БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 3, с. 360 - 368

УДК 578.32; 578.865; 539.26

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРИОНОВ И РЕПОЛИМЕРОВ БЕЛКА

ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ В РАСТВОРЕ

МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО РЕНТГЕНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ*

А.Л. Ксенофонтов¹**, М.В. Петухов^2,3,

А.Н. Прусов¹, Н.В. Федорова¹, Э.В. Штыкова²

¹ НИИ физико химической биологии им. А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

119991 Москва, Россия; электронная почта: ksenofon@belozersky.msu.ru

² Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова, ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН,

119333 Москва, Россия; электронная почта: shtykova@ns.crys.ras.ru

³ Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН,

119071 Москва, Россия; электронная почта: maxim@embl hamburg.de

Поступила в редакцию 07.11.2019

После доработки 20.12.2019

Принята к публикации 22.12.2019

Структурный анализ вирионов и реполимеров белка оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ) в водно со

левом растворе был проведен по данным синхротронного малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

и с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с негативным контрастом. Частицы ре

полимеров белка оболочки обладают уникальной стабильностью и не имеют спиральной симметрии. По

данным ПЭМ, такие частицы содержат гетерогенные по длине поперечно исчерченные палочковидные

«стопки дисков» длиной 300-800 Å. Структурное моделирование этих частиц было выполнено с использо

ванием элемента кристаллографической модели четырехслойного агрегата (PDB: 1EI7). Получившиеся мо

дели «стопок дисков» представляли собой полые цилиндры, и мы сравнили их расчетное рассеяние с экс

периментальным на всем измеряемом диапазоне. Показана лучшая корреляция данных МУРР с моделью из

повторяющейся центральной пары дисков. Кривые МУРР практически совпадали для образцов «стопок

дисков» ВТМ независимо от метода выделения белка. Положения максимумов интенсивности на кривых

рассеяния могут быть использованы в качестве специфической характеристики образцов, некоторые из них

соотнесены с реальными элементами четвертичной структуры частиц (периодичность структуры реполиме

ра, шаг спирали вириона). Впервые структурные данные низкого разрешения реполимеров ВТМ были по

лучены в растворе в условиях, близких к естественным. Анализ подобных наноразмерных объектов важен

для их возможного биомедицинского и биотехнологического применения.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ВТМ, белок оболочки, реполимеры, вирионы, малоугловое рентгеновское рассеяние.

DOI: 10.31857/S0320972520030069

Вирус табачной мозаики (ВТМ) является хо

длины используется его диаметр, а также длина

рошо охарактеризованным растительным виру

шага спирали 22,92 Å, которые измерены очень

сом, состоящим из 2130 идентичных субъеди

точно методом рентгеновской дифракции ори

ниц белка оболочки, расположенных спираль

ентированных волокон [2]. Субъединицы белка

но вокруг одноцепочечной РНК [1]. ВТМ ши

оболочки образуют полый цилиндр длиной

роко изучался с использованием методов кри

3000 Å и диаметром 180 Å. Особенностью выде

сталлографии и электронной микроскопии.

ленного белка оболочки ВТМ является его спо

Из за стабильности и доступности ВТМ в

собность образовывать в растворе большое чис

электронной микроскопии в качестве эталона

ло упорядоченных агрегатов с различной струк

турой. В зависимости от рН, ионной силы, тем

Принятые сокращения: ВТМ - вирус табачной мо

пературы и концентрации белок ВТМ находит

заики, МУРР - малоугловое рентгеновское рассеяние,

ся в двух основных состояниях: дисковом и

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия.

спиральном [3]. К числу агрегатов дискового

* Первоначально английский вариант рукописи опублико

типа относятся двухслойные 20S диски с коэф

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19 321,

фициентом седиментации 20S и агрегаты дис

03.02.2020.

ков, уложенных попарно в «стопки дисков», ко

** Адресат для корреспонденции.

торые образуются при выдерживании препара

360

СТРУКТУРА РЕПОЛИМЕРОВ ВТМ

361

та в растворе с рН 7-9. К спиральному типу от

добной степени стабильности: после того как

носятся прежде всего сами вирионы ВТМ и

молекулы белка собраны в такую структуру, для

идентичный им спиральный реполимеризован

ее разборки требуются денатурирующие условия

ный белок при рН ≤ 6,0, а также двухвитковые

[13, 14]. Подобные наноразмерные объекты -

фрагменты спирали [3]. Двухслойная структура

нановолокна и наностержни - могут найти ши

20S диска определена кристаллографическим

рокое применение в наноэлектронике и различ

анализом с разрешением 2,8 Å [4]. 20S Диски

ных биомедицинских приложениях. Ранее нами

состоят из 34 белковых субъединиц (17 субъеди

с помощью МУРР были охарактеризованы дру

ниц на слой). Два слоя диска соединены на его

гие вирусоподобные частицы - ассоциаты белка

периферии на больших радиусах и не соприка

оболочки спирального потивируса А вируса кар

саются на малых [4], образуя щель около сайта

тофеля - и изучена их диссоциация [15, 16].

связывания РНК. Именно эти данные рентге

ноструктурного анализа послужили основани

ем для построения модели самосборки ВТМ in

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

vitro «изнутри» [5, 6], в соответствии с которой

сборка инициируется связыванием диска 20S со

Получение белка оболочки и реполимеров

специфическим участком РНК со стороны

ВТМ. Препарат ВТМ (штамм U1) был любезно

центрального канала, при этом происходит

предоставлен В.В. Макаровым. Образцы репо

трансформация цилиндрического диска до спи

лимеров ВТМ получали двумя методами: 1) бе

ральной структуры [6].

