БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 3, с. 348 - 359

УДК 577.2

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В ГИБЕЛИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ S. cerevisiae,

ВЫЗВАННОЙ ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ

ПОЛОВОГО ФЕРОМОНА*

С.С. Соколов¹**, К.В. Галкина¹, Е.А. Литвинова²,

Д.А. Кнорре^1,3, Ф.Ф. Северин¹

¹ НИИ физико химической биологии им. А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

119991 Москва, Россия; электронная почта: sviatoslav.sokolov@gmail.com

² Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119991 Москва, Россия

³ Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова

Министерства здравоохранения Российской Федерации, 119992 Москва, Россия

Поступила в редакцию 03.11.2019

После доработки 21.01.2020

Принята к публикации 21.01.2020

Белки Lam1-Lam4 осуществляют невезикулярный транспорт стеринов из плазматической мембраны (ПМ)

в эндоплазматический ретикулум, нарушение их работы приводит к увеличению содержания стеринов в

ПМ. У животных гомологи белков Lam отвечают за интернализацию холестерина из плазмы крови. Биоло$

гическая роль дрожжевых белков Lam остается неясной, так как выраженные фенотипы у штаммов с деле$

цией отдельных генов LAM не наблюдаются. Однако известно, что делеция LAM1(YSP1) препятствует регу$

лируемой гибели клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванной половым феромоном. Мы исследова$

ли, будет ли мутация по гену LAM2 также влиять на гибель клеток в присутствии избытка полового феромо$

на и оценили характер генетических взаимодействий между LAM2 и генами, отвечающими за биосинтез эр$

гостерина. Мы показали, что делеция LAM2 частично предотвращает гибель клеток дрожжей лабораторно$

го штамма W303, вызванную половым феромоном. При этом делеция трех других генов LAM - LAM1, LAM3

и LAM4 - дополнительно не увеличивала этот эффект. Мутация в гене транскрипционного фактора UPC2,

приводящая к избыточному накоплению стеринов в клетке (UPC2 1), приводила к увеличению выживае$

мости клеток в присутствии α$фактора и проявляла аддитивность с делецией LAM2. В то же время в лабо$

раторном штамме BY4741 делеция LAM2 наоборот стимулировала гибель клеток, вызванную феромоном.

Мы обнаружили, что делеция генов биосинтеза эргостерина ERG2 и ERG6 снижала эффект от делеции

LAM2. В штамме Δerg4, в котором делетирован ген терминального этапа пути биосинтеза эргостерина, деле$

ция LAM2 заметно увеличивала долю мертвых клеток и снижала скорость роста суспензионной культуры

клеток этого штамма даже в отсутствие феромона. Мы предполагаем, что отсутствие эффекта от делеции ге$

на LAM2 в штаммах Δerg6 и Δerg2 указывает на неспособность Lam2p транспортировать некоторые интерме$

диаты биосинтеза эргостерина, такие как ланостерин. В совокупности наши данные говорят о том, что роль

белков Lam в клеточной смерти дрожжей, вызванной феромоном, обусловлена их воздействием на стери$

новый состав ПМ.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гены LAM, дрожжи, клеточная смерть, половой феромон, стерины.

DOI: 10.31857/S0320972520030057

У многоклеточных организмов запрограм$

росом. В случае хорошо изученного модельного

мированная гибель клеток (запрограммирован$

объекта - пекарских дрожжей Saccharomyces

ная клеточная смерть, ЗКС) играет важную роль

cerevisiae - принято различать: СКС (случайную

в индивидуальном развитии, иммунитете и под$

клеточную смерть, accidental cell death), вызван$

держании тканевого гомеостаза [1, 2]. Наличие

ную стрессорными факторами высокой интен$

и физиологическая роль ЗКС у одноклеточных

сивности и сопряженной с потерей барьерной

организмов до сих пор остается открытым воп$

функции плазматической мембраны (ПМ), и

Принятые сокращения: ЗКС - запрограммированная клеточная смерть, КОЕ - колониеобразующая единица;

ПМ - плазматическая мембрана; РКС - регулируемая гибель клеток; ЭР - эндоплазматический ретикулум.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.

bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19$339, 24.02.2020.

** Адресат для корреспонденции.

348

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

349

РКС (регулируемую клеточную смерть) [3]. Под

мейству мембранных стерин$связывающих бел$

РКС подразумевают клеточную гибель, вызван$

ков [15]. Функция этих белков, предположи$

ную слабыми стрессорными условиями, внеш$

тельно, заключается в транспорте стеринов

ними или внутренними сигналами, которые

между ПМ и эндоплазматическим ретикулумом

можно искусственно предотвратить, например,

(ЭР). В случае многоклеточных животных такой

путем выключения работы определенных генов.

транспорт необходим для захвата холестерина

ЗКС является естественным (физиологическим)

из плазмы крови [16]. Для пекарских дрожжей

сценарием РКС. В настоящее время описано до$

было показано, что делеция LAM1 приводит к

вольно много индукторов РКС дрожжей и дру$

снижению резистентности клеток к антигриб$

гих одноклеточных организмов, однако физио$

ковому препарату амфотерицину B [15]. По$

логическая роль РКС во многих случаях остает$

скольку амфотерицин B способен встраиваться

ся неизвестной [4-8].

и нарушать функции только тех мембран, где

Ранее мы показали, что высокая концентра$

содержится эргостерин

[17], увеличение

ция полового феромона α$фактора (100 мкг/мл)

чувствительности делеционных мутантов Δlam1

вызывает РКС дрожжей а$типа спаривание [9, 10].

и Δlam2 к амфотерицину B указывает на то, что

Действие полового феромона сопровождается

нарушение транспорта стеринов в дрожжах при$

увеличением в цитоплазме концентрации каль$

водят к увеличению содержания эргостерина в

ция [11], поэтому было высказано предположе$

плазматической мембране. Недавно мы показа$

ние, что увеличение концентрации кальция в

ли, что делеции генов семейства LAM действи$

цитоплазме может быть фактором, принимаю$

тельно приводят к увеличению содержания сте$

щим участие в развитии цепи событий, приводя$

рина в плазматической мембране и во внутрен$

щей к гибели клеток [10]. Антиаритмический

них компартментах клетки [18].

препарат амиодарон также вызывает увеличение

Помимо LAM1 и LAM2 в геноме пекарских

концентрации кальция в цитоплазме [12] и акти$

дрожжей есть еще четыре паралогичных гена то$

вирует цепь событий внутри клетки, схожую с

го же семейства: LAM3, LAM4, LAM5 и LAM6.

