БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 1, с. 73 - 88

УДК 577.121.7

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ АНИОНОВ

НА ЩЕЛОЧНОЕ СОСТОЯНИЕ ЦИТОХРОМА c

Е. Седлак^1,2, Т. Кожар², Р. Вархач¹, А. Мусатов³, Н. Томашкова¹*

¹ Department of Biochemistry, Faculty of Science, P. J. Šafárik University,

04154 Košice, Slovakia; e mail: natasa.tomaskova@upjs.sk

² Centre for Interdisciplinary Biosciences, P. J. Šafárik University, 04154 Košice, Slovakia

³ Department of Biophysics, Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, 04001 Košice, Slovakia

Поступила в редакцию 28.08.2020

После доработки 10.11.2020

Принята к публикации 10.11.2020

Изучено специфическое влияние анионов на структуру и термостабильность, а также на пероксидазную ак

тивность нативного (состояние III) и щелочного (состояние IV) цитохрома с (cyt c) с помощью методов УФ

абсорбционной спектроскопии, собственной флуоресценции триптофана и кругового дихроизма. Терми

ческая и изотермическая денатурация, контролируемая, соответственно, по флуоресценции триптофана и

методом кругового дихроизма, предполагают более низкую стабильность cyt c в состоянии IV по сравнению

с состоянием III. Значения pK_a щелочной изомеризации cyt c зависят от присутствующих солей, в соответ

ствии с эффектом Хофмейстера на стабильность белка, т.е. космотропные анионы увеличивают, а хаотроп

ные анионы уменьшают его значение. Пероксидазная активность cyt c в состоянии III, измеренная путём

окисления гваякола, показывает четкую зависимость от положения солей в ряду Хофмейстера, в то время

как cyt c в щелочном состоянии не проявляет пероксидазной активности независимо от типа анионов, при

сутствующих в растворе. Щелочная изомеризация cyt c в присутствии 8 М мочевины, измеренная по флуо

ресценции Trp59, предполагает существование высокоаффинного не природного для гемового железа ли

ганда даже при частично денатурированной конформации белка. Конформация cyt c в щелочном состоянии

в 8 М мочевине заметно модулируется специфическим эффектом анионов. Основываясь на снижении флуо

ресценции Trp59 при титровании до щелочного значения рН в 8 М мочевине и используя метод молекуляр

ной динамики, мы предполагаем, что Lys79 конформер является, скорее всего, доминирующим щелочным

конформером cyt c. Высокое сродство шестого лиганда к гемовому железу, вероятно, является причиной от

сутствия пероксидазной активности у cyt c в щелочной среде.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: щелочная изомеризация, анионы Хофмейстера, псевдо пероксидазная активность.

DOI: 10.31857/S0320972521010061

ВВЕДЕНИЕ

рован как партнер взаимодействия для более

чем 250 различных биомакромолекул [8, 9]. Та

Цитохром c (cyt c) - это многофункциональ

кая многофункциональность cyt c, по видимо

ный гемопротеин, расположенный преимуще

му, возможна благодаря конформационной гиб

ственно на внешней стороне внутренней мито

кости его окисленного нативного складчатого

хондриальной мембраны, где он выполняет

состояния [10-13], что позволяет структуре бел

свою функциональную роль в качестве мобиль

ка существовать в различных альтернативных

ного переносчика электронов между комплек

конформациях, зависящих от условий окружаю

сом III и комплексом IV в дыхательной цепи.

щей среды (значения рН, локальных электри

Кроме того, cyt c способен катализировать пе

ческих полей и т.д.). Эти ненативные конформа

роксидазо подобные реакции [1], может функ

ции могут различаться в шестой аксильной ко

ционировать как ловушка супероксида [2-4] и

ординации (differ in sixth axial coordination), по

участвовать в инициации апоптоза после выхода

окислительно восстановительным параметрам,

в цитоплазму [5-7]. Более того, во внемитохон

сродству связывания и каталитической актив

дриальном пространстве cyt c был идентифици

ности белка [11, 14, 15].

Возможно одной из наиболее изученных не

нативных конформаций cyt c является так на

Принятые сокращения: cyt c - цитохром с; GdmCl -

гуанидинхлорид; КД - круговой дихроизм; МД - молеку

зываемое щелочное состояние или состоя

лярная динамика.

ние IV, которое характеризуется потерей шесто

* Адресат для корреспонденции.

го аксиального лиганда Met80 гемового железа

СЕДЛАК и др.

без существенного влияния на третичную и вто

Несмотря на интенсивные исследования,

ричную структуры белка [16-18]. Щелочная

функциональная роль щелочных состояний

трансформация cyt c представляет собой кон

cyt c до сих пор неизвестна. Эти не природные

формационное изменение, которое происходит

конфигурации cyt c, по видимому, похожи на

спонтанно в природном cyt c в интервале значе

более поздний промежуточный продукт, распо

ний рН 8,5-11 [19, 20]. В митохондриальном

ложенный вдоль складок [30, 36-38], но были

cyt c исследования рекомбинантной экспрес

также указания на то, что снижение окислитель

сии [21] при сочетании методов ЯМР [22] и ре

но восстановительного потенциала цитохрома c

зонансной Рамановской спектроскопии [23]

является следствием более открытой структу

показали, что Lys73 и Lys79, а также, возможно,

ры гемовой щели, что важно для работы cyt c как

Lys72 [24] в составе Ω петли фолдона, состоя

в цепи переноса электронов [23, 25, 39], так и в

щей из а.о. 70-85, заменяют нативный ли

апоптозе в связи с усилением активности перок

ганд Met80. Эта неоднородность щелочного

сидазы [11, 40-43]. Дискуссия о функциональ

состояния, представленная несколькими про

ной роли щелочно подобных состояний была

странственными конфигурациями, вероятно,

подогрета недавними открытиями некоторых

является причиной трудности получения его

посттранскрипционных модификаций cyt c

кристаллической структуры. Однако структуры

млекопитающих и некоторыми естественными

двойных и тройных мутантов cyt c дрожжей с

точечными мутациями, которые запускают кон

Lys73 в шестом аксиальном положении гемово

формацию белка, аналогичную состоянию IV,

го железа были определены методами ЯМР и

даже при физиологическом значении рН. Му

рентгеновской кристаллографии и представля

тант cyt c Gly41Ser [44, 45], а также Tyr48His [46]

ют собой хорошие структурные модели состоя

в гене cyt c человека индуцируют ранние щелоч

ния IV [6, 25].

ные переходы при нейтральном рН, которые

Результаты, полученные в экспериментах с

способствуют увеличению динамики Ω пет

использование кинетических методов останов

ли (40-57 а.о.), диссоциации Met80 и повыше

ленной струи и в экспериментах по обмену во

нию пероксидазной активности cyt c [43, 45].

дорода с использование ЯМР [10, 14, 23, 27-30]

Эти мутанты проявляли повышенную апопто

позволяют предположить, что механизм щелоч

тическую активность, вероятно, за счет усиле

ного перехода включает как минимум два этапа:

ния связывания и активации Apaf 1 или способ

ствуя реокислению cyt c, сборке апоптосом и их

Cyt³⁺ H (состояние III) ↔

активации [44]. Посттрансляционная модифи

кация cyt c, например нитрованием (остаток Tyr

↔ Cyt³⁺ (состояние III) + H ↔

в положении 74) и фосфорилированием (напри

мер, Tyr48), которая возникает при окислитель

↔ Cyt³⁺ (состояние IV).

ном стрессе, приводит к ослаблению аксиаль

ной связи Fe Met80. Таким образом, эта моди

Результатом первого шага является одново

фикация позволяет осуществлять щелочной пе

дородное депротонирование триггерной груп

реход при физиологическом рН, что, вероятно,

пы, приводящее к нативному депротонирован

связано с повышением пероксидазной актив

ному состоянию III cyt c с экспериментально

ности [15, 41, 47]. Несмотря на возникновение

определенной константой равновесия K_H для

повышенной активности пероксидазы, эти мо

диссоциации протонов (pK_H ~ 11) [27]. Эта ста

дификации оказывали антиапоптотическое воз

дия депротонирования связана со вторым эта

действие за счет снижения способности активи

пом, ограничивающим скорость конформаци

ровать каспазу 9 [41, 47]. Эти данные подтверж

онным изменением cyt c (с константой равнове

дают гипотезу о важной функции щелочной

сия K_C для структурных изменений, pK_C ~ -2),

конформации cyt c in vivo [17, 41, 43, 47-49].

что приводит к лигандному обмену Met80 на

С этой позиции возникает вопрос, связан

другой сильный лиганд [30]. Депротонирование

ный с пероксидазной активностью щелочной

триггерной группы в cyt c дикого типа с pK_H ~ 11

конформации cyt c. Diederich et al. [50, 51] для

говорит в пользу остатков

72,

73 и/или

cyt c сердца лошади и McClelland et al. [52] для

79 [23, 31], но точная идентичность триггерной

tmK72 cyt c и cyt c 550 из Saccharomyces cerevisiae

группы все еще находится в стадии обсужде

показали, что пероксидазная активность белка

ния [15, 28, 32-34]. Следует отметить, что более

снижается с увеличением рН из за заме

поздние исследования указывают на то, что ще

ны Met80 аксиальным лигандом с сильным по

лочной переход является более сложным про

лем, который ингибирует его пероксидазную

цессом, состоящим из нескольких последующих

активность. С другой стороны, было сообщено,

и/или параллельных переходов [31, 35].

что cyt c с Lys в качестве шестого аксиального

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

лиганда обладает повышенной пероксидазной

щению при 274 нм (ε ≈ 2550 M^-1⋅см^-1) [65]. Все

активностью [17, 48, 53, 54], что согласуется с

остальные химикаты были закуплены у компа

активностью cyt c при определенных естествен

ний «Fluka», Германия и «Sigma», США. Исход

ных мутациях и посттрансляционных модифи

ные растворы солей перед использованием

кациях [15, 41, 43, 45, 47].

фильтровали.

Общепризнано, что каталитическая перок

Флуоресцентно/эмиссионная спектроскопия.

сидазная активность cyt c коррелирует с наличи

Измерения флуоресценции проводили с по

ем популяции пятикоординатных высокоспи

мощью 10 мм кюветы на спектрофлуориметре

новых видов [17, 48, 55], которые являются

Varian Cary Eclipse («Varian», США), снабжён

следствием присущей этой популяции динами

ном Пельтье элементом. Щелочное титрование

ки в области гема [11, 56, 57]. Мы и другие ис

проводили путем добавления очень небольших

следователи ранее показали, что динамика

количеств концентрированного NaOH в раст

структуры белка может быть модулирована из

вор, содержащий либо 5 мМ какодилатный бу

менением физико химических свойств раство

фер, либо буфер с 8 М мочевиной и 0,5 М солью.

