БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 8, с. 1091 - 1099

УДК 577.352.5

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ ВО ФРАКЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН

ИЗ ГАЛОТОЛЕРАНТНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ Dunaliella maritima

И ЭФФЕКТЫ N,N′ ДИЦИКЛОГЕКСИЛКАРБОДИИМИДА*

Л.Г. Попова**, Д.А. Маталин, Ю.В. Балнокин

ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН,

127276 Москва, Россия; электронная почта: lora_gp@mail.ru

Поступила в редакцию 22.06.2020

После доработки 22.06.2020

Принята к публикации 26.06.2020

В опытах на везикулярных препаратах плазматической мембраны, выделенных из клеток зеленой галотоле

рантной микроводоросли Dunaliella maritima, исследовали влияние N,N′ дициклогексилкарбодиимида

(N,N′(dicyclohexylcarbodiimide, DCCD) - неспецифического ингибитора транспортных систем, функцио

нирующих в биологических мембранах, - на Na⁺ транспортирующую АТФазу Р типа этого организма. Ис

следовали эффекты DCCD на электрогенную/ион транспортирующую функцию фермента и его АТФ гид

ролазную активность. Электрогенную/ион транспортирующую функцию фермента регистрировали с по

мощью потенциал чувствительного зонда оксонол VI по Na⁺ зависимой генерации электрического потен

циала на везикулярных мембранах. Найдено, что, в отличие от множества других ион транспортирующих

АТФаз, Na⁺ АТФаза D. maritima нечувствительна к действию DCCD. Этот агент не подавлял ни гидролиз

АТФ, катализируемый данным ферментом, ни его транспортную активность. Вместе с тем, DCCD влиял на

способность везикулярных мембран поддерживать электрический потенциал, создаваемый Na⁺ АТФазой

D. maritima. Наблюдаемые эффекты объясняются, исходя из предположения, что DCCD взаимодействует с

Na⁺/Н⁺ антипортером в плазматической мембране D. maritima.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Dunaliella maritima, Na⁺ АТФаза, N,N′ дициклогексилкарбодиимид, микроводорос

ли, мембранный потенциал, плазматическая мембрана.

DOI: 10.31857/S0320972520080084

ВВЕДЕНИЕ

обеспечивает движущую силу для процессов

пассивной диффузии других ионов, а также про

Животные и растительные клетки различа

цессов вторично активного ко транспорта раз

ются по способу энергизации плазматической

личных веществ через мембрану. В раститель

мембраны. В животных клетках основную роль

ных клетках транспортные процессы на плазма

в энергизации клеточной мембраны играет ак

тической мембране обусловлены наличием про

тивный транспорт Na⁺ и K⁺, осуществляемый

тонного градиента, который создает электро

Na⁺, K⁺ АТФазой. Этот фермент поддерживает

генная H⁺ помпа - H⁺ АТФаза [3]. Она выводит

неравновесное распределение Na⁺ и K⁺ по обе

протоны из клетки в окружающую среду/апоп

стороны мембраны и создает отрицательный со

ласт с затратой метаболической энергии, что

стороны цитоплазмы электрический потенциал

также сопровождается генерацией на мембране

на мембране [1, 2]. Создаваемый АТФазой гра

отрицательного со стороны цитоплазмы элект

диент электрохимического потенциала Na⁺

рического потенциала.

Однако и у представителей растительного

царства - галотолерантных зеленых микроводо

Принятые сокращения: CCCP - карбонилцианид m

хлорфенилгидразон (carbonyl cyanide m chlorophenylhydra

рослей Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima - в

zone); DCCD - N,N′ дициклогексилкарбодиимид (N,N′

плазматической мембране были обнаружены

электрогенные Na⁺ помпы [4, 5]. Na⁺ помпы

dicyclohexylcarbodiimide); ETH157 - sodium ionophore II

(N,N′ dibenzyl N,N′ diphenyl 1,2 phenylenedioxydiac микроводорослей принадлежат семейству АТ

etamide); Δψ - трансмембранный электрический потенци

Фаз Р типа, к которому также относятся про

ал; ПМ - плазматическая мембрана.

тонная помпа высших растений и Na⁺, K⁺ АТ

* Первоначально английский вариант рукописи опублико

Фаза животных клеток [6, 7]. Интересно отме

ван на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.

тить, что у данных видов микроводорослей Na⁺

msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20 173,

30.07.2020.

АТФазы в плазмалемме сосуществуют с H⁺

** Адресат для корреспонденции.

помпами - АТФазами Р типа, что было показа

1091

1092

ПОПОВА и др.