лок ВТМ, выделенный литиевым методом [17],

Необычные рентгенограммы, полученные

диализовали в 10 мМ Tris HCl буфер (рН 8,0) c

Франклин в 1955 г. [7] для полимеризованного

0,1 М NaCl; 2) белок ВТМ, полученный ацетат

белка оболочки ВТМ, выделенного из инфици

ным методом [18], диализовали в 10 мМ фос

рованных растений, дали первое указание на об

фатный буфер (рН 8,0) c 0,1 М NaCl. В обоих

разование полимера из дисков, уложенных по

случаях диализ проводили в течение суток при

парно в «стопки дисков» («stacked discs»). Дол

+8 °С, далее препараты белка (1,5-5 мг/мл) вы

гое время предполагалось наличие равновесия и

держивали 5-7 суток при +8 °С для формирова

возможность трансформации между «стопками

ния

«стопок дисков» и центрифугировали

дисков» и спиральными агрегатами, и это под

10 мин при 14 000 об/мин (Benchtop Microfuge

разумевало, что «стопки дисков», подобно спи

22R; «Beckman Coulter», США). Выход белка

рали вируса, должны быть полярной структу

ВТМ составлял 50-70% от расчетного.

рой, в которой все субъединицы ориентированы

Определение концентрации препаратов репо;

в одном направлении [8]. Доказательство бипо

лимеров и вируса ВТМ. Концентрацию препара

лярности «стопок дисков» было получено с по

тов определяли с помощью спектрофотометра

мощью моноклональных антител, которые свя

UV 2600 («Hitachi», Япония), используя спект

зывались лишь с одним концом вириона ВТМ,

ры поглощения в УФ диапазоне 240-340 нм. В

однако эти антитела реагировали с обоими кон

связи с большим вкладом рассеяния в поглоще

цами реполимера [9]. Дальнейшее изучение их

ние реполимера (40-50%) вычисляли истинные

структуры методом криоэлектронной микро

спектры поглощения (E) суспензий частиц ме

скопии с разрешением 9-12 Å [10, 11] показало,

тодом экстраполяции

[19], применяя для

что бóльшая часть двухслойных дисков имеет

экстраполяции область 320-338 нм. Коэффици

четвертичную структуру, аналогичную цент

енты поглощения препаратов белка и вируса

ральной паре колец закристаллизованного че

принимали равными E₀

^1% = 1,3 и Е01% = 2,3 со

тырехслойного дискового агрегата [12].

ответственно. Контроль чистоты образцов осу

В настоящей работе с помощью синхротрон

ществляли с помощью электрофореза по методу

ного малоуглового рентгеновского рассеяния

Лэммли [20], используя 15% ный ПААГ, в каме

(МУРР) впервые охарактеризована структура в

ре Мini PROTEAN 3 Cell («Bio Rad», США). Ге

растворе и выполнено моделирование вирионов

ли окрашивали

0,22% ным Кумасси G 250

и реполимеров белка оболочки ВТМ, сформи

(«Serva», Германия).

рованных в «стопки дисков». Мы представили

Просвечивающая электронная микроскопия

набор моделей, которые были построены с ис

(ПЭМ). Препараты помещали на сетки с угле

пользованием атомарных координат четырех

родным покрытием. Образцы инкубировали

слойного агрегата [12], и сравнили их расчетное

1 мин при 20 °С, промывали дистиллированной

рассеяние с экспериментальным, полученным с

водой в течение 30 с, контрастировали 2% ным

помощью метода МУРР.

уранилацетатом в течение 10-30 с, снова про

Реполимеры «стопки дисков» ВТМ являются

мывали дистиллированной водой и высушива

интригующим объектом из за их амилоидопо

ли. Образцы исследовали в просвечивающем

5 БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

362

КСЕНОФОНТОВ и др.

электронном микроскопе JEM 1400 («JEOL»,

максимумов интенсивности вектора рассеяния s^im

Япония) при увеличении в 60 000 раз.

модели от экспериментальных величин s^iexp:

Эксперимент и анализ данных МУРР. Иссле

Ō = 1/n × Σ(⏐s^im- s^iexp⏐/s^iexp).

дование структуры образцов ВТМ и их реполи

меров с помощью малоуглового рассеяния

синхротронного излучения проводили на син

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

хротроне PetraIII (DESY, Гамбург) на линии P12.

Линия P12 оснащена оборудованием для авто

Электронно;микроскопический анализ препа;

матической смены образцов и двумерным де

ратов. Белок оболочки, выделенный из ВТМ,

тектором Pilatus 2M («DECTRIS», Швейцария).

