БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 6, с. 840 - 848

УДК 577.152.321:577.114.4:57.083.13

СОЗДАНИЕ ПРОДУЦЕНТА ХИТИНАЗЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

EЁ ПРЕПАРАТА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

О.А. Синицына¹*, Е.А. Рубцова², И.Г. Синельников², Д.О. Осипов²,

А.М. Рожкова², В.Ю. Матыс³, Т.В. Бубнова³, В.А. Немашкалов³,

А.С. Середа⁴, Л.А. Щербакова⁵, А.П. Синицын^1,2

¹ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет,

119991 Москва, Россия; электронная почта: oasinitsyna@gmail.com

² ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071 Москва, Россия

³ ФИЦ Пущинский научный центр биологических исследований РАН, Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

⁴ ВНИИ пищевой биотехнологии филиала ФИЦ питания,

биотехнологии и безопасности пищи, 111033 Москва, Россия

⁵ Всероссийский научноAисследовательский институт фитопатологии,

143050 Большие Вязёмы Московской обл., Россия

Поступила в редакцию 16.04.2020

После доработки 18.04.2020

Принята к публикации 18.04.2020

На основе гриба Penicillium verruculosum создан рекомбинантный штамм, комплекс внеклеточных фермен

тов которого содержит хитиназу Myceliophtora thermophila. Активность ферментных препаратов, полученных

из культуральной жидкости штамма продуцента, достигала 0,55, 0,53 и 0,66 ед/мг белка по хитину и хитоза

нам с мол. массой 200 и 1000 кДа соответственно. Оптимумы температуры и рН рекомбинантной хитиназы

составили 52-65 °С и рН 4,5-6,2, что соответствует литературным данным для ферментов этого класса. Со

держание гетерологичной хитиназы в исследованных ферментных препаратах составило 47% от общего со

держания белка в культуральной жидкости. Показано, что новые ферментные препараты, полученные на

основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum ХТ403 и содержащие гетерологичную хитиназу,

способны разрушать мицелий микроскопических, в том числе фитопатогенных грибов, и весьма эффектив

ны в процессах биоконверсии отходов микробиологической промышленности.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хитиназа, хитин, хитозан, Penicillium verruculosum, фитопатогенные грибы, биокон

версия отходов.

DOI: 10.31857/S0320972520060093

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в биотехнологии сущест

вует ряд направлений, в которых используются

Хитиназа (ХТ, эндо 1,4 β поли N ацетил

хитинолитические ферменты. В последнее вре

глюкозаминидаза) является ключевым фермен

мя интенсивно разрабатываются подходы к

том, ответственным за деструкцию хитина и хи

применению этих ферментов для биохимичес

тозана (линейных гомополимеров 1,4 β N аце

кой трансформации хитина в биологически ак

тил D глюкозамина). ХТ эффективно расщеп

тивные хитоолигосахариды, обладающие про

ляет гликозидные связи хитина и хитозана вбли

тивомикробной (антигрибной и антибактери

зи остатков N ацетилглюкозамина (через один

альной), элиситорной, ростостимулирующей,

углеводный остаток), поэтому её активность

противоопухолевой и противовоспалительной

сильно зависит от степени деацетилирования

активностями [1-4]. Кроме того, сами мономе

(СД) субстрата [1].

ры хитина - N ацетилглюкозамин и D глюкоза

мин - также являются физиологически актив

ными веществами [5-7]. Другое современное

Принятые сокращения: ХТ - хитиназа, ФП - фер

направление использования хитиназ - это кон

ментный препарат, КЖ - культуральная жидкость, СД -

степень деацетилирования, ЦБГI - целлобиогидролаза I,

версия отходов хитин содержащего сырья в

ЭГ - эндоглюканаза, КСИЛ - ксиланаза.

микробную и дрожжевую биомассу, белок и био

* Адресат для корреспонденции.

топливо [8-11]. Хитиназы играют ключевую

840

ХИТИНАЗА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРОМИЦЕТОВ

841

роль в комплексе гидролаз, лизирующих кле

ние продуцента ХТ на основе реципиентного

точную стенку грибов, и являются эффектив

штамма Penicillium verruculosum 537 (ΔniaD), об

ным инструментом для выделения протоплас

ладающего высокой секреторной способностью

тов грибных клеток [12, 13].

(до 50-60 г/л внеклеточного белка), в котором

Хитинолитические ферменты имеют фунги

редуцирована репрессия катаболизма глюкозы

цидную, инсектицидную и антипаразитарную

[19-21], и использование полученного фермент

(нематицидную) активности и привлекательны

ного препарата (ФП) для разрушения клеточ

с практической точки зрения для использова

ной стенки микроскопических грибов. В каче

ния их в качестве биопестицидов, которые мог

стве кандидата на клонирование была выбрана

ли бы заменить химические пестициды, массово

хитиназа Myceliophtora thermophyla (ранее

используемые как в открытом грунте, так и в

Chrysosporium lucknowense), поскольку известно,

парниках [4]. Во всех этих случаях функция

что ферменты этого аскомицета обладают ши

ферментов заключается в разрушении хитина,

роким рН и температурным оптимумом актив

входящего в состав клеточной стенки или струк

ности, что существенно облегчает их практичес

турных элементов микроорганизмов, экзоскеле

кое применение [22, 23].

та насекомых и оболочки яиц паразитов. Важ

ную роль хитинолитические ферменты играют

как антимикробные агенты при борьбе с гриб

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ной и бактериальной контаминацией пищевых

и сельскохозяйственных продуктов [14].

