БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 5, с. 637 - 646

УДК 577.322.9

СБОРКА КОМПЛЕКСА 30S СУБЪЕДИНИЦЫ

РИБОСОМЫ И ФАКТОРА RbfA S. aureus in vitro

ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ*

А.Г. Бикмуллин¹**, Л.И. Нуруллина¹, Н.С. Гараева¹, Э.А. Клочкова¹,

Д.С. Блохин¹, А.А. Голубев^1,2, Ш.З. Валидов¹,

И.Ш. Хусаинов^1,2,3, К.С. Усачев¹**, М.М. Юсупов^1,2**

¹ Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008 Казань, Россия;

электронная почта: aydar.bikmullin@gmail.com; konstantin.usachev@kpfu.ru; marat@igbmc.fr

² Институт генетики, молекулярной и клеточной биологии (IGBMC),

67400 Илькирш+Граффенштаден, Франция

³ Институт биофизики им. Макса Планка, 60438 Франкфурт+на+Майне, Германия

Поступила в редакцию 05.12.2019

После доработки 17.02.2020

Принята к публикации 14.03.2020

Связывающий рибосому фактор RbfA из золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) является белком

холодовой адаптации и требуется для роста патогенных клеток при пониженных температурах (10-15 °С).

RbfA участвует в процессинге 16S рРНК, а также в сборке и стабилизации малой 30S субъединицы рибосо%

мы. Изучение структуры и функции RbfA, структуры комплекса фактора с малой субъединицей, а также ме%

ханизма их связывания поможет лучше разобраться в деталях такого сложного и фундаментального процес%

са, как сборка 30S субъединицы рибосомы, определяющего и контролирующего общий уровень биосинте%

за белка в целом. В работе описаны протоколы получения фактора RbfA и малых субъединиц рибосом

S. aureus, а также оптимизированный протокол сборки и очистки комплекса 30S субъединицы и фактора

RbfA для дальнейших структурных исследований методом криоэлектронной микроскопии.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Staphylococcus aureus, рибосома, криоэлектронная микроскопия, RbfA, фактор транс%

ляции, сборка 30S субъединицы рибосомы.

DOI: 10.31857/S0320972520050036

ВВЕДЕНИЕ

resistant Staphylococcus aureus, MRSA), имеющие

множественную устойчивость к антибиотикам

Золотистый стафилококк (Staphylococcus

последних классов [1-5].

aureus) в настоящее время является одним из са%

Ключевым элементом абсолютно любой жи%

мых распространенных и опасных патогенных

вой клетки, контролирующим общий уровень её

микроорганизмов. Эти грамположительные

жизнедеятельности, является рибосома. Коли%

бактерии вызывают множество больничных и

чество рибосом и их функциональная актив%

внебольничных заболеваний дыхательных путей

ность определяют общий уровень синтеза белка

и кожных покровов человека. Основным мето%

на каждом этапе нормального развития клетки и

дом борьбы с патогеном является антибиотико%

в стрессовых условиях [6].

терапия, однако ее эффективность постоянно

Рибосома - это макромолекулярный РНК%

снижается за счет прогрессирующей резистент%

белковый комплекс, сборка которого является

ности стафилококка к используемым против

сложным процессом, включающим в себя со%

него антибиотикам. Существуют штаммы

пряженные этапы биосинтеза рРНК и белков

S. aureus, такие как, например, метициллин%ус%

большой и малой субъединиц, их модификаций,

тойчивый золотистый стафилококк (methicillin%

корректного сворачивания и связывания друг с

другом. Процесс этот строго консервативен и

жестко регулируется на уровне синтеза молекул

* Первоначально английский вариант рукописи опубли%

рРНК, а также зависит от доступности этих мо%

кован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19%314,

лекул в клетке. Образование рибосомальных

27.04.2020.

субъединиц также зависит от скорости роста

** Адресат для корреспонденции.

клеток. Ошибки на этапах сборки снижают об%

637

638

БИКМУЛЛИН и др.

щий уровень метаболизма и могут быть даже фа%

ментального замораживания в жидком этане

тальными для микроорганизмов [7]. Сборка ри%

или смеси этана и пропана [14-17].

босомы и ее работа на различных этапах жизне%

С развитием криоэлектронной микроскопии

деятельности регулируется специальными бел%

значительно расширился спектр рибосомаль%

ковыми факторами, нарушая работу которых

ных комплексов для структурных исследований,

возможно управлять биосинтезом белка, вклю%

в том числе и рибосом бактерий [18-21]. Эти ис%

чать или выключать его. Некоторые факторы

следования показали, что, несмотря на струк%

работают постоянно, ряд факторов активизиру%

турную гомологию рибосом различных бакте%

ется только в условиях стресса [8]. Одним из та%

рий, их оптимум ионных условий и концентра%

ких факторов является связывающий рибосому

ции ионов Mg²⁺ для поддержания правильной

фактор RbfA (ribosome%binding factor A) - белок

конформации in vitro отличаются. Особенно это

холодовой адаптации, необходимый для роста

касается отдельных изолированных рибосо%

клеток при низкой температуре (10-15 °С). RbfA

мальных субъединиц, которые в отсутствие ста%

имеет сродство к 30S субъединице рибосомы и

билизирующих контактов между субъединица%

необходим для её «созревания» - фактор требу%

ми (т.н. межсубъединичных мостиков, intersub%

ется для эффективного процессинга 16S рРНК

unit bridges) наиболее подвержены структурным

(способствует корректной конформации спира%

искажениям, особенно в области интерфейса.

