БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 2, с. 248 - 258

УДК 571.27

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ В КЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛИ

НА МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ

КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА*

Н.А. Петинати¹**, А.Е. Бигильдеев¹, Д.В. Карпенко¹, Н.В. Сац¹,

Н.М. Капранов¹, Ю.О. Давыдова¹, Е.А. Фастова¹, А.У. Магомедова¹, С.К. Кравченко¹,

Г.П. Арапиди^2,3,4, М.И. Русанова⁵, М.А. Лагарькова², Н.И. Дризе¹, В.Г. Савченко¹

¹ Национальный медицинский исследовательский центр гематологии Минздрава России,

125167 Москва, Россия; электронная почта: loel@mail.ru

² Федеральный научно'клинический центр физико'химической медицины ФМБА России, 119435 Москва, Россия

³ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина

и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

⁴ Московский физико'технический институт (национальный исследовательский университет),

141700 Долгопрудный, Московская обл., Россия

⁵ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 30.07.2020

После доработки 14.09.2020

Принята к публикации 14.09.2020

У больных диффузной В клеточной крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ) без вовлечения костного мозга

изменены свойства костномозговых мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК). Было

предположено, что в плазме больных содержатся растворимые факторы, влияющие на свойства МСК и их

активацию у пациентов. Проверка этой гипотезы стала целью данного исследования. Для анализа цитоки

нов и хемокинов в плазме был использован набор Bio Plex Pro Human Cytokine Panel, экспрессию генов в

МСК оценивали ПЦР в реальном времени. Сравнительный анализ концентрации цитокинов в плазме

больных, до и через месяц после окончания лечения, и здоровых доноров выявил достоверные отличия в

концентрации 14 из 27 изученных цитокинов. В плазме больных нарушены взаимосвязи между уровнями

секретируемых цитокинов, т.е. происходит нарушение регуляции иммунного ответа. Некоторые связи вос

станавливаются после окончания лечения. Культивирование МСК здоровых доноров в присутствии плазмы

пациентов приводит к изменениям их свойств, подобным изменениям, наблюдаемым в МСК больных.

Впервые показано, что у пациентов с ДВККЛ без вовлечения костного мозга предшественники стромаль

ного микроокружения - МСК - изменяются из за гуморального эффекта опухоли и реакции организма на

нее. Комплексный анализ выявил, что при достижении ремиссии у пациентов с ДВККЛ состав цитокинов

плазмы частично нормализуется, но не достигает уровня здоровых доноров. Обнаружение нового аспекта

влияния В клеточной опухоли на организм может позволить выявить общие закономерности гуморально

го влияния различных опухолей на стромальные клетки костного мозга.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДВККЛ, МСК, цитокины и хемокины, секреция.

DOI: 10.31857/S0320972521020093

ВВЕДЕНИЕ

рактеристикам

[1]. При ДВККЛ только у

10-25% больных с помощью гистологического

Диффузная В клеточная крупноклеточная

или молекулярного методов исследования выяв

лимфома (ДВККЛ) - гетерогенная группа забо

ляется поражение костного мозга (КМ) [2]. Счи

леваний, различающаяся по гистологическим,

тается, что у остальных пациентов с ДВККЛ

иммуногистохимическим и молекулярным ха

КМ не вовлечен в опухолевой процесс. Стро

Принятые сокращения: ДВККЛ - диффузная В клеточная крупноклеточная лимфома; КМ - костный мозг;

КОЕф - колониеобразующая единица фибробластов; МСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки;

ОУЭ - относительный уровень экспрессии; СУФ - средний уровень флуоресценции; IFN γ - интерферон гамма;

IL - интерлейкин; TNFα - фактор некроза опухолей.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/

biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20 242, 21.01.2021.

** Адресат для корреспонденции.

248

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛИ

249

мальные клетки предшественницы КМ у боль

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ных ДВККЛ без вовлечения КМ изменены [3].

Такие изменения нельзя отнести к взаимодей

Пациенты. В работе исследовали МСК

ствию с опухолевыми клетками, как это проис

35 больных с ДВККЛ без вовлечения костного

ходит при лейкозах [4, 5]. Многие опухоли сек

мозга. Перед забором крови и КМ пациенты и

ретируют цитокины и хемокины [6, 7], более то

доноры подписали информированное согласие.

го, наличие опухоли в организме может быть

Характеристики всех пациентов, вошедших в

рассмотрено как воспалительный процесс [8, 9].

исследование, представлены в табл. 1 в Прило

Воспаление связано с релизом множества фак

жении. Состав цитокинов и хемокинов изучали

торов, которые могут активировать клетки стро

в плазме крови у 9 больных ДВККЛ до начала и

мального микроокружения КМ, в частности

через месяц после окончания лечения. В качест

мультипотентные мезенхимные стромальные

ве контроля использовали плазму от 5 здоровых

клетки (МСК), участвующие в регуляции кро

доноров (1 муж., 4 жен.) в возрасте 34-67 лет. У

ветворения [10]. Активированные интерлейки

всех больных после комплексного лечения была

ном 1 (IL 1), фактором некроза опухоли аль

достигнута ремиссия заболевания, подтверж

фа (TNFα) и интерфероном гамма (IFN γ) МСК

денная данными ПЭТ КТ. Данные об этих па

секретируют ингибиторы и активаторы воспали

циентах представлены в таблице.