Реагенты. Для приготовления ПААГ гелей и

Мицелиальные грибы занимают лидирую

буферных растворов использовали реагенты

щую позицию в качестве объектов биотехноло

фирмы «Bio Rad» (США), «MP Biochemicals

гического производства благодаря высокой про

Inc.» (Франция), «Ferak» (Германия) и «Реахим»

дуктивности при культивировании на дешевых

(Россия). ПААГ гели окрашивали Кумасси

производственных средах и способности к син

бриллиантовым синим R 250В, а в качестве

тезу широкого круга ферментов и таких метабо

маркёров для определения мол. массы белков

литов, как антибиотики, витамины и органичес

использовали набор MW SDS 200 (10-200 кДа)

кие кислоты. Однако в процессе ферментации в

(«ThermoScientific», CША). В качестве калиб

качестве отхода образуется большое количество

ровочного стандарта при определении концен

грибного мицелия - например, в результате

трации белков в растворе методом Лоури и др.

производства лимонной кислоты с помощью

использовали БСА («БелНИИЭМ», Белорус

штамма Aspergillus niger в мире образуется до 0,34

сия).

млн т мицелия в год [15]. Грибная биомасса не

Субстраты. В качестве субстратов при опре

подлежит длительному хранению и служит ис

делении ферментативных активностей исполь

точником загрязнения окружающей среды; наи

зовали натриевую соль карбоксиметилцеллюло

более распространенным способом её утилиза

зы (КМЦ), берёзовый ксилан («Sigma Aldrich»,

ции является сжигание [3, 16]. Хитин является

США) и микрокристаллическую целлюлозу

структурно важным компонентом грибной кле

(МКЦ) («МКЦ Центр», Россия). Хитозан с мол.

точной стенки, его содержание различно у гри

массой 1000 кДа и СД 85%, хитозан с мол. мас

бов разных таксонов и составляет в зависимости

сой 200 кДа и СД 87%, а также коллоидный хи

от систематического положения организма и ус

тин из краба были предоставлены проф. В.П.

ловий культивирования от 0,2 до 26% от сухой

Варламовым (ФИЦ «Биотехнология» РАН).

массы [17]. Весьма перспективным представля

Получение штамма P. verruculosum - продуA

ется способ ферментативной деструкции поли

цента хитиназы. В качестве реципиентного ис

сахаридов клеточной стенки мицелиальных гри

пользовали штамм P. verruculosum B1 537

бов, в первую очередь хитина, который позволя

(ΔniaD), дефектный по гену niaD. Штамм

ет осуществить экологически и экономически

Escherichia coli Mach 1 (ΔrecA1398 endA1 tonA

оправданный процесс переработки биомассы

Φ80ΔlacM15 ΔlacX74 hsdR(r_–m^+K)) («Invitrogen»,

грибного мицелия как отхода микробиологи

США) был использован для клонирования це

ческой промышленности с получением биоло

левых генов, получения и выделения плазмид.

гически ценных компонентов в легкоусвояемой

Плазмида. В составе использованной в рабо

форме [18].

те экспрессионной плазмиды pChi403 целевой

Вышесказанное делает очевидным необхо

ген chi403 (GenBank: XM_0036663496), кодиру

димость создания высокоактивных штаммов

ющий хитиназу M. thermophila, находился под

продуцентов, которые позволят осуществить

контролем гомологичного промотора гена cbh1,

промышленное производство хитинолитичес

кодирующего целлобиогидролазу

1 (ЦБГ1)

ких ферментов. Целью работы является созда

P. verruculosum [23].

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

842

СИНИЦЫНА и др.

Плазмида pChi403 была получена согласно

inearum получали путем их глубинного культи

методу, основанному на амплификации гена

вирования в среде Чапека, на картофельно глю

chi403 методом ПЦР с использованием геном

козной среде (Stagonospora nodorum, Septoria tritiA

ной ДНК штамма M. thermophila в качестве мат

ci) или среде Пайна-Хэглера (Aspergillus flavus)

рицы и пары олигонуклеотидов [24]:

при 220 об/мин и 25-26 °С в течение 7 сут

(Chi403 LIC) 5’ CAAACAGAAGCAACCGA

(Fusarium spp., A. flavus) или 10-12 сут (St. nodorA

CACAATGGGCGGCGGACCTACGGA,

um, S. tritici). Все штаммы, использованные в

(Chi403 LIC) 3’ GAGGAGAAGCCCGGTC

данной части работы, были из Государственной

TAATTGTTCGGGAATCCCTCCCTCA.

коллекции фитопатогенных микроорганизмов и

Клонирование полученного ПЦР продукта

сортов растений идентификаторов патогенных

в вектор pUC CBH обеспечивало экспрессию

штаммов микроорганизмов на базе ВНИИФ

целевого гена chi403 за счёт стабильного интег

(Большие Вязёмы, Московская обл.).

ративного встраивания в хромосому гриба

В конце ферментации грибную биомассу от

P. verruculosum с использованием сайтов незави

деляли фильтрованием через нетканый матери

симого лигирования [25].

ал.

Трансформация штамма реципиента. Реком

Получение ФП. Культивирование отобран

бинантные штаммы серии ХТ403 были получе

ных в качалочных колбах рекомбинантных (и ре

ны в результате трансформации штамма реци

ципиентного) штаммов P. verruculosum осущест

пиента P. verruculosum B1 537 (ΔniaD) плазмидой

вляли в ферментационной установке КФ 108 на

pChi403 [23].