ли h1). Также предполагается, что фактор участ%

При этом малая субъединица наиболее хрупкая

вует в стабилизации малой субъединицы и пос%

и зачастую деформируется в области шейки -

ле созревания 16S рРНК, взаимодействуя с её

элемента, поддерживающего ориентацию го%

5′%концом. В ΔrbfA штаммах Escherichia coli на%

ловки относительно тела 30S частицы. Подоб%

блюдается уменьшение активных 70S рибосом

ная подвижность субъединицы вносит не только

(увеличение количества отдельных субъеди%

искажения в конечную структуру, но и значи%

ниц), а также увеличение количества молекул

тельно увеличивает гетерогенность образца. Та%

17S рРНК - предшественников 16S рРНК. Бел%

ким образом, подбор оптимальных условий

ки семейства RbfA встречаются у большинства

очистки и стабилизации 30S субъединиц и

эу% и архебактерий, а также в хлоропластах рас%

комплекса 30S-RbfA является необходимым и

тений и митохондриях высших организмов, в

важным условием пробоподготовки для даль%

том числе и человека. RbfA S. aureus - это не%

нейшего структурного анализа.

большой белок, состоящий из 115 аминокислот%

В данной статье мы представляем оптимизи%

ных остатков, с молекулярной массой ∼14 кДа

рованный метод сборки и очистки комплекса

[9-13].

фактора RbfA и малой рибосомальной субъеди%

Биосинтез рибосомы является одним из са%

ницы S. aureus для дальнейшего анализа мето%

мых фундаментальных процессов во всем жи%

дом криоэлектронной микроскопии. Были по%

вом. Исследование частных деталей процесса

лучены образцы фактора RbfA и 30S субъединиц

сборки рибосом и их субъединиц в патогенных

S. aureus высокой степени чистоты, затем прово%

для человека золотистых стафилококках позво%

дили их связывание и дополнительную аффин%

лит получить больше информации об этом

ную очистку для увеличения в конечном образ%

сложном процессе в целом, а также позволит уз%

це доли 30S субъединиц, связанных с фактором.

нать больше о том, как функционирует сама ри%

В дальнейшем данная методика может быть

босома. Изучение структуры комплекса малой

применена к множеству белков, связывающихся

субъединицы рибосомы и связывающего рибо%

с малой субъединицей рибосомы S. aureus.

сому фактора RbfA S. aureus позволит опреде%

лить локализацию фактора на субъединице и

описать механизм их связывания, т.е. лучше по%

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

нять этап созревания малой субъединицы и об%

разование инициаторного комплекса трансля%

Материалы. В работе были использованы ре%

ции.

активы: ИПТГ, спермидин, канамицин, хлорам%

Криоэлектронная микроскопия сегодня, на%

феникол («Euromidex», Франция); LB, LB agar

ряду со спектроскопией ядерного магнитного

(«Invitrogen», США); коктейль ингибиторов эн%

резонанса и рентгеноструктурным анализом,

догенных протеаз

(«Roche», Швейцария);

является одним из наиболее информативных

NiNTA%сорбент Superflow («QIAGEN», Герма%

методов в молекулярной и структурной биоло%

ния) и БСА («Helicon», Россия). Остальные ре%

гии. С ее помощью возможно получать разреше%

активы были классифицированы как ЧДА, ХЧ и

ние выше 2 Å. Главной особенностью этого типа

Ос.Ч.

микроскопии является то, что макромолекулы

Получение фактора RbfA S. aureus. Ген факто%

фиксируются в нативном состоянии за счет мо%

ра RbfA S. aureus был амплифицирован из хро%

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

СБОРКА И ОЧИСТКА КОМПЛЕКСА 30S-RbfA S. aureus in vitro

639

мосомной ДНК с введением рестрикционных

Очистка RbfA. Очистку RbfA из супернатанта

сайтов NdeI и HindIII. Были использованы сле%

лизата производили последовательно методами

дующие специфичные прямой (5′%TTTTTTC%

металл%хелатной аффинной хроматографии и

ATATGAGCAGTATGAGAGCAGAGCG%3′) и

гель%фильтрации. Аффинную хроматографию

обратный (5′%TTTTTTAAGCTTATCTATCTTG%

на NiNTA%сорбенте проводили в буфере

TTTGTGTAAATCTTGAATCA%3′) праймеры

(20 мМ Tris%HCl, pH 7,6; 0,5 М NH₄Cl; 1 мМ

(«Евроген», Россия). Температурный режим по%

ДТТ) с промежуточной отмывкой буфером 2

лимеразной цепной реакции (ПЦР), а также

(20 мМ Tris%HCl, pH 7,6; 1 М NH₄Cl; 1 мМ ДТТ),

состав реакционной смеси подбирали в соответ%

буфером 3 (20 мМ Tris%HCl, pH 7,6; 0,5 М

ствии с температурой отжига праймеров (59 °С)

NH₄Cl; 20 мМ имидазол; 1 мМ ДТТ) и элюцией

и по протоколу коммерческого фермента для

буфером 4 (20 мМ Tris%HCl, pH 7,6; 0,5 М

ПЦР Phusion Green High%Fidelity DNA Poly%

NH₄Cl; 0,3 М имидазол; 1 мМ ДТТ). Затем про%

merase («Thermo Scientific», США).