той, которая включается в ответ на добавление

При этом синтезируемые ими белки Lam1,

100 мкг/мл феромона [10]. Следует отметить, что

Lam2, Lam3 и Lam4 локализованы в местах кон$

даже такие высокие концентрации α$фактора

тактов ПМ и ЭР, в то время как Lam5 и Lam6 -

приводят к гибели лишь определенной фракции

в местах контакта ЭР и митохондрий (см. обзо$

клеток в суспензии, в то время как существенная

ры Alli$Balogun и Levine [19] и Sokolov et al. [20]).

часть (50-80%) клеток сохраняют жизнеспособ$

Открытие роли белков Lam в транспорте

ность. Размер этой фракции зависит от штамма и

стеринов поставило вопрос о роли стеринового

дальнейшее увеличение концентрации феромо$

состава мембраны в РКС дрожжей. Возможно,

на не приводит к увеличению доли мертвых кле$

эффекты делеций генов LAM1 и LAM2, на РКС,

ток [13]. Механизмы, ограничивающие гибель

вызванную феромоном, амиодароном и ацета$

клеток в присутствии избытка полового феромо$

том, являются следствием изменения содержа$

на, до сих пор неизвестны. Мутация в гене каль$

ния эргостерина в ПМ. В этом случае другие

модулина cmd1 6 [9] или делеция гена метакас$

воздействия на клетку, повышающие или пони$

пазы дрожжей MCA1 [13] приводят к значитель$

жающие содержание стерина в дрожжах, пред$

ному увеличению количества мертвых клеток в

положительно, будут оказывать такое же воз$

присутствии избытка феромона.

действие. Альтернативой этому предположе$

Ранее мы провели два скрининга, направ$

нию является непосредственное участие белков

ленных на поиск генов - положительных регу$

Lam в трансдукции сигнала, приводящего к ги$

ляторов ЗКС дрожжей, вызванной феромоном и

бели клеток. Более того, до сих пор не известно

амиодароном. В результате были выявлены гены

способны ли паралогичные гены LAM дублиро$

LAM1 и LAM2, снижающие резистентность кле$

вать функции друг друга или каждый из них

ток к амиодарону [10, 14]. Первоначально эти

имеет свою узкую специализацию внутри клет$

гены были названы YSP1 и YSP2 (от Yeast

ки.

Suicidal Proteins), однако позднее переименова$

В своей работе мы исследовали РКС, выз$

ны в LAM1 и LAM2 (от LAM - Lipid transfer pro$

ванную высокой концентрацией полового фе$

tein Anchoredat Membrane contactsites, транспор$

ромона и амиодароном. Для этих индукторов

тер липидов, заякоренный в контактных сайтах

РКС мы оценили роль делеций гена LAM2 и му$

мембраны) соответственно. Делеция гена LAM1

таций, приводящих как к увеличению содержа$

также частично защищала клетки от гибели,

ния стерина (UPC2 1), так и к нарушению тер$

вызванной феромоном [10].

минальных стадий биосинтеза стерина (Δerg2,

Недавно было показано, что LAM1 и LAM2

Δerg3, Δerg4, Δerg6). Кроме того, мы сравнили

кодируют белки, принадлежащие одному се$

эффект от одиночной делеции гена LAM2 с эф$

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

350

СОКОЛОВ и др.

фектом от делеции всех четырех генов LAM

Оценка эффективности скрещивания штам=

(LAM1-LAM4). Полученные нами и ранее опуб$

мов. Клетки обоих типов спаривания выращива$

ликованные данные указывают на то, что роль

ли 12-16 ч до логарифмической стадии роста и

генов LAM в РКС дрожжей опосредована изме$

разводили в жидкой YPD до конечной плотнос$

нениями в стериновом составе мембраны.

ти ~2×10⁶ клеток/мл. Далее смешивали клетки

противоположных типов спаривания и инкуби$

ровали 6 ч при 30 °С. После инкубации смесь

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

клеток микроскопировали и подсчитывали до$

лю зигот на 250-300 клеток.

Штаммы, условия культивирования дрожжей

Проточная цитофлуориметрия, индукция РКС

и реагенты. Реактивы, используемые в исследо$

половым феромоном. Клетки выращивали 12-16 ч

вании: амиодарон, α$фактор, пропидия йодид,

в жидкой среде YPD до конечной плотности

синтетическая среда YNB, аминокислотные до$

4×10⁶ клеток/мл. К суспензии добавляли α$фак$

бавки и галактоза («Sigma$Aldrich», США),

тор до конечной концентрации 100 мкг/мл и ин$

дрожжевой экстракт, пептон и агар («Difco»,

кубировали 4 ч на качалке («New Brunswick

США), глюкоза («Helicon», Россия). Клетки вы$

Scientific», США) при 200 об./мин 30 °С. В каче$

ращивали на средах: YPD

(1% дрожжевой

стве отрицательного контроля использовали

экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза) и YPGal (1%

суспензию клеток, не обработанную α$факто$

дрожжевой экстракт, 2% пептон и 2% галакто$

ром, которую также инкубировали 4 ч на качал$

за). В твердые среды добавляли агар до 2%.

ке при 30 °С. В качестве положительного кон$

Штаммы UPC2 1, Δlam1, Δlam2, Δlam3, Δlam4 и

троля (мертвые клетки) использовали суспен$

Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4 - производные W303.

зию клеток, которую инкубировали 3 ч при

Штаммы Δerg2, Δerg2Δysp2, Δerg3, Δerg3Δysp2,

50 °С. После инкубации все образцы разводили

Δerg4, Δerg4Δysp2, Δerg5, Δerg5Δysp2, Δerg6,

8 раз в фосфатно$солевом буфере PBS

Δerg6Δysp2 - производные штамма BY4741 (таб$

(«Gibco», США) и окрашивали пропидий йоди$

лица).

дом в концентрации 0,5 мкг/мл в течение

Смена типа спаривания. Для смены типа спа$

10 мин. Пропидий йодид - флуоресцентный

ривания мы трансформировали штаммы плаз$

зонд, не способный проникать в живые клетки и

мидой pGAL$HO, в которой закодирована экзо$

окрашивающий мертвые клетки [22]. Флуорес$

нуклеаза HO под контролем галактозо$регули$

ценцию клеток, окрашенных пропидий йоди$

руемого промотора P_GAL, по методу, опублико$

дом, анализировали с помощью проточных ци$

ванному в работе Herskowitz и Jensen [21]. Полу$

тофлуориметров CytoFlex («Beckman», США) и

ченные штаммы инкубировали ночь в среде

Beckman Coulter FC 500 («Beckman», США) при

YPGal (2% галактоза) и переносили на твердую

длине волны возбуждения 488 нм и эмиссион$

среду YPD (2% глюкоза). Тип спаривания полу$

ном фильтре 690/50 нм. Каждый эксперимент

ченных таким образом отдельных колоний оп$

был выполнен не менее чем в трех независимых

ределяли контрольным скрещиванием со штам$

повторах, полученных в разные дни. В каждом

мами а и альфа типа. Колонии с нужным типом

эксперименте анализировали не менее 10 000 со$

спаривания сутки выращивали в жидкой среде

бытий (клеток).