ферментёрах с рабочим объёмом 1 л в ИБФМ

Стандартные процедуры выделения геном

РАН (г. Пущино) в течение 6-7 сут, используя

ной ДНК, выделение ПЦР продуктов из агароз

ферментационную среду следующего состава

ного геля, а также выделение плазмидной ДНК

(%): KH₂PO₄ - 0,7, (NH₄)₂SO₄ × 7H₂O - 0,5,

осуществляли с помощью наборов фирмы

MgSO₄ × 7H₂O - 0,03, CaCl₂ × 2H₂O - 0,023, глю

«Qiagen» (США) по методикам производителя.

коза - 4,0, дрожжевой экстракт - 1,0, пшенич

ПЦР проводили с использованием набора Long

ные отруби - 1,0, МКЦ - 4,0; рН не ниже 4,5,

Polimerase Mix («ThermoScientific», США) на

температура 32,0 ± 0,5 °C, аэрация 1 л/л/мин.

приборе MyCycler («Bio Rad», США) по следую

После окончания процесса культивирования

щей схеме: 94 °С - 3,5 мин - 1 цикл; 94 °С - 30 с,

КЖ отделяли от мицелия гриба продуцента

50 °С - 2 мин, 72 °С - 1 мин - 30 циклов; 72°С -

центрифугированием и подвергали лиофильно

10 мин, 4 °С - 25 мин.

му высушиванию на распылительной сушилке

Культивирование штаммов. Штаммы P. verruA

Mini Spray Dryer B 290 («Buchi», Швейцария).

culosum ХТ403 выращивали на качалках в колбах

Определение ферментативных активностей.

Эрленмейера ёмкостью 750 мл в 100 мл фермен

Активность по отношению к полисахаридным

тационной среды следующего состава

(%):

субстратам (хитозанам, КМЦ, МКЦ, ксилану)

KH₂PO₄ - 1,5, (NH₄)₂SO₄ × 7H₂O - 0,5, MgSO₄ ×

измеряли по начальным скоростям образования

× 7H₂O - 0,03, CaCl₂ × 2H₂O - 0,03, глюкоза -1,0,

восстанавливающих сахаров (ВС) при 50 °С, рН

дрожжевой экстракт-1,0, пшеничные отру

5,0 (0,1 М Na ацетатный буфер) при исходной

би-1,0, МКЦ - 4,0. После культивирования в

концентрации субстрата 5 г/л. ВС определяли

течение 6 сут на качалке при 220 об/мин и 30 °С

модифицированным методом Шомоди-Нель

КЖ отделяли от мицелия центрифугированием

сона [26-28] или с использованием бицинхони

в течение 10 мин при 10 700 g. В КЖ определяли

натного метода (для фракций после хроматогра

концентрацию белка и соответствующие актив

фического фракционирования [29]). За единицу

ности по отношению к коллоидному хитину, хи

активности принимали такое количество фер

тозанам, КМЦ и ксилану.

мента, которое приводит к образованию

Получение биомассы мицелиальных грибов для

1 мкмоль ВС за 1 мин.

разрушения хитиназой. Штамм Aspergillus awamori

Активность по отношению к коллоидному

M2002 (ВКМ F 3771D) культивировали в колбах

хитину определяли двумя способами: модифи

в течение 6 сут при 35 °С в ферментационной сре

цированным феррицианидным методом [30]

де, содержавшей 24% пшеничной муки, обрабо

или по уменьшению светопоглощения суспен

танной термостабильной α амилазой. Штамм

зии хитина при 700 нм [31]. При использовании

Penicillium canescens Pep 4 (ВКМ F 4677D) культи

феррицианидного метода измеряли начальную

вировали в колбах в течение 7 сут при 30 °С в сре

скорость образования ВС (глюкозамина) при

де, в состав которой входили (%): соевая шелуха -

50 °С, рН 5,0 (Na ацетатный буфер); за единицу

4,5, кукурузный экстракт - 5,0, KH₂PO₄ - 2,5.

активности принимали такое количество фер

Биомассу мицелиальных грибов Fusarium

мента, которое приводит к образованию

culmorum, Fusarium sambucinum, Fusarium gramA

1 мкмоль ВС (глюкозамина) за 1 мин. Согласно

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

ХИТИНАЗА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРОМИЦЕТОВ

843

второй методике, реакцию проводили при 37 °С,

держание индивидуальных ферментов в ФП оп

рН 5,0 (Na ацетатный буфер), за единицу хити

ределяли, анализируя данные электрофореза в

назной активности принимали уменьшение све

ПААГ с Ds Na с помощью денситометрии, ис

топоглощения суспензии на 1% от начального её

пользуя программное обеспечение

«Gel

значения на длине волны 700 нм.

Analyser».

Определение концентрации белка. Содержа

Деструкция грибной биомассы. Гидролиз био

ние белка в КЖ и ФП определяли модифициро

массы глубинного мицелия грибов A. awamori,

ванным методом Лоури и др. [32], используя в

P. canescens, F culmorum, F. sambucinum, F. gramiA

качестве стандарта БСА. Содержание белка в

nearum, St. nodorum, S. tritici и A. flavus (расшиф

хроматографических фракциях определяли по

ровано выше, см. раздел «Получение биомассы

светопоглощению при 280 нм, считая средний

мицелиальных грибов для разрушения хитина

коэффициент экстинкции белка равным 2,0.

