БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 12, с. 1818 - 1825

УДК 57.088;575;929;7.06

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО АУТЕНТИЧНОСТИ

ЛОКОНА ВОЛОС, ПРЕДСТАВЛЕННОГО КАК РЕЛИКВИЯ

В МУЗЕЙНОМ ПОРТРЕТЕ ЦЕСАРЕВИЧА АЛЕКСЕЯ,

СЫНА ПОСЛЕДНЕГО РОССИЙСКОГО ИМПЕРАТОРА

Т.В. Андреева^1,2, А.Д. Манахов³, С.С. Кунижева¹, Е.И. Рогаев^1,2,3,4*

¹ Московский государственный университета имени М.В. Ломоносова,

Центр генетики и генетических технологий, биологический факультет,

кафедра генетики, 119991 Москва, Россия; электронная почта: rogaev@vigg.ru

² Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, отдел геномики и генетики человека,

лаборатория эволюционной геномики, 119991 Москва, Россия

³ Научно3технологический университет «Сириус», Научный Центр генетики и наук о жизни,

354340 Сочи, Краснодарский край, Россия

⁴ Медицинская школа Чан Массачусетского университета, департамент психиатрии, 01545 Шрусбери, США

Поступила в редакцию 11.11.2021

После доработки 11.11.2021

Принята к публикации 12.11.2021

Подлинность произведения искусства - это главный фактор, обуславливающий его ценность. Применение

генетического подхода для определения подлинности и происхождения музейной реликвии представлено в

данной работе. Были исследованы два волоска без волосяных луковиц из локона, вмонтированного в уни#

кальный экспонат, хранящийся в Государственном историческом музее - акварельный портрет цесаревича

Алексея Романова, сына последнего русского императора Николая II. С использованием методов масштаб#

ного параллельного секвенирования, а также с помощью мультиплексной ПЦР с последующим секвениро#

ванием продуктов методом Сэнгера был проведён анализ маркёров митохондриальной ДНК (мтДНК). Для

сравнения использовали реконструированную нами ранее полную последовательность мтДНК цесаревича

Алексея, унаследованную им по женской линии королевы Виктории [Rogaev et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 106, 5258#5263]. Несмотря на очень низкое качество и малое количество ДНК, которое удалось выде#

лить из уникальных исторических образцов, нами были определены информативные маркёры мтДНК в об#

разцах из двух единичных волос без волосяных луковиц. Было показано, что гаплотип мтДНК исследован#

ных волос соответствует гаплотипу мтДНК цесаревича Алексея, его сестры, а также матери, императрицы

Александры Фёдоровны Романовой. Этот гаплотип является уникальным и отсутствует в существующих в

настоящее время базах данных последовательностей мтДНК. Полученные результаты свидетельствуют о

том, что локон волос, вмонтированный в портрет, имеет отношение к семье последнего российского импе#

ратора Николая II. Представленная работа является первым примером успешного применения геномного

метода для оценки ценности произведения искусств и показывает перспективность внедрения генетичес#

ких технологий для оценки подлинности музейных экспонатов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: древняя ДНК, музейный экспонат, волос, мтДНК, ДНК#идентификация, масштаб#

ное параллельное секвенирование.

DOI: 10.31857/S032097252112006X

ВВЕДЕНИЕ

малым размером самого волоса, количество кле#

ток в образцах волос, которые могут содержать

Идентификация человека по волосам - одна

ДНК, ограничено, если они вообще присутству#

из важных задач, решаемых в криминалистике.

ют. Также ранее было показано, что содержание

Волосы часто являются единственным источни#

и качество ДНК уменьшается по мере удлине#

ком материала для анализа и при этом наиболее

ния волоса [5-8]. В связи с указанными особен#

ограниченным с точки зрения количества и ка#

ностями волос традиционные методы анализа

чества содержащейся в них ДНК [1, 2]. Результа#

ядерной ДНК, используемые в криминалисти#

ты ранее проведённых исследований, во#пер#

ке, например, основанные на STR#маркёрах,

вых, свидетельствуют о фрагментации ДНК в

могут быть неэффективны при проведении ге#

волосах по мере их роста и кератинизации эпи#

нетического анализа на волосах без луковиц.