тельного процесса [11]. Ранее было показано,

Анализ цитокинов и хемокинов. Для анализа

что у больных ДВККЛ без поражения КМ сум

цитокинов и хемокинов в плазме был исполь

марная клеточная продукция МСК, полученных

зован набор Bio Plex Pro Human Cytokine Panel,

из КМ за 4 пассажа, выше, чем у доноров соответ

27 Plex («BioRad», США) для определения кон

ствующего возраста [3]. В МСК этих больных

центрации IL 1β, IL 1Ra, IL 2, IL 4, IL 5, IL 6,

повышена экспрессия FGFb, FGFR2, IL'6, IL'8 и

IL 7, IL 8, IL 9, IL 10, IL 12 (p70), IL 13, IL

других генов. Нами было предположено, что в

15, IL 17, FGFb, Eotaxin, G CSF, GM CSF,

плазме больных содержатся растворимые факто

IFN γ, IP 10, MCP 1 (MCAF), MIP 1α, MIP

ры, скорее всего, это провоспалительные цито

1β, PDGF bb, RANTES, TNFα, VEGF согласно

кины и хемокины, влияющие на свойства МСК

рекомендациям производителя. Обнаружение

и их активацию у пациентов. Проверка этой ги

флуоресцентных шариков проводили на систе

потезы стала целью данного исследования.

ме Bio Plex 200 («BioRad», США). Все экс

Характеристики пациентов с ДВККЛ (КОЕф и МСК до и через месяц после окончания лечения)

До лечения

Через месяц после окончания лечения

Воз

Пол

№

раст

м/ж

Проведенное лечение

КОЕф на

Продукция МСК

КОЕф

Продукция МСК

10⁶ клеток

за 3 пассажа,

на 10⁶ клеток

за 3 пассажа,

КМ

(×10⁶)

КМ

(×10⁶)

R (DA) EPOCH (6 циклов)

13,9

6,0

9,30

предфаза, R NHL BFM 90

7,6

4,0

7,00

(6 циклов) + auto HSCT

R CHOP 21 (6 циклов)

6,2

3,0

4,10

R (DA) EPOCH (6 циклов) +

6,5

1,0

8,00

+ R DHAP(2 цикла)

R CHOP 21 (6 циклов)

21,3

2,0

22,40

R (DA) EPOCH + auto HSCT

16,9

12,0

7,30

R CHOP 21 (4 цикла)

7,1

1,0

17,00

R (DA) EPOCH (5 циклов) +

4,7

58,0

4,47

+ DHAP (1 цикл)

R CHOP 21 (6 циклов)

58,0

16,0

Примечание. R (DA) EPOCH, R NHL BFM 90, R CHOP 21 - названия комплексных циклов химиотерапии; auto

HSCT - аутотрансплантация гемопоэтических клеток.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

250

ПЕТИНАТИ и др.

перименты проводили в трех независимых пов

Для выделения РНК был использован

торах.

TRIzol («Life Technologies», США) в соответ

Определение концентрации КОЕф в костном

ствии с рекомендациями производителя. Для

мозге пациентов и характеристики МСК. Анализ

построения первых цепей ДНК после гибриди

концентрации колониеобразующих единиц

зации мРНК со смесью (поли Т) праймеров и

фибробластов (КОЕф) в КМ больных и МСК

случайных гексамеров использовали обратную

проводили, как описано ранее [3].

транскриптазу M MLV («Promega», Франция) в

Действие плазмы пациентов на МСК здоровых

соответствии с рекомендациями производителя.

доноров. Для анализа действия плазмы больных

Для нормализации образцов использовали гены

ДВККЛ на МСК из КМ здоровых доноров были

«домашнего хозяйства» BACT (бета актин) и

использованы 10 образов МСК (4 муж. и 6 жен.

GAPDH (глицеральдегид 3 фосфат дегидрогена

в возрасте 14-50 лет, медиана возраста 33 года).

за), относительный уровень экспрессии генов

МСК доноров культивировали 10 дней в бессы

рассчитывали методом ΔΔCt [12]. Ген специфи

вороточной среде StemPro («Gibco», Нидерлан

ческие праймеры и зонды были разработаны ав

ды) в присутствии 10% плазмы от 5 здоровых до

торами и синтезированы («Syntol R & D», Рос

норов и плазмы 9 больных ДБККЛ до начала и

сия) (табл. 2 в Приложении).

через месяц после окончания лечения. Каждый

Статистическая обработка результатов. Гра

образец плазмы добавляли в отдельную ячейку с

фическая обработка результатов выполнена с

МСК. В МСК доноров, обработанных плазмой

использованием программы GraphPad Prism

больных, исследовали суммарную клеточную

8 (www.graphpad.com). Когда была подтверждена

продукцию, анализировали экспрессию поверх

нормальность распределения, сравнение образ

ностных маркеров (средний уровень флуорес

цов проводилось с использованием критерия

ценции (СУФ) и относительный уровень

Стьюдента, в противном случае использовались

экспрессии (ОУЭ)) некоторых генов.

тесты Манна-Уитни - для непарных образцов

Анализ поверхностных антигенов МСК. Опре

или критерий Вилкоксона - для парных образ

деление уровня экспрессии антигенов на МСК

цов, различия при p < 0,05 считались значимы

производили методом проточной цитометрии.

ми. Взаимосвязи между изменениями концент

После снятия МСК со дна флакона их дважды

рации различных цитокинов в плазме пациен

отмывали раствором CellWash («BD Biosciences»,

тов определяли по критерию корреляции Пир

США) и после этого 2 × 10⁴ клеток инкубирова

сона. Коэффициент корреляции анализировали

ли 20 мин в темноте с моноклональными антите

с использованием программы GraphPad Prism 8,

лами: анти HLA ABC, мечеными флуоресцеина

R > 0,7 или R < -0,7 при p < 0,05 считали значи

изотиоцианатом (FITC) («Biolegend», США); ан

мой сильной корреляцией.

ти CD90, мечеными фикоэритрином (PE) («BD

Был проведен комплексный анализ разли

Pharmingen», США); анти CD73, мечеными

чий между цитокинами в 3 х изученных груп

PE («BD Pharmingen», США); анти CD105, ме

пах. Анализ основан на определении расстоя

ченными FITC («Biolegend», США); анти CD

ний между точками в многомерном простран

54, мечеными аллофикоцианином (APC)

стве исследуемых параметров. Колебания и зна

(«Biolegend», США); анти CD146, мечеными

чимость различий для каждого изменения были

PE («BD Pharmingen», США). Анализ проводили

рассчитаны индивидуально. Расчеты по комп

с использованием проточного цитометра

лексному анализу различий между образцами

FACSCanto II («BD Biosciences», США), данные

представлены в Приложении.