способен легко самоассоциироваться в опреде

Интенсивность рассеяния I(s) измеряли в об

ленных условиях в 20S диски, которые при даль

ласти значений волновых векторов 0,003 < s <

нейшей инкубации трансформируются в ста

< 0,5 Å^-1, где s = (4πsinθ)/λ ≤ 2π/d - модуль век

бильные реполимеры, так называемые «стопки

тора рассеяния; 2θ - угол рассеяния; λ = 1,24 Å -

дисков» [13, 14, 25]. На первом этапе мы изучили

длина волны [21]; d - размер рассеивающих не

структуру и длину образованных частиц с по

однородностей, период структуры. Измерения

мощью просвечивающей электронной микро

проводили при температуре 10 °C, за 1 с регист

скопии (ПЭМ). Результаты ПЭМ с негативным

рировали 20 отдельных кривых рассеяния для

контрастом показали, что полученные разными

каждого образца с целью отслеживания возмож

методами препараты реполимеров содержали ге

ного радиационного повреждения. Первичную

терогенные по длине поперечно исчерченные

обработку данных проводили с помощью прог

палочковидные частицы (рис. 1, а, б). Распреде

раммы РRIMUS [22]. Чтобы учесть концентра

ление частиц по размерам (рис. 1, б) показывает,

ционную зависимость, анализировали препарат

что основная объемная доля в препарате прихо

вируса и белка при нескольких различных кон

дится на частицы длиной 300-800 Å (~70% от

центрациях в диапазоне 2,0-7,0 мг/мл. Про

всех частиц). На рис. 1 видно, что фрагмент дли

грамму MASSHA [23] использовали для модели

ной 400 Å содержит ~15-16 колец «стопки»

рования структур вириона и реполимера, прог

(15,5 ± 0,5), что соответствует ранее полученным

рамму CRYSOL [24] - для расчета кривых рассе

данным ПЭМ [8, 9, 14] (рис. 1, врезка), и осевая

яния моделей атомного разрешения и определе

периодичность структуры реполимера составля

ния их радиусов инерции (R_g).

ет (26,0 ± 0,9) Å. Таким образом, сформирован

Размеры в кристаллографической модели

ные «стопки дисков» содержали 6-16 20S дис

(PDB: 1EI7) четырехслойного дискового агрега

ков. Кроме того, в образце можно видеть также

та измеряли с помощью инструментов програм

кластеры латерально связанных реполимеров.

мы RasMol (http://www.rasmol.org/). Для сравне

В следующей части работы с помощью син

ния модельных структур реполимера с реальной

хротронного МУРР мы охарактеризовали струк

структурой в растворе использовали усреднен

туру в растворе и выполнили моделирование ви

ную величину относительных отклонений (Ō)

рионов и реполимеров белка оболочки ВТМ.

Рис. 1. Электронно микроскопический анализ препаратов реполимеров ВТМ (а) и распределение по размерам частиц (б). Из

мерена длина ~250 частиц. Препараты получали из белка ВТМ, выделенного литиевым методом [17]. ПЭМ (JEM 1011,

«JEOL», Япония), контрастирование 2% ным уранилацетатом. Увеличение ×60 000 (а) и ×150 000 (врезка)

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

СТРУКТУРА РЕПОЛИМЕРОВ ВТМ

363

измеренной методом рентгеновской дифракции

ориентированных волокон [2].

Структурное моделирование реполимеров бел;

ка ВТМ в растворе. По данным ПЭМ, препара

ты реполимеров белка ВТМ содержали смесь ге

терогенных по длине частиц с повторяющимися

элементами структуры. Профили рассеяния от

препаратов «стопок дисков» из белка ВТМ, вы

деленного разными методами [17, 18], практи

чески совпадали (отклонение < 0,2% максиму

мов векторов рассеяния s1-s6) на всем интерва

ле измерения (рис. 3, врезка), и в дальнейшем

мы приводим данные МУРР для реполимеров

Рис. 2. Экспериментальные и модельные кривые МУРР

белка, полученного литиевым методом.

(а), модельная структура вириона ВТМ (б); 1 - экспери

ментальные данные, приведенные к нулевой концентра

В качестве структурного элемента для по

ции; 2 - рассеяние, рассчитанное с помощью програм

строения модели вначале была выбрана кристал

мы CRYSOL, модельной структуры вириона, смоделиро

лографическая структура PDB: 1EI7, состоящая

ванной с помощью программы MASSHA

из двух сложенных парных колец БA по 17 субъ

единиц белка в каждом [12]. Нижнее и верхнее

Структурное моделирование вирионов ВТМ в

кольцо обозначали символом Б, а центральные

растворе. Были получены профили рассеяния от

кольца - символом А. Структурный элемент

образцов вирионов ВТМ c концентрацией

БAAБ был размножен посредством простран

3-6 мг/мл. В качестве структурного элемента

ственной трансформации. Профиль интенсив

для моделирования вириона была выбрана

ности рассеяния структуры (БAАБ)₈ значитель

структура PDB: 2OM3 с разрешением 4,4 Å, по

но отличался от профиля, полученного в экспе

лученная методом криоэлектронной микроско

рименте (рис. 3, а, б; табл. 2).

пии и содержащая фрагмент со спиральной сим

В дальнейшем для моделирования реполи

метрией из трех витков [26]. Затем этот фрагмент

меров ВТМ использовали две другие модели на

был воспроизведен 16 раз вдоль винтовой оси

основе пары колец кристаллографической мо

для построения модели вириона (длина ~1200 Å,

дели (PDB: 1EI7): 1) нижняя пара колец (БА;

784 субъединицы). Рассчитанная кривая рассея

рис. 3, г) или 2) центральная пара (AA; рис. 3, е).

ния модели вириона с использованием програм

Эти элементы были размножены посредством

мы CRYSOL [24] (рис. 2, кривая 2) коррелирует с

пространственной трансформации с поворотом

экспериментальными данными по всем пикам и

каждого элемента на 6,35° в соответствии с дан

минимумам кривой рассеяния на интервале век

ными структуры PDB: 1EI7. В результате были

тора рассеяния 0,03 < s < 0,35 (рис. 2, кривая 1).