телиальных клеток [3, 4]. Во#вторых, в связи с

Митохондриальная ДНК (мтДНК) содержится в

клетках в большем числе копий, чем ядерная, и

* Адресат для корреспонденции.

она менее подвержена деградации, благодаря

1818

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АУТЕНТИЧНОСТЬ ВОЛОСА В ПОРТРЕТЕ

1819

защите дополнительной мембраной [9]. Таким

образом, мтДНК является более перспективным

объектом при проведении генетических экспер#

тиз [10]. Ранее было показано, что для исследо#

вания мтДНК в волосах без волосяных луковиц

могут быть использованы как участки гиперва#

риабельных регионов мтДНК, так и полная ми#

тохондриальная ДНК [11-13].

В Государственном историческом музее хра#

нится уникальная реликвия - акварельный

портрет цесаревича Алексея Романова, напи#

санный русским художником#эмигрантом

В.К. Гулевичем, c вмонтированной в него капсу#

лой, содержащей локон волос, предположитель#

но принадлежавший цесаревичу Алексею Рома#

нову, сыну последнего российского императора

Николая II (рис. 1). Загадка происхождения ре#

ликвии остаётся нерешённой, также неизвест#

но, действительно ли прядь волос принадлежала

Рис. 1. Портрет цесаревича Алексея художника В.К. Гуле#

вича с вмонтированным в него локоном волос. Портрет

сыну последнего российского императора.

хранится в Государственном историческом музее (Моск#

В данной работе мы показали, что единичные

ва, Россия)

волоски из исторических и музейных экспона#

тов возрастом более 100 лет могут быть исполь#

зованы для выделения ДНК, а анализ редких ге#

Несколько волосков были изъяты нами из

нетических вариантов митохондриальной ДНК

данной реликвии в Государственном историчес#

позволяет проводить успешную ДНК#иденти#

ком музее и помещены в две отдельные пробир#

фикацию по материнской линии для таких об#

ки, обозначенные S1 и S2. Все дальнейшие опе#

разцов.

рации с образцами проводили в специальной

лаборатории, оборудованной для работы с древ#

ней ДНК. Мы адаптировали методологию рабо#

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ты с древней ДНК с некоторыми модификация#

ми для анализа очень малого количества мате#

Уникальная реликвия - акварельный пор#

риала - старых образцов волос без луковиц. По

трет русского художника#эмигранта В.К. Гуле#

одному волоску из каждой пробирки (рис. 2)

вича с вмонтированным в него локоном волос

были взяты для выделения ДНК с использова#

был передан Историческому музею после Вто#

нием спин#колонок производства «Qiagen», Гер#

рой мировой войны из Музея памяти императо#

мания. Выделение ДНК из отдельного волоса из

ра Николая II, основанного в Белграде в 1936 г.

каждой пробирки проводили в независимых

белыми эмигрантами. Портрет попал в музей

экспериментах в разные дни. Для контроля воз#

Белграда в 1940 г. вместе с документами, выве#

можного загрязнения в каждом эксперименте

зенными в 1920 г. из России во Францию следо#

выделения ДНК использовали отрицательные

вателем по особо важным делам Омского ок#

контроли выделения.

ружного суда Н.А. Соколовым, расследовавшим

Сначала отдельные волоски, помещённые в

казнь царской семьи в Екатеринбурге. После его

пробирки (1,5 или 2 мл), промывали 0,5%#ным

смерти документы и некоторые вещественные

додецилсульфатом натрия и дважды стерильной

доказательства поступили в Музей памяти им#

водой без нуклеаз («Ambion», США). Далее вы#

ператора в Белграде, откуда по окончании Вели#

деляли ДНК с использованием набора реагентов

кой Отечественной войны портрет с вмонтиро#

QIAmp DNA Investigator kit («Qiagen») в соответ#

ванным в него локоном волос был передан в

ствии с протоколом, рекомендованным произ#

Россию, в Государственный исторический му#

водителем набора для выделения ДНК из волос

зей. Обстоятельства, при которых была срезана

без волосяных луковиц. Лизис образцов прово#

эта прядь волос, а также возможная принадлеж#

дили при 56 °C 2 ч (для волоска S1) или 1 ч (для

ность цесаревичу Алексею давно вызывают воп#

волоска S2). Выделенную ДНК элюировали в

росы у историков и сотрудников музея. Возмож#

35 мкл буфера ATE («Qiagen»).