анализировали с помощью программы

FACSDiva («BD Biosciences», США).

Популяцию МСК определяли сначала по па

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

раметрам прямого и бокового светорассеяния, а

также по экспрессии на поверхности клеток ан

Концентрация цитокинов в плазме больных

тигена CD90. В данной популяции клеток оце

ДВККЛ. Сравнительный анализ концентрации

нивали средний уровень флуоресценции

цитокинов в плазме больных (до и через месяц

(MFI/СУФ) по каналам, соответствующим

после окончания лечения) и здоровых доноров

APC, FITC и PE.

выявил достоверные отличия в концентрациях

Анализ экспрессии генов в МСК. Определе

14 из 27 изученных цитокинов (рис. 1; табл. 3

ние уровня экспрессии генов проводили мето

в Приложении). Концентрация некоторых цито

дом обратной транскрипции с последующей по

кинов была достоверно повышена в плазме пер

лимеразной цепной реакцией в режиме реаль

вичных больных по сравнению с плазмой доно

ного времени (модификация Taq Man) на при

ров. Так, концентрация в плазме IL 2 была в

боре Abiprism 7500 («Applied Biosystems», США).

1,5 раза выше, чем у доноров, IL 6 - в 8,5 раза,

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛИ

251

Рис. 1. Достоверные различия в уровне цитокинов и факторов роста в плазме доноров и пациентов с ДВККЛ до и после

лечения. На прямоугольниках горизонтальная линия представляет медиану, длина прямоугольника представляет меж

квартильный диапазон, а вертикальные линии простираются до минимальных и максимальных значений. На рисунке по

казаны только цитокины, концентрация которых в плазме доноров и пациентов значительно отличается (р < 0,05). Плаз

ма у 9 пациентов была исследована до и через месяц после окончания лечения. В качестве контроля использовали плаз

му от 5 здоровых доноров (1 муж. и 4 жен.) в возрасте 34-67 лет

IL 10 - в 5 раз, Eotaxin - в 1,5 раза, FGFb - в

экспрессии генов, которые могли способство

1,5 раза, IP 10 - в 2,5 раза, MIP 1α - в 10 раз,

вать изменениям цитокинов в плазме крови па

MIP 1β - в 3 раза, PDGF bb - в 3,5 раза,

циентов. Сравнивали экспрессию генов в МСК

RANTES - в 2 раза, TNFα - в 4 раза и VEGF - в

из костного мозга первичных пациентов, паци

1,2 раза выше, чем у доноров. После окончания

ентов после лечения и здоровых доноров. Уро

лечения концентрация большинства провоспа

вень экспрессии IL'6, FGFb и FGFR2 был повы

лительных цитокинов и хемокинов, повышен

шен в МСК первичных пациентов по сравне

ная по сравнению с донорами в плазме больных

нию с МСК доноров (рис. 2). Принимая во вни

ДВККЛ в дебюте заболевания, нормализует

мание, что относительный уровень экспрес

ся (IL Ra, IL 6, IL 8, IL 10, GM CSF, MIP 1α,

сии VEGF и генов рецепторов FGFR1 и PDGFRb

MIP 1β, TNFα) (см. табл. 3 в Приложении). Хе

были выше в МСК доноров, чем в МСК пациен

мокины и цитокины, связанные с параметрами

тов, а после окончания лечения восстановился

роста МСК, а также участвующие в процессах

только уровень экспрессии VEGF, можно гово

иммуномодуляции, изменяются значительно

рить о различном влиянии химиотерапевтичес

медленнее и не нормализуются через месяц пос

ких препаратов на экспрессию генов, регулиру

ле окончания терапии (IL 2, Eotaxin, FGFb, IP

ющих поддержание и дифференцировку МСК.

10, MCP 1, PDGF bb, RANTES, VEGF).

Корреляционные связи между цитокинами в

Относительный уровень экспрессии генов в

плазме больных ДВККЛ. Анализировали корре

МСК пациентов с ДВККЛ. Поскольку было по

ляцию между цитокинами в плазме больных и

казано, что МСК пациентов с ДВККЛ измене

здоровых доноров. Изменение корреляции сви

ны, мы изучили относительный уровень

детельствует о нарушении взаимосвязи между

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

252

ПЕТИНАТИ и др.

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов в МСК здоровых доноров и пациентов с ДВККЛ до и после лечения. На

графиках в прямоугольниках горизонтальная линия представляет медиану, длина рамки представляет интервал между

четвертями, а вертикальные линии доходят до минимальных и максимальных значений. Были проанализированы МСК

от 30 здоровых доноров и 29 пациентов с ДВККЛ

этими цитокинами, иными словами, об измене

Корреляции только у больных до лечения,

нии регуляции иммунного ответа. В анализ бы

которые не обнаруживались ни у доноров, ни у

ли включены только достоверные тесные взаи

больных после лечения: IL 2 с IL 1Ra; IL 8 с IL

мосвязи (R > 0,7 и R < -0,7, p < 0,05). Корреля

6; IL 15 с IL 7; IL 17 с IL 4; G CSF с IL 17, IL

ции между концентрациями цитокинов в плаз

2, IL 6, IL 8 и IFN γ; MCP 1 с G CSF, IL 6, IL

ме здоровых доноров отличаются от таковых в

1Ra, G CSF, IFN γ, IL 17, IL 2 и MIP 1α;

плазме больных как до, так и после окончания

PDGF bb с Eotaxin; RANTES с Eotaxin, IL 13,

лечения (табл. 4 в Приложении).

MIP 1α и PDGF bb; TNFα с IFN γ, IL 17, IL 2,

В плазме доноров тесно связаны концентра

IL 6 и IL 1b; VEGF с G CSF, IL 17, IL 1b, IL

ции: IL 6 с IL 9, IL 10, IL 13 и FGFb; IL 9 с IL

1Ra, IL 4, MIP 1α, MIP 1β, TNFα.