но в экспериментах на выделенных из клеток

включая АТФазы разных типов: F типа [15-17],

водорослей везикулярных препаратах плазмати

V типа [18, 19], P типа [20, 21]. Хорошо установ

ческой мембраны [5, 8]. Эти эксперименталь

лен механизм подавления транспортной актив

ные данные согласуются с результатами, полу

ности белков этим ингибитором. DCCD - кар

ченными при анализе секвенированных гено

боксилмодифицирующий агент, который кова

мов зеленых (Chlophyta) микроводорослей

лентно связывается с определенным аминокис

Ostreococcus tauri и Chlamydomonas reinhardtii, ко

лотным остатком (как правило, это Glu или Asp)

торые также показывают сосуществование у

в трансмембранном участке транспортной сис

этих организмов Na⁺ АТФаз и H⁺ АТФаз Р ти

темы, в сайте, по которому осуществляется свя

па [9].

зывание переносимого катиона, и тем самым

Зеленые микроводоросли рода Dunaliella

ингибирует активность транспортной системы

являются удобными модельными объектами в

[15, 19].

исследованиях физиологии устойчивости рас

В данной работе представлены результа

тительных организмов к абиотическим стрес

ты экспериментов по исследованию возможно

сам. Они способны выдерживать экстремаль

го взаимодействия Na⁺ АТФазы D. maritima

ные условия окружающей среды, включая вы

с DCCD, а именно: исследовали влияние

сокую соленость [10]. У этих водорослей отсут

DCCD на электрогенную/ион транспортирую

ствует крупная центральная вакуоль, и, следо

щую функцию этого фермента и его АТФ гид

вательно, за ионное гомеостатирование цитоп

ролазную активность. Эксперименты проведе

лазмы отвечают исключительно механизмы,

ны на обогащенной плазматической мембраной

локализованные в плазматической мембране. В

(ПМ) фракции мембранных везикул, выделен

частности, у галотолерантной микроводоросли

ных из клеток D. maritima.

Dunaliella maritima в плазматической мембране

обнаружена электрогенная Na⁺ транспортиру

ющая АТФаза, которая, по видимому, и отве

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

чает за Na⁺ гомеостатирование клеток этой во

доросли [5]. Представленная работа продолжа

Объект исследования и условия выращивания.

ет исследование свойств Na⁺ АТФазы D. mariti(

Исследования проводили на зеленой галотоле

ma.

рантной микроводоросли Dunaliella maritima

В первичной структуре Na⁺ транспортирую

Massjuk [22]. Водоросль культивировали в одно

щих мембранных белков отсутствуют консерва

литровых стеклянных цилиндрах (средняя тол

тивные последовательности, ответственные за

щина слоя суспензии водорослей 5 см) в среде

связывание ионов Na⁺, а способность к перено

следующего состава (мМ): NaCl - 500, NaNO₃ -

су Na⁺ обусловлена особенностями трехмерной

10, KH₂PO₄ - 5, MgSO₄ - 6, Ca(NO₃)₂- 1,5,

архитектуры белков. В трансмембранной облас

FeSO₄ - 0,01, EDTA - 0,1, раствор микроэле

ти она консервативна и сходна со структурой

ментов по Абдуллаеву и Семененко [23] в коли

краун эфира, где роль центрального координи

честве 1мл/л; pH доводили до 8,0 раствором

рующего иона играет Na⁺ [11, 12]. Для формиро

NaOH. Культуру непрерывно продували возду

вания подобной структуры, способной избира

хом с 1,5% ной CO₂ и освещали белым светом

тельно связывать ионы Na⁺, могут быть важны

люминесцентных ламп ЛБ 20 при освещеннос

ми отдельные аминокислотные остатки, зани

ти 15 000 лк 14 ч в сутки.

мающие соответствующее положение в белке.

Выделение везикул плазматической мембраны

На примере Na⁺,К⁺ АТФазы животных клеток и

из клеток D. maritima. Выделение везикул плаз

Na⁺ специфичных бактериальных F₁F₀ АТФаз

матической мембраны (ПМ) из клеток микро

установлено, что специфичность этих фермен

водоросли осуществляли согласно методу, опи

тов по отношению к переносимым катионам

санному в работе [5]. Мембранную фракцию,

может быть изменена единичными аминокис

обогащенную плазмалеммой, получали диффе

лотными заменами в белке [13, 14]. Первым ша

ренциальным центрифугированием и центри

гом в идентификации подобных аминокислот

фугированием в ступенчатом (30/38%) сахароз

ных остатков может быть исследование взаимо

ном градиенте. Во всех экспериментах, включая

действия белка с определенными ингибитора

определение АТФ гидролазной активности

ми, механизм действия которых известен. При

фермента, использовали свежевыделенную

мером подобного ингибитора является N,N′

фракцию ПМ.