рителя солями, за счет эффекта, известного как

Температура в кюветах поддерживалась посто

эффект Хофмейстера, или специфический со

янной на уровне 20,0 ± 0,5 °С с помощью эле

левой эффект [58-61]. Модуляция динамики

мента Пельтье. При титровании регистрирова

структуры белка может оказывать влияние на

лись спектры эмиссионной флуоресценции cyt c

глобальную и локальную стабильность, конфор

в диапазоне 310-400 нм при длине волны воз

мационные переходы и активность фермен

буждения 290 нм. Концентрация cyt c в кювете

тов [57, 58, 62-64].

составляла 9 мкМ. В качестве эталона был взят

В настоящей работе мы проанализировали

спектр при рН 6,0.

структуру и термическую стабильность, а также

Кривые щелочной изомеризации строили в

пероксидазную активность, щелочного cyt c в

виде зависимости значений флуоресценции

присутствии анионов Хофмейстера. Показано,

при 350 нм от рН. Значения pK_a кривых щелоч

что щелочное состояние cyt c имеет (i) компакт

ной изомеризации определяли по следующему

ную структуру с несколько меньшей изотерми

уравнению:

ческой стабильностью по сравнению с его натив

ным состоянием, и (ii) практически отсутствует

(1)

пероксидазная активность независимо от типа

аниона Хофмейстера, присутствующего в раство

рителе. Наши эксперименты предполагают силь

где f - фракция cyt c в щелочном состоянии, A_N

ное сродство не природного лиганда к гемовому

и A_D - интенсивность флуоресценции в точке

железу даже в присутствии высокой концентра

350 нм нативной и денатурированной форм, а

ции денатуранта. Моделирование молекулярной

n - число протонов, участвующих в переходе.

динамики (МД) в сочетании с эксперименталь

Значения рН измеряли непосредственно в кю

ными результатами свидетельствует о чрезвычай

ветах с помощью стеклянного микроэлектрода

но высоком сродстве лизина к гемовому железу.

Sensorex (до и после регистрации спектров).

Измерения термической стабильности. Терми

ческую денатурацию cyt c регистрировали при

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

длине волны возбуждения 290 нм и излучения -

350 нм, при постоянной скорости сканирова

Цитохром с из сердца лошади («Sigma»,

ния 1 °С/мин и в присутствии 0,5 М солей в

США) использовали без дополнительной очист

50 мМ натрий фосфатном буфере, рН 7,0, и

ки. Перед измерениями белок полностью окис

0,5 М солей в 50 мМ глицин NaOH буфере,

ляли добавлением 1 мкл 10 мМ K₃[Fe(CN)₆] к

рН 10,0. Конечная концентрация белка состав

2,5 мл образца. Концентрацию окисленно

ляла 9 мкМ. Кривые термической денатурации

го cyt c определяли спектрофотометрически по

cyt c были проанализированы с использованием

поглощению при 410 нм (ε ≈ 106 100 M^-1⋅см^-1)

следующего уравнения, описывающего двух

при рН 7,0 в 10 мМ натрий фосфатном буфере.

фазный переход:

Концентрацию 35% ного водного раствора пе

рекиси водорода без добавок («Centrachem»,

Словакия) определяли спектрофотометрически

по поглощению при 240 нм (ε ≈ 40 M^-1⋅см^-1) в

, (2)

дистиллированной воде. Концентрацию гваяко

ла (>99%) («Sigma», США) в исходном растворе

определяли спектрофотометрически по погло

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

где I_obs - наблюдаемая интенсивность флуорес

водили в 10 мм кварцевой кювете. Использова

ценции при температуре T, I_N и I_U, а также

ли свежеприготовленный исходный раст

m_N и m_U представляют собой пересечения и на

вор H₂O₂, и его концентрацию проверяли спект

клоны (intercepts and slopes) нативных (предена

рофотометрически (ε₂₄₀ = 40 M^-1⋅cм^-1). Реакцию

турированных) и развившихся (постденатури

образования тетрагуаякола контролировали

рованных) исходных линий соответственно,

при 470

нм с помощью спектрофотометра

а ΔHtrs - энтальпия при температуре перехо

Specord S300 UV VIS diode array («Analytik Jena

да T_trs.

AG», Германия), оснащенного элементом

Измерения методом кругового дихроизма

Пельтье. Реакции измеряли при 20 °С в присут

(КД). После изотермической денатурации cyt c

ствии и в отсутствие 0,5 М солей в 10 мМ нат

гуанидинхлоридом (GdmCl) проводили измере

рий фосфатном буфере при рН

7,0-7,5;

ние КД в дальней УФ области при 220 нм в 1 мм

10 мМ Tris HCl при рН 8,0-8,5 и 10 мМ глицин

кювете с помощью спектрополяриметра JASCO

NaOH буфере при рН 9,0-10,0. Реакционные

J 810 («Jasco», Япония). Измерения КД прово

смеси содержали 1,8 мкМ cyt c, 1 мМ гваякола и

дили в растворе, содержавшем 25 мкМ cyt c в

соответствующую концентрацию (5-20 мМ) пе

5 мМ буфере натрий какодилат рН 6 и в 10 мМ

рекиси водорода. Реакцию запускали добавле

буфере натрий фосфатном/NaOH рН 11. Изме

нием H₂O₂, как сообщалось ранее [57].

рения проводили при 20 °C.

Моделирование методом молекулярной дина/

Свободная энергия разворачивания Гиббса

мики (МД). Конформации cyt c с шестым лиган

(ΔG), которая выражает стабильность белка, и

дом Lys72, Lys73 и Lys79 были построены вруч

величина m, которая зависит от площади поверх

ную с помощью визуализатора BIOVIA Discovery

ности белка, подвергнутого воздействию рас

Studio 2020 г. выпуска [68]. Нативная структура

творителя при разворачивании [66], были оце

cyt c, основанная на экспериментальной геомет

нены с применением нелинейного анализа наи

рии cyt c с разрешением 1,9 Å (PDB ID:

меньших квадратов, используемого в рассмат

1HRC) [69], была использована для построения

риваемой модели [67].

вышеупомянутых конформационных форм.

Комбинация программ Maestro/Desmond вы

. (3)

пуска 2020 г. [70] была использована для модели

рования различных конформационных состоя

В этой модели отражена наблюдаемая эл

ний cyt c, которые были сольватированы в каж

липтичность (θ) и концентрация денатуран

дом сайте связывания, используя программу

та [D], с входящими в неё параметрами Δθ_N, Δθ_U,

Maestro. На этом этапе была использована SPC

m_N, m_U, m и ΔG, соответствующими модели.

water Model [71] с молекулами воды в 1 нм буфе

Здесь Δθ_N и Δθ_U представляют собой пересече

ре вокруг конформеров cyt c. Полученные

ния базовых кривых преденатурации и постде

структуры были минимизированы и уравнове

натурации соответственно, а m_N и m_U представ

шены при первом 5 нс запуске NPT (давле

ляют собой наклоны исходных линий предена

ние 1,01325 бар) моделирования при 10 К. Для

турации и постденатурации соответственно.

проведения исследований моделирования ис

Значения ΔG и m представляют собой пересече

пользовалось силовое поле OPLS 2005 (совре

ние и наклон линейной экстраполяции проис

менная версия семейства силовых полей

ходящих изменений свободной энергии в зави

OPLS [72, 73]). Окончательные структуры были

симости от концентрации денатуранта. Это

подвергнуты в течение 10 нс NPT моделирова

уравнение учитывает линейную зависимость

нию (давление 1,01325 бар) с помощью прог

преденатурационной и постденатурационной

раммы Desmond при 300 К. Кроме того, веб сер

областей развернувшейся кривой [67].

вис ChExVis [74] был использован для прогнози

Измерения методом абсорбционной спектро/

рования внутримолекулярных каналов всех че

скопии. Спектры поглощения измеряли в 10 мм

тырех конформационных форм cyt c.

кювете на спектрофотометре Varian Cary Bio

100 («Varian», США), оснащенном элементом

Пельтье. Спектры поглощения измеряли в диа

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

пазоне 600-800 нм в присутствии и в отсутствие

8 М мочевины и 0,5 М солей (Na₂HPO₄, NaCl и

Специфическое влияние анионов на щелочную

NaSCN) в 10 мМ натрий фосфатном буфере при

изомеризацию и термостабильность cyt c. Тот

рН 7, 10 и 12. Концентрация cyt c составляла

факт, что соли влияют на щелочной пере

100 мкм.

ход cyt c, был недавно продемонстрирован на

Кинетические исследования пероксидазной

ряде солей Хофмейстера [62]. В данной работе,

активности цитохрома c. Анализ активности про

по сравнению с предыдущей, мы еще больше

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

Рис. 1. Температурная денатурация cyt c в отсутствие соли (белые кружки) и в присутствии 0,5 М солей: Na₂HPO₄ (голу

бые кружки), Na₂SO₄ (синие перевернутые треугольники), CH₃COONa (зеленые треугольники), NaCl (черные кружки),

NaBr (красные ромбы), NaClO₄ (серые квадраты) и NaSCN (пурпурные перевернутые треугольники) в 50 мМ натрий фос

фатном буфере, рН 7 (а) и в 50 мМ глицин NaOH буфере, рН 10 (b). Интенсивность флуоресценции контролировалась

при длине волны излучения 350 нм после возбуждения при длине волны 290 нм. с - Корреляция между значениями pK_a

и T_m, полученными в присутствии исследуемых солей (коэффициент корреляции линейной зависимости равен 0,8895).

(С цветными вариантами рис. 1-6 можно ознакомиться в электронной версии статьи на сайте: http://sciencejournals.ru/

journal/biokhsm/.)

расширили количество изученных солей. Полу

ценции при рН 7 и 10 (рис. 1, a и b), и получен

ченные значения pK_a щелочной изомеризации

ные значения T_m приведены в табл. S2 Прило

cyt c (табл. S1 в Приложении) наглядно демон

жения. Тепловые переходы цитохрома с при всех

стрируют специфическое действие анионов в

исследованных условиях делают очевидным

зависимости от их положения в ряду Хофмейс

двойной характер его состояний. Температуры

тера. Фактически, щелочное состояние, состоя

перехода определяли путем внесения экспери

ние IV, стабилизируется хаотропными анионами

ментальных данных в уравнение 2. При низкой

по мере уменьшения значений pK_a в процессе

ионной силе температура перехода cyt c при

перехода, т.е. состояние III cyt c дестабилизиру

рН 10 (79,5 °C) была примерно на 6 °C ниже по

ется в направлении от космотропных к хаотроп

сравнению с температурой при рН 7 (85,6 °C).