10, IL 13, IL 15, IL 17, GM CSF и VEGF; IL

Корреляции у больных до и после лечения,

12 с IL 1b и IL 10; IL 7 с IL 4; MIP 1α с IL 5 и

которых нет у доноров: MCP 1 с IL 1b, IL 1Ra,

GM CSF; GM CSF с Eotaxin; TNFα с PDGF bb.

IL 2; G CSF с IL 1Ra и IL 4; GM CSF с IL 2;

Перечисленные комбинации цитокинов не

IL 15 с IL 13; IL 17 с IL 1Ra; IL 17 с IL 2, IL

имеют взаимосвязи в плазме больных до и после

8 с IL 2; MIP 1α с G CSF, IL 1b и IL 4; MIP

лечения.

1β с IL 1Ra; TNFα с IL 1Ra, IL 4 и MIP 1α;

Корреляции присутствуют у всех доноров и

VEGF с FGFb, IL 2, IL 5, IL 6 и IL 8.

больных: IL 1Ra с IL 1b; IL 2 с IL 5, IL 6, IFN

Корреляции у доноров и больных после ле

γ и FGFb; IL 4 с IL 1Ra; IL 5 с IL 12, IL 13, IL

чения: IL 2 с IL 7, IL 10, IL 12 и IL 13; IL 5 с

15, IL 17, GM CSF и FGFb; IL 6 с IFN γ; IL

IFN γ; IL 6 с IL 12 и GM CSF; IL 7 с IL 10, IL

8 с IFN γ и MIP 1α; IL 12 с IL 13 и FGFb; IL

17 и IFN γ; IL 8 с FGFb; IL 10 с IL 13 и IL 17;

13 с FGFb; IL 17 с FGFb; TNFα с MIP 1β.

IL 12 с IFN γ; IL 13 с VEGF; IFN γ с FGFb.

Корреляции у доноров и больных до лечения

Помимо анализа корреляций цитокинов и

обнаруживались между: IL 1Ra с IFN γ; IL

хемокинов между собой в плазме больных

4 с IL 1b, IL 2, FGFb и IFN γ; IL 6 с MIP 1α;

ДВККЛ был проведен анализ корреляций меж

IL 10 с IL 15 и FGFb; TNFα с MCP 1 и с

ду экспрессией генов в МСК 5 больных и концен

RANTES; RANTES с MIP 1β - и все они отсут

трацией цитокинов в плазме этих пациен

ствовали после лечения.

тов (таблица, пациенты №№ 3-7; табл. 5 в При

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛИ

253

ложении). Оказалось, что концентрация IL 1b,

больных до начала лечения, и цитокинами в

IL 2, IL 4, IL 5 (p = 0,041 с BMP2), IL 10, IL 15

плазме этих больных ДВККЛ. Количество кле

(p = 0,02 с BMP2), VEGF (p = 0,021 c BMP2) и

ток в культурах МСК доноров, культивирован

FGFb (p = 0,024 с BMP2) тесно положительно

ных в присутствии плазмы больных после окон

коррелируют с экспрессией BMP2 и SOX9. Кро

чания лечения, имеет только обратную, но не

ме того, с BMP2 тесно коррелируют IL 8, IL 9,

достоверную корреляцию с IL 2 (R = -0,729),

IL 12, IL 13, IL 17, GM CSF и MCP 1

IP 10 (R = -0,742), MCP 1 (R = -0,801) и

(p = 0,024). IL 4 и IL 7 тесно коррелируют с

RANTES (R = -0,814).

FGFR1, FGFR2, VEGF.

Анализ поверхностных маркеров МСК до

Обратная корреляция выявлена между кон

норов после культивирования в присутствии

центрацией IL 6 в плазме пациентов и экспрес

плазмы здоровых доноров и больных ДВККЛ

сией генов MMP2, SPP1, ICAM1 и SMURF.

показал, что процент МСК, экспрессирующих

Eotaxin имеет обратную сильную взаимосвязь с

на поверхности CD54 (ICAM1), повышается

экспрессией IL'6, SOX9 (p = 0,015). G CSF име

почти в 2 раза при культивировании в присут

ет обратную сильную корреляцию с экспресси

ствии плазмы больных по сравнению с клетка

ей ICAM1 (p = 0,033) и SMURF. SMURF, в свою

ми, культивированными с плазмой доноров

очередь, обратно коррелирует с концентрацией

(р = 0,0032) (рис. 3, б). Одновременно увеличи

в плазме IP 10, MIP 1α и RANTES. MIP 1β об

вается и ОУЭ CD54 на МСК, обработанных

ратно коррелирует с FGFb (p = 0,025) и IL'8

плазмой больных (рис. 3, в). ОУЭ гена ICAM1

(p = 0,02). Концентрация RANTES в плазме об

повышается в МСК, обработанных плазмой

ратно коррелирует с экспрессией FGFR2

больных в дебюте заболевания, и остается повы

(R = -0,958, p = 0,01) (табл. 5 в Приложении).

шенным после лечения. ICAM1 - молекула ад

Других тесных взаимосвязей между концентра

гезии, обеспечивающая взаимодействие МСК с

цией цитокинов и хемокинов в плазме и

лимфоцитами, и ее повышение указывает на ак

экспрессией генов выявлено не было.

тивацию МСК, обработанных плазмой боль

Концентрация КОЕф в костном мозге боль

ных. СУФ CD105 (ENG) и CD146 (MCAM) сни

ных ДВККЛ до начала лечения тесно коррели

жены в МСК, которые культивировали с плаз

рует с концентрацией в плазме следующих ци

мой больных. СУФ CD274 (PD L1) повышается

токинов: IL 1Ra (R = 0,717, p > 0,05), IL

на МСК при добавлении плазмы больных в де

6 (R = 0,956, p = 0,022), IL 8 (R = 0,717, p > 0,05),

бюте и еще больше возрастает при добавлении

G CSF (R = 0,717 p > 0,05), MIP 1α (R = 0,717,

плазмы больных после лечения.

p > 0,05), VEGF (R = 0,717, p > 0,05), однако дос

При анализе относительного уровня

товерная корреляция КОЕф выявлена только с

экспрессии генов выяснилось, что в МСК, об

IL 6. После окончания лечения какие либо по

работанных плазмой больных, снижается экс

ложительные корреляции концентрации цито

прессия IL'1b, IL'8, SDF1 и LIF (рис. 3, в).