дициклогексилкарбодиимид (N,N′(dicyclohexyl

Полученные препараты ПМ водоросли

carbodiimide, DCCD) - неспецифический инги

представляли смесь инвертированных (цитоп

битор различных транспортных систем, функ

лазматическая сторона обращена в наружную

ционирующих в биологических мембранах,

среду) и нормально ориентированных везикул.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ Dunaliella maritima

1093

В экспериментах наблюдали активность только

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

инвертированных везикул, в которых активные

центры АТФазы были экспонированы в наруж

В плазматической мембране микроводорос

ную среду

ли D. maritima функционирует электрогенная

Регистрация электрогенной активности Na⁺

Na⁺ транспортирующая АТФаза, как было по

АТФазы D. maritima. Электрогенную активность

казано ранее в экспериментах на выделенных из

Na⁺ АТФазы в выделенных везикулах ПМ реги

клеток водоросли везикулах ПМ [5]. Работу

стрировали по Na⁺ и АТФ зависимой генера

электрогенной Na⁺ АТФазы D. maritima иллю

ции электрического потенциала на везикуляр

стрирует рис. 1, а. Внесение АТФ в суспензию

ной мембране, как это описано в работе [5]. Ге

везикул ПМ индуцирует генерацию электричес

нерацию электрического потенциала на везику

кого потенциала (Δψ) на везикулярных мембра

лярной мембране наблюдали по изменениям

нах, обусловленную работой H⁺ АТФазы D.

дифференциальной абсорбции (А₆₂₁-А₅₈₂) по

maritima [5]. Добавка ионов Na⁺ приводит к су

тенциал чувствительного оптического зонда ок

щественной стимуляции генерации Δψ на вези

сонол VI. Измерения, осуществляемые в дву

кулярных мембранах, которая, очевидно, обус

волновом режиме (длина волны измерения λ₂ =

ловлена переносом ионов Na⁺ в везикулярный

621, длина волны сравнения λ₁ = 582 нм), прово

люмен, осуществляемым Na⁺ АТФазой. Генера

дили с помощью спектрофотометра Hitachi 557.

ция Δψ на везикулах ПМ может быть индуциро

Стандартная реакционная среда (в спектрофо

вана также Li⁺, но не K⁺ (не представлено). По

тометрической кювете объемом 2 мл) имела сле

добная ионная специфичность характерна для

дующий состав: 0,4 М сахароза, 5 мМ MgSO₄,

многих мембранных Na⁺ транспортирующих

1 мМ EGTA, 20 мМ Mes/BTP буфер, рН 7,5,

механизмов, которые, наряду с ионами Na⁺,

2 мкМ оксонол VI, ∼100 мкг мембранного белка.

способны переносить и Li⁺ [26, 27].

Генерацию электрического потенциала на вези

В отсутствие ионов Na⁺ внесение DCCD в

кулярных мембранах инициировали внесением

реакционную смесь в ходе АТФ зависимой гене

АТФ (конечная концентрация 2 мМ; АТФ ис

рации Δψ на везикулярных мембранах приводи

пользовали в форме Тris соли) и ионов Na⁺ (в

ло к распаду сформированного потенциала (рис.

виде Na₂SO₄).

1, б, трек 1). Однако при добавлении DCCD к

Аналитические методы. АТФ гидролазную

суспензии везикул ПМ в ходе АТФ и Na⁺ зави

активность мембранных фракций определяли

симой генерации Δψ, скорость генерации Δψ не

по высвобождению P_i из добавленного АТФ.

только не уменьшалась (чего следовало бы ожи

Гидролиз АТФ фракциями ПМ осуществлялся в

дать при ингибировании Na⁺ зависимой АТФа

среде следующего состава: 0,4 М сахароза,

зы), а даже возрастала (рис. 1, б, трек 2).

20 мМ Mes/BTP буфер (рН 5,5-9,0), 1 мМ

Известно, что переносимый ион защищает

MgSO₄, 1 мМ EGTA, 50 мкМ СССР, 10-15 мкг

транспортную систему от ингибирования

мембранного белка. Реакцию инициировали

DCCD [16, 17, 28]. Для того, чтобы предотвра

внесением 0,5 мМ Na₂АТФ и останавливали че

тить возможное протекторное действие ионов

рез 20 мин. Остальные добавки указаны в под

Na⁺ на Na⁺ АТФазу, везикулы ПМ предвари

писи к рисунку. Высвобожденный P_i определяли

тельно инкубировали с DCCD в течение 15 мин

по методу Carter и Karl [24].

в отсутствие Na⁺, после чего генерацию Δψ на

Белок в получаемых препаратах определяли

везикулярной мембране индуцировали последо

методом Simpson и Sonne [25] для определения

вательным внесением АТФ и Na⁺. В этом слу

микроколичеств белка в мембранных фракци

чае, в зависимости от концентрации присут

ях. Метод основан на дезинтеграции мембран

ствующего в реакционной смеси DCCD, на

в щелочной среде и определении интенсивнос

чальная скорость АТФ и Na⁺ индуцируемой ге

ти окрашивания комплекса белок Кумасси

нерации Δψ также возрастала (рис. 2, а, б), но

G 250.