ным анионам.

Такая же тенденция наблюдалась и в присут

Специфическое влияние анионов на термо

ствии 0,5 М анионов. Значения температур пе

стабильность cyt c в состояниях III и IV изучали

рехода cyt c при рН 10 были во всех солях, кроме

путем мониторинга интенсивности флуорес

того, в присутствии хаотропного перхлората и

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

термодинамических параметров для нативного

цитохрома с при рН 6 (m = 12,7 ± 0,7 кДж/моль/м

и ΔG = 34,9 ± 2,1 кДж/моль) и щелочного цито

хрома с при рН 11 (m = 10,9 ± 0,6 кДж/моль/м

и ΔG = 29,9 ± 1,6 кДж/моль). Эти результаты

свидетельствуют о том, что в нативном состоя

нии cyt c имеет более высокую стабиль

ность ~5 кДж/моль, чем в щелочном состоянии,

что согласуется с результатами термической де

натурации. Полученные значения m, пропорци

ональные площади поверхности белка, обра

щённой в растворитель [66], позволяют предпо

ложить, что развернутая конформация обоих

состояний III и IV аналогична, а структура ще

лочного состояния несколько более открыта по

сравнению с нативным состоянием cyt c.

Рис.

2. Изотермическая денатурация cyt c в присут

Пероксидазная активность щелочного цито/

ствии GdmCl в 5 мМ натрий какодилате, рН 6 (чёрный) и

хрома с в присутствии анионов. Пероксидазную

в 10 мМ натрий фосфат/NaOH, рН 11 (синий), сопровож

активность cyt c в диапазоне рН 7-10 определя

дающаяся эллиптичностью при 222 нм

ли при окислении гваякола, как было описано

ранее [57]. При рН 7 у cyt c равномерно увеличи

тиоцианата они были ниже по сравнению со

валась пероксидазная активность, начиная от

значениями при рН 7 (табл. S2 в Приложении).

присутствия космотропных и до хаотропных

При обоих рН термостабильность cyt c плавно

анионов. Действительно, константа скорости

снижается от космотропных к хаотропным ани

второго порядка пероксидазной активности

онам (рис. 1, а и b; табл. S2 в Приложении) в со

cyt c увеличивалась в 2,5 раза в присутствии ха

ответствии с известным эффектом Хофмейстера

отропных анионов по сравнению с таковой в

на стабильность белка [75].

присутствии космотропных анионов или в отсу

Отметим, что интенсивность флуоресцен

тствие солей (рис. 3, табл. S3 в Приложении).

ции при термической денатурации при рН 10

Однако при постепенном увеличении рН конс

была примерно в два раза ниже, чем при рН 7,

танта скорости второго порядка пероксидазной

что свидетельствует о более компактном состоя

активности cyt c снижалась независимо от типа

нии термически денатурированного цитохро

аниона, и при рН 10 пероксидазная активность

ма с при щелочном рН, чем при нейтраль

cyt c не обнаруживалась. Отметим, что в присут

ном рН (рис. 1, а и b). График зависимости вели

ствии 0,5 М перхлората пероксидазная актив

чины pK_a от температуры перехода цитохрома с

ность cyt c наиболее высока при рН 6, но эта ак

в присутствии исследуемых солей демонстриру

тивность исчезает уже при рН 8. Это наблюде

ет корреляцию, указывающую на взаимосвязь

ние ясно показывает, что пероксидазная актив

между этими параметрами (рис. 1, c).

ность cyt c исчезает при переходе его в состоя

Изотермическая денатурация цитохрома с в

ние IV (pK_a щелочной изомеризации cyt c в при

нативном и щелочном состояниях. Для сравнения

сутствии 0,5 М NaClO₄ составляет ~7,5), что со

стабильности нативного и щелочного состоя

гласуется с ингибированной пероксидазной ак

ний cyt c мы также провели эксперименты по

тивностью cyt c в присутствии всех исследуемых

изотермической денатурации, контролируя зна

солей при рН 10.

чения эллиптичности при 220 нм в присутствии

Влияние анионов на щелочную изомеризацию

гуанидинхлорида (рис. 2). GdmCl индуциро

денатурированного cyt c. Анализ щелочной изо

ванное разворачивание нативного и щелочного

меризации cyt c в присутствии 8 М мочевины

состояний cyt c было обратимым, что позволило

позволил проверить гипотезу о том, что срод

применить равновесный термодинамический

ство Lys к гемовому железу при щелочном зна

анализ. Значения эллиптичности, измеренные

чении рН сохраняется даже в таких суровых ус

при 220 нм, были нормированы по минималь

ловиях. При инкубации cyt c в 8 М мочевине на

ным и максимальным значениям эллиптичнос

тивный лиганд гемового железа в cyt c, Met80,

ти в исследуемом диапазоне концентраций де

заменяется другим сильным лигандом, His33,

натуранта. Экспериментальные данные эллип

при этом небольшая часть cyt c находится в не

тичности, в зависимости от концентра

упорядоченном состоянии, похожем на пента

ции GdmCl, были получены в соответствии с

координированное [76]. Фактически, именно на

уравнением 3. В результате был получен набор

это указывает спектр поглощения cyt c в 8 М мо

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

чевине в области 600-700 нм (рис. 4, а): (i) поло

са 695 нм отсутствует и (ii) присутствует слабая

полоса 620 нм (показатель высокоспинового

состояния гемового железа), соответствую

щая ~5% от высокоспинового состояния cyt c,

наблюдаемого при низкой ионной силе при

рН 2. Щелочную изомеризацию в 8 М мочевине

можно проследить с помощью другой характе

ристики cyt c - собственной флуоресценции

триптофана. Cyt c содержит только один остаток

триптофана (Trp59), который погружён в гемо

вую щель вблизи гема и отражает малейшие из

менения своего (Trp59) расстояния от гема [77].

Рис. 3. Зависимость нормированного коэффициента конс

В нативной конформации cyt c флуоресцентное

танты скорости второго порядка пероксидазной активнос

излучение триптофана гасится за счет переноса

ти cyt c, измеренного при окислении гваякола, от рН в гемом энергии Фестера [55], но при рН 7 в

присутствии и в отсутствие разного рода солей: без со

8 М мочевине интенсивность флуоресценции

ли (белый), Na₂HPO₄ (голубой), Na₂SO₄ (синий),

CH₃COONa (зеленый), раствор NaCl (черный),

cyt c достигает

~60-65% от флуоресцен

NaBr (красный), NaNO₃ (оранжевый) и NaClO₄ (серый)

ции NATA (N ацетил L триптофанамида) -

Рис. 4. Спектры поглощения cyt c в области 600-800 нм, измеренные при рН 7 (а), рН 10 (b) и РН 12 (c) в буфере (пунк

тирная линия) и в присутствии 8 М мочевины при рН 7, 10 и 12 в отсутствие солей (серая линия) и в присутствии

0,5 М Na₂HPO₄ (голубая линия), 0,5 М NaCl (черная линия) и 0,5 М NaSCN (пурпурная линия). d - Зависимости интен

сивности флуоресценции cyt c при 350 нм в 8 М мочевине в отсутствие соли в 5 мМ какодилатном буфере (белые кружки)

и в присутствии 0,5 М натриевых солей: Na₂HPO₄ (голубые кружки), Na₂SO₄ (синие перевернутые треугольники),

CH₃COONa (зеленые треугольники), NaCl (черные кружки), NaBr (красные ромбы), NaClO₄ (серые квадраты) и

NaSCN (пурпурные перевернутые треугольники)

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

аналога остатка триптофана (данные не приве

Анионы Хофмейстера существенно влияют

дены).

на pH переходы cyt c в 8 М мочевине. В присут

Щелочная изомеризация cyt c в 8 М мочеви

ствии космотропных анионов (фосфатов и суль

не в интервале рН 6-12 явно указывает на три

фатов) снижение флуоресценции наиболее вы

переходные состояния (рис. 4): (i) первый пере

ражено, в то время как в присутствии хаотро

ход состоит в неожиданном снижении флуорес

пов (тиоцианата и перхлората) изменения флуо

ценции почти во всех условиях (кроме присут

ресценции триптофана довольно незначитель

ствия тиоцианата) со значением pK_a 7,7-9,1

ны (рис. 4, d).

(табл. S4 в Приложении), а значение n ~1 гово

Основываясь на анионзависимом снижении

рит о том, что депротонированию подверглась

флуоресценции триптофана, мы предполагаем,

одна группа. Эти переходы отражают изменение

что анионы в щелочном состоянии не стабили

конформации молекул, находящихся в состоя

зируют одинаково все возможные состояния ли

нии низкоспинового гемового железа (рис. 4, а),

гирования. Для решения этой гипотезы мы ис

и небольшой популяции молекул с высокоспи

следовали молекулярную динамику cyt c в раз

новым гемом железа (в случае хаотропов) в дру

личных лигированных состояниях: Met80,

гое низкоспиновое состояние гемового железа

Lys79, Lys73 и Lys72.

(рис. 4, b); (ii) второй переход заключается в уве

Моделирование МД различных лигированных

личении флуоресценции триптофана до исход

состояний cyt c. Моделирование МД различных

ного, т.е. на уровне рН

6, со значения

связанных состояний cyt c предсказывает раз

ми pK_a 11,0 ± 0,4 и значениями n ~(2-3), подра

личную ориентацию (рис. 5) и различную гиб

зумевающими более чем одну группу, подверга

кость конформации петель (рис. 6). На рис. 5

ющуюся депротонированию (табл. S4 в Прило

показана исходная геометрия для моделирова

жении). Окончательная конформация cyt c во

ния. Желтым цветом выделены конформации

втором переходе представлена низкоспиновым

петель (71-87 а.о.), содержащих Met80, Lys72,

гемом железа (рис. 4, с). Эти переходы, скорее

Lys73 и Lys79. В то время как небольшие кон

всего, представляют собой щелочно подобные

формационные изменения необходимы для ко

переходы к конформации Lys гемового железа

ординационного обмена Met80 на Lys79, боль

при более низких значениях рН (6-10), т.е. в IV

ший конформационный сдвиг необходим для

подобное состоянию, и переход в V подобное

того, чтобы Lys72 или Lys73 взаимодействовали

состояние в диапазоне pH 10-12.