кинов в плазме и КОЕф отсутствуют.

Экспрессия SDF1 после лечения повышается до

На основании этих изменений в плазме

уровня, соответствующего МСК, обработанных

больных ДВККЛ было предположено, что плаз

плазмой доноров.

ма больных будет действовать на МСК здоровых

доноров.

Действие плазмы больных ДВККЛ на МСК

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

здоровых доноров. Культивирование МСК доно

ров в присутствии плазмы доноров и больных

Цитокины и хемокины секретируются в

ДВККЛ (до и через месяц после окончания ле

кровь различными тканями. В норме все факто

чения) выявило достоверные изменения в сум

ры, регулирующие кроветворение, секретиру

марной клеточной продукции МСК за 2 иссле

ются различными органами, например GM

дованных пассажа (3 и 4 пассажи). Оказалось,

CSF и G CSF секретируются легкими, мышца

что культивирование МСК доноров в присут

ми, эндотелием мочевого пузыря, лимфоцита

ствии плазмы больных до лечения снижает кле

ми [13]. IL 6 продуцируется гладкомышечными

точную продукцию, а плазма больных после

клетками, эндотелием сосудов, макрофага

окончания лечения повышает ее (рис. 3, а).

ми [14]. Хемокины также продуцируются боль

Количество клеток в культурах МСК, обра

шим количеством тканей и опухолевыми клет

ботанных плазмой доноров, прямо коррелирует

ками [6]. Стромальные клетки костного мозга, в

с концентрацией GM CSF в плазме доно

том числе МСК, участвуют в секреции цитоки

ров (R = 0,708, р = 0,018). Не обнаруживается

нов и хемокинов, регулирующих кроветворение

корреляций между количеством клеток в куль

и иммунный ответ [11]. Концентрация цитоки

турах МСК доноров, обработанных плазмой

нов в крови очень невелика, но может возрас

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

254

ПЕТИНАТИ и др.

тать во много раз в зависимости от запроса орга

Выявленные изменения могут быть связаны

низма. Баланс цитокинов и их взаимосвязи мо

с секрецией опухолевыми клетками или реак

гут изменяться при патологии. Исследование

цией тканей организма, включая МСК, на на

плазмы больных ДВККЛ показало достоверное

личие опухоли или терапии. Комплексный ана

увеличение концентрации по крайней мере

лиз показывает, что при достижении ремиссии

14 цитокинов из 27 изученных по сравнению с

у пациентов с ДВККЛ состав цитокинов плаз

донорами. Концентрация некоторых из них

мы нормализуется, но не достигает уровня здо

нормализуется после достижения ремиссии и

ровых доноров. Не только баланс цитокинов в

окончания лечения. Однако другие цитокины,

плазме крови, но и изменения в строме костно

такие как FGFb, Eotaxin, VEGF и RANTES, ос

го мозга остаются частично нарушенными, ве

таются повышенными. Мы также наблюдали

роятно, в какой то степени из за курсов химио

аналогичные изменения в экспрессии FGFb в

терапии.

МСК пациентов, что указывает на вклад МСК в

Взаимосвязь между цитокинами имеет боль

повышение концентрации этого фактора в

шое значение для регуляции кроветворения и

плазме пациентов.

воспаления. В плазме здоровых доноров выяв

Комплексный анализ различий между всеми

лены нормальные для организма корреляции,

изученными цитокинами, хемокинами и корре

обеспечивающие созревание кроветворных кле

ляциями между ними выявил четкое разделение

ток [15]. Некоторые из этих взаимосвязей сохра

здоровых доноров и пациентов до и после лече

няются и у больных ДВККЛ - это корреляции

ния (рис. 4).

факторов, участвующих в созревании мегакарио

Рис. 3. Влияние плазмы пациентов ДВККЛ на МСК здоровых доноров. а - Тотальная клеточная продукция МСК здоро

вых доноров в присутствии плазмы здоровых доноров и пациентов до и после лечения. На графиках в прямоугольниках

горизонтальная линия представляет медиану, длина рамки представляет интервал между четвертями, а вертикальные ли

нии доходят до минимальных и максимальных значений. б - Изменения в экспрессии поверхностных маркеров на донор

ских МСК, культивируемых в присутствии плазмы пациентов, по сравнению с культивированием с плазмой доноров.

в - Изменения в экспрессии генов в МСК доноров, культивированных в присутствии плазмы пациентов, по сравнению

с культивированием в плазме доноров. Были проанализированы МСК от 10 здоровых доноров, культивируемых в прису

тствии плазмы доноров (5 образцов) и плазмы пациентов с ДВККЛ до (21 образец) и после (18 образцов) лечения

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛИ

255

Рис. 4. Комплексный анализ хемокинов и цитокинов здоровых доноров и больных ДВККЛ. Все данные по хемокинам и

цитокинам проецируют здоровых доноров и пациентов с ДВККЛ до и после лечения на ось консолидированных парамет

ров. Точка на диаграмме показывает, во сколько раз образец ближе к группе доноров, чем к группе пациентов до лечения

(ось абсцисс) или после лечения (ось ординат). Расчет расстояния в многомерном пространстве между образцом и груп

пой представлен в Приложении

цитов, дендритных клеток, некоторых субпопу

ние функций В клеток, участвующих в адаптив

ляций Т и В лимфоцитов.