величина Δψ, создаваемого Na⁺ АТФазой на

В работе использовали свежеприготовлен

мембране везикул, уменьшалась (рис. 2, а, в).

ные спиртовые растворы DCCD. Конечная кон

Возрастание начальной скорости генерации

центрация вносимого с DCCD этанола в реак

Δψ говорит об отсутствии ингибирующего

ционных смесях при измерениях активности

действия DCCD на Na⁺ АТФазу. Последнее

АТФазы не превышала 0,2%. Контрольные ва

подтверждается результатами экспериментов по

рианты содержали этанол в таких же концентра

исследованию АТФ гидролазной активности

циях.

этого фермента.

На рисунках и графиках представлены дан

Фракция ПМ D. maritima катализирует гид

ные репрезентативных экспериментов из (по

ролиз АТФ в широком диапазоне рН; АТФ гид

крайней мере) трех независимых повторностей.

ролазную активность Na⁺ АТФазы отражает

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

1094

ПОПОВА и др.

Рис. 1. АТФ и Na⁺ зависимая генерация электрического потенциала на везикулах плазматической мембраны D. maritima.

Эффекты DCCD. О генерации электрического потенциала (Δψ) на везикулярных мембранах («+» в везикулярном люме

не) свидетельствует уменьшение дифференциальной абсорбции потенциал чувствительного зонда оксонол VI. Генера

цию Δψ инициировали добавлением АТФ (в форме Тris соли) до конечной концентрации 1 мМ. Моменты внесения до

бавок отмечены стрелками. а - Исходно: стандартная реакционная среда без Na⁺. Добавка Na⁺ (в виде 10 мМ Na₂SO₄) ус

коряет генерацию Δψ (аналогичный эффект наблюдается при внесении Li⁺). Протонофор СССР (50 мкМ) или проника

ющий анион NO_3- (50 мМ, в форме соли BTP^.NO₃, pH 7,5) возвращают дифференциальную абсорбцию зонда к исходно

му уровню, что говорит о распаде сформированного Δψ (соответственно вследствие выхода Н⁺ из везикул или вследствие

компенсации избыточного положительного заряда внутри везикул анионом); б - эффекты DCCD (100 мкМ), добавлен

ного в реакционную смесь в ходе генерации Δψ на везикулярных мембранах. Трек 1: стандартная реакционная среда без

Na⁺. Трек 2: стандартная реакционная среда содержала Na⁺ (в виде 1 мМ Na₂SO₄)

Na⁺ стимулируемый прирост гидролиза АТФ,

Уменьшение стационарной величины Δψ,

максимум которого наблюдается при рН 7,5-8,0

создаваемого Na⁺ АТФазой на мембране вези

(рис. 3, a, кривая 2). Преинкубация везикул ПМ

кул, преинкубированных с DCCD, может объ

с DCCD до добавления АТФ и Na⁺ не приводит

ясняться увеличением ионной проводимости

к существенным изменениям величины Na⁺

мембраны вследствие взаимодействия DCCD с

стимулируемого прироста гидролиза АТФ (рис.

каким то другим (не Na⁺ АТФазой) ион транс

3, а, сравнить попарно кривые 1 и 2, кривые 3 и

портирующим белком в ПМ D. maritima. Воз

4; рис. 3, б). Последнее, очевидно, свидетель

можными претендентами на эту роль являются

ствует об отсутствии ингибирования Na⁺ АТФа

Н⁺ АТФаза и/или Na⁺/H⁺ антипортер, которые

зы этим агентом.

также функционируют в этой мембране [5, 29].

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ Dunaliella maritima

1095

Как Н⁺ АТФаза, так и Na⁺/H⁺ антипортер могут

мембране при внесении Na⁺, быстро и самопро

взаимодействовать с DCCD [30-32].

извольно распадался (рис. 4, б). Если на мембра

Предположение о том, что преинкубация ве

не везикул, преинкубированных с DCCD, соз

зикул ПМ с DCCD приводит к увеличению ион

давали K⁺ диффузионный потенциал, послед

ной проводимости мембраны, было проверено в

ний достаточно долго сохранялся и распадался

экспериментах, где электрический потенциал

только при внесении протонофора CCCP (рис.

на везикулярной мембране создавали АТФ не

4, в). Вместе с тем, K⁺ диффузионный потенци

зависимым образом в виде Na⁺ или K⁺ диффу

ал, созданный на везикулах ПМ, преинкубиро

зионного потенциала, внося в суспензию вези

ванных с DCCD, распадался при добавлении

кул катион и соответствующий ионофор -

ионов Na⁺ (рис. 4, г). Эти результаты приводят к

ETH157 для Na⁺ и валиномицин для K⁺(рис. 4).