YPD для потери плазмиды pGAL$HO. Потерю

плазмиды pGAL$HO проверяли по отсутствию

роста на селективной среде YNB$leu («Sigma$

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Aldrich», США).

Индукция РКС амиодароном, и оценка жиз=

Делеция гена LAM2 частично предотвращает

неспособности клеток дрожжей. Клетки выращи$

гибель клеток, вызванную избытком полового

вали 12-16 ч до логарифмической стадии роста

феромона, и не проявляет аддитивность с деле$

и разводили до конечной плотности 4×10⁶ кле$

циями генов LAM1, LAM3 и LAM4.

ток/мл в YPD с добавлением 25 мМ MES (2$(N$

Как отмечалось выше, в геноме дрожжей со$

морфолино)этансульфоновая кислота) («Sigma$

держатся четыре гена LAM (LAM1-LAM4). Ко$

Aldrich», США), pH 5,5. К суспензии клеток до$

дируемые ими белки (Lam1-Lam4) локализова$

бавляли амиодарон до конечной концентрации

ны в местах контакта ПМ и ЭР. Ген LAM2 (YSP2)

60 мкМ. Инкубацию с амиодароном проводили

был ранее найден нами в результате генетичес$

в течение часа при 30 °С. Затем клетки разбавля$

кого скрининга, направленного на поиск мута$

ли и переносили на твердую среду YPD. Через

ций, снижающих чувствительность к амиодаро$

24 ч измеряли долю выживших клеток, как со$

ну [14]. Этот ген является паралогом гена LAM1

отношение колониеобразующих единиц (КОЕ)

(YSP1) [15], делеция которого частично пред$

после стресса к КОЕ до стресса.

отвращает гибель клеток, вызванную высокой

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

351

Штаммы, использованные в исследовании

Штамм

Генотип

Родительский штамм

или источник

W303 1A

MATa ade2 101 his3 11 trp1 1 ura3 52 can1 100 leu2 3

Laboratory of A. Hyman

Δlam2

MATa ade2 101 his3 11 trp1 1 ura3 52 can1 100 leu2 3 Δlam2::TRP1

[14]

Δlam1Δlam2

MATa ade2 101 his3 11 trp1 1 ura3 52 can1 100 leu2 3 MATa ade2 101 his3 11 trp1 1

[35]

Δlam3Δlam4

ura3 52 can1 100 leu2 3 Δlam3::kanMX4 Δlam2::TRP1 Δlam1::NAT Δlam4::loxP

UPC2 1 MATa

MATa UPC2 1 ura3 1 his3 11, 15 leu2 3, 112 trp1 1

UPC2 1 MATalpha

UPC2 1 Δlam2

MATa UPC2 1 ura3 1 his3 11, 15 leu2 3, 112 trp1 1 Δlam2::HIS3

UPC2 1 MATa

PGAL LAM2

MATa ade2 101 his3 11 trp1 1 ura3 52 can1 100 leu2 3 PGAL LAM2::kanMX4

W303 1A

cmd1 6

[10]

BY4741

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

EUROSCARF

BY4742

MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

EUROSCARF

Δerg2MATa

Δerg2 MATalpha

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg2::kanMX4

EUROSCARF

Δerg3MATa

Δerg3 MATalpha

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg3::kanMX4

EUROSCARF

Δerg4MATa

Δerg4 MATalpha

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg4::kanMX4

EUROSCARF

Δerg5MATa

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg5::kanMX4

Δerg5 MATalpha

EUROSCARF

Δerg6MATa

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg6::kanMX4

Δerg6 MATalpha

EUROSCARF

Δerg2 Δlam2

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg2::kanMX4 Δlam2::HIS3

Δerg2 MATa

Δerg3 Δlam2

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg3::kanMX4 Δlam2::HIS3

Δerg3 MATa

Δerg4 Δlam2

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg4::kanMX4 Δlam2::HIS3

Δerg4 MATa

Δerg5 Δlam2

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg5::kanMX4 Δlam2::HIS3

Δerg5 MATa

Δerg6 Δlam2

MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 erg6::kanMX4 Δlam2::HIS3

Δerg6 MATa

концентрацией α$фактора [10]. Мы проверили,

~45% клеток (рис. 1, в), а мутация в гене кальмо$

будет ли делеция остальных трех генов (LAM1,

дулина увеличивала чувствительность клеток к

LAM3 и LAM4) ингибировать РКС, вызванную

воздействию α$фактора (рис.1, г), что соответ$

феромоном. Для этого мы сравнили соотноше$

ствует данным литературы [23]. Мы обнаружи$

ние живых и мертвых клеток в суспензионной

ли, что делеция гена LAM2 частично предотвра$

культуре клеток дрожжей, подверженных

щала гибели клеток под действием α$фактора

действию α$фактора (100 мкг/мл, 4 ч). Мы раз$

(рис. 1, д). Одновременно с оценкой сигнала от

личали живые и мертвые клетки по накоплению

пропидий йодида мы оценивали линейные раз$

ими пропидий йодида с помощью проточной

меры клеток по светорассеянию. Как видно из

цитофлуорометрии (рис. 1, а, б). Пропидий йодид

рис. 1, α$фактор вызывал значительное увели$

способен проникать только в мертвые клетки, в

чение линейного светорассеяния (FSC$A). Это

то время как живые клетки с целостной плазма$

увеличение размера индивидуальных клеток, по

тической мембраной остаются неокрашенными.

всей видимости, обусловлено образованием

Добавление α$фактора приводило к гибели

«шму» - половых выростов и увеличением объ$

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

352

СОКОЛОВ и др.

Рис. 1. Распределение линейных размеров (FSC$A) клеток и интенсивности сигнала от пропидий йодида (PI). a - Кон$

трольные клетки W303 1A в отсутствие стресса (отрицательный контроль на мертвые клетки); б - клетки W303 1A под$

вергнутые действию теплового шока - 50°С, 3 ч (положительный контроль на мертвые клетки); в-е - клетки, подвергну$

тые действию α$фактора (100 мкг/мл, 4 ч) различных штаммов: родительский штамм (в); штамм с мутацией в гене каль$

модулина cmd1 6 (г); штамм с делецией гена LAM2 (д); штамм с делециями всех четырех генов LAM (LAM1-LAM4) (e). На

графиках обозначена зона (gate), событие в которой расценивались нами как мертвые клетки. Для каждого из условий

указан процент мертвых клеток от общего числа клеток. Данные репрезентативных экспериментов, по 10 000 событий в

каждом эксперименте.