ном иммунном ответе. Уровень IL 10 повышен в

В дебюте заболевания возникают измене

плазме больных до лечения (рис. 1). Подобное

ния, которые, вероятнее всего, связаны с присут

повышение выявлено в мышиных моделях крас

ствием опухоли в организме. Наблюдается по

ной волчанки [16]. После окончания лечения

вышение факторов воспаления, увеличиваю

уровень IL 10 нормализуется. Известно, что ци

щих продукцию и созревание нейтрофилов и

токиновый профиль, секретируемый В клетка

макрофагов, таких как IL 6, IL 17, G CSF,

ми, может быть изменен при различных заболе

MCP 1 и MIP 1α. Уровень большинства из этих

ваниях, в некоторых случаях он нормализуется

факторов в дебюте заболевания коррелирует

при лечении больных ритуксимабом [17].

между собой.

Происходящие у больных ДВККЛ без пора

Регуляция врожденного иммунитета эффек

жения костного мозга изменения затрагивают

торными и регуляторными В клетками связана

не только кроветворные клетки и цитокины, но

с экспрессией IL 12 и IFN γ (эффекторные

и другие ткани, в том числе стромальное микро

клетки) и IL 10 (регуляторные клетки) [10].

окружение костного мозга. У больных в плазме

В плазме больных нет корреляции между IL 12,

крови до начала лечения значительно повыше

IFN γ и IL 10 в дебюте заболевания. После

ны уровни IL 6 и MIP 1α, которые после окон

окончания лечения между этими цитокинами

чания лечения снижаются до нормальных зна

возникает связь высокой тесноты, что говорит о

чений. Эти цитокины участвуют в остром воспа

том, что у больных в дебюте заболевания нару

лительном процессе (acute inflammatory state).

шен механизм врожденного иммунитета, кото

Их концентрация в плазме коррелирует с концен

рый восстанавливается после окончания лече

трацией КОЕф в костном мозге, что указывает

ния.

на ответ стромальных предшественников на

В регуляции адаптивного иммунитета при

воспалительный процесс в организме. При дос

нимают участие IL 4, IL 2 и IL 13, секретируе

тижении ремиссии корреляции исчезают, веро

мые эффекторными В клетками, и IL 10, секре

ятнее всего, за счет того, что вне опухолевого и

тируемый регуляторными В клетками. У паци

воспалительного процессов концентрация КО

ентов до лечения коррелирует секреция IL 2 и

Еф регулируется другими факторами. IL 10 сек

IL 4, остальные не связаны. Однако после окон

ретируется клетками ДВККЛ [18]. Концентра

чания лечения возникает корреляция между IL

ция IL 8, MIP 1α и IL 10 повышена в различ

2, IL 12 и IL 10, что указывает на восстановле

ных жидкостях, связанных с опухолью, и в пери

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

256

ПЕТИНАТИ и др.

туморальной области (peritumoral tissue) [6]. По

ных в дебюте заболевания повышается способ

казано, что концентрация L 8, IP 10, MCP 1,

ность МСК к адгезии лимфоцитов за счет повы

MIP 1β, IL 6, IL 12p40/p70, MIP 1α, IFN α, G

шения экспрессии ICAM1 как на уровне

CSF и IL 2R снижается после удаления опухо

РНК (рис. 3, в), так и на уровне белка. При этом

лей головного мозга в перитуморальной облас

в плазме больных до и после окончания лечения

ти [19]. То есть показанные в нашей работе по

есть факторы, которые повышают способность

вышение и корреляция этих факторов в плазме

МСК ингибировать активацию лимфоци

больных ДВККЛ указывают на то, что опухоль

тов (PD L1). Одновременно у этих МСК умень

может вносить значительный вклад в секрецию

шается способность регулировать стволовые

этих цитокинов и хемокинов.

кроветворные клетки и клетки эндотелия за счет

Свойства МСК больных ДВККЛ измене

снижения ENG и MCAM (рис. 3, б). Повыше

ны - суммарная клеточная продукция, иммуно

ние экспрессии HLA DR на МСК здоровых до

фенотип и экспрессия многих генов [3]. В настоя

норов при добавлении в среду культивирования

щей работе были проанализированы связи меж

плазмы больных может быть связано с актива

ду концентрацией цитокинов в плазме больных

цией этих клеток.

и экспрессией некоторых генов в МСК этих

Все цитокины, экспрессия которых снижа

больных в дебюте заболевания. Обнаружены

ется в МСК, культивированных с плазмой боль

прямые корреляции между экспрессией генов,

ных, участвуют в регуляции кроветворных кле

связанных с пролиферацией, дифференциров

ток и иммунном ответе. Экспрессия SDF1, в от

кой и образованием сосудов, в МСК с провоспа

личие от остальных цитокинов, повышается до

лительными цитокинами и GM CSF, повышен

уровня, соответствующего МСК, обработанных

ными в плазме этих больных. Это объясняет из

плазмой доноров после лечения (рис. 3, в). Эти

менения свойств МСК из костного мозга этих

данные указывают на то, что нормализуется

пациентов. Выявлено ингибирующее действие

способность МСК регулировать миграцию кро

повышения IL 6, G CSF, RANTES, MIP 1α и

ветворных клеток в костном мозге, а также на

MIP 1β в плазме больных на гены, участвующие

то, что происходящие при ДВККЛ изменения в

в дифференцировке МСК и адгезии лимфоци

МСК могут быть обратимы.