водили осаждение белка сульфатом аммония

Обработка ПЦР фрагментов и плазмиды

(80%, w/v) [22].

pET28a соответствующими рестриктазами,

Гель%фильтрацию проводили с помощью

очистка ДНК%компонентов и их лигирование

хроматографической системы NGC Discover

проводили согласно протоколам коммерческих

(«BioRad», США) на колонке Enrich Sec70

ферментов NdeI, HindIII и наборов GeneJet Gel

(«BioRad», США) в буфере следующего состава:

Extraction Kit, T4 DNA Ligase Kit. Затем прово%

мM натрий%фосфатный буфер, pH

6,8;

дили трансформацию лигазной смеси в штамм

0,25 M NH₄Cl. Чистоту полученного образца

E. coli DH5α и выделение вектора с помощью

оценивали с помощью денатурирующего элект%

коммерческого набора GenJet Plasmid MiniPrep.

рофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в

В результате нами был получен вектор

Tris%глициновом буферном растворе, рН 8,3

Rbfa_Sa::pET28a, несущий ген фактора RbfA с 6

(25 мМ Tris%буфер; 250 мМ глицин; 0,1% доде%

гистидинами на N%конце (гис%таг) под контро%

цилсульфат натрия), при температуре 20 °С и ра%

лем LacI^q промотора. На всех этапах клонирова%

бочем напряжении 140 V.

ния использовали ферменты и коммерческие

Получение 70S рибосом S. aureus. 70S рибосо%

наборы производства «Thermo Fisher Scientific»,

мы S. aureus были получены согласно протоколу,

США.

разработанному в Институте генетики, молеку%

Экспрессию фактора проводили в штамме

лярной и клеточной биологии (Страсбург,

E. coli BL21 (DE3, pLysS) на селективной богатой

Франция) [23]. 30S субъединицы были получе%

питательной среде LB, содержащей канамицин

ны путем диссоциации 70S рибосом в градиенте

и хлорамфеникол. Рост клеток осуществляли

сахарозы (0-30%) в буфере D (30 мМ NH₄Cl;

при температуре 37 °С и скорости качания

1 мМ MgOAc; 10 мМ Hepes%K, pH 7,5; 1 мM

180 об./мин на шейкере%инкубаторе «Inforse HT»

ДТТ) на ультрацентрифуге Optima XPN%80

(«Inforse», Германия). При достижении поглоще%

(«Beckman Coulter», США) на роторе SW28 при

ния OD₆₀₀ = 0,6 производили индукцию экспрес%

скорости 20 550 об./мин в течение 16 ч при тем%

сии фактора RbfA путем добавления ИПТГ

пературе 4 °C. Фракции градиента, содержащие

(изопропил%β%D%1%тиогалактопиранозида) до

малые субъединицы рибосом, были объединены

конечной концентрации 1 мМ. Экспрессию про%

и сконцентрированы на спин%центриконах

водили в течение 6 ч при температуре 30 °С и ско%

Amicon Ultra («Merck Millipore», Ирландия)

рости качания 180 об./мин. Затем клетки осажда%

(размер пор 100 кДа) с заменой буфера градиен%

ли центрифугированием («Beckman», США), за%

та на буфер G (10 мМ NH₄Cl; 10 мМ MgOAc;

мораживали и хранили при температуре -20 °С.

10 мМ Hepes%K, pH 7,5; 50 мМ KCl; 1 мМ ДТТ;

После разморозки разрушение клеток осу%

2,5 мМ спермидина). Чистоту рибосом и субъе%

ществляли за счет эндогенного T7 лизоцима

диниц также оценивали с помощью денатуриру%

(pLysS) на ультразвуковом гомогенизаторе

ющего электрофореза в ПААГ (условия анало%

HD2070 («Bandelin», Германия) в присутствии

гичны анализу проб после гель%фильтрации) и

ингибиторов эндогенных протеаз, в том числе и

электрофореза в агарозном геле с бромистым

металлопротеаз, в базовом буфере 1 для NiNTA%

этидием (0,8% агарозный гель; буфер TBE,

хроматографии (состав см. далее). Осаждение

pH 8,0 (89 мМ Tris%буфер; 89 мМ борная кисло%

нерастворимой фазы клеточного лизата произ%

та; 2 мМ ЕДТА); 0,5 мкг/мл бромистый этидий;

водили последовательно методом центрифуги%

20 °С; рабочее напряжение 180 V).

рования при 25 000 g в течение 30 мин и 100 000 g

Получение и очистка комплекса 30S-RbfA. К

в течение 45 мин на центрифугах «Beckman»

90 мкл смеси 30S субъединиц в буфере G были

(США) - Avanti JXN%26 (ротор JA%25.50) и

добавлены 10 мкл фактора RbfA разной концен%

Optima XPN (ротор 45Ti) соответственно.

трации в фосфатном буфере так, чтобы соотно%

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

640

БИКМУЛЛИН и др.

шение 30S : RbfA было равно 1 : 1, 1 : 5 и 1 : 10.