С цветным вариантом рис. 1 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

ема клеток. Делеция гена LAM2 не препятство$

Также, как и в случае с α$фактором, нарушение

вала увеличению линейного светорассеяния,

LAM2 оказывало максимальный эффект, и мы

что свидетельствует о чувствительности клеток к

не обнаружили значимой разницы в резистент$

половому феромону.

ности к амиодарону между штаммом Δlam2 и

Как видно из рис. 2, делеция LAM2 оказыва$

штаммом Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4 с делецией че$

ет наибольший эффект из проверенных генов

тырех генов LAM (рис. 3, а).

LAM на устойчивость к α$фактору, делеция до$

РКС, вызванная половым феромоном, сниже=

полнительно трех генов LAM на фоне делеции

на в штамме UPC2 1. Штамм с частично доми$

LAM2 не привела к увеличению выживаемости

нантным аллелемUPC2 1 демонстрирует повы$

клеток в присутствии полового феромона. Ана$

шенную скорость захвата стеринов клетками

логичный результат мы получили в случае с дру$

[24] и активирует транскрипцию генов ERG, что

гим индуктором РКС дрожжей — амиодароном.

приводит к увеличению содержания стеринов в

Ранее мы показали, что добавление амиодарона

клетке и ПМ в частности [25]. Делеция генов

к клеткам вызывает каскад событий, что и при

LAM также приводит к увеличению концентра$

добавлении избытка полового феромона [10].

ции эргостерина в плазматической мембране

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

353

[15, 25]. Если резистентность делеционных

бы проверить это предположение мы исследо$

штаммов по генам LAM обусловлена изменения$

вали гибель дрожжей штамма UPC2 1 и дикого

ми концентрации эргостерина в ПМ, то аллель

типа под действием α$фактора (100 мкг/мл). На

UPC2 1 также должен предотвращать гибель

рис. 4 приведена типичная контурная диаграм$

клеток, вызванную половым феромоном. Что$

ма, где по одной оси отложена интенсивность

Рис. 2. РКС клеток дрожжей с нарушенным транспортом и накоплением эргостерина, вызванным добавлением α$факто$

ра (100 мкг/мл). Соотношение мертвых и живых клеток оценивали с помощью пропидий йодида и проточной цитофлуо$

риметрии. На столбчатых диаграммах указано среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3)

Рис. 3. Выживание клеток в присутствии индуктора РКС дрожжей амиодарона (60 мкМ, 1 ч инкубации). За 100% прини$

мали количество клеток (КОЕ) в начальный момент времени (до добавки амиодарона)

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

354

СОКОЛОВ и др.

Рис. 4. Распределение линейных размеров (FSC$A) клеток и интенсивности сигнала от пропидий йодида (PI) в клетках

дрожжей дикого типа (а) и мутантного штамма UPC2 1 (б). Клетки инкубировали 4 ч в присутствии 100 мкг/мл α$факто$

ра. Данные репрезентативных экспериментов, 10 000 событий в каждом эксперименте.

С цветным вариантом рис. 4 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

сигнала от пропидий йодидом, а по другой

значит эта мутация ингибирует гибель клеток,

оси - линейный размер клеток, который мы

вызванную α$фактором (см. также рис. 2, где

оценивали по амплитуде линейного светорассея$

представлены усредненные данные трех экспе$

ния (FSC$A). Как видно из рисунка, мутация

риментов). В отношении амиодарона штамм с

UPC2 1 приводила к снижению относительного

мутацией UPC2 1 напротив демонстрировал по$

числа клеток, окрашенных пропидий йодидом,

вышенную чувствительность (рис. 3, а). Срав$

нение частоты образования зигот при скрещи$

вании штаммов UPC2 1 MATa с UPC2

1MATalpha (2,2%), Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4MATa

с Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4MATalpha (1,8%) и ди$

кого типа BY4741 (MATa) с BY4742 (MATalpha)

(2.3%) не выявило различий, а значит повы$

шенная

устойчивость

UPC2 1

Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4 к α$фактору не связана

со снижением ответа клеток на него.

Генетические взаимодействия LAM2 и генов

биосинтеза эргостерина. В следующей серии экс$

периментов мы исследовали РКС дрожжей,

вызванную феромоном и амиодароном, на клет$

ках дрожжей с делециями генов ERG2-ERG6.

Эти гены кодируют ферменты, катализирующие

терминальные этапы биосинтеза эргостерина.

Нарушение биосинтеза эргостерина, как прави$

Рис. 5. РКС клеток дрожжей с мутациями по генам био$

синтеза эргостерина, вызванная добавлением α$фактора

ло, летально [26], однако делеция генов, кото$

(100 мкг/мл). Соотношение мертвых и живых клеток оце$

рые кодируют ферменты терминальных стадий

нивали с помощью пропидий йодида и проточной цито$

биосинтеза от ланостерина до эргостерина, не

флуориметрии. На столбчатых диаграммах указано среднее приводит к потере клетками жизнеспособности

значение ± стандартное отклонение (n = 3).

[26]. Из нашего анализа мы исключили ген

С цветным вариантом рис. 5 можно ознакомиться в элек$

тронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

ERG5, так как штамм Δerg5 с высокой частотой

journal/biokhsm/

(до 80%) терял митохондриальную ДНК, а поте$

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

355

ря митохондриальной ДНК значительно снижа$

вательности, соответствующей реакциям био$

ет чувствительность клеток к α$фактору [9, 10].

синтеза эргостерина ферментами, закодирован$

Следует также отметить, что в этой серии опы$

ными этими генами. Как видно из рисунка, де$

тов мы использовали другой родительский

леция генов ERG не снижала, а иногда даже уве$

штамм (BY4741), тогда как эксперименты с

личивала долю мертвых клеток в присутствии α$

UPC2 1 проводили на штаммах, полученных на

фактора. При этом делеция LAM2 в штаммах

основе лабораторного штамма W303. Чувстви$

Δerg6 и Δerg2 не оказывала значительного эф$

тельность этих лабораторных штаммов к феро$

фекта на РКС, индуцированную феромоном

мону значительно различалась.

(рис. 5). В то же время мы не наблюдали сниже$

Мы оценили процент мертвых клеток дрож$

ния РКС дрожжей от делеции в штаммах с нару$

жей в штамме дикого типа и в штаммах с деле$

шенным синтезом эргостерина. Делеция LAM2 в

цией генов: ERG6, ERG2, ERG3 и ERG4 (рис. 5).