получены модели структур «стопок дисков» в

Для более точного сравнения в табл. 1 сопо

виде полых цилиндров, содержащих по

ставили величины вектора рассеяния s и разме

двухслойных дисков. Данные модели содержали

ра рассеивающих неоднородностей d для всех

544 субъединицы и имели размер длинной оси

семи пиков (s1-s7) экспериментальной и мо

~820 Å. Обе модели - (БA)₁₆и (АA)₁₆ - имели

дельной кривых. Анализ табл. 1 показывает, что

неплохую корреляцию между эксперименталь

некоторые максимумы интенсивности вектора

ными данными I_exp(s) и теоретическими кривы

рассеяния s хорошо соответствуют известным

ми рассеяния, рассчитанными для этих моде

размерам в вирионе, например, d4 (линейный

лей. Положения максимумов интенсивности на

размер 22,9 Å) равен длине шага спирали 22,9 Å,

кривых рассеяния (s1-s6) могут быть использо

Таблица 1. Сравнение характеристик рассеяния вирионов ВТМ в растворе с рассеянием от модели вириона

Вирион ВТМ*

Эксперимент

0,062

101

0,129

48,7

0,175

36,0

0,274

22,9

0,290

21,6

0,309

20,4

0,330

19,0

Модель

0,062

101

0,129

48,7

0,175

36,0

0,271

23,2

0,288

21,9

0,306

20,6

0,330

19,0

Costa, 2016**

0,062

101

0,130

48,7

0,175

35,9

0,275

23,2

0,294

21,8

0,311

20,5

0,336

19,0

* Использовали модель PDB: 2OM3; s (Å^-1) - модуль вектора рассеяния; d = 2π/s (Å) - период структуры, размер рассеи

вающих неоднородностей.

** Экспериментальные данные, приведенные в статье Costa et al. [29].

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

364

КСЕНОФОНТОВ и др.

полностью не совпала с экспериментальной

кривой.

Влияние длины модельных реполимеров на

расчетные кривые МУРР. Чтобы оценить влия

ние длины реполимера на кривые рассеяния,

мы рассчитали с помощью программы CRYSOL

[24] характеристики ряда смоделированных

структур: А, (АА)₁, (АА)₂, (АА)₄, (АА)₈, (АА)₁₆

кристаллической модели PDB: 1EI7 [12], где А -

одно кольцо из 17 субъединиц белка (рис. 4).

На кривых рассеяния моделей кольца А и дис

ка (АА)₁ полностью отсутствуют брэгговские мак

симумы (рис. 4, кривые 1 и 2), тогда как в моделях

реполимера (АА)₂ и (АА)₄интенсивность рассея

ния возрастает в положениях угловых векторов

s1, s4 и s5 (кривые 3, 4). В моделях реполимера

(АА)₈ и (АА)₁₆ интенсивность рассеяния значи

тельно увеличивается в положениях угловых век

торов s2, s4 и s6 (кривые 5, 6), которые соответ

ствуют рассеивающим размерам в препарате ре

полимера: d2 = 51 Å, d4 = 26,9 Å и d6 = 13,4 Å

(табл. 2). Размер d4 близок к определенной нами

методом ПЭМ величине осевой периодичности

колец реполимера (26,0 ± 0,9 Å). Удвоенная вели

чина (52 Å) соответствует периодичности дисков

в реполимерах и близка к рассеивающему разме

ру d2. Определенная методом рентгеновской

дифракции ориентированных волокон Франк

лин и Коммонером [7], эта величина составляла

53 Å. В табл. 3 приведены расчетные инварианты

(молекулярные массы M_r и радиусы инерции R_g)

для этих моделей и препарата реполимера. Вели

Рис. 3. Малоугловое рентгеновское рассеяние реполиме

чины R_g для моделей от 1 до 32 колец в реполиме

ров ВТМ в виде «стопок дисков»; а, в, д - эксперименталь

ре находились в диапазоне 64,2-253,4 Å. Инвари

ные и рассчитанные данные МУРР от модельных структур

анты для модели (АA)₁₆оказались близки к значе

(б, г, е). Рассеяние рассчитывали с помощью программы

ниям препарата реполимера в растворе.

CRYSOL. Модели структур - (БAАБ)₈ (б), (БA)₁₆(г) и (АA)

(е) - были получены в программе MASSHA. Эксперимен

тальные данные показаны точками, рассеяние моделей -

сплошными линиями. Стрелки указывают на максимумы

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

интенсивности векторов рассеяния. Врезка - кривые

МУРР для препаратов реполимера из белка оболочки, по

Современные методы интерпретации данных

лученного литиевым (кривая 1) или ацетатным (кривая 2)