тов к стромальным клеткам. Так как МСК -

Таким образом, в плазме крови пациентов с

один из главных компонентов ниши для стволо

ДВККЛ изменена концентрация провоспали

вых кроветворных клеток - активно изучается

тельных и регулирующих кроветворение цито

изменение их характеристик при заболеваниях с

кинов. Баланс между этими цитокинами нару

вовлечением костного мозга [20]. Однако даже

шен в дебюте заболевания и частично восста

без прямого контакта опухолевых клеток с кост

навливается после окончания лечения. Очевид

ным мозгом в МСК происходят значительные

но, что наличие В клеточной опухоли в орга

изменения. Более того, можно считать, что су

низме влияет на все ткани, включая строму

ществует петля обратной связи между концент

костного мозга. Показано, что это влияние осу

рацией цитокинов в плазме и секрецией цито

ществляется, как минимум, частично через

кинов МСК [21]. Ранее показано, что в секрето

растворимые факторы. МСК, не контактирую

ме МСК больных ДВККЛ без вовлечения кост

щие напрямую с опухолью, изменяют не только

ного мозга, по сравнению с секретомом МСК

свои свойства, но и экспрессируемые и секрети

здоровых доноров, повышена концентрация

руемые ими факторы, внося свой вклад в изме

белков IL 6, IL 8, MCP 1, TNFα, ICAM1 и M

нение цитокинового профиля крови. Культиви

CSF [22]. Таким образом, МСК из костного моз

рование МСК здоровых доноров в присутствии

га больных ДВККЛ также вносят свой вклад в

плазмы больных ДВККЛ приводит к изменени

изменение концентрации и баланса цитокинов в

ям, подобным наблюдаемым в МСК больных.

плазме больных в дебюте заболевания.

Совокупность полученных данных свидетель

Исходя из полученных нами результатов, ре

ствует о влиянии опухолевого процесса на стро

шено было изучить влияние плазмы больных

мальное микроокружение костного мозга у

ДВККЛ на МСК здоровых доноров. Показано,

больных ДВККЛ независимо от межклеточного

что добавление плазмы больных в дебюте забо

контакта МСК с опухолевыми клетками. Ре

левания достоверно снижает суммарную кле

зультаты работы демонстрируют гуморальную

точную продукцию МСК здоровых доноров,

регуляцию стромы костного мозга опухолевыми

тогда как добавление плазмы больных после

клетками напрямую или опосредованно.

окончания лечения повышает ее в

ра

за (рис. 3, а). Кроме суммарной клеточной про

дукции, изменяются также и поверхностные

Финансирование. Работа выполнена при фи

маркеры МСК. При добавлении плазмы боль

нансовой поддержке Российского фонда фунда

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

ГУМОРАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛИ

257

ментальных исследований (грант № 17 04

дартам институционального и/или националь

00170).

ного комитета по исследовательской этике и

Благодарности. Авторы благодарят О. Пше

Хельсинкской декларации 1964 года и ее после

ничникову за продуктивное обсуждение мате

дующим изменениям или сопоставимым нор

риалов работы.

мам этики. От каждого из включенных в иссле

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

дование участников было получено информи

сутствии конфликта интересов.

рованное добровольное согласие.

Соблюдение этических норм. Настоящая

Дополнительные материалы. Приложение к

статья не содержит описания каких либо иссле

статье на английском языке опубликовано на

дований, не одобренных этическим комитетом

сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://

ФГБУ НМИЦ Гематологии Минздрава России.

protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте издатель

Все процедуры, выполненные в исследовании с

ства Springer (https://link.springer.com/journal/

участием людей, соответствуют этическим стан

10541), том 86, вып. 2, 2021.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Beltran, B. E., Quiñones, P., Morales, D., Malaga, J. M.,

12.

Schmittgen, T. D., and Livak, K. J. (2008) Analyzing real

Chavez, J. C., et al. (2018) Response and survival benefit

time PCR data by the comparative CT method, Nat.

with chemoimmunotherapy in Epstein-Barr virus positive

Protoc., 3, 1101 1108, doi: 10.1038/nprot.2008.73.

diffuse large B cell lymphoma, Hematol. Oncol., 36, 93 97,

13.

Metcalf, D. (2008) Hematopoietic cytokines, Blood, 111,

doi: 10.1002/hon.2449.

485 491, doi: 10.1182/blood 2007 03 079681.

Swerdlow, S. H., World Health Organization, International

14.

Metcalf, D., Willson, T. A., Hilton, D. J., Di Rago, L., and

Agency for Research on Cancer

(2017) in WHO

Mifsud, S. (1995) Production of hematopoietic regulatory

Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid

factors in cultures of adult and fetal mouse organs: mea

Tissues (Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, N. L., Jaffe,

surement by specific bioassays, Leukemia, 9, 1556 1564.

E. S., Pileri, S. A., Stein, H., and Thiele, J., eds) Vol. 2,

15.

Lyman, G. H., and Dale, D. C. (2010) Introduction to the

Revised 4th Edn., International Agency for Research on

Hematopoietic Growth Factors, Springer, Boston, MA,

Cancer, Lyon.

pp. 3 10.

Fastova, E. A., Magomedova, A. U., Petinati, N. A., Sats,

16.

Lenert, P., Brummel, R., Field, E. H., and Ashman, R. F.

N. V., Kapranov, N. M., Davydova, Yu. O., Drize, N. I.,

(2005) TLR 9 activation of marginal zone B cells in lupus

Kravchenko, S. K., and Savchenko, V. G. (2019) Bone

mice regulates immunity through increased IL 10 produc

marrow multipotent mesenchymal stromal cells in patients

tion, J. Clin. Immunol., 25, 29 40, doi: 10.1007/s10875

with diffuse large B cell lymphoma, Bull. Exp. Biol. Med.,

005 0355 6.

167, 150 153, doi: 10.1007/s10517 019 04480 6.

17.

Ma, N., Zhang, Y., Liu, Q., Wang, Z., Liu, X., et al. (2017)

Chen, Q., Yuan, Y., and Chen, T. (2014) Morphology, dif

B cell activating factor (BAFF) selects IL 10 B cells over

ferentiation and adhesion molecule expression changes of

IL 10+B cells during inflammatory responses, Mol.

bone marrow mesenchymal stem cells from acute myeloid

Immunol., 85, 18 26, doi: 10.1016/j.molimm.2017.02.002.

leukemia patients, Mol. Med. Rep.,

293298,

18.