штамме Δerg4 и в контрольном штамме BY4741

На рис. 5 результаты с разными делеционными

приводила к существенному увеличению доли

мутантами по генам ERG приведены в последо$

мертвых клеток в присутствии α$фактора.

Рис. 6. Штамм Δerg4Δlam2 с двойной делецией содержит субпопуляцию мертвых клеток, окрашиваемых пропидий йоди$

дом, и обладает сниженной скоростью роста. а - Анализ выживаемости штаммов в контрольных условиях (среднее ±

± стандартное отклонение, n = 3); во вставке представлена фотография клеток штаммов Δerg4Δlam2 и Δerg4, окрашенных

пропидий йодидом. б - Репрезентативная гистограмма эксперимента с проточного цитофлуориметра. в - Сравнение ско$

ростей роста штаммов Δerg4 и Δerg4Δlam2 (сверху), Δerg3 и Δerg3Δlam2 (снизу) по увеличению светорассеяния (длина вол$

ны λ = 550 нм).

С цветным вариантом рис. 6 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/journal/

biokhsm/

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

356

СОКОЛОВ и др.

Мы обратили внимание, что в штамме

этого предположения требует дополнительных

Δerg4Δlam2 с двойной делецией даже в отсут$

исследований. С другой стороны, штаммы с

ствии полового феромона количество мертвых

одиночными делециями Δlam3 и Δlam4 не вызы$

(пропидий йодид положительных) клеток зна$

вали устойчивости к α$фактору (рис. 2). Учиты$

чительно увеличено по сравнению с родитель$

вая данные широкомасштабных масс$спектро$

ским штаммом и со всеми другими исследован$

метрических протеомных анализов, что Lam2р

ными нами двойными и одиночными мутанта$

содержится в клетках в больших количествах,

ми (рис. 6, а, б). Мы показали, что делеция

чем другие белки Lam [28, 29], можно предполо$

LAM2 существенно снижает скорость роста

жить, что отсутствие эффекта делеций LAM3 и

штамма, в котором делетирован ген ERG4, в то

LAM4 на резистентность к РКС, вызванной α$

время как при делеции гена ERG3, находящего$

фактором, связано с разницей в концентрации

ся на один шаг выше по каскаду в метаболичес$

этих белков в стандартных условиях. Однако в

ком пути биосинтеза стерина, такого эффекта

этих анализах количество Lam2р не превышало

не наблюдается (рис. 6, в). Таким образом, наши

суммарного количества его трех паралогов, а в

данные указывают на эпистаз между геном

другой работе с упрощенным протоколом подго$

LAM2 и геном ERG4.

товки проб к масс$спектрометрии Lam1p даже

Исследование устойчивости к амиодарону

был обнаружен в больших количествах [30]. Та$

показало, что делеция LAM2 повышает выживае$

ким образом, мы считаем, что отсутствие эффек$

мость клеток на фоне всех испытанных мутаций

та от делеции генов LAM1, LAM3, LAM4 в штам$

(Δerg2, Δerg3, Δerg4 и UPC2 1) (рис. 3).

ме Δlam2 не связано с низким содержанием этих

белков в клетке, а отражает их функциональную

взаимосвязь. Распределение вклада делеций ге$

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

нов LAM в устойчивость к амиодарону оказалось

сходным: LAM2 вносит основной вклад, а допол$

Исследование генов LAM в пекарских дрож$

нительное нарушение генов LAM1, LAM3, LAM4

жах затруднено из$за того, что они представле$

не увеличивает устойчивость.

ны паралогичными парами [20]. В связи с этим

Лабораторный штамм BY4741 оказался зна$

до сих пор было описано довольно мало фено$

чительно более резистентным к РКС, вызван$

типов для штаммов, в которых нокаутированы

ной α$фактором, чем штамм W303. При этом де$

отдельные гены LAM. Так, например, нами ра$

леция гена LAM2 не уменьшала, а наоборот уве$

нее было показано, что делеция LAM2 приводит

личивала долю мертвых клеток в нашей экспе$

к увеличению раздробленности митохондриаль$

риментальной модели с половым феромоном

ной сети в клетках, находящихся в стационар$

(рис. 5). В то же время эффект делеции LAM2 на

ной фазе роста [27]. Исключениями являются

резистентность к амиодарону не зависел от ге$

устойчивость к амиодарону, показанная нами

нетического фона, который мы использовали

ранее для Δlam1 и Δlam2 [10, 14], и устойчивость

(рис. 4). Считается, амиодарон вызывает тот же

к α$фактору, которая показана для штамма

каскад событий в клетке, что и половой феро$

Δlam1 [10]. В этой работе мы показали, что деле$

мон, но на более поздних стадиях - амиодарон

ция LAM2 также демонстрирует заметное сни$

стимулирует вход избытка кальция в цитоплаз$

жение чувствительности штамма W303 S. cere

му клетки [10, 12]. По$видимому, это происхо$

visiae к РКС, вызванной α$фактором (рис. 1, 2).

дит из$за гиперполяризации ПМ вследствие на$

Далее, воспользовавшись этим выраженным

рушения функционирования ионных каналов

фенотипом в качестве тест$системы для изуче$

[31]. Вероятно, вызванное делецией LAM2 по$

ния генетических взаимодействий, мы исследо$

вышение эргостерина на ПМ влияет как на ак$

вали РКС, вызванную феромоном в штамме

тивность ионных каналов ПМ, так и на актив$

Δlam1Δlam2Δlam3Δlam4 с четверной делецией.

ность феромонового рецептора. При этом эф$

Делеция дополнительных генов LAM не привела

фект гена LAM2 на каскад событий, вызванный

к снижению чувствительности штамма к α$фак$

половым феромоном, сильно зависит от генети$

тору дополнительно к тому, что наблюдалось в

ческого фона. Картирование мутаций, обеспе$

штамме с одиночной делецией Δlam2. Получен$

чивающих различие штаммов BY4741 и W303 по

ный результат говорит о том, что другие белки

отношению к РКС, вызванной половым феро$

Lam не проявляют функции, связанной с кле$

моном, требует дополнительных исследований.

точным ответом на половой феромон, если но$

Однако на основании представленных в этой

каутирован ген LAM2. Можно предположить,

работе результатов можно заключить, что роль

что белки Lam функционируют в качестве гете$

генов LAM в РКС, вызванной феромоном, не

родимеров и наличие LAM2 является необходи$

консервативна и зависит от других генетических

мым фактором для их работы, однако проверка

факторов.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

357

Мы обнаружили аддитивность между эффек$

минимум двух генов MAP$киназного каскада,

тами от делеций генов LAM2 и ERG4 (рис. 5, 6).