зой») проводили в стеклянных градуированных

Электрофорез в ПААГ. Электрофорез в 12%

пробирках объемом 10 мл с притертыми пробка

ном ПААГ с Ds Na проводили на приборе

ми в течение 24, 36 или 48 ч при гидромодуле 1 : 10

MiniProtein («Bio Rad», США) согласно руковод

(1 г сырого мицелия на 10 мл дистиллированной

ству к прибору.

воды) при температуре 25-27 °C без перемеши

Хроматографическое фракционирование ФП.

вания. ФП вносили в дозировке 10 мг белка на

Анализ состава ФП проводили по схеме, вклю

1 г сырого мицелия, а результат их действия на

чавшей три стадии: предварительную очистку

грибную биомассу оценивали визуально, изме

ФП, анионообменную и гидрофобную хрома

ряя объем оставшегося осадка по градуирован

тографию. Раствор ФП осаждали (NH₄)₂SO₄

ной шкале пробирки, а также с помощью мик

(80% от насыщения при 25 °С), перерастворяли

роскопирования, используя лабораторный мик

в 0,02 М бис Tris HСl буфере, рН 6,8 и обессо

роскоп Eclipse Ci («Nikon Corporation», Япония).

ливали на колонке с биогелем Р 4, уравнове

шенной с тем же буфером. Последующие стадии

проводили на жидкостном хроматографе NGC

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Chromatography System («Bio Rad», США). Для

анионообменной хроматографии обессоленно

Получение продуцентов хитиназы. Ген chi403

го ФП использовали колонку с носителем

(GenBank AN: NC_016476), кодирующий ХТ M.

Source 15Q («Pharmacia», Швеция), уравнове

thermophile, которая относится к семейству гли

шенную со стартовым буфером 0,02 М бис Tris

козил гидролаз GH18, был клонирован в вектор

HСl, рН 6,8. Элюирование белков вели в линей

pUC CBHI, который обеспечивает экспрессию

ном градиенте концентраций NaCl от 0 до 0,4 М.

целевых генов в реципиентном штамме P. verruA

В полученных фракциях значение рН доводили

culosum B1 537 (ΔniaD) под контролем индуци

до 5,0 с помощью 1,0 М Na ацетатного буфера,

бельного промотора cbh1, кодирующего ЦБГ1.

рН 5,0. Фракции, содержавшие целевые фер

В результате клонирования была получена

менты, подвергали гидрофобной хроматогра

плазмида pChi403, экспрессионная кассета ко

фии на колонке с носителем Source 15 Isopropyl

торой схематично представлена на рис. 1. Плаз

(объём геля 1 мл, «Pharmacia», Швеция), урав

мида pChi403 состояла из гомологичного про

новешенной с 1,7 М раствором (NH₄)₂SO₄ в

мотора и терминатора гена cbh1 гриба P. verrucuA

0,05 М Na ацетатном буфере, рН 5,0. Элюирова

losum и гетерологичного гена chi403, для секре

ние белков вели в линейном градиенте концент

ции XT был использован гомологичный сиг

раций (NH₄)₂SO₄ от 1,7 до 0 М.

нальный пептид ЦБГI.

В полученных фракциях определяли содер

Реципиентный штамм P. verruculosum B1 537

жание белка и активность ферментов по отно

(ΔniaD) был котрансформирован 10 мкг плазми

шению к различным субстратам. Кроме того,

ды pChi403 совместно с 1 мкг плазмиды pSTA10

все фракции исследовали методом электрофо

(niaD). В результате были получены ∼250 транс

реза в ПААГ с Ds Na.

формантов серии ХТ403, что соответствует

Определение состава ФП. Для определения

средней трансформационной частоте мицели

качественного состава ФП сопоставляли дан

альных грибов [33]. Далее случайным образом

ные по активности хроматографических фрак

выбраны 10 трансформантов, которые были пе

ций по отношению к различным субстратам и

ренесены на минимальную селективную среду

результаты их электрофоретического анализа.

[23], а затем проанализированы методом ПЦР

Количественный состав исследуемого ФП был

на наличие целевого гена с использованием

рассчитан как отношение количества фермента

олигонуклеотидов для его амплификации. Все

в гомогенной фракции к суммарному количест

анализируемые трансформанты содержали гете

ву белка в исследуемом образце. Кроме того, со

рологичный ген chi403.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

844

СИНИЦЫНА и др.

Рис. 1. Схематическое изображение экспрессионной кассеты в плазмиде pChi403 с геном chi403, кодирующим ХТ GH18

M. thermophila

Отобранные трансформанты культивирова

P. verruculosum B1 537 (ΔniaD). Удельная актив

ли в качалочных колбах. После завершения фер

ность ФП ХТ403 4 по отношению к хитозанам

ментации в КЖ определяли концентрацию бел

200 и 1000 кДа составила 0,53 и 0,66 ед/мг белка

ка и ферментативную активность по отноше

соответственно, по отношению к коллоидному

нию к коллоидному хитину, хитозанам с мол.

хитину - 0,55 ед/мг. Активность контрольного

массой 200 и 1000 кДа, КМЦ и ксилану. В каче

ФП по отношению к хитозанам с мол. массой

стве контроля использовали КЖ реципиентного

200 и 1000 кДа и хитину составила 0,04, 0,04 и

штамма P. verruculosum B1 537 (ΔniaD). По ре

0,05 ед/мг соответственно.