методом

синхротронного МУРР вместе с комплементар

ным методом электронной микроскопии позво

лили нам в данной работе провести детальный

ваны в качестве специфической характеристики

структурный анализ образцов реполимеров бел

образцов. Для количественной оценки сходства

ка оболочки ВТМ в форме «стопок дисков». По

моделей реполимеров с реальной структурой в

данным МУРР можно определять в многоком

растворе использовали усредненную величину

понентном растворе молекулярную архитектуру

относительных отклонений максимумов интен

белков [27] и белков с гибкими неструктуриро

сивности вектора рассеяния s^im модели от экспе

ванными фрагментами [28]. Новые подходы к

риментальных величин: Ō = 1/n × Σ (⏐s^im -

анализу данных МУРР позволяют получать ин

- s^iexp⏐/s^iexp). Наименьшая величина Ō оказалась у

формацию о четвертичной структуре биологи

модели (АA)₁₆(Ō = 0,02 ± 0,01), что указывало на

ческих объектов. Метод способен визуализиро

наилучшее сходство с реальной структурой в

вать структуру исследуемых объектов в широ

растворе в сравнении с другими моделями -

ком диапазоне размеров в зависимости от энер

(БA)₁₆(Ō = 0,03 ± 0,01) или (БAАБ)₈(Ō = 0,04 ±

гии рентгеновского излучения и анализируемо

± 0,01). Однако ни одна из модельных кривых

го углового диапазона, который соответствует

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

СТРУКТУРА РЕПОЛИМЕРОВ ВТМ

365

Таблица 2. Сравнение характеристик рассеяния реполимеров ВТМ в растворе с рассеянием от моделей

Препарат

0,054

114

0,124

51,0

0,168

37,4

0,234

26,9

0,287

21,90

0,47

13,4

Модель (БAAБ)₈*

0,057

110

0,119

53,0

0,168

37,4

0,221

28,5

0,278

22,60

Модель (БA)₁₆

0,058

108

0,130

48,0

0,177

35,6

0,236

26,7

0,290

21,60

0,47

13,4

Модель (AA)₁₆

0,058

109

0,119

52,7

0,168

37,4

0,237

26,5

0,290

21,60

0,48

13,2

* Использовали кристаллографическую структуру PDB: 1EI7; величины s (Å^-1) и d (Å) - как в табл. 1. Препарат реполи

мера был получен литиевым методом.

определяемому размеру частиц ~10-2100 Å.

В последующей работе данной лаборатории с

Поскольку длинная ось вириона ВТМ составля

помощью МУРР сравнивали кинетику рекон

ет ~3000 Å, его длина не может быть измерена

струкции из белка и РНК вирионов ВТМ и ви

непосредственно при данном угловом диапазо

руса зеленой крапчатой мозаики огурца по из

не (0,003 < s < 0,5 Å^-1). Экспериментальные и

менению величины R_gи показали, что для ВТМ

рассчитанные кривые после s = 0,35 Å^-1расхо

скорость сборки значительно выше [32]. Кине

дятся (рис. 2), что может быть связано с низкой

тику образования спиральных «завитков», воз

точностью определения МУРР размеров менее

можных интермедиатов сборки ВТМ, и длин

15 Å или некоторым различием структур трех

ных спиральных реполимеров в кислой среде

виткового фрагмента (PDB: 2OM3) и аналогич

изучали в работе Potschka et al. [33] на линии

ного элемента вириона в растворе. Недавно в

DORIS I (DESY, Гамбург; λ = 1,50 Å).

работе Costa et al. [29] методом МУРР был изме

В настоящей работе с помощью МУРР впер

рен препарат вирионов ВТМ на малоугловой

вые охарактеризована структура в растворе и вы

линии BM29 (ESRF, Гренобль, λ = 0,99 Å) и по

полнено моделирование кривой МУРР во всем

лучена кривая рассеяния вириона при концент

измеряемом диапазоне для вирионов и реполи

рации вируса в 4 раза выше используемой нами

меров ВТМ. По данным ПЭМ, препарат реполи

(26 мг/мл). Из табл. 1 видно, что величины s и d

меров содержал набор длинных и гетерогенных

хорошо совпадают с данными нашей работы

по длине частиц в виде «стопок дисков» (рис. 1).

(относительное отклонение не превышает

Основная часть частиц препарата включала 6-16

1,5%). Приближение геометрических моделей

20S дисков. Измеренные величины усредненно

было выполнено авторами с использованием

го радиуса инерции R_g = 244,1 Å и молекулярно

программы Genfit [30]. С помощью трехцилинд

го веса M_r = 8308 кДа оказались близкими к мо

ровой модели вириона им удалось воспроизвес

дели (АA)₁₆: R_g = 253,4 Å и M_r= 9505 кДа (табл. 3).

ти лишь первые два максимума пиков s1 и s2 из

семи на экспериментальной кривой рассеяния.

Ранее в работе Hiragi et al. [31] методом

МУРР изучали препарат агрегатов белка ВТМ,

сформированных в растворе с рН 7,2, ионной

силе 0,1-0,2 М при температуре 15-25 °С на ма

лоугловой линии («Photon Factory», Япония; λ =

1,49 Å). Приближение было выполнено автора

ми с использованием цилиндрической модели

20S диска с наружным и внутренним диаметра

ми 180 и 40 Å соответственно, с двумя слоями

толщиной 23 Å, с радиусом инерции R_g, равным

66,5 Å. Препарат оказался в значительной сте

пени полидисперсным, содержащим в основ

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

ном двух , четырехслойные агрегаты и неболь

шое количество более длинных агрегатов. Ради

ус инерции образца увеличивался с ростом ион

Рис. 4. Модельные кривые МУРР. Расчет модельных ин

тенсивностей проводили с помощью программы

ной силы, температуры и концентрации и до

CRYSOL [24] для ряда моделей: А, (АА)₁, (АА)₂, (АА)₄,

стигал 85,6 Å в 100 мМ фосфатном буфере при

(АА)₈, (АА)₁₆, кривые 1-6 соответственно. Стрелки указы

25 °С и 12 мг/мл, что близко к нашей модели ре

вают на максимумы интенсивности векторов рассеяния

полимера (АA)₄с R_g, равным 88,7 Å (табл. 3).