инициируемого также феромоном [36]. Возни$

ERG4 кодирует C$24(28) стерин редуктазу, кото$

кает предположение, что в мутантах по LAM по$

рая катализирует последнюю реакцию метабо$

вышенный эргостерол ПМ предотвращает РКС,

лического пути биосинтеза эргостерина в

снижая активность Upc2. Наши данные свиде$

дрожжах [32]. При этом в штамме Δerg3, где от$

тельствуют против этого предположения.

сутствует фермент, катализирующий предпос$

Действительно, гиперактивация Upc2 (мутация

леднюю реакцию этого же пути, эффект от де$

UPC2 1) не увеличивает, а снижает феромон$за$

леции LAM2 был меньше в абсолютном выра$

висимую РКС (рис. 1, 2). Поскольку Upc2 явля$

жении. На фоне делеций генов ERG2 и ERG6

ется основным активатором синтеза эргостери$

изменений резистентности к феромону мы не

на, можно предположить, что увеличение концен$

обнаружили. Делеция генов биосинтеза эрго$

трации эргостерина в ПМ влияет на ионные по$

стерина приводит к изменению стеринового

токи через ПМ, и это приводит к устойчивости.

состава клеточных мембран - эргостерин заме$

Действительно, известно, что мутации по генам

щается на интермедиаты его биосинтеза [33].

биосинтеза эргостерина приводят к нарушениям

Делеция ERG6 и ERG2 обрывает биосинтез на

работы различных транспортеров ПМ [37].

зимостерине и фекостерине соответственно

Повышенная чувствительность клеток

[34], однако нам не известны работы, в которых

штамма UPC2 1 к амиодарону также хорошо

бы определяли количественное распределение

согласуется с данными литературы. Амиодарон

интермедиатов биосинтеза стерина в делецион$

вызывает увеличение концентрации кальция в

ных штаммах. Мы предполагаем, что отсут$

цитоплазме [12], что вызывает дальнейший кас$

ствие эффекта от делеции LAM2 в штаммах

кад событий, приводящий к гибели клеток [10].

Δerg2 и Δerg6 связано с тем, что LAM2 не спосо$

При этом повышение уровня эргостерина вызы$

бен полностью или частично транспортировать

вает нарушения в вакуолях [38]. Нормальное

зимостерин, фекостерин и ланостерин - ран$

функционирование вакуолей, в свою очередь,

ние интермедиаты биосинтеза. В этом случае

обеспечивает устойчивость к амиодарону: вакуо$

делеция гена LAM2 никак не может повлиять на

ли способны удалять избыточный Ca²⁺ из ци$

фенотип клеток. В то же время согласно пред$

топлазмы, и это их свойство критично для ус$

лагаемой нами модели, поздние интермедиаты

тойчивости к амиодарону - токсичность амио$

биосинтеза и эргостерин транспортируются

дарона опосредована подъемом Ca²⁺ [39].

LAM2.

Таким образом, по нашему мнению, наибо$

Сам факт того, что делеции LAM снижают

лее предпочтительным объяснением роли генов

смерть дрожжевых клеток от высоких концен$

LAM в РКС, вызванной феромоном, является

траций полового феромона и амиодарона, из$

следующее: гены LAM влияют на процессы, про$

вестен уже более десяти лет [10, 14]. Тем не менее

текающие внутри клетки опосредованно. Эф$

молекулярный механизм участия белков Lam в

фекты их делеций связаны с изменением содер$

этих типах РКС оставался неясен. Планируя на$

жания эргостерина в плазматической мембране,

ше исследование, мы рассматривали две воз$

которое, в свою очередь, меняет активность

можности: (1) мутации по генам LAM влияют на

мембранных белков и обусловленных ими ион$

РКС опосредованно, влияя на эргостерин ПМ;

ных потоков между внешней средой и цитоплаз$

(2) белки Lam непосредственно взаимодей$

мой.

ствуют с сигнальными молекулами ПМ. Наши

данные указывают на первую возможность, так

как все другие вмешательства в гомеостаз стери$

Финансирование. Работа выполнена при под$

нов в клетке также сильно влияли на устойчи$

держке Российского научного фонда (грант

вость клеток к этим типам РКС. Вероятно, деле$

№ 18$14$00151) (рис. 1, 2, 4, 5, 6) и Российского

ции генов LAM приводят к увеличению эргосте$

фонда фундаментальных исследований (грант

рина в ПМ. Это следует из приведенных выше

№ 18$04$01183) (рис. 3).

данных по чувствительности к амфотерицину В,

Благодарности. Выражаем благодарность Ва$

а также из наших недавних работ по чувстви$

силине Ефимовой за участие в получении двой$

тельности к липофильным катионам [35] и изу$

ных Δerg Δlam2 мутантов.

чению влияния генов LAM на устойчивость к

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от$

стрессу [18].

сутствии конфликта интересов.

Как повышенный эргостерин ПМ может

Соблюдение этических норм. Настоящая

влиять на РКС? Известно, что высокий эргосте$

статья не содержит каких$либо исследований с

рин предотвращает перемещение Upc2 в ядро.

участием людей или использованием животных

При этом Upc2 активирует транскрипцию как

в качестве объектов исследований.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

358

СОКОЛОВ и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Nagata, S. (2018) Apoptosis and clearance of apoptotic

Hartman, C.L., Strugatsky, D., Lee, S.D., He, C., Hong, C.,

cells, Annu. Rev. Immunol., 36, 489-517, doi: 10.1146/

Jiang, H., Bentolila, L.A., Gatta, A.T., Levine, T.P., Ferng, A.,

annurev$immunol$042617$053010.

Lee, R., Ford, D.A., Young, S.G., Ikonen, E.,

Fuchs, Y., and Steller, H. (2015) Live to die another way:

Schwabe, J.W.R., and Tontonoz, P. (2018) Aster proteins

modes of programmed cell death and the signals emanating

facilitate nonvesicularplasma membrane to ER cholesterol

from dying cells, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 16, 329-344,

transport in mammalian cells, Cell, 175, 514-529.e20,

doi: 10.1038/nrm3999.

doi: 10.1016/j.cell.2018.08.033.

Carmona$Gutierrez, D., Bauer, M.A., Zimmermann, A.,

17.

Huang, W., Zhang, Z., Han, X., Tang, J., Wang, J., Dong, S.,

Aguilera, A., Austriaco, N., et al. (2018) Guidelines and

and Wang, E. (2002) Ion channel behavior of amphotericin

recommendations on yeast cell death nomenclature,

B in sterol$free and cholesterol$ or ergosterol$containing

Microb. Cell Fact., 5, 4-31, doi: 10.15698/mic2018.01.607.

supported phosphatidylcholine bilayer model membranes

Gordeeva, A.V., Labas, Y.A., and Zvyagilskaya, R.A. (2004)

investigated by electrochemistry and spectroscopy, Biophys.