зультатам измерений был отобран трансфор

Удельная активность рекомбинантного ФП

мант Chi403 4, обладавший максимальной ак

ХТ403 4 по отношению к МКЦ, отражающая

тивностью ХТ (данные не приведены). Этот

целлобиогидролазную активность, снижалась в

трансформант далее культивировали в 1 литро

2,7 раза по сравнению с контролем, что, вероят

вых ферментёрах, и, в конечном итоге, был по

но, связано с недостатком положительных фак

лучен препарат ФП ХТ403 4, представлявший

торов транскрипции в рекомбинантном штамме

собой лиофильно высушенную КЖ.

[34].

Активность рекомбинантного ФП. В получен

Удельная активность эндоглюканазы (ЭГ) по

ном ФП ХТ403 4 было определено содержание

КМЦ и ксиланазы (КСИЛ) по березовому кси

белка и активность по отношению к различным

лану рекомбинантного ФП ХТ403 4 также сни

субстратам (табл. 1). В качестве контроля ис

зилась - в 6,2 и 9,4 раза, соответственно, по

пользовали ФП из КЖ реципиентного штамма

сравнению с контролем.

Таблица 1. Удельная активность ФП по отношению к различным субстратам

Удельная активность, уд/мг

Ферментный

Содержание белка,

препарат

мг/г

ХТЗ 200 кДа*

ХТЗ 1000 кДа**

КХТ***

МКЦ

КМЦ

Ксилан

ХТ403 4

300 ± 16

0,53 ± 0,02

0,66 ± 0,02

0,55 ± 0,02

0,22 ± 0,01

1,70 ± 0,07

1,80 ± 0,07

Контроль

680 ± 25

0,040 ± 0,003

0,050 ± 0,003

0,61 ± 0,02

10,6 ± 0,2

16,9 ± 0,3

* Хитозан 200 кДа.

** Хитозан 1000 кДа.

*** Коллоидный хитин.

Таблица 2. Компонентный состав ФП

Содержание фермента, % общего белка

Ферментный препарат

ХТ

ЦБГ

ЭГ

КСИЛ

Другие

ФП ХТ403 4

Контроль

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

ХИТИНАЗА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРОМИЦЕТОВ

845

турные оптимумы хитиназной активности ре

комбинантного ФП ХТ 403 4, а также стабиль

ность ХТ при различных температурах. Полу

ченные результаты представлены в табл. 3.

Максимальную активность ХТ проявляла при

60 °С и рН 4,7-5,5; область значений темпера

туры и рН, в которой ХТ проявляла 80% актив

ности от максимальной, составила 52-65 °С и

4,5-6,2, что соответствует описанным в литера

туре для ферментов этого класса [1]. ХТ облада

ла достаточно высокой стабильностью в водном

растворе к продолжительному воздействию по

вышенных температур (в растворе): за 3 ч инку

бации при 40 и 50 °С (рН 5) она сохраняла 90 и

83% исходной активности соответственно

Рис. 2. Электрофорез в ПААГ в присутствии Ds Na. 1 -

(табл. 3).

ФП ХТ403 4; 2 - контрольный ФП, полученный с по

Применение ФП ХТ для разрушения грибного

мощью реципиентного штамма B1 537 (ΔniaD)

мицелия. В качестве источника грибного мице

лия использовали A. awamori - промышленный

Состав рекомбинантного ФП. На рис.

продуцент глюкоамилазы, а также P. canescens -

представлены результаты анализа рекомбинант

промышленный продуцент протеаз. Для прове

ного ФП с помощью электрофореза в ПААГ с

дения деструкции мицелия использовали ФП

Ds Na. Видно, что его электрофореграмма отли

ХТ403 4 в дозировке 10 мг белка на 1 г сырой

чается от контрольного ФП наличием хорошо

биомассы грибов. Остаточный объём биомассы

выраженной новой полосы в области 43 кДа, со

мицелия A. awamori поcле 24 ч под действием

ответствующей гетерологичной ХТ, и заметным

препарата ХТ403 4 уменьшался в 2,2 раза,

уменьшением площади полос, соответствующих

P. canescens - ∼ в 2 раза (рис. 3). ФП, получен

ЦБГ1 (66 кДа), ЭГ2 (39 кДа) и КСИЛ (32 кДа).

ный с помощью реципентного штамма В1 537

Изучение компонентного состава рекомби

(ΔniaD), обладающий в основном только целлю

нантного ФП ХТ403 4 проводили путем хрома

тографического фракционирования. Очищен

ный от низкомолекулярных веществ с помощью

Таблица 3. Биохимические характеристики ферментного

гель фильтрации ФП ХТ403 4 подвергали анио

препарата ФП ХТ 403 4 (определены при использовании

нообменной хроматографии на колонке с носи

коллоидного хитина в качестве субстрата)