но, локон был сохранён кем#то, кто находился в

В связи с очень малым ожидаемым количе#

ссылке с царской семьёй, и позже был передан

ством ДНК мы не проводили оценку её концен#

следователю Н.А. Соколову.

трации, а напрямую использовали для приго#

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

1820

АНДРЕЕВА и др.

ровали первоначально на приборе FGx ForenSeq

(«Illumina», США) и потом, для получения боль#

шего объёма информации,

- на приборе

HiSeq2000/2500 («Illumina»). Из полученных в

результате секвенирования коротких прочтений

с помощью программы AdapterRemoval v2 [15]

были удалены последовательности низкого ка#

чества и адаптерные последовательности. Ко#

роткие прочтения длиной более 25 п.н. были

картированы на референсный геном человека

(сборка hg38) и на референсную последователь#

ность мтДНК человека (rCRS, NC_012920.1) с

помощью пакета программ BWA [16] с парамет#

рами, рекомендуемыми для анализа древней

ДНК «#l

1024»,

«#n

0.01» и

«#o

2»

[17].

MapDamage2 использовали для оценки уровня

замен C → T, характерных для древней ДНК, на

концах фрагментов ДНК [18].

Для прямого секвенирования участков

мтДНК проводили мультиплексную амплифи#

кацию, как было описано ранее [19]. В связи с

малым количеством материала и потенциаль#

ными проблемами, обусловленными малым ко#

личеством матрицы, все эксперименты прово#

дили в нескольких повторностях.

Нами были подобраны олигонуклеотидные

праймеры для амплификации коротких фраг#

ментов ДНК, содержащих редкие варианты

(частота аллеля < 0,05), выявленные нами ранее

в мтДНК цесаревича Алексея Романо#

ва (табл. 1). В связи с малым количеством ДНК,

Рис. 2. Образцы волос, использованные для выделения

ДНК: S1 (a) и S2 (б)

выделенной из волосков, проводили два раунда

ПЦР#амплификации [19]. На первом этапе в

мультиплексной ПЦР амплифицировали 3 или

товления геномной библиотеки или ПЦР#амп#

4 фрагмента мтДНК для волос S1 и S2 соответ#

лификации.

ственно. Мультиплексная реакционная смесь

Для приготовления геномной библиотеки мы

объёмом 40 мкл включала 20 мкл 2× QIAGEN

адаптировали протокол, основанный на одноце#

Multiplex PCR Master Mix

(«Qiagen») и

почечной ДНК [14]. При этом 8 мкл образца

2-5 мкл ДНК. В первом раунде проводили

ДНК S2 предварительно репарировали с исполь#

25 циклов амплификации. Затем 1 мкл получен#

зованием смеси ферментов PreCR MIX («NEB»,

ных продуктов мультиплексной ПЦР использо#

США). Готовую геномную библиотеку секвени#

вали для второго раунда ПЦР с индивидуальны#

Таблица 1. Последовательности праймеров для анализа редких вариантов в последовательности мтДНК цесаревича Алексея

Координаты мтДНК

Аллель цесаревича

Частота

Последовательность прямого,

Размер ПЦР#

(NC_012920.1)

Алексея [19]

аллеля

обратного праймера

продукта (п.н.)

524

524.1C 524.2A

0,035

attattttcccctcccactcc, tgtctttggggtttggttg

120

4137

0,0001

gagttggtcgtagcggaatcg, tcctaggaacaacatatgacgca

131

16111

0,054*

acccatcaacaaccgctatg, agggggttttgatgtggatt

120

16357

0,0033

aaacctacccacccttaca, gtcaagggacccctatctg

118

Примечание. * Вариант 16 111T был включён в анализ в связи с крайне низкой частотой встречаемости в европейских по#

пуляциях (частота аллеля T - 0,003).