с гемовым железом. Этот конформационный

сдвиг связан с большей гибкостью этой петли по

сравнению с нативной формой cyt c. Более зна

чительная гибкость петли (71-87 а.о.), когда

Lys72, Lys73 или Lys79 координационно связы

ваются с гемовым железом, проиллюстрирована

на рис. 6, b-d на схемах петель различной окрас

ки. Эти результаты хорошо согласуются с дан

ными Oviedo Rouco et al. [78], которые предска

зали, что сегменты петли (71-87 а.о.) и пет

ли (41-57 а.о.) будут более гибкие для конфор

меров, содержащих Lys в положении шестого

лиганда. Сравнение гибкости петель показано

на рис. 6, где cyt c представлен в виде ленты с от

меченными аминокислотами, координационно

связывающимися с атомом гемового железа.

Визуализируется около 1000 конформаций для

всех форм cyt c, которые были сохранены при

нс МД моделировании в водной среде

(рис. S1 и S2 в Приложении).

Координационная связь Fe S, возникающая

в случае Met80 и нативного cyt c (рис. 6, а), веро

Рис. 5. Суперпозиция нативной структуры цитохрома c, а

ятно, приводит к более высокой стабилизации

также различных конформаций, в которых различные ли

геометрии петли, чем координационная связь

зины образуют координационную связь с гемовым желе

Fe N, которая имеется в случае Lys72, Lys73 и

зом. Гибкость петли выделена светло оранжевым цветом, а

Lys79. Как следствие, в случае конформеров Lys

стрелки иллюстрируют движение петли, облегчающее взаи

модействие K72, К73 или К79 с гемовым железом. (Обо

гибкость петли, по видимому, выше (рис. 6, b-d).

значения: K - остаток Lys, М - Met, W - Trp)

Интересно, что аминокислоты сегмента пет

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

Рис. 6. Конформационные ансамбли различных форм cyt c по отношению к координации гема железо-сера (для случая

Met80) и координации азот-железо (в случае Lys72, Lys73 и Lys79). Различными цветами обозначены петли (41-57 а.о.) и

(71-87 а.о.). При координационном связывании Lys с гемовым железом была обнаружена бóльшая гибкость петель, чем

при координационной связи с серой нативного cyt c. (Обозначения: K - остаток Lys, М - Met)

ли (41-57 а.о.), которые не находятся в прямом

и IV в однонаправленного транспортёра элект

взаимодействии с гемовым железом, также об

рона (к комплексу IV) с возможной регулятор

ладают более высокой гибкостью в случае Lys

ной ролью in vivo [19, 81]. Однако только недав

конформеров по сравнению с нативным состоя

но было обнаружено, что некоторые естествен

нием cyt c.

ные мутации [43, 45, 82, 83] и посттрансляцион

ные модификации [15, 41, 47, 84] смещают ще

лочную изомеризацию в нейтральную, близкую

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

к физиологической, область значений рН.

Предполагается, что щелочное состояние играет

Щелочное состояние cyt c, включающее в се

определенную роль в проапоптотических собы

бя смесь по меньшей мере двух конформаций с

тиях, во время которых cyt c повышает свою

ненативными лигандами гемового железа, явля

способность катализировать пероксидазную ре

ется единственным из пяти различных состоя

акцию [17, 26, 41, 49, 52]. Систематически сооб

ний, кроме нативного, в диапазоне рН 0-14, с

щалось, что в условиях, благоприятствующих

низкоспиновым состоянием гемового желе

состоянию IV, как образца аксиального взаимо

за [79]. Цитохром c в состояниях III и IV имеет в

действия, cyt c обладает повышенной перокси

целом сходные свойства, которые суммированы

дазной активностью по сравнению с состояни

в таблице. Однако пониженный восстановитель

ем III [48, 53, 54]. Интересно, что в cyt c как в

ный потенциал в состоянии IV, по сравнению с

состоянии III, так и в состоянии IV, присутству

состоянием III, привлёк большое внимание.

ют низкоспиновые формы гемового железа, что

Действительно, более низкий (на 0,3-0,5 В) вос

означает наличие сильного шестого аксиально

становительный потенциал cyt c в состоя

го лиганда и, следовательно, отсутствие перок

нии IV [53, 80] превращал cyt c из обратимого

сидазной активности. Гемовый белок, способ

переносчика электрона между комплексами III

ный катализировать пероксидазные реакции,

6 БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

должен находиться в пента координированном

Из за сопоставимости стабильности состоя

состоянии с вакантным шестым сайтом, что яв

ний III и IV (рис. 2) мы предположили анало

ляется неизбежным условием доступности ак

гичное влияние анионов Хофмейстера на пе

тивного участка для субстрата. Действительно,

роксидазную активность состояния IV, как это

было показано, что пероксидазная активность

наблюдалось для состояния III. Однако во всех

cyt c является результатом временно формирую

изученных условиях, с солями или без них, cyt c

щегося пента координированного состояния

в состоянии IV обладает незначительной перок

гема. Это считается следствием присущей дан

сидазной активностью. Наше объяснение этого

ной области гема динамики - обратимого раз

наблюдения состоит в том, что Met80, шестой

ворачивания наименее стабильных фолдонов

лиганд состояния III, находится в относительно

cyt c [57], т.е. так называемых инфракрасных и

лабильном положении, конкурируя с другими

красных фолдонов, состоящих из а.о. 41-57 и

аминокислотными остатками (Lys) за связь с ге

71-87 соответственно [85]. Это предположение

мовым железом, как это следует из детального

основано на экспериментальных наблюдениях

анализа спектральных свойств cyt c, выполнен

связывания малых лигандов, таких как циа

ного группой Schweitzer Stenner [97, 98]. По

нид [60, 86, 87] или имидазол [88], с гемовым

видимому, следствием этой конкуренции за ге

железом. Основываясь на наших выводах о том,

мовое железо является существование популя

что анионы Хофмейстера влияют на динамику в

ции в пента координированном состоянии,

области гема, как показано на анионной зависи

способной катализировать пероксидазные ре

мости константы скорости связывания цианида

акции. С другой стороны, несмотря на анало

с гемовым железом [60], мы предположили, что

гичную гетерогенность щелочного состояния

эффект Хофмейстера должен влиять также на

cyt c, представленную наличием двух гем же

пероксидазную активность cyt c в состоянии III.

лезных лигандов, Lys73 и Lys79 [31], перокси

Фактически, полученные результаты перокси

дазная активность этого состояния ингибирует

дазной активности cyt c, контролируемой окис

ся. По видимому, координационная связь Lys73

лением гваякола (рис. 3), подтверждают эту ги

и Lys79 с гемовым железом при щелочном зна

потезу. Показано, что пероксидазная актив

чении рН прочна и ограничена в диссоциации,

ность cyt c в присутствии солей возрастает в

препятствуя таким образом образованию пен

направлении от космотропных к хаотропным

та координированного состояния. Мы прове

анионам в соответствии с повышенной динами

рили прочность этой координационной свя

кой в области гема. Это согласуется с нашей

зи(ей) титрованием cyt c до щелочного значе

предыдущей работой, в которой мы наблюдали

ния рН в присутствии 8 М мочевины с солями

повышенную окислительную модификацию

Хофмейстера и без них (рис. 4). Russell и Bren

cyt c перекисью водорода в присутствии хаот

[76] показали, что cyt c в присутствии 8 М моче

ропных, по сравнению с космотропными, анио

вины существует в трёх (по крайней мере) попу

нов [89]. Однако в то время, при измерении ме

ляциях, где шестой лиганд свободен либо занят

тодом FOX2, мы не наблюдали разницы в перок

Lys79 или His 33. При титровании до щелочного

сидазной активности cyt c, что свидетельствует о

значения рН равновесие этих популяций, веро

его меньшей чувствительности по сравнению с

ятно, смещается в сторону лиганда(ов) Lys.

методом, основанном на окислении гваякола.

Действительно, мы наблюдали снижение флуо

В наших исследованиях, посвященных эф

ресценции Trp59 при рН 10 в отсутствие солей,

фекту Хофмейстера, мы отмечали, что анионы

что свидетельствует о более компактном состо

влияют не только на динамику cyt c в области ге

янии со значением pK_a, сопоставимым со зна

ма, но и на значения pK_a в его щелочном состо

чениями щелочной изомеризации cyt c в присут

янии [62]. Этот вывод согласуется с наблюдени

ствии хаотропных солей в отсутствии моче

ями локальной дестабилизации Ω пет

вины.

ли (70-85 а.о.) в результате мутаций [90-93],

Компактность такого щелочно подобного

посттрансляционной модификации [41, 43, 47,

состояния (в 8 М мочевине) cyt c, по видимому,

49, 55], физико химических факторов, таких как

может модулироваться солями Хофмейстера. В

повышенная концентрация денатурантов [76]

присутствии космотропных сульфатных и фос

или температура [94-96], что снижает значе

фатных солей снижение наиболее выражено, в

ния pK_a щелочной изомеризации cyt c. Наши

то время как в присутствии хаотропных солей,

результаты подтверждают этот вывод, как видно

таких как тиоцианат натрия, щелочной переход

из корреляции между стабильностью в целом,

не наблюдается (рис. 4, d). Это говорит о том,

представленной значениями T_m, и значения

что соли хаотропа дестабилизируют координа

ми pK_a, наблюдаемыми в присутствии со

ционную связь в щелочно подобном состоянии

лей (рис. 1, с).

cyt c в присутствии 8 M мочевины, в отличие от

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

Сравнение структурных свойств, аксиального лигирования, спинового состояния, физического и термодинамического,

а также активности в нативном (состояние III) и щелочном (состояние IV) состояниях cyt c

Феррицитохром c

Нативное состояние III

Щелочное состояние IV

третичный

глобулярная упаковка [69, 102, 103]

глобулярная упаковка [25, 26]

вторичный

пять α спиралей и два коротких β

то же, что и нативное состояние III (не повлияло) [16, 18]

слоя, взаимосвязанных Ω петлями

[69, 102, 104-106]

щель гема

• закрытая форма [107]

• закрытая форма [104], более 20% выявленного гема,

• широкая сеть водородных связей

чем в нативном состоянии [25]

[69, 108, 109]

• искажение в сети H связей между складками Ω петли

(70-85 и 40-57) [15, 83, 110]

Шестой аксиальный

Met80 [69, 102, 111]

Lys73/79/72 [21-23, 27, 90, 112-115]

лиганд

Спиновое состояние

низкое [69, 116, 117]

низкое [20, 118]

гемового железа

Восстановительный

+255 мВ при pH 7 [115, 119-122]

• +120 мВ при pH 10 [27, 123]

потенциал

• на 0,3-0,5 В ниже, чем состояние III [53, 80]

Стабильность

• изотермальная денатурация:

• изотермальная денатурация: ~ 30 кДж/моль [данная

~ 34-35 кДж/моль [124, данная работа]

работа]

• температурная денатурация:

• температурная денатурация: 79,5 ± 0,3 °C [данная

85,6 ± 0,1 °C (данная работа)

работа]

• основанное на редокс потенциале

состояние III на ~42 кДж/моль более

стабильно, чем состояние IV [80]

Пероксидазная

низкая пероксидазная активность [7]

• повышенная пероксидазная активность [48, 53, 54]

активность

• нет пероксидазной активности [50-52, данная работа]

космотропных солей, которые оказывают силь

носительно связи железо Met80 гораздо боль

ное стабилизирующее действие на эту связь.

