного кластера среди

GlсpNAc в КПС К32_. Наконец, для Gtr69_K32

различных клональных линий вследствие гори"

(GenPept, номер доступа AHB32284.1), входя"

зонтального генетического переноса между ни"

щей в семейство белков glycos_transf_2 (Pfam -

ми.

PF00535), не было найдено соответствий в базе

данных BLASTp. Так как в К"звене оставалась

только одна связь - β"D"GalpNAc"(1→4)"D"

Финансирование. Работа выполнена при фи"

GlcpA, к которой могла быть отнесена эта глико"

нансовой поддержке гранта Российского науч"

зилтрансфераза, был сделан вывод, что Gtr69_K32

ного фонда (проект 19"14"00273) для Ю.А.К. и

отвечает за образование этой связи (рис. 3).

гранта Australian Research Council (ARC)

Функции белков Atr9 (GenPept, номер досту"

DECRA Fellowship 180101563 для Дж.Дж.К.

па AHB32287.2) и Orf (GenPept, номер доступа

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от"

AHB32288.2) не могли быть установлены, пос"

сутствии конфликта интересов.

кольку КПС не содержит ацетильных или дру"

Соблюдение этических норм. Настоящая

гих ацильных групп, и все особенности его

статья не содержит описания каких"либо иссле"

структуры обусловлены наличием остальных ге"

дований с использованием людей и животных в

нов в генном кластере KL32.

качестве объектов изучения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Russo, T., Luke N., Beanan J., Olson R., Sauberan S.,

mannii LUH5533, Carbohydr. Res.,

479,

1-5,

MacDonald U., Schultz L., Umland T., and Campagnari A.

doi: 10.1016/j.carres.2019.04.008.

(2010) The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter bau+

9. Shashkov, A.S., Senchenkova, S.N., Popova, A.V., Mei, Z.,

mannii strain 307"0294 is a major virulence factor, Infect.

Shneider, M.M., Liu, B., Miroshnikov, K.A., Volozhantsev, N.V.,

Immun., 78, 3993-4000, doi: 10.1128/IAI.00366"10.

and Knirel, Y.A. (2015) Revised structure of the capsular

Singh, J.K., Adams, F.G., and Brown, M.H. (2018)

polysaccharide of Acinetobacter baumannii LUH5533

Diversity and function of capsular polysaccharide in

(serogroup O1) containing di"N"acetyllegionaminic acid,

Acinetobacter baumannii, Front. Microbiol., 9, 3301,

Russ. Chem. Bull. Int. Ed., 64, 1196-1199, doi: 10.1007/

doi: 10.3389/fmicb.2018.03301.

s11172"015"1000"9.

Tipton, K.A., Chin, C.Y., Farokhyfar, M., Weiss, D.S., and

10. Senchenkova, S.N., Popova, A.V., Shashkov, A.S.,

Rather, P.N. (2018) Role of capsule in resistance to disin"

Shneider, M.M., Mei, Z., Arbatsky, N.P., Liu, B.,

fectants, host antimicrobials, and desiccation in

Miroshinikov, K.A., Volozhantsev, N.V., and Knirel, Y.A.

Acinetobacter baumannii, Antimicrob. Agents Chemother.,

(2015) Structure of a new pseudaminic acid"containing cap"

62, doi: 10.1128/aac.01188"18.

sular polysaccharide of Acinetobacter baumannii LUH5550

Geisinger, E., Huo, W., Hernandez"Bird, J., and Isberg, R.R.

having the KL42 capsule biosynthesis locus, Carbohydr. Res.,

(2019) Acinetobacter baumannii: envelope determinants

407, 154-157, doi: 10.1016/j.carres.2015.02.006.

that control drug resistance, virulence, and surface vari"

11. Kasimova, A.A., Kenyon, J.J., Arbatsky, N.P., Shashkov, A.S.,

ability, Ann. Rev. Microbiol., 73, 481-506, doi: 10.1146/

Popova, A.V., Knirel, Y.A., and Hall, R.M.

(2018)

annurev"micro"020518"115714.

Structure of the K82 capsular polysaccharide from

Kenyon, J.J., and Hall, R.M. (2013) Variation in the com"

Acinetobacter baumannii LUH5534 containing a D"galac"

plex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter bau+

tose 4,6"pyruvic acid acetal, Biochemistry (Moscow), 83,

mannii genomes, PLoS One, 8, e62160, doi: 10.1371/journal.

831-835, doi: 10.1134/S0006297918070064.

pone.0062160.

12. Shashkov, A.S., Liu, B., Kenyon, J.J., Popova, A.V.,

Traub, W.H. (1989) Acinetobacter baumannii serotyping for

Shneider, M.M., Senchenkova, S.N., Arbatsky, N.P.,

deliniation of outbreaks of nosocomial cross"infection,

Miroshnikov, K.A., Wang, L., and Knirel, Y.A. (2017)

J. Clin. Microbiol., 27, 2713-2716.

Structures of the K35 and K15 capsular polysaccharides of

Hu, D., Liu, B., Dijkshoorn, L., Wang, L., and Reeves, P.R.