(см. рис. 3, кривая 1)

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

366

КСЕНОФОНТОВ и др.

Таблица 3. Сравнение инвариант модельных структур и препарата реполимера ВТМ

Модели «стопок дисков»*

Образец

Инварианты

(АА)₁

(АА)₂

(АА)₄

(АА)₈

(АА)₁₆

реполимер

M_{r aa}, кДа

297,5

595

1190

2380

4760

9520

M_{r Crys}, кДа

297,0

594

1188

2376

4752

9505

8308

R_g, Å

64,2

65,5

70,8

88,7

138,4

253,4

244,1

* Величины молекулярных масс (M_{r Crys}) и радиусов инерции (R_g) для ряда смоделированных структур: А, (АА)₁, (АА)₂,

(АА)₄, (АА)₈, (АА)₁₆ - рассчитывали с помощью программы CRYSOL [24], используя кристаллографическую структуру

PDB: 1EI7; величины M_raa - из данных аминокислотной последовательности.

Ранее с помощью криоэлектронной микроско

ре при условиях, близких к физиологическим,

пии «стопок дисков» белка ВТМ было показано,

тогда как более трудоемкий метод рентгено

что их структура подобна ассоциату двух цент

структурного анализа позволяет определять

ральных колец закристаллизованного четырех

структуру в кристалле, а с помощью криоэлек

слойного агрегата, определен размер толщины

тронной микроскопии можно проанализиро

одного кольца 26,8 Å [10, 11], что близко к опре

вать выборку замороженных частиц. Нами

деленной нами величине периода структуры

впервые были охарактеризованы структуры в

d4 = 26,9 Å реполимера (табл. 2).

растворе и выполнено структурное моделирова

Причиной низкой корреляции модельных и

ние по данным МУРР во всем измеряемом диа

экспериментальных кривых МУРР может быть

пазоне для вирионов и реполимеров белка обо

различие в длинах используемой модели (АA)₁₆

лочки ВТМ. Ряд максимумов интенсивности на

(~820 Å) и частиц в препарате реполимера

кривых рассеяния соотнесен с реальными эле

(300-800 Å). На рис. 4 хорошо видно, что увели

ментами четвертичной структуры (периодич

чение длины частиц приводит к возрастанию

ность структуры, шаг спирали в вирионе), и наи

интенсивности пиков s2, s4 и s6, соответствую

лучшее совпадение с экспериментальными дан

щих упаковке дисков в структуре реполимера.

ными оказалось у модели реполимера из повто

Различная гидратация 20S дисков в кристалле и

ряющихся 20S дисков центральной пары колец

растворе реполимера также может быть одной

кристаллической модели PDB: 1EI7.

из причин несовпадения данных. Франклин и

Коммонер [7] обнаружили значительную гидра

тацию дисков в растворе и уменьшение размера

Финансирование. Работа выполнена при под

осевой периодичности в «стопках дисков» с 53

держке Российского фонда фундаментальных

до 43 Å при удалении воды в препаратах. Можно

исследований (18 04 00525а) и Министерства

предположить также, что атомарные структуры

науки и высшего образования Российской Фе

белка в кристаллической модели PDB: 1EI7 не

дерации в рамках выполнения работ по Государ

сколько отличаются от их структуры реполиме

ственному заданию ФНИЦ «Кристаллография

ра в растворе. Это различие в структуре может

и фотоника» РАН в части проведения экспери

быть причиной необычной стабильности репо

ментов МУРР.

лимера ВТМ в растворе и объяснять связывание

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

некоторых красителей, характерное для амило

сутствии конфликта интересов.

идов [13, 14].

Соблюдение этических норм. Настоящая

статья не содержит описания каких либо иссле

Одним из преимуществ МУРР является воз

дований с участием людей или использованием

можность характеристики всех частиц в раство

животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Caspar, D.L., and Namba, K. (1990) Switching in the self

Butler, P.J. (1999) Self assembly of tobacco mosaic virus:

assembly of tobacco mosaic virus, Adv. Biophys., 26,

the role of an intermediate aggregate in generating both

157-185, doi: 10.1016/0065 227x(90)90011 h.

specificity and speed, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol.

Kendall, A., McDonald, M., and Stubbs, G. (2007) Precise

Sci., 354, 537-550, doi: 10.1098/rstb.1999.0405.

determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus,

Bloomer, A.C., Champness, J.N., Bricogne, G., Staden, R.,

Virology, 369, 226-227, doi: 10.1016/j.virol.2007.08.013.

and Klug, A. (1978) Protein disk of tobacco mosaic virus at

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

СТРУКТУРА РЕПОЛИМЕРОВ ВТМ

367

2.8 Å resolution showing the interactions within and

20.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins dur

between subunits, Nature, 276, 362-368, doi: 10.1038/

ing the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature,

276362a0.

227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

Klug, A. (1999) The tobacco mosaic virus particle: structure

21.

Blanchet, C.E., Spilotros, A., Schwemmer, F., Graewert, M.A.,

and assembly, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 354,

Kikhney, A., Jeffries, C.M., Franke, D., Mark, D.,

531-535, doi: 10.1098/rstb.1999.0404.