выводу, что диссипация электрического потен

DCCD, добавленный к везикулам, на мемб

циала на везикулярных мембранах, преинкуби

ране которых предварительно был создан Na⁺

рованных с DCCD, зависит от наличия Na⁺ в ре

диффузионный потенциал, не оказывал види

акционной смеси.

мого влияния на последний (рис. 4, а). Однако

Отметим, что в описанных экспериментах

если везикулы были преинкубированы с DCCD

электрический потенциал на везикулярных

до добавления Na⁺, Na⁺ диффузионный потен

мембранах распадался вследствие выхода из ве

циал, который формировался на везикулярной

зикулярного люмена катионов, отличных от Na⁺

Рис. 2. Влияние DCCD на создаваемый Na⁺ АТФазой на везикулах ПМ D. maritima электрический потенциал. Везикулы

инкубировали (15 мин, 22 °С) в стандартной реакционной смеси, содержащей DCCD, после чего инициировали генера

цию Δψ последовательным добавлением АТФ и Na⁺ (10 мМ Na₂SO₄). а - Кинетика генерации Δψ в отсутствие DCCD

(трек 1) и в присутствии 300 мкМ DCCD (трек 2). Зависимость начальной скорости генерации Δψ (б) и стационарной ве

личины создаваемого Δψ (в) от концентрации DCCD, присутствующего в реакционной смеси

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

1096

ПОПОВА и др.

Рис. 3. рН Зависимость гидролиза АТФ фракциями плазматической мембраны (ПМ) D. maritima и эффекты DCCD.

а - Стандартная реакционная среда содержала дополнительно: 1 (светлые кружки) - 25 мМ KNO₃; 2 (черные кружки) -

25 мM NaNO₃; 3 (светлые квадраты) - 25 мM KNO₃, 100 мкМ DCCD; 4 (черные квадраты) - 25 мM NaNO₃, 100 мкМ

DCCD. В вариантах с DCCD везикулы были преинкубированы в стандартной реакционной среде, содержащей дополни

тельно DCCD, в течение 15 мин до добавления Na⁺ и АТФ; б - Na⁺ индуцируемое увеличение гидролиза АТФ фракция

ми ПМ в отсутствие (кривая 1, черные кружки) и в присутствии DCCD (кривая 2, светлые квадраты)

(или соответственно K⁺), поскольку в присут

ком/белками везикулярной мембраны; 3) Na⁺

ствии ETH157 (соответственно валиномици

защищает этот белок от взаимодействия с

на), обеспечивающего высокую проводимость

DCCD; 4) взаимодействие DCCD c этим белком

везикулярной мембраны для Na⁺ (или K⁺), пос

приводит к увеличению Н⁺ проводимости вези

ледний находится в состоянии электрохимичес

кулярной мембраны, причем последнее требует

кого равновесия по обе стороны везикулярной

наличия ионов Na⁺; 5) для осуществления

мембраны («+» внутри везикул) и, следователь

DCCD индуцируемой Na⁺ зависимой Н⁺ про

но, отсутствуют движущие силы для выхода Na⁺

водимости мембраны необходимо также нали

(или K⁺) из везикул. Наиболее вероятно, что в

чие электрического потенциала на мембране.

данном случае избыточный положительный за

Наиболее очевидным является предположе

ряд из везикулярного люмена уносит протон,

ние, что наблюдаемые эффекты обусловлены

движущей силой для выхода которого служит

взаимодействием DCCD с Na⁺/Н⁺ антипорте

Na⁺ диффузионный (или K⁺ диффузионный)

ром в ПМ D. maritima. Последний способен свя

потенциал. Путь утечки Н⁺, очевидно, форми

зывать и переносить через мембрану как Na⁺,

руется вследствие взаимодействия DCCD с не

так и Н⁺. Взаимодействие с DCCD приводит к

которым белком/белками везикулярной мемб

тому, что антипортер сохраняет способность пе

раны и является потенциал зависимым, пос

реносить Н⁺, но не Na⁺. Тем не менее, наличие

кольку Na⁺ диффузионный потенциал мог быть

иона Na⁺, вероятно, связанного в определенном

создан на мембране везикул, преинкубирован

сайте белка, необходимо для осуществления пе

ных с DCCD, и лишь при достижении опреде

реноса Н⁺. Другими словами, при взаимодей

ленной величины потенциала начинался его

ствии с DCCD электронейтральный Na⁺/Н⁺ ан

распад (рис. 4, б).