шее структурное нарушение происходит для ге

Предполагая, что разные лиганды в щелочно

мового лиганда в положении 73, чем для лиган

подобном состоянии обладают разной стабиль

да в положении 79, когда он замещает Met80.

ностью по аналогии с ситуацией при нейтраль

Наше МД моделирование показало, что струк

ном значении pH [99], мы попытались опреде

турные возмущения во время щелочной изоме

лить наиболее стабильный конформер щелоч

ризации были связаны с одним специфическим

ного состояния на основе расстояния меж

фолдоном Ω петли (70-85 а.о., красный фол

ду Trp59 и гемовым железом. МД моделирова

дон) в сочетании с фолдоном Ω петли

ние показало, что самое короткое расстояние

(40-57 а.о., черный, называемый также инфрак

между Trp59 и гемовым железом, соответствую

расным, фолдон), что согласуется с теорией

щее наиболее компактному состоянию, было

фолдона Englander [100, 101] и работами Oviedo

получено для Lys79 конформера

(~8,9

Å)

Rouco et al. [15, 78].

(рис. 6). Расстояние для нативного состояния с

лигандом Met80 составляет ~9,2 Å, а для кон

В заключение мы показываем, что образова

формеров Lys72 и Lys73 - это ~9,3 Å. Хотя эти

ние щелочного состояния цитохрома c коррели

задачи не обязательно должны соответствовать

рует со стабильностью белка и может модулиро

ситуации в случае щелочного состояния, иден

ваться солями Хофмейстера посредством спе

тификация Lys79, как наиболее стабильного

цифического анионного эффекта. Мы пришли к

конформера щелочного состояния, согласуется

выводу, что конформационная стабильность

с работой Maity et al. [14]. Работа Nelson и

состояний III и IV сравнима, но, в отличие от

Bowler [29] с изоформой 1 cyt c также свидетель

состояния III, щелочное состояние не обладает

ствует в пользу роли Lys79 как наиболее ста

пероксидазной активности, что указывает на

бильной щелочной формы cyt c. Они показали,

присутствие сильного лиганда, скорее всего,

что из за структурной близости Lys73 и Lys79 от

Lys79.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

Финансирование. Эта работа была поддержа

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

на исследовательским грантом, предоставлен

сутствии прямого или потенциального конф

ным Словацким агентством исследований и

ликта интересов, связанного с публикацией

разработок (грант № APVV 15 0069) и гранто

этой статьи.

вым агентством Министерства образования, на

Соблюдение этических норм. Эта статья не

уки, исследований и спорта Словацкой Респуб

содержит описания исследований, выполнен

лики (грант № VEGA 2/0009/17). Данная публи

ных авторами с участием человека или живот

кация является результатом реализации проек

ных в качестве объектов.

та: Открытое научное сообщество для современ

Дополнительные материалы. Приложение к

ных междисциплинарных исследований в меди

статье на английском языке опубликовано на

цине (Акроним: OPENMED), ITMS2014 +:

сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://

313011V455 при поддержке Интегрированной

protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте изда

инфраструктуры операционной программы,

тельства Springer (https://link.springer.com/

финансируемой ЕФРР.

journal/10541), том 86, вып. 1, 2021.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Radi, R., Turrens, J. F., and Freeman, B. A. (1991) Cyto

12.

Schweitzer Stenner, R. (2018) Relating the multi func

chrome c catalyzed membrane lipid peroxidation by

tionality of cytochrome c to membrane binding and struc

hydrogen peroxide, Arch. Biochem. Biophys., 288, 118 125,

tural conversion, Biophys. Rev.,

10,

11511185,

doi: 10.1016/0003 9861(91)90172 f.

doi: 10.1007/s12551 018 0409 4.

Atlante, A., Calissano, P., Bobba, A., Azzariti, A., Marra, E.,

13.

Milorey, B., Schweitzer Stenner, R., Kurbaj, R., and

and Passarella, S. (2000) Cytochrome c is released from

Malyshka, D. (2019) pH induced switch between different

mitochondria in a reactive oxygen species (ROS) depen

modes of cytochrome c binding to cardiolipin containing

dent fashion and can operate as a ROS scavenger and as a

liposomes, ACS Omega, 4, 1386 14000, doi: 10.1021/

respiratory substrate in cerebellar neurons undergoing

acsomega.8b02574.

excitotoxic death, J. Biol. Chem., 275, 3715937166,

14.

Maity, H., Rumbley, J. N., and Englander, S. W. (2006)

doi: 10.1074/jbc.M002361200.

Functional role of a protein foldon - an Ω loop foldon

Paradies, G., Petrosilio, G., Pistolese, M., and Ruggiero,

controls the alkaline transition in ferricytochrome c,

F. M. (2000) The effect of reactive oxygen species generat

Proteins, 63, 349 355, doi: 10.1002/prot.20757.

ed from the mitochondrial electron transfer chain on the

15.

Oviedo Rouco, S., Castro, M. A., Alvarez Paggi, D,

cytochrome c oxidase activity and on the cardiolipin con

Spedalieri, C., Tortora, V., et al. (2019) The alkaline tran

tent in bovine heart submitochondrial particles, FEBS

sition of cytochrome c revisited: effects of electrostatic

Lett., 466, 323 326, doi: 10.1016/s0014 5793(00)01082 6.

interactions and tyrosine nitration on the reaction dynam

Pereverzev, M. O., Vygodina, T. V., Konstantinov, A. A., and

ics, Arch. Biochem. Biophys., 665, 96 106, doi: 10.1016/

Skulachev, V. P. (2003) Cytochrome c, an ideal antioxidant,

j.abb.2019.02.016.

Biochem. Soc. Trans., 31, 1312 1315, doi: 10.1042/bst0311312.

16.

Oellerich, S., Waxckerbarth, H., and Hildebrandt, P.

Liu, X., Kim, C. N., Yang, J., Jemmerson, R., and

(2002) Spectroscopic characterization of nonnative con

Wang, X. (1996) Induction of apoptotic program in cell

formational states of cytochrome c, J. Phys. Chem. B, 106,

free extracts: requirement for dATP and cytochrome c,

6566 6580, doi: 10.1021/jp013841g.

Cell, 86, 147 157, doi: 10.1016/s0092 8674(00)80085 9.

17.

Alvarez Paggi, D., Hannibal, L., Castro, M. A., Oviedo

Jiang, X., and Wang, X. (2004) Cytochrome c mediated

Rouco, S., Demicheli, V., et al. (2017) Multifunctional

apoptosis, Annu. Rev. Biochem., 73, 87 106, doi: 10.1146/

cytochrome c: learning new tricks from an old dog, Chem.

annurev.biochem.73.011303.073706.

Rev., 117, 13382 13460, doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00257.

Kagan, V. E., Tyurin, V. A., Jiang, J., Tyurina, Y. Y., Ritov,

18.

Milazzo, L., Tognaccini, L., Howes, B. D., and

V. B., et al. (2005) Cytochrome c acts as a cardiolipin oxy

Smulevich, G. (2018) Probing the non native states of

genase required for release of proapoptotic factors, Nat.

cytochrome c with resonance Raman spectroscopy: a tool

Chem. Biol., 1, 223 232, doi: 10.1038/nchembio727.

for investigating the structure function relationship,

Chapple, C. E., Robisson, B., Spinelli, L., Guien, C.,

J. Raman. Spectrosc., 49, 1041 1055, doi: 10.1002/jrs.5315.

Becker, E., and Brun, C. (2015) Extreme multifunctional

19.

Osheroff, N., Borden, D., Koppenol, W. H., and

proteins identified from a human protein interaction net

Margoliash, E.

(1980) Electrostatic interactions in

work, Nat. Commun., 6, 7412, doi: 10.1038/ncomms8412.

cytochrome c. The role of interactions between residues 13

González Arzola, K., Velázquez Cruz, A., Guerra

and 90 and residues 79 and 47 in stabilizing the heme

Castellano, A., Casado Combreras, M. A., Pérez Mej as,

crevice structure, J. Biol. Chem., 255, 1689 1697.

G., et al. (2019) New moonlighting functions of mitochon

20.

Moore, G. R., and Pettigrew, G. W. (1990) Cytochromes c:

drial cytochrome c in the cytoplasm and nucleus, FEBS

Evolutionary, Structural and Physicochemical Aspects,

Lett., 593, 3101 3119, doi: 10.1002/1873 3468.13655.

Springer Verlag, New York.

10.

Cherney, M. M., and Bowler, B. E. (2011) Protein dynam

21.

Pollock, W. B., Rosell, F. I., Twitchett, M. B., Dumont,

ics and function: making new strides with an old warhorse,

M. E., and Mauk, A. G. (1998) Bacterial expression of a

the alkaline transition of cytochrome c, Coord. Chem. Rev.,

mitochondrial cytochrome c. Trimethylation of lys72 in yeast

255, 664 677, doi: 10.1016/j.ccr.2010.09.014.

iso 1 cytochrome c and the alkaline conformational transi

11.

Hannibal, L., Tomasina, F., Capdevila, D. A., Demicheli, V.,

tion, Biochemistry, 37, 6124 6131, doi: 10.1021/bi972188d.

Tortora, V., et al. (2016) Alternative conformations of cyto

22.

Rosell, F. I., Ferrer, J. C., and Mauk, A. G. (1998) Proton

chrome c: structure, function, and detection, Biochemistry,

linked protein conformational switching: definition of the

55, 407 428, doi: 10.1021/acs.biochem.5b01385.

alkaline conformational transition of yeast iso 1 ferricy

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

tochrome c, J. Am. Chem. Soc., 120, 1123411245,

38.