телем Source 15Q при pH 6,8. Фракции, содер

Измеряемый параметр

Значение параметра

жавшие ХТ, подвергали гидрофобной хроматог

рафии на колонке с носителем Source

рН оптимум активности

4,7-5,5

Isopropyl. Во всех случаях в элюенте определяли

содержание белка и активность ферментов по

рН диапазон активности ≥80%

4,5-6,2

отношению к хитозанам, хитину, КМЦ, МКЦ и

рН диапазон активности ≥50%

3,7-6,5*

ксилану. Кроме того, все фракции анализирова

ли методом электрофореза в ПААГ с Ds Na. На

Температурный оптимум

основании полученных данных было рассчита

активности, °С

но содержание основных компонентов исследу

Температурный диапазон

52-65

емого ФП (табл. 2). Количество гетерологичной

активности ≥80%, °С

ХТ в нём составило 47% от общего содержания

белка. Содержание ЦБГI в ФП ХТ403 4 снизи

Температурный диапазон

45-75

активности ≥50%, °С

лось в 2,3 раза по сравнению с контролем, что

согласуется со снижением удельной активности

Остаточная активность после

90**

по отношению к МКЦ (табл. 1). В рекомбинант

инкубации при 40 °С (рН 5), %

ном ФП ХТ403 4 наблюдали также снижение

содержания ЭГ и КСИЛ, что соответствовало

Остаточная активность после

83**

инкубации при 50 °С (рН 5), %

снижению их удельной активности по отноше

нию к соответствующим специфическим суб

* Измерение активности при значениях рН выше 6,5 для

стратам.

коллоидного хитина затруднительно из за свойств

Термостабильность, рН и температурные оптиA

субстрата.

мумы ФП ХТ. Были определены рН и темпера

** Aктивность через 3 ч инкубации.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

846

СИНИЦЫНА и др.

лолитической активностью (активность ХТ

очень низка, см. табл. 1), никак не влиял на объ

ём биомассы мицелия обоих штаммов (рис. 3).

Результаты, полученные с помощью анализа

остаточного объёма осадка мицелия, подтверж

даются данными микроскопирования (рис. 4),

которые свидетельствуют о деструкции клеточ

ной стенки A. awamori и P. canescens под дейт

ствием ФП ХТ403 4.

ФП ХТ403 4 был использован для разруше

ния мицелия фитопатогенных грибов F. culmorum,

F. sambucinum, F. graminearum, St. nodorum, S. tritici

и A. flavus (условия обработки мицелия препара

том ХТ были такие же, как и использованные для

обработки грибов продуцентов ферментов). Ос

Рис. 3. Остаточный объем мицелия после 24 ч гидролиза

таточный объём биомассы мицелия перечислен

биомассы A. awamori (1) и P. canescens (2) ферментным пре

паратом хитиназы: I - контроль без ФП, II - ХТ403 4,

ных выше фитопатогенов после инкубации с ФП

III - ФП из реципиентного штамма B1 537 (ΔniaD)

ХТ403 4 уменьшался в 2,3, 2,0, 2,3, 2,1, 2,2 и 2,4

Рис. 4. Результаты микроскопирования мицелия грибов A. awamori (a) и P. canescens (б) после 24 ч гидролиза препаратом

хитиназы ХТ403 4, где: 1 - мицелий без ФП; 2 - мицелий, обработанный ХТ403 4; 3 - мицелий, обработанный ФП из

реципиентного штамма B1 537 (ΔniaD)

Рис. 5. Остаточный объем мицелия после 24 ч гидролиза ФП хитиназы ХТ403 4 (1) и ФП из реципиентного штамма

B1 537 (2) биомассы фитопатогенных грибов, где I - F. culmorum , II - F. sambucinum, III - F. graminearum, IV - St. nodorum,

V - S. tritici и VI - A. flavus

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

ХИТИНАЗА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРОМИЦЕТОВ

847

раза, соответственно, по сравнению с контролем

Финансирование. Работа выполнена при под

(рис. 5). Результаты, полученные с помощью ана

держке Министерства науки и высшего образо

лиза остаточного объёма осадка мицелия подтвер

вания (уникальный идентификатор проекта:

ждаются микроскопированием (данные не при

RFMEFI61620X0128).

ведены). Контрольный ФП, полученный с по

Благодарности. В работе использовали обо

мощью реципиентного штамма, никак не влиял

рудование Центра коллективного пользования

на объём биомассы мицелия фитопатогенных

«Промышленные биотехнологии» ФИЦ Био

штаммов.

технологии РАН.

Полученные результаты показали перспек

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

тивность использования ФП ХТ, полученного с

сутствии конфликта интересов в финансовой

помощью экспрессионной системы на базе

или какой либо иной сфере.

P. verruculosum, для эффективной биоконверсии

Соблюдение этических норм. Настоящая

отходов микробиологической промышленнос

статья не содержит описания выполненных ав

ти, а также для разрушения мицелия фитопато

торами исследований с участием людей или ис

генных грибов.

пользованием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Мелентьев А. И., Актуганов Г. Э. (2013) В кн. ФерменA

single cell protein, Biotechnol. Bioeng., 23, 1067 1078,

ты деградации хитина и хитозана. Хитозан (под ред.

doi: 10.1002/bit.260230514.

Г. К. Скрябина, С. Н. Михайлова, В. П. Варламова),

12.

Dahia, N., Tiwari, R., Tiwari, R. P., and Hoondal, G. S.

центр «Биоинженерия» РАН, Москва, с. 71 114.

(2005) Production of an antifungal chitinase from

Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their Derivatives:

Enterobacter sp. NRG4 and its application in protoplast

Biological Activity and Applications (2011) (Kim, S. K., ed.)

production, World J. Microbiol. Biotechnol., 21, 1611 1615,

CRC Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton,

doi: 10.1007/s11274 005 8343 6.

London, N. Y., doi: 10.1201/EBK1439816035.

13.

Johnson, E. A., Villa, T. G., Lewis, M. J., and Phaff, H. J.