контролей. Условия электрофореза были анало%

Реакционную смесь для сборки комплекса ин%

гичны проведенным ранее. Перенос белков с

кубировали в течение 40 мин при температуре

15%%го ПААГ на мембрану из поливинилиден%

37 °С.

фторида (ПВДФ, 0,45 мкм, «BioRad», США)

Очистку комплекса от не связавшихся с бел%

производили в трансфер буфере (25 мМ Tris%

ком 30S субъединиц производили при помощи

HCl, pH 8,3; 190 мМ глицина; 20% метанола (v/v))

NiNTA%сорбента в буферных условиях сборки.

на блот%системе полусухого переноса Trans%Blot

Объем сорбента был равен объему реакционной

SEMI%DRY («BioRad», США) при напряжении

смеси

(100

мкл). После нанесения смеси

17 V в течение 40 мин. Блокирование неспеци%

NiNTA%сорбент был промыт буфером G объе%

фического связывания проводили в 20% раство%

мом в десять раз превышающим объем сорбен%

ре бычьего сывороточного альбумина (БСА) в

та. Элюцию проводили последовательно элюи%

ТБСТ буфере (25 мМ Tris%HCl, pH 7,2; 150 мМ

рующими буферами, содержащими 100, 150 и

NaCl; 0,05% (w/v) Tween 20) при качании в тече%

200 мМ имидазола в объеме, превышающем

ние 1 ч. После двукратной отмывки буфером

объем сорбента в 3 раза. В качестве контроля на

ТБСТ следовала инкубация с антителами при

сорбент также наносили свободные 30S субъе%

качании в течение 1 ч. После промывки буфе%

диницы без фактора RbfA, их отмывку и элю%

ром ТБСТ следовала активация антител, связав%

цию проводили аналогично опыту с комплек%

шихся с белком, в смеси коммерческих раство%

сом.

ров субстрата и реагента хемилюминесцентной

Для дальнейшего анализа были отобраны

ферментативной реакции (1 : 1). Обнаружение

первые 5, 10%я и 20%я фракции отмывки и пер%

свечения антител, связавшихся с гис%тагом ре%

вые 6 фракций элюции. Объем фракции состав%

комбинантного фактора RbfA, производили при

лял 50 мкл. Анализировали оптическое погло%

помощи системы гель%документирования

щение отобранных фракций при длинах волн

ChemiDoc MP («BioRad», США).

260 нм и 280 нм (максимумы поглощения нукле%

Оценка качества полученного образца ком=

иновых кислот и белков соответственно). Также

плекса 30S-RbfA. Оценку качества полученного

эти фракции были исследованы методами бел%

образца комплекса малой субъединицы рибосо%

кового ПААГ%электрофореза в денатурирующих

мы и фактора RbfA производили на электронном

условиях и электрофореза нуклеиновых кислот

микроскопе Titan Krios («Thermo Fisher», США)

в агарозном геле в присутствии бромистого эти%

в Институте генетики, молекулярной и клеточ%

дия. Условия электрофоретических исследова%

ной биологии (Страсбург, Франция). После раз%

ний были аналогичны описанным ранее при

морозки на льду образец наносили на покрытые

анализе белковых проб после гель%фильтрации

углеродом подложки с помощью прибора

и субъединиц после диссоциации рибосом.

Vitrobot («FEI company/Thermo Fisher», США)

Фракции, содержащие комплекс, сразу за%

при температуре 4 °С и относительной влажнос%

мораживали в жидком азоте и хранили при тем%

ти 100%. После «вымачивания» в течение 30 с

пературе -80 °С. Транспортировку образцов

подложки замораживали в жидком этане. Визуа%

осуществляли при низких температурах в сухом

лизацию проводили с использованием детектора

льду. Разморозку образцов проводили непосред%

Falcon 3 («FEI company/Thermo Fisher», США)

ственно перед криомикроскопическими иссле%

при увеличении 75 000 раз (соответствующее фи%

дованиями.

зическому размеру пикселя 0,85 Å/pix), дефоку%

Вестерн=блот. Для дополнительной качест%

се - 3 мкм и общей дозе 60 e/Å².

венной идентификации фактора RbfA в полу%

Связывание RbfA c большой субъединицей ри=

ченном образце комплекса после NiNTA%очист%

босомы. Также для подтверждения специфич%

ки был проведен вестерн%блот фракции элюции

ности связывания фактора RbfA с малой субъе%

с максимальным значением оптического погло%

диницей рибосомы был проведен эксперимент

щения с коммерческим набором вторичных хе%

по связыванию RbfA c большой субъединицей.

милюминесцентных антител к гис%тагу

Условия связывания фактора с 50S субъедини%

«HisProbe™%HRP» («Thermo Scientific», США).

цей (50S : RbfA = 1 : 10), а также анализ проб

В набор антител также входили растворы реа%

после NiNTA%очистки были аналогичны связы%

гента и субстрата для хемилюминесцентной

ванию его с 30S. Элюцию проводили при концен%

ферментативной реакции. Вестерн%блот прово%

трации имидазола 100 мМ. В качестве контроля

дили по протоколу коммерческого набора при

параллельно проводили эксперимент по нанесе%

комнатной температуре. Сначала был проведен

нию на NiNTA%сорбент свободных 50S субъеди%

ПААГ%электрофорез в денатурирующих услови%

ниц без фактора RbfA. Их отмывку и элюцию

ях фракции элюции, а также свободных 30S

проводили аналогично опыту с комплексом.