Nelson, C. J., LaConte, M. J., and Bowler, B. E. (2001)

doi: 10.1021/ja971756.

Direct detection of heat and cold denaturation for partial

23.

Döpner, S., Hildebrandt, P., Rosell, F. I., and Mauk, A. G.

unfolding of a protein, J. Am. Chem. Soc., 123, 7453 7454,

(1998) Alkaline conformational transitions of ferricyt

doi: 10.1021/ja016144a.

cohrome c studied by Resonance Raman spectroscopy,

39.

Weber, C., Michael, B., and Bosshard, H. R. (1987) Spectro

J. Am. Chem. Soc., 120, 1124611255, doi: 10.1021/

scopic analysis of the cytochrome c oxidase cytochrome c

ja9717572.

complex: circular dichroism and magnetic circular dichro

24.

Krishna, M. M. G., Maity, H., Rumbley, J. N., Lin, Y., and

ism measurements reveal change of cytochrome c heme

Englander, S. W. (2006) Order of steps in the cytochrome c

geometry imposed by complex formation, Proc. Natl. Acad.

folding pathway: evidence for a sequential stabilization

Sci. USA, 84, 6687 669, doi: 10.1073/pnas.84.19.6687.

mechanism, J. Mol. Biol., 359, 1410 1419, doi: 10.1016/

40.

Jemmerson, R., Liu, J., Hausauer, D., Lam, K. P.,

j.jmb.2006.04.035.

Mondino, A., and Nelson, R. D. (1999) A conformational

25.

Assfalg, M., Bertini, I., Dolfi, A., Turano, P., Mauk, A. G.,

change in cytochrome c of apoptotic and necrotic cells is

Rosell, F. I., and Gray, H. B. (2003) Structural model for

detected by monoclonal antibody binding and mimicked

an alkaline form of ferricytochrome c, J. Am. Chem. Soc.,

by association of the native antigen with synthetic phos

125, 2913 2922, doi: 10.1021/ja027180s.

pholipid vesicles, Biochemistry,

38,

35993609,

26.

Amacher, J. F., Zhong, F., Lisi, G. P., Zhu, M. Q., Alden,

doi: 10.1021/bi9809268.

S. L., et al. (2015) A compact structure of cytochrome c

41.

Abriata, L. A., Cassina, A., Tortora, V., Marin, M., Souza,

trapped in a lysine ligated state: loop refolding and func

J. M., et al. (2009) Nitration of solvent exposed tyrosine 74

tional implications of a conformational switch, J. Am.

on cytochrome c triggers heme iron methionine 80 bond

Chem. Soc., 137, 8435 8449, doi: 10.1021/jacs.5b01493.

disruption. Nuclear magnetic resonance and optical spec

27.

Davis, L. A., Schejter, A., and Hess, G. P. (1974) Alkaline

troscopy studies, J. Biol. Chem., 284, 17 26, doi: 10.1074/

isomerization of oxidized cytochrome c. Equilibrium and

jbc.M807203200.

kinetic measurements, J. Biol. Chem., 249, 2624 2632.

42.

Santucci, R., Sinibaldi, F., Patriarca, A., Santucci, D., and

28.

Gadsby, P. M., Peterson, J., Foote, N., Greenwood, C., and

Fiorucci, L. (2010) Misfolded proteins and neurodegener

Thomson, A. J. (1987) Identification of ligand exchange

ation: role of non native cytochrome c in cell death, Expert

process tn the alkaline transition of horse cytochrome c,

Rev. Proteomics, 7, 507 5017, doi: 10.1586/epr.10.50.

Biochem. J., 246, 43 54, doi: 10.1042/bj2460043.

43.

Josephs, T. M., Liptak, M. D., Hughes, G., Lo, A., Smith,

29.

Nelson, C. J., and Bowler, B. E. (2000) pH dependence of

R. M., et al. (2013) Conformational change and human

formation of a partially unfolded state of a Lys 73 → His

cytochrome c function: mutation of residue 41 modulates

variant of iso 1 cytochrome c: implications for the alkaline

caspase activation and destabilizes Met 80 coordination,

conformational transition of cytochrome c, Biochemistry,

J. Biol. Inorg. Chem., 18, 289 297, doi: 10.1007/s00775

39, 13584 13594, doi: 10.1021/bi0017778.

012 0973 1.

30.

Hoang, L., Maity, H., Krishna, M. M. G., Lin, Y., and

44.

Liptak, M. D., Fagerlund, R. D., Ledgerwood, E. C.,

Englander, S. W.

(2003) Folding units govern the

Wilbanks, S. M., and Bren, K. L. (2011) The proapoptotic

cytochrome c alkaline transition, J. Mol. Biol., 331, 37 43,

G41S mutation to human cytochrome c alters the heme

doi: 10.1016/s0022 2836(03)00698 3.

electronic structure and increases the electron self

31.

Weinkam, P., Zimmermann, J., Sagle, L. B., Matsuda, S.,

exchange rate, J. Am. Chem. Soc., 133, 11531155,

Dawson, P. E., Wolynes, P. G., and Romesberg, F. E.

doi: 10.1021/ja106328k.

(2008) Characterization of alkaline transitions in ferricy

45.

Karsisiotis, A. I., Deacon, O. M., Wilson, M. T.,

tochrome c using carbon deuterium infrared probes,

Macdonald, C., Blumenschein, T. M. A., et al. (2016)

Biochemistry, 47, 13470 13480, doi: 10.1021/bi801223n.

Increased dynamics in the 40 57 Ω loop of the G41S vari

32.

Hartshorn, R. T., and Moore, G. R. (1989) A denatura

ant of human cytochrome c promote its pro apoptotic con

tion induced proton uptake study of horse cytochrome c,

formation, Sci. Rep., 6, 30447, doi: 10.1038/srep30447.

Biochem. J., 258, 595 598, doi: 10.1042/bj2580595.

46.

De Rocco, D., Cerqua, C., Goffrini, P., Russo, G.,

33.

Rosell, F. I., Harris, T. R., Hildebrand, D. P., Döpner, S.,

Pastore, A., et al. (2014) Mutations of cytochrome c iden

Hildebrandt, P., and Mauk, A. G. (2000) Characterization

tified in patients with thrombocytopenia THC4 affect both

of an alkaline transition intermediate stabilized in the

apoptosis and cellular bioenergetics, Biochim. Biophys.

Phe82Trp variant of yeast iso 1 cytochrome c,

Acta, 1842, 269 274, doi: 10.1016/j.bbadis.2013.12.002.

Biochemistry, 39, 9047 9054, doi: 10.1021/bi001095k.

47.

Garcia Heredia, J. M., Diaz Quintana, A., Salzano, M.,

34.

Silkstone, G. G., Cooper, C. E., Svistunenko, D., and

Orzaez, M., Perez Paya, E., et al. (2011) Tyrosine phos

Wilson, M. T. (2005) EPR and optical spectroscopic stud

phorylation turns alkaline transition into a biologically rel

ies of Met80X mutants of yeast ferricytochrome c. Models

evant process and makes human cytochrome c behave as an

for inter mediates in the alkaline transition, J. Am. Chem

ant apoptotic switch, J. Biol. Inorg. Chem., 16, 1155 1168,

Soc., 127, 92 99, doi: 10.1021/ja045719b.

doi: 10.1007/s00775 011 0804 9.

35.

Verbaro, D., Hagarman, A., Soffer, J., and Schweitzer

48.

Capdevila, D., Alvarez Paggi, D., Castro, M., Tortora, V.,

Stenner, R. (2009) The pH dependence of the 695 nm

Demicheli, V., et al. (2014) Coupling of tyrosine deproto

charge transfer band reveals the population of an interme

nation and axial ligand exchange in nitrocytochrome c,

diate state of the alkaline transition of ferricytochrome c at

Chem. Commun., 50, 2592 2594, doi: 10.1039/c3cc47207h.

low ion concentrations, Biochemistry, 48, 29902996,

49.

Josephs, T. M., Morison, I. M., Day, C. L., Wilbanks,

doi: 10.1021/bi802208f.

S. M., and Ledgerwood, E. C. (2014) Enhancing the per

36.

Bai, Y., Sosnick, T. R., Mayne, L., and Englander, S. W.

oxidase activity of cytochrome c by mutation of residue 41:

(1995) Protein folding intermediates: native state hydrogen

implications for peroxidase mechanism any cytochrome c

exchange, Science,

269,

192197, doi:

10.1126/sci

release, Biochem. J.,

458,

259265, doi:

10.1042/

ence.7618079.

BJ20131386.

37.

Godbole, S., and Bowler, B. E. (1999) Effect of pH on for

50.

Diederix, R. E., Ubbink, M., and Canters, G. W. (2001)

mation of a nativelike intermediate on the unfolding path

The peroxidase activity of cytochrome c 550 from

way of a Lys 73→His variant of yeast iso 1 cytochrome c,

Paracoccus versutus, Eur. J. Biochem., 268, 4207 4216,

Biochemistry, 38, 487 495, doi: 10.1021/bi981698k.

doi: 10.1046/j.1432 1327.2001.02335.x.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

51.

Diederix, R. E., Ubbink, M., and Canters, G. W. (2002)

and other phenolic compounds, J. Am. Chem. Soc., 69,

Peroxidase activity as a tool for studying the folding of c

2998 3000, doi: 10.1021/ja01204a018.

type cytochromes, Biochemistry,

41,

1306713077,

66.

Myers, J. K., Pace, C. N., and Scholtz, J. M. (1995)

doi: 10.1021/bi0260841.

Denaturant m values and heat capacity changes: relation to

52.

McClelland, L. J., Mou, T. Ch., Jeakins Cooley, M. E.,

changes in accessible surface areas of protein unfolding,

Sprang, S. R., and Bowler, B. E. (2014) Structure of mito

Protein Sci., 4, 2138 2148.

chondrial cytochrome c conformer competent for peroxi

67.

Santoro, M. M., and Bolen, D. W. (1988) Unfolding free

dase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111, 6648 6653,

energy changes determined by the linear extrapolation

doi: 10.1073/pnas.1323828111.

method. 1. Unfolding of phenylmethanesulfonyl alpha

53.

Battistuzzi, G., Borsari, M., Sola, M., and Francia, F.

chymotrypsin using different denaturants, Biochemistry,

(1997) Redox thermodynamics of the native and alkaline

27, 8063 8068, doi: 10.1021/bi00421a014.

forms of eukaryotic and bacterial class I cytochrome c,

68.