типортер из катион обменного механизма прев

Таким образом, полученные данные свиде

ращается в потенциал чувствительный Н⁺ уни

тельствуют о том, что: 1) Na⁺ АТФаза D. mariti(

портер.

ma нечувствительна к DCCD; 2) в отсутствие

Остается открытым вопрос, почему на вези

ионов Na⁺ DCCD взаимодействует с неким бел кулах ПМ D. maritima, преинкубированных с

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

1098

ПОПОВА и др.

DCCD, начальная скорость генерации потенци

phyta, класс Chlorophyceae) функционирует пер

ала при добавлении АТФ и Na⁺ увеличивается

вичный Na⁺ насос, электрогенная Na⁺ транс

(рис. 2, б), при том, что DCCD не оказывает сти

портирующая АТФаза Р типа, которая опреде

мулирующее действие на АТФ гидролазную ак

ляет Na⁺ гомеостаз у этого организма [5]. Най

тивность Na⁺ АТФазы (рис. 3).

дено, что, в отличие от множества других ион

Одним из возможных объяснений этого яв

транспортирующих АТФаз, этот фермент явля

ления может быть следующее. По видимому,

ется нечувствительным к действию DCCD.

Na⁺/H⁺ антипортер не единственный белок в

DCCD не подавляет ни гидролиз АТФ, катали

ПМ D. maritima, с которым связывается DCCD.

зируемый данным ферментом, ни его транспорт

DCCD может связаться с H⁺ помпой, функцио

ную активность. По своей нечувствительнос

нирующей в этой мембране. Известно, что

ти к действию DCCD Na⁺ АТФаза D. maritima

DCCD инактивирует Н⁺ АТФазу, блокируя

сходна с Na⁺ АТФазой другой галотолерантной

транслокацию протонов этим ферментом [15,

микроводоросли, Tetraselmis viridis (отд.

19, 30]. Таким образом, взаимодействие DCCD с

Chlorophyta, класс Prasinophyceae) [4]. Для Na⁺

Н⁺ АТФазой (а также, вероятно, и с определен

АТФазы T. viridis также ранее было продемон

ными ионными каналами) приводит к уменьше

стрировано, что DCCD не оказывает ингибиру

нию общей протонной проводимости мембра

ющее действие на этот фермент [8]. Нечувстви

ны, что, в свою очередь, в условиях эксперимен

тельность Na⁺ транспортирующих АТФаз, най

та приводит к снижению ионных (протонных)

денных у двух видов водорослей, к DCCD мо

утечек из везикулярного люмена и росту вели

жет отражать структурное сходство этих фер

чины электрического потенциала, генерируемо

ментов, обусловленное их эволюционной бли

го на везикулярной мембране при включении

зостью.

Na⁺ АТФазы. По мере работы Na⁺ АТФазы, при

достижении определенных значений Δψ на ве

зикулярной мембране, протонная проводимость

Финансирование. Работа выполнена при фи

мембраны резко возрастает вследствие увеличе

нансовой поддержке РФФИ (грант

2004

ния протонной проводимости Na⁺/Н⁺ антипор

00903).

тера, который, предположительно, в результате

Конфликт интересов. У авторов отсутствует

взаимодействия с DCCD превратился из элект

конфликт интересов в финансовой или какой

ронейтрального катион обменного механизма в

либо иной сфере.

потенциал чувствительный Н⁺ унипортер.

Соблюдение этических норм. Настоящая

статья не содержит описания выполненных ав

В плазматической мембране галотолерант

торами исследований с участием людей или ис

ной микроводоросли D. maritima (отдел Chloro пользованием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Boldyrev, A. A. (2001) Na/K ATPase as an oligomeric

8. Pagis, L. Y., Popova, L. G., Andreev, I. M., and Balnokin, Y. V.

ensemble, Biochemistry (Moscow), 66, 821 831, doi: 10.1023/

(2003) Comparative characterization of the two primary

a:1011964832767.

pumps, H⁺ ATPase and Na⁺ ATPase, in the plasma mem

Scheiner Bobis, G. (2002) The sodium pump, Eur. J.

brane of the marine alga Tetraselmis viridis, Physiol. Plant.,

Biochem.,

269,

24242433, doi:

10.1046/j.1432

118, 514 522, doi: 10.1034/j.1399 3054.2003.00113.x.

1033.2002.02909.x.

9. Pedersen, Ch. N. S., Axelsen, K. B., Harper, J. F., and

Gaxiola, R. A., Palmgren, M. G., and Schumacher, K.

Palmgren, M. G. (2012) Evolution of plant P type

(2007) Plant proton pumps, FEBS Lett., 581, 2204 2214,

ATPases, Front. Plant Sci., 3, doi: 10.3389/fpls.2012.00031.

doi: 10.1016/j.febslet.2007.03.050.