субъединиц и очищенного RbfA в качестве

Полученные после элюции образцы анализиро%

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

СБОРКА И ОЧИСТКА КОМПЛЕКСА 30S-RbfA S. aureus in vitro

641

Рис. 1. Оптическое поглощение при 260 нм (1) и 280 нм (2) фракций NiNTA%очистки комплекса 30S-RbfA при соотноше%

нии 30S : RbfA = 1 : 1 (а), 1 : 5 (б), 1 : 10 (в) и свободных 30S субъединиц рибосом (г). W1-W20 - фракции отмывки,

E1-E6 - фракции элюции при 100 мМ, 150 мМ и 200 мМ имидазола

вали с помощью ПААГ%электрофореза в денату%

акционной смеси на 10% и менее не критично

рирующих условиях.

для стабильности субъединицы рибосомы [24].

Поэтому к 90 мкл 30S субъединиц в буфере G мы

добавляли 10 мкл раствора фактора RbfA в фос%

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

фатном буфере.

По литературным данным [9], RbfA связыва%

Для получения комплекса малой субъедини%

ется с 30S субъединицей в области декодирую%

цы рибосомы и фактора RbfA была выбрана сле%

щего центра, при этом С%терминальный конец

дующая стратегия: in vitro инкубировали малые

белковой молекулы связывается с кором субъе%

субъединицы рибосомы и молекулы фактора

диницы. Связывающийся с NiNTA%сорбентом

RbfA при физиологически нормальной для

гис%таг находится на N%конце фактора. Таким

S. aureus температуре 37 °С в буферном растворе

образом, теоретически RbfA должен своим

G, имеющем наиболее оптимальный для рибо%

N%концом связаться с NiNTA%сорбентом, удер%

сом состав, при молярном соотношении субъе%

живая при этом С%концом субъединицу рибосо%

диниц и молекул фактора: 1 : 1, 1 : 5 и 1 : 10.

мы. Эти факты делают возможной очистку по%

Общий объем реакционной смеси составил

лученного образца комплекса 30S-RbfA от не

100 мкл. Стабильность малой субъединицы ри%

связавшихся с фактором субъединиц с по%

босомы сильно зависит от буферных условий, а

мощью NiNTA%сорбента.

именно от концентрации ионов Mg²⁺ в растворе.

В качестве контрольного эксперимента на

При добавлении фактора RbfA в фосфатном бу%

сорбент наносили свободные 30S субъединицы

фере к 30S субъединицам происходит разведе%

без фактора RbfA, их отмывку и элюцию прово%

ние буфера G, в котором они находятся, соответ%

дили аналогично опыту с комплексом.

ственно концентрация ионов Mg²⁺ в объеме

Первые 5, 10%я и 20%я фракции отмывки, а

уменьшается. Разведение итогового объема ре% также первые 6 фракций каждой элюции были

3 БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

642

БИКМУЛЛИН и др.

ния дополнительных артефактов и шумов на

электронных микрографиях [25]. Наибольшее

кДа

количество комплекса наблюдается во фракции

элюции Е2 при десятикратном избытке фактора

RbfA по отношению к 30S субъединицам (30S :

RbfA = 1 : 10). Именно это соотношение было

взято нами для дальнейших структурных иссле%

дований. При других проверенных нами соот%

ношениях общий выход комплекса был меньше

на ~20%. Большее количество фактора относи%

тельно 30S не исследовалось.

Для анализа с помощью методов электрофо%

реза были взяты фракции сборки комплекса при

молярном соотношении 30S субъединиц к фак%

тору RbfA, равном 1 : 5. Электрофореграммы

представлены на рис. 2 и 3, и данные этих ри%

Рис. 2. Электрофоретический анализ в ПААГ при денату%

сунков соотносятся с данными, представленны%

рирующих условиях фракций после очистки комплекса

30S-RbfA (30S : RbfA = 1 : 5). Дорожки: 1 - белковый мар%

ми на рис. 1, и подтверждают факт сборки ком%

кер, 2-4 - фракции отмывки W1, W2, W20, 5 - контроль

плекса. На гели были нанесены некоторые

RbfA, 6 - контроль 30S, 7-10 - фракции элюции при

100 мМ имидазола E1-E4

фракции отмывки W, элюции E, а также отдель%

но 30S субъединицы и очищенный фактор RbfA

в качестве контроля.

отобраны для измерения их поглощения при

В первых фракциях отмывки мы видим нали%

длинах волн 260 нм и 280 нм (рис. 1). Факт сбор%

чие рибосомальных белков на ПААГ и 16S рРНК

ки комплекса и наличие его или отдельных ком%

на агарозном геле (расположение окрашенных

понентов во фракциях определяли качественно:

белковых пятен и свечения в ультрафиолетовом

поглощение при 260 нм и 280 нм свидетельство%

свете совпадают с контролями 30S и RbfA). Пос%

вало о наличии 16S рРНК и белкового фактора;

ледняя фракция отмывки не содержит белков и

наличие рибосомальных белков и фактора RbfA

рРНК. В первых фракциях элюции мы снова

также подтверждали с помощью денатурирую%

наблюдаем наличие рибосомальных белков,

щего ПААГ%электрофореза, наличие малой

фактора RbfA на ПААГ и 16S рРНК на агарозном

субъединицы, а именно 16S рРНК - с помощью

агарозного электрофореза с бромистым этидием

(рис. 2 и 3). В качестве контролей на гели элект%

рофорезов наносили очищенный RbfA и сво%

бодные малые субъединицы рибосом.