Zengerle, R., Cipriani, F., Fiedler, S., Roessle, M., and

Butler, P.J. (1984) The current picture of the structure and

Svergun, D.I. (2015) Versatile sample environments and

assembly of tobacco mosaic virus, J. Gen. Virol., 65 (Pt 2),

automation for biological solution X ray scattering experi

253-279, doi: 10.1099/0022 1317 65 2 253.

ments at the P12 beamline (PETRA III, DESY), J. Appl.

Franklin, R.E., and Commoner, B. (1955) Abnormal pro

Crystallogr., 48, 431-443, doi: 10.1107/S160057671500254X.

tein associated with tobacco mosaic virus; X ray diffraction

22.

Konarev, P.V., Volkov, V.V., Sokolova, A.V., Koch, M.H.J.,

by an abnormal protein (B8) associated with tobacco

and Svergun, D.I. (2003) PRIMUS: a Windows PC based sys

mosaic virus, Nature, 175, 1076-1077, doi: 10.1038/

tem for small angle scattering data analysis, J. Appl. Crystallogr.,

1751076a0.

36, 1277-1282, doi: 10.1107/S0021889803012779.

Unwin, P.N., and Klug, A. (1974) Electron microscopy of

23.

Konarev, P.V., Petoukhov, M.V., and Svergun, D.I. (2001)

the stacked disk aggregate of tobacco mosaic virus protein.

MASSHA - a graphics system for rigid body modelling of

I. Three dimensional image reconstruction, J. Mol. Biol.,

macromolecular complexes against solution scattering data,

87, 641-656, doi: 10.1016/0022 2836(74)90075 8.

J. Appl. Crystallogr.,

34,

527-532, doi:

10.1107/

Dore, I., Ruhlmann, C., Oudet, P., Cahoon, M., Caspar, D.L.,

S0021889801006100.

and Van Regenmortel, M.H. (1990) Polarity of binding of

24.

Svergun, D., Barberato, C., and Koch, M.H.

(1995)

monoclonal antibodies to tobacco mosaic virus rods and

CRYSOL - a program to evaluate X ray solution scattering of

stacked disks, Virology, 176, 25-29, doi: 10.1016/0042

biological macromolecules from atomic coordinates, J. Appl.

6822(90)90226 h.

Crystallogr., 28, 768-773, doi: 10.1107/S0021889895007047.

10.

Diaz Avalos, R., and Caspar, D.L. (1998) Structure of the

25.

Durham, A.C., Finch, J.T., and Klug, A. (1971) States of

stacked disk aggregate of tobacco mosaic virus protein,

aggregation of tobacco mosaic virus protein, Nat. New Biol.,

Biophys. J.,

74,

595-603, doi:

10.1016/S0006

229, 37-42, doi: 10.1038/newbio229037a0.

3495(98)77818 X.

26.

Sachse, C., Chen, J.Z., Coureux, P.D., Stroupe, M.E.,

11.

Diaz Avalos, R., and Caspar, D.L. (2000) Hyperstable

Fandrich, M., and Grigorieff, N. (2007) High resolution

stacked disk structure of tobacco mosaic virus protein: elec

electron microscopy of helical specimens: a fresh look at

tron cryomicroscopy image reconstruction related to atom

tobacco mosaic virus, J. Mol. Biol., 371, 812-835,

ic models, J. Mol. Biol., 297, 67-72, doi: 10.1006/jmbi.

doi: 10.1016/j.jmb.2007.05.088.

1999.3481.

27.

Blanchet, C.E., and Svergun, D.I. (2013) Small angle X

12.

Bhyravbhatla, B., Watowich, S.J., and Caspar, D.L. (1998)

ray scattering on biological macromolecules and nanocom

Refined atomic model of the four layer aggregate of the

posites in solution, Annu. Rev. Phys. Chem., 64, 37-54,

tobacco mosaic virus coat protein at 2.4 A resolution,

doi: 10.1146/annurev physchem 040412 110132.

Biophys. J.,

74,

604-615, doi:

10.1016/S0006

28.

Shtykova, E.V., Baratova, L.A., Fedorova, N.V.,

3495(98)77819 1.

Radyukhin, V.A., Ksenofontov, A.L., Volkov, V.V.,

13.

Raghavendra, K., Adams, M.L., and Schuster, T.M. (1985)

Shishkov, A.V., Dolgov, A.A., Shilova, L.A., Batishchev, O.V.,

Tobacco mosaic virus protein aggregates in solution: struc

Jeffries, C.M., and Svergun, D.I. (2013) Structural analysis

tural comparison of 20S aggregates with those near condi

of influenza A virus matrix protein M1 and its self assem

tions for disk crystallization, Biochemistry, 24, 3298-3304,

blies at low pH, PLoS One, 8, e82431, doi: 10.1371/journal.

doi: 10.1021/bi00334a034.

pone.0082431.

14.

Raghavendra, K., Salunke, D.M., Caspar, D.L., and

29.

Costa, L., Andriatis, A., Brennich, M., Teulon, J.M.,

Schuster, T.M. (1986) Disk aggregates of tobacco mosaic

Chen, S.W., Pellequer, J.L., and Round, A.

(2016)

virus protein in solution: electron microscopy observations,

Combined small angle X ray solution scattering with atom

Biochemistry, 25, 6276-6279, doi: 10.1021/bi00368a066.

ic force microscopy for characterizing radiation damage on

15.