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АУТЕНТИЧНОСТЬ ВОЛОСА В ПОРТРЕТЕ

1821

ми парами праймеров для каждого локу#

ность мтДНК человека, что недостаточно для её

са (табл. 1). 30 Циклов амплификации проводи#

полного покрытия и реконструкции. Тем не ме#

ли с использованием системы PicoMaxx High

нее нам удалось провести анализ полученных

Fidelity PCR System («Agilent Technology», США)

данных на предмет присутствия в них маркёров

в объёме 20 мкл. Полученные таким образом

мтДНК, которые ранее были выявлены в

ПЦР#фрагменты секвенировали с использова#

мтДНК цесаревича Алексея [19]. Мы обнаружи#

нием набора реагентов BigDye Terminator v3.1

ли 5 таких маркёрных позиций мтДНК, каждая

(«Applied Biosystems», США) на приборе

из которых была покрыта по меньшей мере од#

3730xl DNA Analyzer («Applied Biosystems»).

ним прочтением, содержащим замену, характер#

Секвенирование проводили для каждого про#

ную для мтДНК цесаревича Алексея, включая

дукта ПЦР с использованием как прямого, так и

позиции, содержащие редкие генетические ва#

обратного праймеров. Два независимых муль#

рианты (16 111 и 16 357, табл. 3).

типлексных эксперимента были поставлены для

Секвенирование по методу Сэнгера. Исполь#

ДНК из волоса S1, и 3 повтора были сделаны для

зуя образцы ДНК, выделенные из обоих во#

ДНК из волоса S2, в каждом эксперименте ис#

лос S1 и S2, нам удалось амплифицировать

пользовали отрицательные контроли процедур

участки мтДНК, содержащие редкие аллельные

выделения ДНК и амплификации.

варианты, присутствующие в ранее опублико#

Для определения частот встречаемости ис#

ванных митохондриальных последовательнос#

следуемых вариантов мтДНК мы использовали

тях цесаревича Алексея Романова [19]. Ни в од#

базы данных митохондриальных последователь#

ном из отрицательных контролей специфичес#

ностей EMPOP (http://empop.online/) и Mitomap

ких фрагментов выявлено не было (рис. 5).

(http://mitomap.org/MITOMAP). Отношение

В результате секвенирования методом Сэн#

правдоподобия (LR) рассчитывали, используя

гера трёх индивидуальных ПЦР#продуктов для

односторонний доверительный интервал, по

образца S1 и четырёх - для образца S2 были ре#

стандартной формуле LR = x/y, где x - вероят#

конструированы последовательности соответ#

ность того, что исследуемый и сравниваемый

ствующих фрагментов мтДНК. Для обоих волос

гаплотипы принадлежат к одной и той же мате#

во всех исследуемых позициях были выявлены

ринской линии, а y - вероятность того, что ис#

генетические варианты, совпадающие с вариан#

следуемый образец принадлежит неродственно#

тами мтДНК цесаревича Алексея (рис. 6).

му (или случайно родственному) индивиду из

Статистический анализ. Расчёт отношения

базы данных. В данном случае x всегда прини#

правдоподобия (LR) проводили по методу

мается за 1, а y - односторонний 95%#ный дове#

Holland и Parsons [20] с использованием частот

рительный интервал [20].

встречаемости гаплотипов мтДНК, реконструи#

рованных в результате секвенирования, в базах

данных EMPOP и MITOMAP (табл. 4). Результа#

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ты оценки правдоподобия показывают, что ве#

роятность того, что исследованные образцы во#

Полногеномное секвенирование. Экстракт

лос принадлежат цесаревичу Алексею или

ДНК S2 использовали для приготовления ге#

родственникам Александры Фёдоровны Рома#

номной библиотеки по протоколу, основанному

новой по материнской линии королевы Викто#

на использовании одноцепочечных фрагментов

рии, чьи мтДНК идентичны, не менее чем в

ДНК [14]. Подготовленная библиотека была

4,3 × 10³-5,3 × 10⁴ раз (в зависимости от числа

просеквенирована на платформе Illumina, в об#

индивидов, представленных в базе данных) выше

щей сложности было получено 97 млн «сырых»

вероятности, что изученные образцы волос при#

прочтений. Большая часть прочтений, прошед#

надлежат случайному неродственному индивиду.