На рисунке 1, а-в видно, что более полови%

ны малых субъединиц рибосом не связались с

белком и сошли (W1-W20). Возможно, не все

нативные субъединицы способны связываться с

фактором, или эти субъединицы разрушились и

потеряли способность к связыванию. Свобод%

ные 30S субъединицы без фактора также не свя%

зались с колонкой в контрольном эксперименте

(рис. 1, г). Таким образом, очистка комплекса

30S-RbfA методом металл%хелатной хроматог%

рафии позволила нам очистить образец от не

связавшихся с фактором 30S субъединиц и тем

самым значительно повысить гомогенность об%

разца перед анализом методом криоэлектрон%

ной микроскопии.

Было установлено, что концентрация ими%

дазола 100 мМ является достаточной для элю%

Рис. 3. Электрофоретический анализ в агарозном геле в

присутствии бромистого этидия фракций после очистки

ции комплекса. Использование минимально

комплекса 30S-RbfA (30S : RbfA = 1 : 5). Дорожки: 1-2 -

достаточной концентрации имидазола позволя%

фракции отмывки W1, W20; 3 - контроль 30S; 4 - контроль

ет сохранять образец в условиях, приближенных

RbfA; 5-8 - фракции элюции при 100 мМ имидазола

к оптимальным, а также снизить риск появле%

Е1-Е4

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

СБОРКА И ОЧИСТКА КОМПЛЕКСА 30S-RbfA S. aureus in vitro

643

кДа

Рис. 4. Вестерн%блот анализ комплекса 30S-RbfA после очистки: а - полиакриламидный гель; б - ПВДФ%мембрана пос%

ле связывания с антителами и их активации. Дорожки: 1 - белковый маркер, 2 - контроль 30S, 3 - комплекс 30S-RbfA

(фракция элюции Е2), 4 - контроль RbfA

геле, что говорит о том, что комплекс фактора и

Можно предположить, что связывание RbfA

30S субъединицы был связан с NiNTA%сорбен%

с 30S субъединицей вызвано неспецифическим

том. Основное количество комплекса содержит%

взаимодействием белка RbfA с рРНК. Для под%

ся в первых двух фракциях элюции. Во фракции

тверждения специфичности связывания RbfA с

E4 на ПААГ (рис. 2) наблюдается присутствие

малой субъединицей был воспроизведен опи%

только белка RbfA, который был в избытке по

санный выше эксперимент по сборке и очистке

сравнению с субъединицами рибосом.

комплекса, но вместо 30S субъединиц с факто%

Для дополнительной идентификации факто%

ром RbfA инкубировали 50S субъединицы (50S :

ра RbfA в составе полученного комплекса

RbfA = 1 : 10). Элюцию с NiNTA%сорбента про%

30S-RbfA был проведен вестерн%блот фракции

водили при концентрации имидазола 100 мМ. В

элюции Е2 с наибольшей концентрацией образ%

качестве контроля для этого эксперимента в

ца. В работе были использованы коммерческие

аналогичных условиях наносили на NiNTA%

вторичные хемилюминесцентные антитела спе%

сорбент и элюировали свободные 50S субъеди%

цифичные к гистидиновому тагу. Единственным

ницы.

компонентом нашей системы, имеющим гис%

Были определены значения поглощения при

таг, является рекомбинантный белковый фактор

длинах волн 260 нм и 280 нм фракций отмывки

RbfA. На рисунке 4, а представлены результаты

W1-W20 и фракций элюции E1-E6. Фракции

ПААГ%электрофореза в денатурирующих усло%

отмывки W1, W3, W5 и W20, а также фракции

виях фракции Е2 и контрольных образцов -

элюции с наибольшей концентрацией образца

свободных 30S субъединиц и фактора RbfA (ок%

E1-E3 были исследованы с помощью денатури%

раску геля производили уже после переноса бел%

рующего ПААГ%электрофореза (рис. 5, а). Пос%

ка на мембрану при вестерн%блоте с помощью

ле нанесения свободных 50S субъединиц на

красителя Кумасси по протоколу Лэммли [26]).

NiNTA%сорбент с помощью электрофореза ана%

Во фракции элюции E2 мы видим наличие

лизировали те же фракции отмывки и элюции,

рибосомальных белков - профиль идентичен

что и в смеси с RbfA (рис. 5, б).

контрольному образцу свободных малых субъ%

На гелях на рисунках 5, а и б, мы видим отсут%

единиц. С этого геля был проведен перенос бел%

ствие белков 50S субъединиц во фракциях элю%

ков на ПВДФ%мембрану. Визуализация мембра%

ции E1-E3 и в эксперименте с фактором RbfA,

ны показала наличие свечения, что говорит о

и в эксперименте со свободными субъединица%

связывании антитела с белком RbfA, несущим

ми. В эксперименте с фактором видно, что RbfA

гис%таг. На рисунке 4, б мы видим наличие бел%

связывается с сорбентом и смывается с него при

ка в контрольном образце RbfA и в образце

элюции.