Ksenofontov, A.L., Dobrov, E.N., Fedorova, N.V.,

biological macromolecules, BMC Struct. Biol., 16, 18,

Arutyunyan, A.M., Golanikov, A.E., Jarvekulg, L., and

doi: 10.1186/s12900 016 0068 2.

Shtykova, E.V. (2018) Structure of potato virus A coat pro

30.

Spinozzi, F., Ferrero, C., Ortore, M.G., Antolinos, A.D.,

tein particles and their dissociation, Molecular Biology, 52,

and Mariani, P. (2014) GENFIT: software for the analysis of

913-921, doi: 10.1134/S0026893318060109.

small angle X ray and neutron scattering data of macro

16.

Ksenofontov, A.L., Dobrov, E.N., Fedorova, N.V.,

molecules in solution, J. Appl. Crystallogr., 47, 1132-1139,

Serebryakova, M.V., Prusov, A.N., Baratova, L.A., Paalme, V.,

doi: 10.1107/S1600576714005147.

Jarvekulg, L., and Shtykova, E V. (2018) Isolated potato

31.

Hiragi, Y., Inoue, H., Sano, Y., Kajiwara, K., Ueki, T.,

virus A coat protein possesses unusual properties and forms

Kataoka, M., Tagawa, H., Izumi, Y., Muroga, Y., and

different short virus like particles, J. Biomol. Struct. Dyn.,

Amemiya, Y. (1988) Temperature dependence of the struc

36, 1728-1738, doi: 10.1080/07391102.2017.1333457.

ture of aggregates of tobacco mosaic virus protein at pH 7.2.

17.

Goodman, R.M. (1975) Reconstitution of potato virus X in

Static synchrotron small angle X ray scattering, J. Mol.

vitro. I. Properties of the dissociated protein structural sub

Biol., 204, 129-140, doi: 10.1016/0022 2836(88)90604 3.

units, Virology,

68,

287-298, doi:

10.1016/0042

32.

Sano, Y., Inoue, H., and Hiragi, Y. (1999) Differences of

6822(75)90272 x.

reconstitution process between tobacco mosaic virus and

18.

Fraenkel Conrat, H. (1957) Degradation of tobacco mosa

cucumber green mottle mosaic virus by synchrotron small

ic virus with acetic acid, Virology, 4, 1-4, doi: 10.1016/

angle X ray scattering using low temperature quenching, J.

0042 6822(57)90038 7.

Protein Chem., 18, 801-805, doi: 10.1023/a:1020689720082.

19.

Ksenofontov, A.L., Kozlovskii, V.S., Kordiukova, L.V.,

33.

Potschka, M., Koch, M.H., Adams, M.L., and Schuster, T.M.

Radiukhin, V.A., Timofeeva, A.V., and Dobrov, E.N. (2006)

(1988) Time resolved solution X ray scattering of tobacco

Determination of concentration and aggregate size in

mosaic virus coat protein: kinetics and structure of interme

influenza virus preparations from true UV absorption spectra,

diates, Biochemistry,

27,

8481-8491, doi:

10.1021/

Molecular Biology, 40, 152-158.

bi00422a028.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020

368

КСЕНОФОНТОВ и др.

CHARACTERIZATION OF TOBACCO MOSAIC VIRUS VIRIONS

AND REPOLYMERIZED COAT PROTEIN AGGREGATES

IN SOLUTION BY SMALL;ANGLE X;RAY SCATTERING*

A. L. Ksenofontov¹**, M. V. Petukhov^2,3, A. N. Prusov¹, N. V. Fedorova¹, and E. V. Shtykova²

¹ Belozersky Institute of Physico Сhemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119991 Moscow, Russia; E mail: ksenofon@belozersky.msu.ru

² Shubnikov Institute of Crystallography, Federal Scientific Research Centre «Crystallography and Photonics»,

Russian Academy of Sciences, 119333 Moscow, Russia; E mail: shtykova@ns.crys.ras.ru

³ Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences,

119071 Moscow, Russia; E mail: maxim@embl hamburg.de

Received November 7, 2019

Revised December 20, 2019

Accepted December 22, 2019

The structure of tobacco mosaic virus (TMV) virions and stacked disk aggregates of TMV coat protein (CP) in solu

tion was analyzed by synchrotron based small angle X ray scattering (SAXS) and negative contrast transmission elec

tron microscopy (TEM). TMV CP aggregates had a unique stability but did not have helical symmetry. According to

the TEM data, they were stacked disks associated into transversely striated rod shaped structures 300 to 800 Å long.

According to modeling based on the crystallographic model of the 4 layer TMV CP aggregate (PDB: 1EI7), the

stacked disks represented hollow cylinders. The calculated SAXS pattern for the disks was compared to the experi

mental one over the entire measured range. The best correlation with the SAXS data was found for the model with the

repeating central pair of discs; the SAXS curves for the stacked disks were virtually identical irrespectively of the pro

tein isolation method. The positions of maxima on the scatter curves could be used as characteristic features of the

studied samples; some of the peaks were assigned to the existing elements of the quaternary structure (periodicity of

aggregate structure, virion helix pitch). Low resolution structural data for the repolymerized TMV CP aggregates in

solution under conditions similar to natural were produced for the first time. Analysis of such nano size objects is

essential for their application in biomedicine and biotechnology.

Keywords: TMV, coat protein, stacked disk aggregates, virions, small angle X ray scattering

БИОХИМИЯ том 85 вып. 3 2020