URL: https://www.3ds.com/products services/biovia/

Biochemistry, 36, 16247 16258, doi: 10.1021/bi971535g.

(Dassault Systems BIOVIA; Discovery Studio Client; San

54.

Millo, D., Bonifacio, A., Raineri, A., Borsari, M., Gooijer, C,

Diego, USA (2020) Dassault Systems BIOVIA; Discovery

and Van Der Zwan, G. (2007) pH induced changes in

Studio 2020 Client; San Diego, USA.)

absorbed cytochrome c. Voltammetric and surface

69.

Bushnell, G. W., Louie, G. V., and Brayer, G. D. (1990)

enhanced resonance Raman characterization performed

High resolution three dimensional structure of horse heart

simultaneously at chemically modified silver electrodes,

cytochrome c, J. Mol. Biol., 214, 585 595, doi: 10.1016/

Langmuir, 23, 9898 9904, doi: 10.1021/la701751r.

0022 2836(90)90200 6.

55.

Capdevila, D. A., Oviedo Rouco, S., Tomasina, F.,

70.

Bowers, K. J., Sacerdoti, F. D., Salmon, J. K., Shan, Y.,

Torora, V., Demicheli, V., et al. (2015) Active site structure

Shaw, D. E., et al. (2006) Molecular dynamics - Scalable

and peroxidase activity of oxidatively modified cytochrome

algorithms for molecular dynamics simulations on com

c species in complexes with cardiolipin, Biochemistry, 54,

modity clusters, Proceedings of the 2006 ACM/IEEE confer

7491 7504, doi: 10.1021/acs.biochem.5b00922.

ence on Supercomputing SC ‘06, ACM Press.

56.

Deacon, O. M., Karsisiotis, A. I., Moreno Chicano, T.,

71.

Berendsen, H. J. C., Grigera, J. R., and Straatsma, T. P.

Hough, M. A., Macdonald, C., et al. (2017) Heightened

(1987) The missing term in effective pair potentials,

dynamics of the oxidized Y48H variant of human

J. Phys. Chem., 91, 6269 6271, doi: 10.1021/j100308a038.

cytochrome c increases its peroxidatic activity,

72.

Jorgensen, W. L., and Tirado Rives, J. (1988) The OPLS

Biochemistry, 56, 6111 6124, doi: 10.1021/acs.biochem.

[optimized potentials for liquid simulations] potential

7b00890.

functions for proteins, energy minimizations for crystals of

57.

Tomášková, N., Varhač, R., Lysáková, V., Musatov, A., and

cyclic peptides and crambin, J. Am. Chem. Soc., 110, 1657

Sedlák, E. (2018) Peroxidase activity of cytochrome c in its

1666, doi: 10.1021/ja00214a001.

compact state depends on dynamics of the heme region,

73.

Jorgensen, W. L., Tirado Rives, J. (2005) Potential energy

Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom., 1866, 1073 1083,

functions for atomic level simulations of water and organ

doi: 10.1016/j.bbapap.2018.09.003.

ic and biomolecular systems, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

58.

Žoldák, G., Sprinzl, M., and Sedlák, E.

(2004)

102, 6665 6670, doi: 10.1073/pnas.0408037102.

Modulation of activity of NADH oxidase from Thermus

74.

Masood, T. B., Sandhya, S., Chandra, N., and

thermophilus through change in flexibility in the enzyme

Natarajan, V. (2015) CHEXVIS: a tool for molecular channel

active site induced by Hofmeister series anions, Eur. J.

extraction and visualization, BMC Bioinformatics, 16, 119.

Biochem.,

271,

4857, doi:

10.1046/j.1432 1033.

75.

Baldwin, R. L. (1996) How Hofmeister ion interactions

2003.03900.x.

affect protein stability, Biophys. J.,

71,

20562063,

59.

Dér, A., Kelemen, L., Fábián, L., Taneva, S. G., Fodor, E.,

doi: 10.1016/S0006 3495(96)79404 3.

et al. (2007) Interfacial water structure controls protein

76.

Russell, B. S., and Bren, K. L. (2002) Denaturant depen

conformation, J. Phys. Chem. B.,

111,

53445350,

dence of equilibrium unfolding intermediates and dena

doi: 10.1021/jp066206p.

tured state structure of horse ferricytochrome c, J. Biol.

60.

Varhač, R., Tomášková, N., Fabián, M., and Sedlák, E.

Inorg. Chem., 7, 909 916, doi: 10.1007/s00775 002 0381 z.

(2009) Kinetics of cyanide binding as a probe of local sta

77.

Tsong, T. Y. (1974) The Trp 59 fluorescence of ferricy

bility/flexibility of cytochrome c, Biophys. Chem., 144, 21

tochrome c as a sensitive measure of the over all protein

26, doi: 10.1016/j.bpc.2009.06.001.

conformation, J. Biol. Chem., 249, 1988 1990.

61.

Bogár, F., Bartha, F., Násztor, Z., Fábián, L., Leitgeb, B.,

78.

Oviedo Rouco, S., Perez Bertoldi, J. M., Spedalieri, C,

and Dér, A. (2014) On the Hofmeister effect: fluctuations at

Castro, M. A., Tomasina, F., et al. (2020) Electron transfer

the protein water interface and the surface tension, J. Phys.

and conformational transitions of cytochrome c are modu

Chem. B., 118, 8496 8504, doi: 10.1021/jp502505c.

lated by the same dynamical features, Arch. Biochem.

62.

Tomášková, N., Varhač, R., Žoldák, G., Olekšáková, L.,

Biophys., 680, 108243, doi: 10.1016/j.abb.2019.108243.

Sedláková, D., and Sedlák, E. (2007) Conformational sta

79.

Theorell, H., and Åkesson, Å.

(1941) Studies on

bility and dynamics of cytochrome c affect its alkaline iso

cytochrome c. II. The optical properties of pure

merization, J. Biol. Inorg. Chem.,

12,

257266,

cytochrome c and some of its derivatives, J. Am. Chem.

doi: 10.1007/s00775 006 0183 9.

Soc., 63, 1804 1811, doi: 10.1021/ja01852a005.

63.

Garajová, K., Balogová, A., Dušeková, E., Sedláková, D,

80.

Barker, P. D., and Mauk, A. G. (1992) pH Linked confor

Sedlák, E., and Varhač, R. (2017) Correlation of lysozyme

mational regulation of a metalloprotein oxidation reduc

activity and stability in the presence of Hofmeister series

tion equilibrium: electrochemical analysis of the alkaline

anions, Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom., 1865,

form of cytochrome c, J. Am. Chem. Soc., 114, 3619 3624,

281 288, doi: 10.1016/j.bbapap.2016.11.016.

doi: 10.1021/ja00036a006.

64.

Dušeková, E., Garajová, K., Yavaşer, R., Varhač, R., and

81.

Lambeth, D. O., Campbell, K. L., Zand, R., and

Sedlák, E. (2018) Hofmeister effect on catalytic properties

Palmer, G. (1973) The appearance of transient species of

of chymotrypsin is substrate dependent, Biophys. Chem.,

cytochrome c upon rapid oxidation or reduction at alkaline

243, 8 16, doi: 10.1016/j.bpc.2018.10.002.

pH, J. Biol. Chem., 248, 8130 8136.

65.

Lemon, H. W. (1947) The effect of alkali on the ultraviolet

82.

Deacon, O. M., White, R. W., Moore, G. R., Wilson,

absorption spectra of hydroxyaldehydes, hydroxyketones,

M. T., and Worrall, J. A. R. (2020) Comparison of the

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

ЭФФЕКТ ХОФМЕЙСТЕРА ПРИ ЩЕЛОЧНОМ СОСТОЯНИИ ЦИТОХРОМА c

structural dynamic and mitochondrial electron transfer

perturbations of the heme chromophore in cytochrome C

properties of the proapoptotic human cytochrome c vari

at room temperature probed by visible electronic circular

ants, G41S, Y48H and A51V, J. Inorg. Biochem., 203,

dichroism spectroscopy, Biophys. J.,

92,

989998,

110924, doi: 10.1016/j.jinorgbio.2019.110924.

doi: 10.1529/biophysj.106.095976.

83.

Deacon, O. M., Svistusenko, D. A., Moore, G. R., Wilson,

98. Shah, R., and Schweitzer Stenner, R. (2008) Structural

M. T., and Worrall, J. A. R. (2018) Naturally occurring dis

changes of horse heart ferricytochrome c induced by

ease related mutations in the 40 57 Ω loop of human

changes of ionic strength and anion binding, Biochemistry,

cytochrome c control triggering of the alkaline isomeriza

47, 5250 5257, doi: 10.1021/bi702492n.

tion, Biochemistry, 57, 42764288, doi: 10.1021/acs.

99. Schweitzer Stenner, R., Shah, R., Hagarman, A., and

biochem.8b00520.

Dragomir, I. (2007) Conformational substates of horse

84.

Guerra Castellano, A., D az Quintana, A., Moreno

heart cytochrome c exhibit different thermal unfolding of

Beltrán, B., López Prados, J., Nieto, P. M., et al. (2015)

the heme cavity, J. Phys. Chem. B, 111, 96039607,

Mimicking tyrosine phosphorylation in human

doi: 10.1021/jp069022j.

cytochrome c by the evolved tRNA synthetase technique,

100. Maity, H., Maity, M., and Englander, S. W. (2004) How

Chemistry,

21,

1500415012, doi:

10.1002/chem.

cytochrome c folds, and why: submolecular foldon units

201502019.

and their stepwise sequential stabilization, J. Mol. Biol.,

85.

Tsai, M. Y., Morozov, A. N., Chu, K. Y., and Lin, S. H.

343, 223 233, doi: 10.1016/j.jmb.2004.08.005.

(2009) Molecular dynamics insight into the role of tertiary

101. Hu, W., Kan, Z. Y., Mayne, L., and Englander, S. W. (2016)

(foldon) interactions on unfolding in cytochrome c, Chem.

Cytochrome c folds through foldon dependent native like

Phys. Lett., 475, 111115, doi: 10.1016/j.cplett.2009.

intermediates in an ordered pathway, Proc. Natl. Acad. Sci.

05.027.

USA, 113, 3809 3814, doi: 10.1073/pnas.1522674113.

86.

George, P., and Tsou, C. L. (1952) Reaction between

102. Dickerson, R. E., Takano, T., Eiseberg, D., Kallai, O. B.,

hydrocyanic acid, cyanide ion and ferricytochrome c,

Samson, L., Cooper, A., and Margoliash, E.

(1971)

Biochem. J., 50, 440 448, doi: 10.1042/bj0500440.