Berini, F., Katz, C., Gruzdev, N., Casartelli, M.,

(1979) Lysis of the cell wall of yeast Phaffia rhodozyme by

Tettamanti, G., and Marinelli, F. (2018) Microbial and

lytic complex from Bacillus circulans WL 12, J. Appl.

viral chitinases: attractive biopesticides for integrated pest

Biochem., 1, 273 282.

management, Biotechnol. Adv., 36, 818 828, doi: 10.1016/

14.

Biotransformation of Waste Biomass into High Value

j.biotechadv.2018.01.002.

Biochemicals (2014) (Brar, S. K., Dhillon, G. S., and

Vijayakumar, N., and Alagar, S. (2017) Consequence of

Soccol, C., eds) Springer Verlag, N. Y., p. 504.

chitinase from Trichoderma viride integrated feed on diges

15.

Камзолкина О. В., Дунаевский Я. Е. (2017) Биология

tive enzymes in Corcyra cephalonica (Stainton) and antimi

грибной клетки. Учебное пособие. 2Aе изд., Товарищест

crobial potential, Biosci. Biotech. Res. Asia, 14, 513 519,

во научных изданий КМК, Москва.

doi: 10.13005/bbra/2473.

16.

Kuranda, M. J., and Robbins, P. W. (1991) Chitinase is

Sakai, K., Uchiyama, T., Matahira, Y., and Nanjo, F.

required for cell separation during growth of SaccharoA

(1991) Immobilization of chitinolytic enzymes and contin

myces cerevisiae, J. Biol. Chem., 266, 19707 19758.

uous production of N acetyl D glucosamine with the

17.

Курченко В. П., Буга С. В., Петрашкевич Н. В., Бутке

immobilized enzymes, J. Ferment. Bioeng., 72, 168 172,

вич Т. В., Ветошкин А. А., Демченков Е. Л., Лоды

doi: 10.1016/0922 338X(91)90211 X.

гин А. Д., Зуева О. Ю., Варламов В. П., Бородин О. И.

Saschiwa, H., Fujishima, S., and Yamano, N. (2002)

(2016) Технологические основы получения хитина и

Production of N acetyl D glucosamine from alpha chitin

хитозана из насекомых, Труды БГУ, 11, 110 126.

by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H 2330,

18.

Середа А. С., Великорецкая И. А., Осипов Д. О., Ма

Carbohydr. Res., 337, 761763, doi: 10.1016/s0008

тыс В. Ю., Бубнова Т. В., Немашкалов В. А., Синицы

6215(02)00034 4.

на О. А., Рожкова А. М., Цурикова Н. В., Синицын А. П.

Jain, T., Kumar, H., and Dutta, P. K. (2016) in Chitin and

(2018) Ферментные комплексы для разрушения кле

Chitosan for Regenerative Medicine (Dutta, P. K., ed.) Springer

точной стенки мицелиальных грибов - продуцентов

India, Bangalore, Mumbai, New Delhi, India, p. 279 295.

промышленных ферментов, Известия Уфимского наA

Wang, S. L., Liang, T. W., and Yen, Y. H. (2011) Biocon

учного центра РАН, 3, 31 35.

version of chitin containing wastes for the production of

19.

Патент РФ 2361918.

enzymes and bioactive materials, Carbohydr. Pol., 84, 732

20.

Патент РФ 2378372.

742, doi: 10.1016/j.carbpol.2010.06.022.

21.

Синицын А. П., Короткова О. Г., Рубцова Е. А., Сини

Thadathil, N., and Velappan, S. P. (2014) Recent develop

цына О. А., Кондратьева Е. Г., Середа А. С., Зоров И. Н.,

ments in chitosanase research and its biotechnological

Рожкова А. М. (2019) Конструирование рекомбинант

applications: a review, Food Chem.,

150,

392399,

ных продуцентов ферментных препаратов для кор

doi: 10.1016/j.foodchem.2013.10.083.

мопроизводства с помощью экспрессионной системы

10.

Sakai, K., Yokota, A., Kurokawa, H., Wakayama, M., and

на основе гриба Penicillium verruculosum, БиотехнолоA

Moriguchi, M. (1998) Purification and characterization of

гия, 35, 6 14, doi: 10.21519/0234 2758 2019 35 4 6 14.

three thermostable endochitinases of a noble Bacillus

22.

Bukhtoyarov, F. E., Ustinov, B. B., Salanovich, T. N.,

strain, MH 1, isolated from chitin containing compost,

Antonov, A. I., Gusakov, A. V., Okunev, O. N., and

Appl. Environ. Microbiol., 64, 3397 3402, doi: 10.1128/

Sinitsyn, A. P. (2004) Cellulase complex of the fungus

AEM.64.9.3397 3402.1998.

Chrysosporium lucknowense: isolation and characteristics of

11.

Revah Moiseev, S., and Carroad, P. A. (1981) Conversion

endoglucanases and cellobiohydrolases, Biochemistry

of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to

(Moscow), 69, 542 551.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020

848

СИНИЦЫНА и др.

23.