Li, L., Zhang, J., Chen, J., Xu Monette, Z. Y., Miao, Y.,

doi: 10.3892/mmr.2013.1789.

et al. (2018) B cell receptor mediated NFATc1 activation

Shipounova, I. N., Petrova, T. V, Svinareva, D. A.,

induces IL 10/STAT3/PD L1 signaling in diffuse large B

Momotuk, K. S., Mikhailova, E. A., and Drize, N. I.

cell

lymphoma,

Blood,

132,

18051817,

(2009) Alterations in hematopoietic microenvironment in

doi: 10.1182/blood 2018 03 841015.

patients with aplastic anemia, Clin. Transl. Sci., 2, 67 74,

19.

Portnow, J., Badie, B., Liu, X., Frankel, P., Mi, S., Chen,

doi: 10.1111/j.1752 8062.2008.00074.x.

M., and Synold, T. W. (2014) A pilot microdialysis study in

Kotyza, J. (2017) Chemokines in tumor proximal fluids,

brain tumor patients to assess changes in intracerebral

Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky. Olomouc Czech

cytokine levels after craniotomy and in response to treat

Repub., 161, 41 49, doi: 10.5507/bp.2016.062.

ment with a targeted anti cancer agent, J. Neurooncol.,

Vilgelm, A. E., and Richmond, A. (2019) Chemokines

118, 169 177, doi: 10.1007/s11060 014 1415 4.

modulate immune surveillance in tumorigenesis, metasta

20.

Cheng, H., Sun, G., and Cheng, T. (2018) Hematopoiesis

sis, and response to immunotherapy, Front. Immunol., 10,

and microenvironment in hematological malignancies,

333, doi: 10.3389/fimmu.2019.00333.

Cell Regen., 7, 22 26, doi: 10.1016/j.cr.2018.08.002.

Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., and Balkwill, F.

21.

Zhong, W., Zhu, Z., Xu, X., Zhang, H., Xiong, H., et al.

(2008) Cancer related inflammation, Nature, 454, 436

(2019) Human bone marrow derived mesenchymal stem

444, doi: 10.1038/nature07205.

cells promote the growth and drug resistance of diffuse

Okrój, M., Potempa, J. (2019) Complement activation as

large B cell lymphoma by secreting IL 6 and elevating IL

a helping hand for inflammophilic pathogens and cancer,

17A levels, J. Exp. Clin. Cancer Res., 38, 73, doi: 10.1186/

Front. Immunol., 9, 3125, doi: 10.3389/fimmu.2018.

s13046 019 1081 7.

03125.

22.

Petinati, N. A., Sats, N., Drize, N. J., Malyants, I.,

10.

Lund, F. E. (2008) Cytokine producing B lymphocytes

Shender, V., Grigorieva, T., Arapidi, G., Lagarkova,

key regulators of immunity, Curr. Opin. Immunol., 20, 332

M., Fastova, E. A., Magomedova, A., Kravchenko, S., and

338, doi: 10.1016/j.coi.2008.03.003.

Savchenko, V. (2019) Alterations in secretome and tran

11.

Munir, H., Ward, L. S. C., and McGettrick, H. M. (2018)

scriptome of bone marrow derived MSCs in patients with

Mesenchymal stem cells as endogenous regulators of

diffuse large B cell lymphoma without bone marrow

inflammation, Adv. Exp. Med. Biol.,

1060,

7398,

involvement, Blood, 134, 1514 1514, doi: 10.1182/blood

doi: 10.1007/978 3 319 78127 3_5.

2019 122431.

8 БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021

258

ПЕТИНАТИ и др.

HUMORAL EFFECT OF A B CELL TUMOR ON THE BONE MARROW

MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS*

N. A. Petinati¹**, A. E. Bigildeev¹, D. S. Karpenko¹, N. V. Sats¹, N. M. Kapranov¹,

Y. O. Davydova¹, E. A. Fastova¹, A. U. Magomedova¹, S. K. Kravchenko¹, G. P. Arapidi^2,3,4,

M. I. Rusanova⁵, M. M. Lagarkova², N. I. Drize¹, and V. G. Savchenko¹

¹ National Research Center for Hematology, Ministry of Health, 125167 Moscow, Russia; E'mail: loel@mail.ru

² Federal Research and Clinical Center of Physical'Chemical Medicine,

Federal Medical Biological Agency, 119435 Moscow, Russia

³ Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 117997 Moscow, Russia

⁴ Moscow Institute of Physics and Technology (State University), 141700 Dolgoprudny, Moscow Region, Russia

⁵ Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 119234 Moscow, Russia

The properties of bone marrow (BM) derived multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are altered in the

patients with the diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) without BM involvement. It was suggested that plasma from

the patients contains soluble factors that affect MSCs. Plasma and BM derived MSCs from the DLBCL patients at

the onset of the disease and one month after the end of treatment were studied. Concentration of the plasma cytokines

and gene expression in the MSCs were evaluated by the Bio Plex Pro Human Cytokine Panel kit to measure 27 ana

lytes and real time PCR. Plasma and MSCs from the healthy donors were used as controls. Analysis of cytokines in

the plasma from healthy donors and patients before and one month after the end of treatment revealed significant dif

ferences in the concentration of 14 out of 27 cytokines. Correlations between the levels of secreted cytokines were

altered in the plasma from patients indicating that the immune response regulation was disturbed. Cultivation of the

MSCs from the healthy donors in the medium supplemented with the plasma from patients led to the changes in the

MSC properties, similar to those observed in the MSCs from patients. The BM derived MSCs were shown to partic

ipate in the humoral changes occurring in the DLBCL patients. For the first time, it was shown that the precursors of

the stromal microenvironment - multipotent mesenchymal stromal cells - are altered in the patients with DLBCL

without bone marrow involvement due to the humoral effect of the tumor and the response of organism to it.

Comprehensive analysis of the results shows that, when remission is achieved in the patients with DLBCL, composi

tion of the plasma cytokines normalizes, but does not reach the level observed in the healthy donors. The discovery of

a new aspect of the effect of the tumor B cells on the organism could help to reveal general regularities of the humoral

effect of various tumors on the bone marrow stromal cells.

Keywords: DLBCL, MSCs, cytokines, chemokines, secretion

БИОХИМИЯ том 86 вып. 2 2021