Ferricytochrome c. I. General features of the horse and

87.

Sutin, N., and Yandell, J. K. (1972) Mechanisms of the

bonito proteins at 2.8 Å resolution, J. Biol. Chem., 246,

reactions of cytochrome c. Rate and equilibrium constants

1511 1535.

for ligand binding to horse heart ferricytochrome c, J. Biol.

103. Louie, G. V., Hutcheon, W. L., and Brayer, G. D. (1988)

Chem., 247, 6932 6936.

Yeast iso 1 cytochrome c. A 2.8 Å resolution three dimen

88.

Dumortier, C., Meyer, T. E., and Cusanovich, M. A.

sional structure determination, J. Mol. Biol., 199, 295 314,

(1999) Protein dynamics: imidazole binding to class I C

doi: 10.1016/0022 2836(88)90315 4.

type cytochromes, Arch Biochem Biophys., 371, 142 148,

104. Levin, Ö.

(1963) Electron micrographs of bovine

doi: 10.1006/abbi.1999.1440.

cytochrome c, J. Mol. Biol., 6, 137 140, doi: 10.1016/

89.

Tomášková, N., Varinská, L., and Sedlák, E. (2010) Rate of

S0022 2836(63)80129 1.

oxidative modification of cytochrome c by hydrogen per

105. Margoliash, E., Needleman, S. B., and Stewart, J. W.

oxide is modulated by Hofmeister anions, Gen. Physiol.

(1963) A comparison of the amino acid sequences of the

Biophys., 29, 254 264, doi: 10.4149/gpb_2010_03_255.

cytochrome c of several vertebrates, Acta Chem. Scand., 17,

90.

Pearce, L. L., Gärtner, A. L., Smith, M., and Mauk, A. G.

S250 S256.

(1989) Mutation induced perturbation of the cyto

106. Zand, R., and Vinogradov, S. (1968) Circular Dichroism

chrome c alkaline transition, Biochemistry, 28, 3152 3156,

Studies II. The far ultraviolet circular dichroism of

doi: 10.1021/bi00434a006.

cytochrome c, Arch. Biochem. Biophys., 125, 9497,

91.

Nall, B. T., Zuniga, E. H., White, T. B., Wood, L. C., and

doi: 10.1016/0003 9861(68)90642 5.

Ramdas, L. (1989) Replacement of a conserved proline

107. Margoliash, E., Schejter, A. (1966) Cytochrome c, Adv.

and the alkaline conformational change in iso 2

Protein Chem.,

21,

113286, doi:

10.1016/s0065

cytochrome c, Biochemistry, 28, 9834 9839, doi: 10.1021/

3233(08)60128 x.

bi00451a043.

108. Takano, T., and Dickerson, R. E. (1981) Conformation

92.

Sinibaldi, F., Piro, M. C., Howes, B. D., Smulevich, G.,

change of cytochrome c. I. Ferricytochrome c refinement

Ascoli, F., and Santucci, R. (2003) Rupture of the hydro

at 1.8 Å and comparison with the ferrocytochrome struc

gen bond linking two Omega loops induces the molten

ture, J. Mol. Biol., 153, 95115, doi: 10.1016/0022

globule state at neutral pH in cytochrome c, Biochemistry,

2836(81)90529 5.

42, 7604 7610, doi: 10.1021/bi034132r.

109. Berghuis, A. M., and Brayer, G. D. (1992) Oxidation state

93.

Baddam, S., and Bowler, B. E. (2006) Mutation of

dependent conformational changes in cytochrome c,

asparagine 52 to glycine promotes the alkaline form of iso

J. Mol. Biol.,

223,

959976, doi:

10.1016/0022

1 cytochrome c and causes loss of cooperativity in acid

2836(92)90255 i.

unfolding, Biochemistry, 45, 4611 4619, doi: 10.1021/

110. Lei, H., Bowler, B. E. (2019) Naturally occurring A51V

bi0524971.

variant of human cytochrome c destabilizes the native state

94.

Taler, G., Schejter, A., Navon, G., Vig, I., and

and enhances peroxidase activity, J. Phys. Chem. B, 123,

Margoliash, E. (1995) The nature of the thermal equilibri

8939 8953, doi: 10.1021/acs.jpcb.9b05869.

um affecting the iron coordination of ferric cytochrome c,

111.

Harbury, H. A., Cronin, J. R., Fanger, M. W., Hettinger,

Biochemistry, 34, 14209 14212, doi: 10.1021/bi00043a027.

T. P., Murphy, A. J., et al. (1965) Complex formation

95.

Banci, L., Bertini, I., Spyroulias, G. A., and Turano, P.

between methionine and a heme peptide from

(1998) The conformational flexibility of oxidized

cytochrome c, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1658 1664,

cytochrome c studied through its interaction with NH3 and

doi: 10.1073/pnas.54.6.1658.

at high temperatures, Eur. J. Inorg. Chem., 1998, 583 591.

112. Wilgus, H., and Stellwagen, E. (1974) Alkaline isomeriza

96.

Varhač, R., Sedláková, D., Stupák, M., and Sedlák, E.

tion of ferricytochrome c: identification of the lysine lig

(2015) Non two state thermal denaturation of ferricy

and, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

71,

28922894,

tochrome c at neutral and slightly acidic pH values, Biophys.

doi: 10.1073/pnas.71.7.2892.

Chem., 203 204, 41 50, doi: 10.1016/j.bpc.2015.05.002.

113. Brautigan, D. L., Feinberg, B. A., Hoffman, B. M.,

97.

Dragomir, I., Hagarman, A., Wallace, C., and Schweitzer

Margoliash, E., Preisach, J., and Blumberg, W. E. (1977)

Stenner, R. (2007) Optical band splitting and electronic

Multiple low spin forms of the cytochrome c ferrihe

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021

СЕДЛАК и др.

mochrome. EPR spectra of various eukaryotic and

119. Paul, K. G. (1947) Oxidation reduction potential of

prokaryotic cytochromes c, J. Biol. Chem., 252, 574 582.

cytochrome c, Arch. Biochem., 12, 441 450.

114. Ferrer, J. C., Guillemette, J. G., Bogumil, R., Inglis, S. C.,

120. Henderson, R. W., and Rawlinson, W. A.

(1956)

Smith, M., and Mauk, A. G. (1993) Identification of Lys79

Oxidation reduction potential od modified cytochrome c,

as an iron ligand in one form of alkaline state yeast iso 1

Nature, 177, 1180 1181, doi: 10.1038/1771180b0.

cytochrome c, J. Am. Chem. Soc., 115, 75077508,

121. Theodorakis, J. L., Garber, E. A., McCracken, J., Peisach, J.,

doi: 10.1021/ja00069a062.

Schejter, A., and Margoliash, E. (1995) A chemical modi

115. Moore, G. R., and Williams, R. J. P. (1977) Structural basis

fication of cytochrome c lysines leading to changes in

for the variation in redox potential of cytochromes, FEBS

heme iron ligation, Biochim. Biophys. Acta, 1252, 103 113,

Lett., 79, 229 232, doi: 10.1016/0014 5793(77)80793 x.

doi: 10.1016/0167 4838(95)00097 e.

116. Eaton, W. A., and Hochstrasser, R. M. (1967) Electric

122. Lemberg, R., and Barrett, J.

(1973) Cytochromes,

spectrum of single crystals of ferricytochrome c, J. Chem.

Academic Press, New York.

Phys., 46, 2533 2539, doi: 10.1063/1.1841081.

123. Rodkey, F. L., and Ball, E. G. (1950) Oxidation reduction

117. Pettigrew, G. W., and Moore, G. R. (1987) Cytochromes c

potentials of the cytochrome c system, J. Biol. Chem., 182,

Biological Aspects, Springer Verlag, Berlin Heidelberg,

17 28.

doi: 10.1007/978 3 642 72698 9.

124. Shejter, A., Luntz, T. L., Koshy, T. I., and Margoliash, E.

118. Brandt, K. G., Parks, P. C., Czerlinski, G. H., and Hess,

(1992) Relationship between local and global stabilities of

G. P. (1966) On the elucidation of the pH dependence of

proteins: site directed mutants and chemically modified

the oxidation reduction potential of cytochrome c at alka

derivatives of cytochrome c, Biochemistry, 31, 8336 8343,

line pH, J. Biol. Chem., 241, 4180 4185.

doi: 10.1021/bi00150a030.

ANIONS SPECIFIC EFFECTS ON ALKALINE STATE OF CYTOCHROME c

E. Sedlák^1,2, T. Kožár², R. Varhač¹, A. Musatov³, and N. Tomášková¹*

¹ Department of Biochemistry, Faculty of Science, P. J. Šafárik University,

04154 Košice, Slovakia; E mail: natasa.tomaskova@upjs.sk

² Centre for Interdisciplinary Biosciences, P. J. Šafárik University, 04154 Košice, Slovakia

³ Department of Biophysics, Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, 04001 Košice, Slovakia

Specific effects of anions on the structure, thermal stability, and peroxidase activity of native (state III) and alkaline

(state IV) cytochrome c (cyt c) have been studied by the UV VIS absorbance spectroscopy, intrinsic tryptophan fluo

rescence, and circular dichroism. Thermal and isothermal denaturation monitored by the tryptophan fluorescence

and circular dichroism, respectively, implied lower stability of cyt c state IV in comparison with the state III. The pK_a

value of alkaline isomerization of cyt c depended on the present salts, i.e., kosmotropic anions increased and

chaotropic anions decreased pK_a (Hofmeister effect on protein stability). The peroxidase activity of cyt c in the

state III, measured by oxidation of guaiacol, showed clear dependence on the salt position in the Hofmeister series,

while cyt c in the alkaline state lacked the peroxidase activity regardless of the type of anions present in the solution.

The alkaline isomerization of cyt c in the presence of 8 M urea, measured by Trp59 fluorescence, implied an existence

of a high affinity non native ligand for the heme iron even in a partially denatured protein conformation. The con

formation of the cyt c alkaline state in 8 M urea was considerably modulated by the specific effect of anions. Based on

the Trp59 fluorescence quenching upon titration to alkaline pH in 8 M urea and molecular dynamics simulation, we

hypothesize that the Lys79 conformer is most likely the predominant alkaline conformer of cyt c. The high affinity of

the sixth ligand for the heme iron is likely a reason of the lack of peroxidase activity of cyt c in the alkaline state.

Keywords: alkaline isomerization, Hofmeister anions, pseudo peroxidase activity

БИОХИМИЯ том 86 вып. 1 2021