Apoptosis in unicellular organisms: mechanisms and evo$

J., 83, 3245-3255, doi: 10.1016/S0006$3495(02)75326$5.

lution, Biochemistry (Moscow),

69,

1055-1066,

18.

Sokolov, S., Vorobeva, M., Smirnova, E., Smirnova, A.,

doi: 10.1023/b:biry.0000046879.54211.ab.

Trushina, N., Galkina, K., Severin, F., and Knorre, D.

Severin, F.F., Meer, M.V., Smirnova, E.A., Knorre, D.A.,

(2020) LAM genes contribute to environmental stress toler$

and Skulachev, V.P. (2008) Natural causes of programmed

ance but sensibilise yeast cells to azoles, Front. Microbiol.,

death of yeast Saccharomyces cerevisiae, Biochim. Biophys.

11, 38, doi: 10.3389/fmicb.2020.00038.

Acta, 1783, 1350-1353, doi: 10.1016/j.bbamcr.2008.

19.

Alli$Balogun, G.O., and Levine, T.P. (2019) Regulation of

02.001.

targeting determinants in interorganelle communication,

Carmona$Gutierrez, D., Eisenberg, T., Büttner, S.,

Curr. Opin. Cell Biol., 57, 106-114, doi: 10.1016/j.ceb.

Meisinger, C., Kroemer, G., and Madeo, F.

(2010)

2018.12.010.

Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines, Cell

20.

Sokolov, S.S., Trushina, N.I., Severin, F.F., and Knorre, D.A.

Death Differ., 17, 763-773, doi: 10.1038/cdd.2009.219.

(2019) Ergosterol turnover in yeast: an interplay between

Sukhanova, E.I., Rogov, A.G., Severin, F.F., and

biosynthesis and transport, Biochemistry (Moscow), 84,

Zvyagilskaya, R.A.

(2012) Phenoptosis in yeasts,

346-357, doi: 10.1134/S0006297919040023.

Biochemistry (Moscow), 77, 761-775, doi: 10.1134/

21.

Herskowitz, I., and Jensen, R.E. (1991) Putting the HO

S0006297912070097.

gene to work: practical uses for mating$type switching, in

Aouacheria, A., Cunningham, K.W., Hardwick, J.M.,

Methods in Enzymology, Academic Press, pp. 132-146,

Palková, Z., Powers, T., Severin, F.F., and Váchová. L.

doi: 10.1016/0076$6879(91)94011$z.

(2018) Comment on «Sterilizing immunity in the lung

22.

Sträuber, H., and Müller, S. (2010) Viability states of bac$

relies on targeting fungal apoptosis$like programmed cell

teria - specific mechanisms of selected probes, Cytometry

death», Science, 360, doi: 10.1126/science.aar6910.

A, 77, 623-634, doi: 10.1002/cyto.a.20920.

Severin, F.F., and Hyman, A.A. (2002) Pheromone induces

23.

Moser, M.J., Geiser, J.R., and Davis, T.N. (1996) Ca²⁺$

programmed cell death in S. cerevisiae, Curr. Biol., 12,

calmodulin promotes survival of pheromone$induced

R233-R235, doi: 10.1016/j.cellbi.2005.10.023.

growth arrest by activation of calcineurin and Ca²⁺$

10.

Pozniakovsky, A.I., Knorre, D.A., Markova, O.V.,

calmodulin$dependent protein kinase, Mol. Cell. Biol., 16,

Hyman, A.A., Skulachev, V.P., and Severin, F.F. (2005)

4824-4831, doi: 10.1128/mcb.16.9.4824.

Role of mitochondria in the pheromone$ and amiodarone$

24.

Crowley, J.H., Leak, F.W. Jr., Shianna, K.V., Tove, S., and

induced programmed death of yeast, J. Cell Biol., 168,

Parks, L.W. (1998) A mutation in a purported regulatory

257-269, doi: 10.1083/jcb.200408145.

gene affects control of sterol uptake in Saccharomyces cere

11.

Ohsumi, Y., and Anraku, Y. (1985) Specific induction of

visiae, J. Bacteriol., 180, 4177-4183.

Ca²⁺ transport activity in MATa cells of Saccharomyces

25.

Joshua, I.M., and Höfken, T. (2017) From lipid homeosta$

cerevisiae by a mating pheromone, alpha factor, J. Biol.

sis to differentiation: old and new functions of the zinc

Chem., 260, 10482-10486.

cluster proteins Ecm22, Upc2, Sut1 and Sut2, Int. J. Mol.

12.

Gupta, S.S., Ton, V.$K., Beaudry, V., Rulli, S.,

Sci., 18, doi: 10.3390/ijms18040772.

Cunningham, K., and Rao, R. (2003) Antifungal activity of

26.

Daum, G., Lees, N.D., Bard, M., and Dickson, R. (1998)

amiodarone is mediated by disruption of calcium homeo$

Biochemistry, cell biology and molecular biology of lipids

stasis, J. Biol. Chem., 278, 28831-28839, doi: 10.1074/

of Saccharomyces cerevisiae, Yeast,

14,

1471-1510,

jbc.M303300200.

doi: 10.1002/(SICI)1097$0061(199812)14:16<1471::AID$

13.

Zhang, N.$N., Dudgeon, D.D., Paliwal, S., Levchenko, A.,

YEA353>3.0.CO;2$Y.

Grote, E., and Cunningham, K.W. (2006) Multiple signal$

27.

Knorre, D.A., Ojovan, S.M., Saprunova, V.B., Sokolov, S.S.,

ing pathways regulate yeast cell death during the response

Bakeeva, L.E., and Severin, F.F. (2008) Mitochondrial

to mating pheromones, Mol. Biol. Cell, 17, 3409-3422,

matrix fragmentation as a protection mechanism of yeast

doi: 10.1091/mbc.e06$03$0177.

Saccharomyces cerevisiae, Biochemistry (Moscow), 73,

14.

Sokolov, S., Knorre, D., Smirnova, E., Markova, O.,

1254-1259, doi: 10.1134/s0006297908110126.

Pozniakovsky, A., Skulachev, V., and Severin, F. (2006)

28.

de Godoy, L.M.F., Olsen, J.V., Cox, J., Nielsen, M.L.,

Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or

Hubner, N.C., Fröhlich, F., Walther, T.C., and Mann, M.

intracellular acidification, Biochim. Biophys. Acta, 1757,

(2008) Comprehensive mass$spectrometry$based proteome

1366-1370, doi: 10.1016/j.bbabio.2006.07.005.

quantification of haploid versus diploid yeast, Nature, 455,

15.