50S субъединицы обнаруживаются

комплекса, тогда как в контроле 30S ничего нет.

только во фракциях отмывки W. Можно сделать

Молекулярные массы RbfA в контроле и ком%

заключение, что 50S субъединицы не связыва%

плексе совпадают. Можно сделать заключение о

ются ни с NiNTA%сорбентом, ни с фактором

присутствии белка RbfA в комплексе.

RbfA, т.е. фактор RbfA имеет сродство к 30S

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

644

БИКМУЛЛИН и др.

кДа

Рис. 5. Электрофоретический анализ в ПААГ при денатурирующих условиях фракций после очистки смеси 50S и RbfA (а)

и свободных 50S (б). Дорожки: 1 — белковый маркер, 2-5 - фракции отмывки W1, W3, W5, W20, 6 - контроль RbfA,

7 - контроль 50S, 8-10 - фракции элюции при 100 мМ имидазола E1-E3

субъединице. Фактор специфически связывает%

Результаты, представленные выше, позволя%

ся с компонентами малой субъединицы.

ют сделать вывод о том, что был получен и очи%

На рисунке 6 изображена микрофотография

щен комплекс фактора RbfA и 30S субъединицы

образца комплекса 30S-RbfA после очистки на

рибосомы для дальнейших структурных иссле%

NiNTA%собренте, полученная с помощью элект%

дований методом криоэлектронной микроско%

ронного микроскопа. В основном можно заме%

пии.

тить отдельные 30S субъединицы продолговатой

Последовательно были получены очищен%

формы. Также есть некоторое количество агре%

ные препараты связывающего рибосому фактора

гатов субъединиц. Гомогенность образца позво%

RbfA и 30S малых субъединиц рибосом S. aureus.

ляет проводить дальнейший сбор данных. Раз%

Далее была произведена сборка макромолеку%

мер субъединиц совпадает с представленными в

лярного комплекса 30S-RbfA, оптимизация ус%

литературе данными [27] и составляет около 15 ×

ловий его дополнительной очистки, непосред%

20 нм. Наличие фактора RbfA на 30S субъедини%

ственно очистка, характеристика и корректная

це, его структуру и локализацию, а также общую

для дальнейших исследований заморозка образ%

долю связавшихся с белком субъединиц будет

ца. Также была проведена предварительная визу%

возможно определить только после обработки и

альная микроскопическая оценка качества полу%

систематизации набора данных.

ченного образца. В результате был получен обра%

зец комплекса RbfA и 30S субъединицы S. aureus

для структурных исследований с помощью мето%

да криоэлектронной микроскопии.

Финансирование. Исследование выполнено

при финансовой поддержке Российского фонда

фундаментальных исследований (проект № 18%

34%00375).

Благодарности. Выражается благодарность

Германской службе академических обменов

(DAAD).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от%

сутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая

статья не содержит исследований с участием

Рис. 6. Микрофотография образца комплекса 30S-RbfA,

людей или использованием животных в качест%

полученная на электронном микроскопе

ве объектов.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020

СБОРКА И ОЧИСТКА КОМПЛЕКСА 30S-RbfA S. aureus in vitro

645

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Lowy, F. D. (1998) Medical progress - Staphylococcus

15.

Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., and Walz, T.

aureus infections, N. Engl. J. Med., 339, 520%532,

(2015) A primer to single%particle cryo%electron

doi: 10.1056/NEJM199808203390806.

microscopy, Cell, 161, 438%449, doi: 10.1016/j.cell.2015.

Kluytmans, J., and Verbrugh, H. (1997) Nasal carriage of

03.050.

Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mecha%

16.

Binshtein, E., and Ohi, M. D. (2015) Cryo%electron

nisms, and associated risks, Clin. Microbiol. Rev., 10, 505%

microscopy and the amazing race to atomic resolution,

520, doi: 10.1128/CMR.10.3.505.

Biochemistry, 54, 3133%3141, doi: 10.1021/acs.biochem.

Le Loir, Y., Baron, F., and Gautier, M. (2003) Staphylococcus

5b00114.

aureus and food poisoning, Genet. Mol. Res., 2, 63%76.

17.

Vonk, J., and Mills, D. J. (2017) Advances in high%resolu%

Cimolai, N.

(2008) MRSA and the environment:

tion cryo%EM of oligomeric enzymes, Curr. Opin. Struct.

Implications for comprehensive control measures, Eur. J.

Biol., 46, 48%54, doi: 10.1016/j.sbi.2017.05.016.

Clin. Microbiol. Infect. Dis., 27, 481%493, doi: 10.1007/

18.

Shimokava%Chiba, N., Muller, C., Fujiwara, K., Beckert, B.,

s10096%008%0471%0.

Koreaki, I., Wilson, D. N., and Chiba, S. (2019) Release

Wilson, D. N. (2014) Ribosome%targeting antibiotics and

factor%dependent ribosome rescue by BrfA in the Gram%

mechanisms of bacterial resistance, Nat. Rev. Microbiol.,

positive bacterium Bacillus subtilis, Nat. Commun., 10,

12, 35%48, doi: 10.1038/nrmicro3155.

5397, doi: 10.1038/s41467%019%13408%7.

Kaczanowska, M., and Rydén%Aulin, M. (2007) Ribosome

19.