ших через процедуру удаления адаптерных пос#

Необходимость исследования произведений

ледовательностей и фильтрацию по качеству,

искусства обусловлена не только их эстетичес#

оказались очень короткими. Только 6 млн про#

чтений (~6% от исходного набора данных), с

Таблица 2. Результаты секвенирования библиотеки, приго#

длиной фрагментов ДНК более 25 п.н. (табл. 2,

товленной из ДНК образца S2, на платформе Illumina

рис. 3), были использованы для последующего

Картировано

Картировано на

Прочтений,

анализа. Фрагменты, картированные на рефе#

Всего

прошедших

геном человека

на мтДНК

ренсную последовательность мтДНК (rCRS),

прочтений

фильтрацию

(hg38)

человека

содержали на концах специфичные для древней

(rCRS)

ДНК замены C → T (рис. 4).

Всего лишь 259 коротких прочтений были

97 300 168

6 174 682

943 795 (15,28%)

259

картированы на референсную последователь#

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

1822

АНДРЕЕВА и др.

Рис. 3. Распределение длин прочтений после фильтрации по качеству и удаления адаптерных последовательностей прог#

раммой AdapterRemoval (а) и прочтений, длиной более 25 п.н., картированых на мтДНК человека (б)

Рис. 4. Профиль нуклеотидных замен, полученный с использованием программы mapDamage2 [18] для прочтений образ#

ца S2, картированных на мтДНК человека. По оси X указана нуклеотидная позиция в прочтении. Наблюдается повыше#

ние уровня замен C → T (красный) к концам фрагментов, специфичное для древней ДНК и обусловленное постморталь#

ными модификациями ДНК, что подтверждает подлинность древней ДНК, полученной из стержня волоса

10380

Рис. 5. Ампликоны, полученные в результате мультиплексной ПЦР (а) и вторичной амплификации с индивидуальными

парами праймеров для позиции 524 мтДНК (б). 1 - Образец S2; 2 - отрицательный контроль выделения ДНК; 3 - отри#

цательный контроль мультиплексной ПЦР; KS2 - отрицательный контроль вторичной ПЦР с индивидуальными прайме#

рами, проведённой на отрицательном контроле выделения ДНК; K- - отрицательный контроль ПЦР с индивидуальны#

ми праймерами; M - маркёр размера ДНК

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АУТЕНТИЧНОСТЬ ВОЛОСА В ПОРТРЕТЕ

1823

ревича Алексея Романова - сына последнего

Таблица 3. Характерные для материнской линии цесареви#

ча Алексея варианты мтДНК, выявленные при секвениро# российского императора Николая II.

вании образца S2

В результате проведённого исследования во#

Рефе#

Аллель,

Число прочте#

Частота

лос без луковиц из исторического произведения

Позиция

ренсный

обнару#

ний, содержа#

по базе

искусства нами был выявлен высокий уровень

мтДНК

аллель

женный

щих альтерна#

GnomAD

фрагментации содержащейся в них ДНК (пре#

в S2

тивный аллель

обладающая длина фрагментов ДНК составляет

менее 25 п.н.), что затрудняет проведение гене#

750

0.98

тического анализа [5-8]. Однако мы показали,

1438

0.96

что несмотря на крайне малое количество высо#

кодеградированной ДНК, выделенной из еди#

16111

0.054

ничных исторических старых волос, она всё же

может быть успешно использована для генети#

16357

0.003

ческого анализа как с применением классичес#

16519

0.66

ких методов (ПЦР и секвенирование по Сэнге#

ру), так и с помощью новых методов масштаб#

ного параллельного секвенирования.