Acinetobacter baumannii LUH5535 and LUH5554 con"

(2013) Diversity in the major polysaccharide antigen of

taining amino and diamino uronic acids, Carbohydr. Res.,

Acinetobacter baumannii assessed by DNA sequencing, and

448, 28-34, doi: 10.1016/j.carres.2017.05.017.

development of a molecular serotyping scheme, PLoS One,

13. Kenyon, J.J., Shashkov, A.S., Senchenkova, S.N.,

8, e70329, doi: 10.1371/journal.pone.0070329.

Shneider, M.M., Liu, B., Popova, A.V., Arbatsky, N.P.,

Senchenkova, S.N., Kenyon, J.J., Jia, T., Popova, A.V.,

Miroshnikov, K.A., Wang, L., Knirel, Y.A., and Hall, R.M.

Shneider, M.M., Kasimova, A.A., Shashkov, A.S., Liu, B.,

(2017) Acinetobacter baumannii K11 and K83 capsular

Hall, R.M., and Knirel, Y.A. (2019) The K90 capsular

polysaccharides have the same 6"deoxy"l"talose"contain"

polysaccharide produced by Acinetobacter baumannii

ing pentasaccharide K units but different linkages between

LUH5553 contains di"N"acetylpseudaminic acid and is

the K units, Int. J. Biol. Macromol., 103, 648-655,

structurally related to the K7 polysaccharide from A. bau+

doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.05.082.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020

286

КАХИЛЛ и др.

14.

Shashkov, A.S., Kenyon, J.J., Arbatsky, N.P., Shneider, M.M.,

Genom., 2, e000050, doi: 10.1099/mgen.0.000050.

Popova, A.V., Miroshnikov, K.A., Hall, R.M., and Knirel, Y.A.

21. Kenyon, J.J., Marzaioli, A.M., Hall, R.M., and De Castro, C.

(2016) Related structures of neutral capsular polysaccha"

(2014) Structure of the K2 capsule associated with the KL2

rides of Acinetobacter baumannii isolates that carry related

gene cluster of Acinetobacter baumannii, Glycobiology, 24,

capsule gene clusters KL43, KL47, and KL88, Carbohydr.

554-563, doi: 10.1093/glycob/cwu024.

Res., 435, 173-179, doi: 10.1016/j.carres.2016.10.007.

22. Kasimova, A.A., Kenyon, J.J., Arbatsky, N.P., Shashkov, A.S.,

15.

Westphal, O., and Jann, K. (1965) Bacterial lipopolysaccha"

Popova, A.V., Shneider, M.M., Knirel, Y.A., and Hall, R.M.

rides: extraction with phenol"water and further applications

(2018) Acinetobacter baumannii K20 and K21 capsular

of the procedure, in Methods in Carbohydrate Chemistry

polysaccharide structures establish roles for UDP"glucose

(Whistler, R. ed.) Academic press, New York, pp. 83-91.

dehydrogenase Ugd2, pyruvyl transferase Ptr2 and two gly"

16.

Sawardeker, J.S., Sloneker, J.H., and Jeanes, A. (1965)

cosyltransferases, Glycobiology, 28, 876-884, doi: 10.1093/

Quantitative determination of monosaccharides as their

glycob/cwy074.

alditol acetates by gas liquid chromatography, Anal. Chem.,

23. Lipkind, G.M., Shashkov, A.S., Knirel, Y.A., Vinogradov, E.V.,

37, 1602-1604, doi: 10.1021/ac60231a048.

and Kochetkov, N.K. (1988) A computer"assisted structur"

17.

Bankevich, A., Nurk, S., Antipov, D., Gurevich, A.A.,

al analysis of regular polysaccharides on the basis of ¹³C"

Dvorkin, M., Kulikov, A.S., Lesin, V.M., Nikolenko, S.I.,

n.m.r. data, Carbohydr. Res., 175, 59-75, doi: 10.1016/

Pham, S., Prjibelski, A.D., Pyshkin, A.V., Sirotkin, A.V.,

0008"6215(88)80156"3.

Vyahhi, N., Tesler, G., Alekseyev, M.A., and Pevzner, P.A.

24. Jansson, P.E., Kenne, L., and Schweda, E. (1987) Nuclear

(2012) SPAdes: a new genome assembly algorithm and its

magnetic resonance and conformational studies on

applications to single"cell sequencing, J. Comput. Biol., 19,

monoacetylated methyl D"gluco" and D"galacto"pyrano"

455-477, doi: 10.1089/cmb.2012.0021.

sides, J. Chem. Soc. Perkin Trans.,

377-383,

18.

Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E.,

doi: 10.1039/P19870000377.

Coutinho, P.M., and Henrissat, B. (2014) The carbohy"

25. Toukach, P. (2011) Bacterial Carbohydrate Structure

drate"active enzymes database (CAZy) in 2013, Nucleic

Database 3: principles and realization, J. Chem. Inf.

Acids Res., 42, 490-495, doi: 10.1093/nar/gkt1178.

Model., 51, 159-170, doi: 10.1021/ci100150d.

19.

Finn, R.D., Coggill, P., Eberhardt, R.Y., Eddy, S.R.,

26. Shashkov, A.S., Cahill, S.M., Arbatsky, N.P., Westacott, A.C.,

Mistry, J., Mitchell, A.L., Potter, S.C., Punta, M.,

Kasimova, A.A., Shneider, M.M., Popova, A.V., Shagin, D.A.,

Qureshi, M., Sangrador"Vegas, A., Salazar, G.A., Tate, J.,

Shelenkov, A.A., Mikhailova, Y.V., Yanushevich, Y.G.,

and Bateman, A. (2016) The Pfam protein families data"

Edelstein, M.V., Kenyon, J.J., and Knirel, Y.A. (2019) Acineto+

base: towards a more sustainable future, Nucleic Acids Res.,

bacter baumannii K116 capsular polysaccharide structure is

44, 279-285, doi: 10.1093/nar/gkv1344.

a hybrid of the K14 and revised K37 structures, Carbohydr.

20.

Schultz, M.B., Thanh, D.P., Hoan, N.T.D., Wick, R.R.,

Res., 484, 107774, doi: 10.1016/j.carres.2019.107774.

Ingle, D.J., Hawkey, J., Edwards, D.J., Kenyon, J.J.,

27. Landersjö, C., Weintraub, A., and Widmalm, G. (1996)

Lan, N.P.H., Campbell, J.I., Thwaites, G., Nhu, N.T.K.,

Structure determination of the O"antigen polysaccharide

Hall, R.M., Fournier"Level, A., Baker, S., and Holt, K.E.

from the enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) O143 by

(2016) Repeated local emergence of carbapenem"resistant

component analysis and NMR spectroscopy, Carbohydr.

Acinetobacter baumannii in a single hospital ward, Microb.

Res., 291, 209-216, doi: 10.1016/s0008"6215(96)00168"1.

ELUCIDATION OF THE K32 CAPSULAR POLYSACCHARIDE STRUCTURE

AND CHARACTERIZATION OF THE KL32 GENE CLUSTER

OF Acinetobacter baumannii LUH5549*^,**

S. M. Cahill^1#, N. P. Arbatsky^2#, A. S. Shashkov², M. M. Shneider³,

A. V. Popova^4,5, R. M. Hall^6#, J. J. Kenyon^1#, Yu. A. Knirel²***^#

¹ Institute of Health and Biomedical Innovation, School of Biomedical Sciences, Faculty of Health,

Queensland University of Technology, QLD 4001 Brisbane, Australia

² Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 119991 Moscow, Russia; E+mail: yknirel@gmail.com

³ Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 117997 Moscow, Russia

⁴ Moscow Institute of Physics and Technology, 141701 Dolgoprudny, Moscow Region, Russia

⁵ State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, 142279 Obolensk, Moscow Region, Russia

⁶ School of Life and Environmental Sciences, The University of Sydney, Sydney, Australia

Received October 29, 2019

Revised November 25, 2019

Accepted November 26, 2019

Capsular polysaccharide (CPS) isolated from Acinetobacter baumannii LUH5549 carrying the KL32 capsule biosyn"

thesis gene cluster, was studied by sugar analysis, Smith degradation, and one" and two"dimensional ¹H and ¹³C NMR

spectroscopy. The K32 CPS was found to be composed of branched pentasaccharide repeats (K units) containing two

residues of β"D"GalpNAc and one residue of β"D"GlcpA (β"D"glucuronic acid) in the main chain and one residue

of each of β"D"Glcp and α"D"GlcpNAc in the side disaccharide chain. Consistent with the established CPS struc"

ture, the KL32 gene cluster includes genes for UDP"D"glucose 6"dehydrogenase (Ugd3) responsible for D"glu"

curonic acid (D"GlcA) synthesis and four glycosyltransferases that were assigned to specific linkages. Genes encod"

ing acetyltransferase and unknown protein product were not involved in the CPS biosynthesis. Whilst the KL32 gene

cluster has previously been found in the global clone 2 (GC2) lineage, LUH5549 belongs to the sequence type ST354,

thus demonstrating horizontal gene transfer between these lineages.

Keywords: Acinetobacter baumannii, capsule, K locus, polysaccharide structure, glucuronic acid

БИОХИМИЯ том 85 вып. 2 2020