10. Oren, A. (2005) A hundred years of Dunaliella research:

Balnokin, Y. V., and Popova, L. G. (1994) The ATP driven

1905 2005, Saline Systems, 1, 1 14, doi: 10.1186/1746

Na⁺ pump in the plasma membrane of the marine unicel

1448 1 2.

lular alga Platymonas viridis, FEBS Lett., 343, 61 64,

11. Gouaux, E., and MacKinnon, R. (2005) Principles of

doi: 10.1016/0014 5793(94)80607 1.

selective ion transport in channels and pumps, Science,

Popova, L. G., Shumkova, G. A., Andreev, I. M., and

310, 1461 1465, doi: 10.1126/science.1113666.

Balnokin, Y. V. (2005) Functional identification of electro

12. Meier, T., Krah, A., Bond, P. J., Pogoyelov, D., Diederichs, K.,

genic Na⁺ translocating ATPase in the plasma membrane

and Faraldo Gomez, J. D. (2009) Complete ion coordina

of the halotolerant microalga Dunaliella maritima, FEBS

tion structure in the rotor ring of Na⁺ dependent F ATP

Lett., 579, 5002 5006, doi: 10.1016/j.febslet.2005.07.087.

synthases, J. Mol. Biol., 391, 498 507, doi: 10.1016/

Axelsen, K., and Palmgren, M. G. (1998) Evolution and

j.jmb.2009.05.082.

substrate specificities in the P type ATPase superfamily, J.

13. Imagawa, T., Yamamoto, T., Kaya, Sh., Sakaguchi, K., and

Mol. Evol., 46, 84 101, doi: 10.1007/pl00006286.

Taniguchi, K. (2005) Thr 774 (transmembrane segment

Palmgren, M. G., and Nissen, P. (2011) P type ATPases,

M5), Val 920 (M8), and Glu 923 (M9) are involved in

40, 243 266, doi: 10.1146/annurev.biophys.093008.131331.

Na⁺ transport, and Gln 923 (M8) is essential for Na⁺,K⁺

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020

ЭЛЕКТРОГЕНЕЗ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ Dunaliella maritima

1099

ATPase activity, J. Biol. Chem., 280, 1873618744,

prospects for its potential utilization, Naukova Dumka,

doi: 10.1074/jbc.M500137200.

Kiev, p. 244.

14.

Kaim, G., and Dimroth, P. (1994) Construction, expres

23. Abdullaev, A. A., and Semenenko, V. E. (1974) Intensive

sion and characterization of a plasmid encoded Na⁺ spe

cultivation and certain physiological characteristics of

cific ATPase hybrid consisting of Propionigenium modestum

Dunaliella salina Teod., Soviet Plant Physiol., 21, 947 955.

F_o ATPase and Escherichia coli F₁ ATPase, Eur. J.

24. Carter, S. G., and Karl, D. W. (1982) Inorganic phosphate

Biochem., 222, 615 623, doi: 10.1111/j.1432 1033.1994.

assay with malachite green: an improvement and evalua

tb18904.x.

tion, J. Biochem. Biophys. Methods, 7, 7 13, doi: 10.1016/

15.

Toei, M., and Noji, H. (2013) Single molecule analysis of

0165 022x(82)90031 8.

F₀F₁ ATP synthase inhibited by N,N′ dicyclohexylcar

25. Simpson, I. A., and Sonne, O. (1982) A simple, rapid and

bodiimide, J. Biol. Chem., 288, 25717 25726, doi: 10.1074/

sensitive method for measuring protein concentration in

jbc.M113.482455.

subcellular membrane fractions prepared by sucrose densi

16.

Ferguson, S., Keis, S., and Cook, G. M.

(2006)

ty ultracentrifugation, Anal. Biochem., 119, 424427,

Biochemical and molecular characterization of a Na⁺

doi: 10.1016/0003 2697(82)90608 x.

translocating F₁F₀ ATPase from the thermoalkaliphilic

26. Krulwich, T. A. (1983) Na⁺/H⁺ antiporters, Biochim. Biophys.

bacterium Clostridium paradoxum, J. Bacteriol., 188, 5045

Acta, 726, 245 264, doi: 10.1016/0304 4173(83)90011 3.

5054, doi: 10.1128/JB. 00128 06.

27. Pagis, L. Ya., Popova, L. G., Andreev, I. M., and

17.

Soontharapirakkul, K., and Incharoensakdi, A.

(2010)

Balnokin, Yu. V. (2001) Ion specificity of Na⁺ transporting

Na⁺ stimulated ATPase of alkaliphilic halotolerant

systems in the plasma membrane of the halotolerant alga

cyanobacterium Aphanothece halophytica translocates Na⁺

Tetraselmis (Platymonas) viridis, Russ. J. Plant Physiol., 48,

into proteoliposomes via Na⁺ uniport mechamism, BMC

281 286, doi: 10.1023/A:1016645829002.