Merzlov, D. A., Zorov, I. N., Dotsenko, G. S., Denisenko, Y. A.,

29. Zorov, I. N., Dubasova, M. Y., Sinitsyn, A. P., Gusakov, A. V.,

Rozhkova, A. M., Satrutdinov, A. D., Rubtsova, E. A.,

Mytchenko, A. A., Baraznenok, V. A., Gutierrez, B., and

Kondrat’eva, E. G., and Sinitsyn, A. P. (2015) Properties of

Popova, N. N. (1997) Application of the bicinchininic

Enzyme preparations and homogenous enzymes

method of assay for the reducing sugars to determine car

endoglucanase EG2 Penicillium verruculosum and endoglu

boxymethylcellulase activity of cellulases using a

canase LAM Myceliophtora thermophila, Biochemistry

microplate reader, Biochemistry (Moscow), 62, 704 709,

(Moscow), 80, 473 482, doi: 10/1134/S0062979150401122

doi: 10.1134/S0006297910010062.

24.

Semenova, M. V., Gusakov, A. V., Volkov, P. V., Matys, V. Yu.,

30. Синицын А. П., Черноглазов В. М., Гусаков А. В.

Nemashkalov, V. A., Telitsyn, V. D., Rozhkova, A. M., and

(1993) Методы изучения и свойства целлюлолитических

Sinitsyn, A. P. (2019) Enhancement of the enzymatic cel

ферментов. Серия «Биотехнология», 25 (Итоги науки и

lulose saccharification by Penicillium verruculosum mul

техники АН СССР), ВИНИТИ, Москва.

tienzyme cocktails containing homologously overexpressed

31. Decleire, M., De Cat, W., and Tang, V. H. (1996) in Chitin

lytic polysaccharide monooxygenase, Mol. Biol. Rep., 46,

Enzymology (Muzzarelli, R. A. A., ed.) Atec Edizioni,

2363 2370, doi: 10.1007/s11033 019 04693 y.

Glottamare, Italy, 165 169.

25.

Aslanidis, C., and de Jong, J. P. (1990) Ligation indepen

32. Peterson, G. L. (1977) Review of the Folin phenol protein quan

dent cloning of PCR products (LIC PCR), Nucleic Acids

titation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall, Anal.

Res., 18, 6069 6075, doi: 10.1093/nar/18.20.6069.

Biochem., 100, 201 220, doi: 10.1016/0003 2697(79)90222 7.

26.

Nelson, N. A. (1944) Photometric adoption of the

33. Aleksenko, A. Y., Makarova, N. A., Nikolaev, I. V., and

Somogyi method for the determination of glucose, J. Biol.

Clutterbuck, A. J. (1995) Integrative and replicative trans

Chem., 153, 375 379.

formation of Penicillium canescens with a heterologous

27.

Somogyi, M. (1952) Notes on sugar determination, J. Biol.

nitrate reductase gene, Curr. Genet., 28, 474 478, doi:

Chem., 195, 19 23.

10.1007/BF00310818.

28.

Sinitsyna, O. A., Bukhtoyarov, F. E., Gusakov, A. V.,

34. Чулкин А. М., Кислицин В. Ю., Зоров И. Н., Сини

Okunev, O. N., Bekarevich, A. O., Vinetsky, Y. P., and

цын А. П., Рожкова А. М. (2019) Определение копий

Sinitsyn, A. P. (2003) Isolation and properties of major

ности целевых генов карбогидраз в рекомбинантных

components of Penicilium canescens extracellular enzyme

штаммах гриба Penicillium verruculosum, Биотехнология,

complex, Biochemistry (Moscow), 68, 1200 1209.

35, 51 57, doi: 10.21519/0234 2758 2019 35 5 51 57.

DEVELOPMENT OF THE CHITINASE PRODUCER AND USE OF ENZYME

PREPARATION FOR DISRUPTION OF MYCELIAL FUNGAL CELL WALL

О. A. Sinitsyna¹*, Е. A. Rubtsova², I. G. Sinelnikov², D. O. Osipov²,

А. M. Rozhkova², V. Yu. Matys³, T. V. Bubnova³, V. A. Nemashkalov³,

A. S. Sereda⁴, L. A. Tcsherbakova⁵, and А. P. Sinitsyn^1,2

¹ Lomonosov Moscow State University, Chemistry Department, 119991 Moscow, Russia; EAmail: oasinitsyna@gmail.com

² Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology”

of the Russian Academy of Sciences, 119071 Moscow, Russia

³ Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”,

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences,

142290 Pushchino, Moscow Region, Russia

⁴ Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology, 111033 Moscow, Russia

⁵ AllARussian Research Institute of Phytopathology,

143050 Bolshye Vyazemy, Moscow Region, Russia

Received April 16, 2020

Revised April 18, 2020

Accepted April 18, 2020

A recombinant strain producing a complex of extracellular enzymes including chitinase from Myceliophtora therA

mophila was created based on the fungus Penicillium verruculosum. The activity of the enzyme preparations obtained

from the cultural fluid of the producer strain was 0.55, 0.53, and 0.66 U/mg protein with chitin and chitosans with

the molecular weight of 200 and 1000 kDa, respectively. The temperature optimum for the recombinant chitinase

was 52 65°C; the pH optimum was 4.5 6.2, which corresponded to the published data for this class of the enzymes.

The content of heterologous chitinase in the obtained enzyme preparations was 47% of total protein content in the

cultural fluid. Enzyme preparations produced by the recombinant P. verruculosum XT403 strain and containing het

erologous chitinase were able to degrade the mycelium of micromycetes, including phytopathogenic ones, and were

very efficient in the bioconversion of microbiological industry waste.

Keywords: chitinase, chitin, chitosan, Penicillium verruculosum, phytopathogenic fungi, waste bioconversion

БИОХИМИЯ том 85 вып. 6 2020