кой значимостью, но и историческими аспекта#

Анализ мтДНК показал, что гаплотип, выяв#

ми их создания и происхождения. В данной ра#

ленный в образцах волос, совпадает с ранее опуб#

боте мы адаптировали и применили методы ана#

ликованным гаплотипом мтДНК цесаревича

лиза древней ДНК для проверки подлинности

Алексея, его сестры Марии и их матери - импе#

ценного музейного экспоната - пряди волос,

ратрицы Александры Фёдоровны [19] (табл. 5).

вмонтированной в акварельный портрета цеса#

Мы не обнаружили этот гаплотип ни в одной из

Таблица 4. Частоты встречаемости выявленного гаплотипа и отношения правдоподобия (LR) по базам данных EMPOP и

MITOMAP

База данных (число

Число

Оценочная

Частота гаплотипа, 95%#ный

LR, 95%#ный

последовательностей

совпадений

частота

доверительный интервал

в базе)

гаплотипа^#

EMPOP¹ (4289)

0,00023

0,00070

4,3×10³

1,4×10³

EMPOP² (38361)

0,00003

0,00008

3,8×10⁴

1,3×10⁴

MITOMAP³ (52633)

0 (3*)

0,00002

0,00006

5,3×10⁴

1,8×10⁴

¹ База EMPOP, полные последовательности мтДНК.

² База EMPOP, контрольный регион мтДНК (16024-576).

³ База MITOMAP, полные последовательности мтДНК.

* Последовательности мтДНК Императрицы Александры Фёдоровны (FJ656214.1), цесаревича Алексея (FJ656216.1) и Ве#

ликой Княжны Марии (FJ656217.1) были включены ранее в базу MITOMAP [19].

^# Рассчитана по [20].

Таблица 5. Варианты мтДНК, выявленные в образцах волос, вмонтированных в портрет царевича Алексея, и у представи#

телей женской линии королевы Виктории

Позиция

Референснсый

Прядь

Алексей

Мария

Александра Фёдоровна

Родственники королевы Виктории

мтДНК

вариант

волос

(N146)*

(N147)*

(N7)*

по материнской линии*

524,1

524,2

750

1438

16111

16357

16519

* Данные из [19].

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

1824

АНДРЕЕВА и др.

Рис. 6. Электрофореграмма секвенирования методом Сэнгера фрагментов мтДНК волоса S2. Синими рамками отмечены

позиции с редкими генетическими вариантами, ранее выявленными в мтДНК цесаревича Алексея

проанализированных баз данных, за исключе#

Финансирование. Данная работа была час#

нием гаплотипов у трёх индивидов, опублико#

тично поддержана проектом Минобрнауки Рос#

ванных нами ранее, которые представлены в

сии, системный номер 075#10#2020#116 (грант

базе данных MITOMAP, и принадлежащих им#

№ 13.1902.21.0023) (разработка методов геном#

ператрице Александре Фёдоровне (FJ656214.1),

ного секвенирования и анализа древней ДНК).

цесаревичу Алексею (FJ656216.1) и великой

Благодарности. Авторы выражают благодар#

княжне Мария (FJ656217.1) [19]. Таким обра#

ность сотрудникам Государственного Истори#

зом, полученные нами данные показывают

ческого Музея Евгению Лукьянову и Алексею

принадлежность локона волос, вмонтирован#

Константиновичу Левыкину за предоставление

ного в портрет цесаревича Алексея, прямому

материалов, фотографий портрета и оказанную

родственнику королевы Виктории и Александ#

в ходе проведения исследования поддержку.

ры Фёдоровны Романовой (внучка королевы

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от#

Виктории и мать царевича Алексея) по женс#

сутствии конфликта интересов.

кой линии. Это подтверждает гипотезу о про#

Соблюдение этических норм. Настоящая статья

исхождении данной реликвии от цесаревича

не содержит описания каких#либо исследований

Алексея.