Khusainov, I., Vicens, Q., Ayupov, R., Usachev, K.,

biogenesis and the translation process in Escherichia coli,

Myasnikov, A., Simonetti, A., Validov, Sh., Kieffer, B.,

Microbiol. Mol. Biol. Rev., 71, 477%94.

Yusupova, G., Yusupov, M., and Hashem, Y. (2017)

Shajani, Z., Sykes, M. T., and Williamson, J. R. (2011)

Structures and dynamics of hibernating ribosomes from

Assembly of bacterial ribosomes, Annu. Rev. Biochem., 800,

Staphylococcus aureus mediated by intermolecular interac%

521%526, doi: 10.1146/annurev%biochem%062608%160432.

tions of HPF, EMBO J., 36, 2073%2087, doi: 10.15252/

Starosta, A. L., Lassak, J., Jung, K., and Wilson, D. N.

embj.201696105.

(2014) The bacterial translation stress response, FEMS, 38,

20.

Li, X., Sun, Q., Jiang, C., Yang, K., Hung, L., Zhang, J.,

1172%1201, doi: 10.1111/1574%6976.12083.

and Sacchettini, J. C. (2015) Structure of ribosomal

Datta, P. P., Wilson, D. N., Kawazoe, M., Swami, N. K.,

silencing factor bound to Mycobacterium tuberculosis ribo%

Kaminishi, T., Sharma, M. R., Booth, T. M., Takemoto, C.,

some, Structure, 23, 1858%1865, doi: 10.1016/j.str.2015.07.

Fucini, P., Yokoyama, S., and Agrawal, R. K. (2007)

014.

Structural aspects of RbfA action during small ribosomal

21.

Mishra, S., Ahmed, T., Tyagi, A., Shi, J., and Bhushan, S.

subunit assembly, Mol. Cell, 9, 434%445, doi: 10.1016/

(2018) Structures of Mycobacterium smegmatis 70S ribo%

j.molcel.2007.08.026.

somes in complex with HPF, tmRNA, and P%tRNA, Sci.

10.

Xia, B., Ke, H., Shinde, U., and Inouye, M. (2003) The

Rep., 8, 13587, doi: 10.1038/s41598%018%31850%3.

role of RbfA in 16S rRNA processing and cell growth at low

22.

Ayupov, R. Kh., Khusainov, I. Sh., Validov, S. Z.,

temperature in Escherichia coli, J. Mol. Biol, 19, 332, 575%

Yusupova, G. Z., and Yusupov, M. M. (2016) Isolation and

584, doi: 10.1016/S0022%2836(03)00953%7.

purification of Staphylococcus aureus hibernation%promot%

11.

Huang, Y. J., Swapna, G. V., Rajan, P. K., Ke, H., Xia, B.,

ing factor inactivating of the ribosome, Int. J. Pharm.

Shukla, K., Inouye, M., and Montelione, G. T. (2003)

Technol., 8, 14392%14398.

Solution NMR structure of ribosome%binding factor A

23.

Khusainov, I., Vicens, Q., Bochler, A., Grosse, F.,

(RbfA), a cold%shock adaptation protein from Escherichia

Myasnikov, A., Ménétret, J. F., Chicher, J., Marzi, S.,

coli, J. Mol. Biol., 21, 327, 521%536, doi: 10.1016/S0022%

Romby, P., Yusupova, G., Yusupov, M., and Hashem, Y.

2836(03)00061%5.

(2016) Structure of the 70S ribosome from human

12.

Rubin, S. M., Pelton, J. G., Yokota, H., Kim, R., and

pathogen Staphylococcus aureus, Nucleic Acids Res., 44,

Wemmer, D. E. (2003) Solution structure of a putative ribo%

10491%10504, doi: 10.1093/nar/gkw933.

some binding protein from Mycoplasma pneumoniae and

24.

Weiss, R. L., Kimes, B. W., and Morris, D. R. (1973)

comparison to a distant homolog, J. Struct. Funct. Genomics,

Cations and ribosome structure. III. Effects on the 30S and

4, 235%243, doi: 10.1023/b:jsfg.0000016127.57320.82.

50S subunits of replacing bound Mg²⁺ by inorganic cations,

13.

Blokhin, D. S., Bikmullin, A. G., Nurullina, L. I.,

Biochemistry, 12, 450%456.

Garaeva, N. S., Validov, Sh. Z., Klochkov, V. V., Aganov, A. V.,

25.

Guo, F., and Jiang, W. (2014) Single particle cryo%electron

Khusainov, I. Sh., Yusupov, M. M., and Usachev, K. S.

microscopy and 3%D reconstruction of viruses, Methods Mol.

(2018) Backbone and side chain NMR assignments for the

Biol., 1117, 401%443, doi: 10.1007/978%1%62703%776%1_19.

ribosome binding factor A (RbfA) from Staphylococcus

26.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins dur%

aureus, Biomol. NMR Assign., 13, 27%30, doi: 10.1007/

ing the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature,

s12104%018%9845%0.

227, 680%685.

14.

Merino, F., and Raunser, S. (2016) Cryo%EM as a tool for

27.

Vasiliev, V. D. (1974) Morphology of the ribosomal 30S

structure%based drug development, Angew. Chem. Int. Ed.

subparticle according to electron microscopic data, Acta

Engl., doi: 10.1002/anie.201608432.

Biol. Med. Ger., 33, 779%793.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020