Biochemistry, 11, doi: 10.1186/1471 2091 11 30.

28. Kluge, C., and Dimroth, P. (1993) Specific protection by

18.

Murata, T., Kawano, M., Igarashi, K., Yamato, I., and

Na⁺ or Li⁺ of the F₁F_o ATPase of Propionigenium modes(

Kakinuma, Y. (2001) Catalytic properties of Na⁺ translo

tum from the reaction with dicyclohexylcarbodiimide, J.

cating V ATPase in Enterococcus hirae, Biochim. Biophys.

Biol. Chem., 268, 14557 14560.

Acta, 1505, 75 81, doi: 10.1016/S0005 2728(00)00278 4.

29. Popova, L. G., Shumkova, G. A., Andreev, I. M., and

19.

Yokoyama, K., Nakano, M., Imamura, H., Yoshida, M.,

Balnokin, Yu. V. (2000) Na+ dependent electrogenic

and Tamakoshi, M. (2003) Rotation of the proteolipid ring

ATPase from the plasma membrane of the halotolerant

in the V ATPase, J. Biol. Chem., 278, 2425524258,

microalga Dunaliella maritima, Doklady Biochemistry, 375,

doi: 10.1074/jbc.M303104200.

235 238, doi: 10.1023/A:1026675923730.

20.

Corbalan Garsia, S., Teruel, J. A., and Gomez Fernandez, J. C.

30. Sussman, M. R., and Slayman, C. W. (1983) Modification of

(1992) Characterization of Ruthenium Red binding sites

the Neurospora crassa plasma membrane H⁺ ATPase with

of the Ca²⁺ ATPase from sarcoplasmic reticulum and their

N,N′ dicyclohexylcarbodiimide, J. Biol. Chem., 258, 1839 1843.

interaction with Ca²⁺ binding sites, Biochemistry, 287,

31. Kinsella, J. L., Wehrle, J., Wilkins, N., and Sacktor, B.

767 774, doi: 10.1042/bj2870767.

(1987) Inhibition of Na⁺ H⁺ exchange by N,N′ dicyclo

21.

Wiangnon, K., Raksajit, W., and Incharoensakdi, A. (2007)

hexylcarbodiimide in isolated rat renal brush border mem

Presence of a Na⁺ stimulated P type ATPase in the plasma

brane vesicles, J. Biol. Chem., 262, 7092 7097.

membrane of the alkaliphilic halotolerant cyanobacterium

32. Murakami, N., and Konishi, T. (1989) Mechanism of

Aphanothece halophytica, FEMS Microbiol. Lett., 270, 139

function of dicyclohexylcarbodiimide sensitive Na⁺/H⁺

145, doi: 10.1111/j.1574 6968.2007.00667.x.

antiporter in Halobacterium halobium: pH effect, Arch.

22.

Massyuk, N. P. (1973) Morphology, taxonomy, ecology and

Biochem. Biophys., 271, 515523, doi: 10.1016/0003

geographic distribution of the genus Dunaliella Teod. and

9861(89)90303 2.

ELECTROGENESIS IN PLASMA MEMBRANE FRACTIONS ISOLATED

FROM HALOTOLERANT MICROALGA Dunaliella maritima

AND N,N′ DICYCLOHEXYLCARBODIIMIDE EFFECTS*

L. G. Popova**, D. A. Matalin, and Y. V. Balnokin

Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, 127276 Moscow, Russia; E(mail: lora_gp@mail.ru

Received June 22, 2020

Revised June 22, 2020

Accepted June 26, 2020

The effects of N,N′ dicyclohexylcarbodiimide (DCCD), non specific inhibitor of various transport systems functioning

in biological membranes, on Na⁺ transporting P type ATPase of the green halotolerant microalga Dunaliella maritima

were studied in the experiments with vesicular plasma membranes isolated from the alga cells. The effects of DCCD on

electrogenic/ion transport function of the enzyme and its ATP hydrolase activity were investigated. Electrogenic/ion

transport function of the enzyme was recorded as a Na⁺ dependent generation of electric potential on the vesicle mem

branes with the help of the potential sensitive probe oxonol VI. It was found that unlike many other ion transporting

ATPases, the Na⁺ ATPase of D. maritima is insensitive to DCCD. This agent did not inhibit either ATP hydrolysis cat

alyzed by this enzyme or its transport activity. At the same time DCCD affected the ability of the vesicle membranes to

maintain electric potential generated by the D. maritima Na⁺ ATPase. The observed effects can be explained based on

the assumption that DCCD interacts with the Na⁺/H⁺ antiporter in the plasma membrane of D. maritima.

Keywords: Dunaliella maritima, Na⁺ ATPase, N,N′(dicyclohexylcarbodiimide, microalgae, membrane potential,

plasma membrane

БИОХИМИЯ том 85 вып. 8 2020