с участием людей или животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Pfeiffer, H., Hühne, J., Ortmann, C., Waterkamp, K.,

sue. Part I: Hair and nail, Ann. Anat., 194, 17#25,

Brinkmann, B. (1999) Mitochondrial DNA typing from

doi: 10.1016/j.aanat.2011.03.013.

human axillary, pubic and head hair shafts - success rates

Linch, C. A., Whiting, D. A., and Holland, M. M. (2001)

and sequence comparisons, Int. J. Legal Med., 112, 287#

Human Hair histogenesis for the mitochondrial DNA

290, doi: 10.1007/s004140050251.

forensic scientist, J. Forensic Sci.,

46,

15056J,

Graham, E. A. M. (2007) DNA reviews: ancient DNA,

doi: 10.1520/jfs15056j.

Forensic Sci. Med. Pathol., 3, 221#225.

Almeida, M., Betancor, E., Fregel, R., Suárez, N. M., and

Brandhagen, M. D., Loreille, O., and Irwin, J. A. (2018)

Pestano, J. (2011) Efficient DNA extraction from hair

Fragmented nuclear DNA is the predominant genetic

shafts, Forensic Sci. Int. Genet. Suppl. Ser., 3, E319#E320,

material in human hair shafts, Genes (Basel), 9, 640,

doi: 10.1016/j.fsigss.2011.09.022.

doi: 10.3390/genes9120640.

Müller, K., Klein, R., Miltner, E., and Wiegand, P. (2007)

Bengtsson, C. F., Olsen, M. E., Brandt, L. Ø., Bertelsen,

Improved STR typing of telogen hair root and hair shaft DNA,

M. F., Willerslev, E., et al. (2012) DNA from keratinous tis#

Electrophoresis, 28, 2835#2842, doi: 10.1002/elps.200600669.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АУТЕНТИЧНОСТЬ ВОЛОСА В ПОРТРЕТЕ

1825

8. Desmyter, S., Bodner, M., Huber, G., Dognaux, S., Berger,

14. Gansauge, M.#T., Gerber, T., Glocke, I., Korlevic, P.,

C., et al. (2016) Hairy matters: MtDNA quantity and sequence

Lippik, L., (2017) Single#stranded DNA library prepara#

variation along and among human head hairs, Forensic Sci.

tion from highly degraded DNA using T4 DNA ligase,

Int. Genet., 25, 1#9, doi: 10.1016/j.fsigen.2016.07.012.

Nucleic Acids Res., 45, e79, doi: 10.1093/nar/gkx033.

9. Budowle, B., Allard, M. W., Wilson, M. R., and

15. Schubert, M., Lindgreen, S., and Orlando, L.

(2016)

Chakraborty, R. (2003) Forensics and mitochondrial

AdapterRemoval v2: rapid adapter trimming, identifica#

DNA: applications, debates, and foundations, Annu. Rev.

tion, and read merging, BMC Res. Notes,

88,

Genomics Hum. Genet., 4, 119#141.

doi: 10.1186/s13104#016#1900#2.

10. Allen, M., Engström, A.#S., Meyers, S., Handt, O.,

16. Li, H., and Durbin, R. (2009) Fast and accurate short read

Saldeen, T., (1998) Mitochondrial DNA sequencing of

alignment with Burrows-Wheeler transform, Bioinformatics,

shed hairs and saliva on robbery caps: sensitivity and

25, 1754#1760, doi: 10.1093/bioinformatics/btp324.

matching probabilities, J. Forensic Sci., 43, 16169J,

17. Schubert, M., Ginolhac, A., Lindgreen, S., Thompson,

doi: 10.1520/jfs16169j.

J. F., Al#Rasheid, K. A. S., et al. (2012) Improving

11. Irwin, J. A., Saunier, J. L., Strouss, K. M., Sturk, K. A.,

ancient DNA read mapping against modern reference

Diegoli, T. M., (2007) Development and expansion of

genomes, BMC Genomics, 13, 178, doi: 10.1186/1471#

high#quality control region databases to improve forensic

2164#13#178.

mtDNA evidence interpretation, Forensic Sci. Int. Genet.,

18. Jónsson, H., Ginolhac, A., Schubert, M., Johnson,

1, 154#157, doi: 10.1016/j.fsigen.2007.01.019.