Gatta, A.T., Wong, L.H., Sere, Y.Y., Calderón Noreña, D.M.,

1251-1254, doi: 10.1038/nature07341.

Cockcroft, S., Menon, A.K., and Levine, T.P. (2015) A

29.

Peng, M., Taouatas, N., Cappadona, S., van Breukelen, B.,

new family of StART domain proteins at membrane con$

Mohammed, S., Scholten, A., and Heck, A.J.R. (2012)

tact sites has a role in ER$PM sterol transport, Elife, 4,

Protease bias in absolute protein quantitation, Nat.

doi: 10.7554/eLife.07253.

Methods, 9, 524-525, doi: 10.1038/nmeth.2031.

16.

Sandhu, J., Li, S., Fairall, L., Pfisterer, S.G., Gurnett, J.E.,

30.

Kulak, N.A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., and

Xiao, X., Weston, T.A., Vashi, D., Ferrari, A., Orozco, J.L.,

Mann, M. (2014) Minimal, encapsulated proteomic$sam$

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

РОЛЬ ГЕНОВ LAM В СМЕРТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

359

ple processing applied to copy$number estimation in

sterols on the interaction of SDS, benzalkoniumchloride,

eukaryotic cells, Nat. Methods, 11, 319-324, doi: 10.1038/

and anovel compound, Kor105, with membranes,

nmeth.2834.

Biomolecules, 9, doi: 10.3390/biom9100627.

31. Maresova, L., Muend, S., Zhang, Y.$Q., Sychrova, H., and

36. Höfken, T. (2017) Ecm22 and Upc2 regulate yeast mating

Rao, R. (2009) Membrane hyperpolarization drives cation

through control of expression of the mating genes PRM1

influx and fungicidal activity of amiodarone, J. Biol.

and PRM4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 493,

Chem., 284, 2795-2802, doi: 10.1074/jbc.M806693200.

1485-1490, doi: 10.1016/j.bbrc.2017.10.005.

32. Zweytick, D., Hrastnik, C., Kohlwein, S.D., and Daum, G.

37. Kodedová, M., and Sychrová, H. (2015) Changes in the

(2000) Biochemical characterization and subcellular local$

sterol composition of the plasma membrane affect mem$

ization of the sterol C$24(28) reductase, erg4p, from the

brane potential, salt tolerance and the activity of multidrug

yeast Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett., 470, 83-87,

resistance pumps in Saccharomyces cerevisiae, PLoS One,

doi: 10.1016/s0014$5793(00)01290$4.

10, e0139306, doi: 10.1371/journal.pone.0139306.

33. Liu, G., Chen, Y., Færgeman, N.J., and Nielsen, J. (2017)

38. Hongay, C., Jia, N., Bard, M., and Winston, F. (2002)

Elimination of the last reactions in ergosterol biosynthesis

Mot3 is a transcriptional repressor of ergosterol biosynthet$

alters the resistance of Saccharomyces cerevisiae to multiple

ic genes and is required for normal vacuolar function in

stresses, FEMS Yeast Res., 17, doi: 10.1093/femsyr/fox063.

Saccharomyces cerevisiae, EMBO J., 21, 4114-4124,

34. Parks, L.W., and Casey, W.M. (1995) Physiological implica$

doi: 10.1093/emboj/cdf415.

tions of sterol biosynthesis in yeast, Annu. Rev. Microbiol.,

39. Zhang, Y.$Q., Gamarra, S., Garcia$Effron, G., Park, S.,

49, 95-116, doi: 10.1146/annurev.mi.49.100195.000523.

Perlin, D.S., and Rao, R. (2010) Requirement for ergo$

35. Jiménez$Mungu a, I., Volynsky, P.E., Batishchev, O.V.,

sterol in V$ATPase function underlies antifungal activity of

Akimov, S.A., Korshunova, G.A., Smirnova, E.A., Knorre,

azole drugs, PLoS Pathog., 6, e1000939, doi: 10.1371/

D.A., Sokolov, S.S., and Severin, F.F. (2019) Effects of

journal.ppat.1000939.

THE ROLE OF LAM GENES IN SEX PHEROMONE=INDUCED

S. cerevisiae YEAST CELL DEATH*

S. S. Sokolov¹**, K. V. Galkina¹, E. A. Litvinova², D. A. Knorre^1,3, and F. F. Severin¹

¹ Belozersky Institute of Physico Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119991 Moscow, Russia; E mail: sviatoslav.sokolov@gmail.com

² Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 119991 Moscow, Russia

³ Sechenov First Moscow State Medical University Ministry of Health of the Russian Federation,

119992 Moscow, Russia

Received November 3, 2019

Revised January 21, 2020

Accepted January 21, 2020

Lam1$Lam4 proteins shuttle sterols between plasma membrane and endoplasmic reticulum. Disruption of their func$

tion presumably increases plasma membrane sterol content. While in mammals the homologs of Lam proteins are

responsible for the internalization of cholesterol from blood plasma, the biological role of Lam proteins in yeast

remains unclear, since the deletions of individual LAM genes do not produce pronounced phenotypes. However, the

deletion of LAM1 (YSP1) interferes with regulated cell death (RCD) of Saccharomyces cerevisiae yeast caused by sex

pheromone. Here we studied the role of LAM2 deletion in pheromone$induced RCD and the genetic interactions

between LAM2 and the genes of ergosterol biosynthesis. The deletion of LAM2 gene partially prevented the

pheromone$induced cell death in the W303 laboratory yeast strain. Additional deletions of LAM1, LAM3, and LAM4

did not increase the effect of LAM2 deletion. A mutation in the Upc2 transcription factor gene (UPC2 1), leading to

increased accumulation of sterols in cells, also inhibited pheromone$induced RCD, the effect being additive with the

effect of LAM2 deletion. On the contrary, LAM2 deletion in another yeast laboratory strain, BY4741, stimulated

pheromone$induced RCD. Next, the deletions of ergosterol biosynthesis genes ERG2 and ERG6 decreased the effect

of the LAM2 deletion. Interestingly, in Δerg4 strain (with deletion of the gene encoding Erg4 protein catalyzing the

terminal stage of ergosterol biosynthesis), the deletion of LAM2 significantly increased the proportion of dead cells

and reduced the growth rate of cells in suspension even in the absence of pheromone. Possibly, the lack of the LAM2

deletion phenotype in Δerg6 and Δerg2 strains indicates the inability of Lam2 protein to transport upstream ergosterol

biosynthesis intermediates, such as lanosterol. Together, our data suggest that the role of Lam proteins in pheromone$

induced yeast RCD is mediated by their effect on the sterol composition of plasma membrane.

Keywords: LAM genes, yeast, regulated cell death, pheromone, sterols

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020