P. L. F., and Orlando, L. (2013) mapDamage2.0: fast

12. Just, R. S., Scheible, M. K., Fast, S. A., Sturk#

approximate Bayesian estimates of ancient DNA damage

Andreaggi, K., Röck, A. W., et al. (2015) Full mtGenome

parameters, Bioinformatics, 29, 1682#1684, doi: 10.1093/

reference data: development and characterization of 588

bioinformatics/btt193.

forensic#quality haplotypes representing three U. S. popu#

19. Rogaev, E. I., Grigorenko, A. P., Moliaka, Y. K.,

lations, Forensic Sci. Int. Genet., 14, 141#155, doi: 10.1016/

Faskhutdinova, G., Goltsov, A., et al. (2009) Genomic

j.fsigen.2014.09.021.

identification in the historical case of the Nicholas II royal

13. McElhoe, J. A., Holland, M. M., Makova, K. D., Su,

family, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 5258#5263,

M. S. W., Paul, I. M., (2014) Development and assessment

doi: 10.1073/pnas.0811190106.

of an optimized next#generation DNA sequencing approach

20. Holland, M. M., and Parsons, T. J. (1999) Mitochondrial

for the mtgenome using the Illumina MiSeq, Forensic Sci.

DNA sequence analysis - validation and use for forensic

Int. Genet., 13, 20#29, doi: 10.1016/j.fsigen.2014.05.007.

casework, Forensic Sci. Rev., 11, 21#50.

GENETIC EVIDENCE OF AUTHENTICITY OF A HAIR SHAFT RELIC

FROM THE PORTRAIT OF TSESAREVICH ALEXEI, SON

OF THE LAST RUSSIAN EMPEROR

T. V. Andreeva^1,2, A. D. Manakhov³, S. S. Kunizheva¹, and E. I. Rogaev^1,2,3,4*

¹ Centre for Genetics and Genetic Technologies, Department of Genetics, Faculty of Biology,

Lomonosov Moscow State University, 119192 Moscow, Russia; E3mail: rogaev@vigg.ru

² Department of Genomics and Human Genetics, Laboratory of Evolutionary Genomics,

Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, 119333 Moscow, Russia

³ Center for Genetics and Life Science, Sirius University of Science and Technology, 354340 Sochi, Russia

⁴ Department of Psychiatry, UMass Chan Medical School, 222 Maple Ave,

Reed3Rose3Gordon Building, Shrewsbury, MA 01545, USA

To determine the value of a piece of art, authenticity of the artwork must be verified. We demonstrate here a genetic

approach to determine origin of a historic relic in the museum piece. We tested two hair shafts of unknown origin

framed into a watercolor portrait of Tsesarevich Alexei Romanov, son of the last Russian Tzar Nicholas II, which is a

unique item kept in the State Historical Museum. Genetic identification of the hair shafts was performed by analysis

of mitochondrial DNA (mtDNA) markers using both massive parallel genomic sequencing and multiplex targeted

PCR, followed by Sanger sequencing. In previous works, we reconstructed the complete mtDNA sequence inherited

to Alexei Romanov through the Queen Victoria lineage [Rogaev et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 5258#

5263]. DNA extracts were obtained from the two thin hair shafts and used for comparative genetic analysis. Despite

the very low quantity and quality of the DNA templates retrieved from the historical single hair shaft specimen, infor#

mative mtDNA sequences were determined. The mtDNA haplotype in the hair shafts corresponds to the mtDNA

haplotype of Tsarevich Alexei, his sisters, and his mother, Empress Alexandra Feodorovna. This haplotype remains

unique in the currently available mtDNA databases. Our results reveal that the hair relic from the portrait is associat#

ed with the family of the last Russian Emperor Nicholas II. The study is an example of primary application of the

genetic methodology for verification of the value of museum artwork items.

Keywords: ancient DNA, museum item, hair shaft DNA, mtDNA, human identification, NGS

БИОХИМИЯ том 86 вып. 12 2021