БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 3, с. 443 - 450
УДК 617.713
МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ АНТИОКСИДАНТ SKQ1
ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГИПОТЕРМИЧЕСКОЙ
КОНСЕРВАЦИИ РОГОВИЦЫ
© 2021
Г.С. Батурина1,2, Л.Е. Каткова1, И.Г. Пальчикова2,3,
Н.Г. Колосова1, Е.И. Соленов1,2,4*, И.А. Искаков5
1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук, 630090 Новосибирск, Россия; электронная почта: eugsol@bionet.nsc.ru
2 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090 Новосибирск, Россия
3 Конструкторско(технологический институт научного приборостроения Сибирского отделения
Российской академии наук, 630058 Новосибирск, Россия
4 Новосибирский государственный технический университет, 630087 Новосибирск, Россия
5 НМИЦ Межотраслевой научно(технический комплекс «Микрохирургия глаза им. акад. С.Н. Федорова»
Минздрава России, Новосибирский филиал, 630096 Новосибирск, Россия
Поступила в редакцию 28.07.2020
После доработки 16.10.2020
Принята к публикации 16.10.2020
Одной из основных причин слепоты в мире являются заболевания роговицы, лечение тяжёлых форм кото!
рых основано на кератопластике. Успех лечения зависит от жизнеспособности трансплантата роговицы, оп!
ределяющейся эффективностью восстановления функций эндотелия после консервации, что делает акту!
альной разработку методов объективной оценки сохранности эндотелия и совершенствования консерваци!
онных сред. Проведено исследование влияния гипотермической консервации на равновесную концентра!
цию внутриклеточного натрия в клетках эндотелия роговицы, устанавливающуюся в них после прекраще!
ния консервации, и зависимости этого параметра от присутствия в консервационной среде митохондриаль!
ного антиоксиданта SkQ1. Оценивали влияние SkQ1 на внутриклеточную концентрацию натрия в клетках
эндотелия роговицы глаза свиньи после гипотермической консервации при 4 °С длительностью 1, 5 и
10 дней в стандартном растворе Eusol!C. Концентрацию внутриклеточного натрия определяли с помощью
флуоресцентного красителя Sodium Green в препаратах клеток эндотелия. Флуоресцентные изображения
клеток анализировали, используя оригинальную программу «CytoDynamics». В контрольных образцах пос!
ле 10 дней гипотермической консервации выявлено значительное повышение концентрации внутриклеточ!
ного натрия в клетках эндотелия роговицы и снижение проницаемости для натрия их плазматических
мембран. Консервация роговицы в присутствии 1 нМ SkQ1 приводила к установлению более низкого по
сравнению с контролем уровня равновесной концентрации внутриклеточного натрия при температу!
ре 37 °С, снижения проницаемости плазматических мембран не наблюдалось. Таким образом, SkQ1 повы!
шает способность клеток эндотелия к восстановлению концентрации внутриклеточного натрия, что делает
перспективным его использование для повышения сохранности функциональной компетентности клеток
эндотелия роговицы при гипотермической консервации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эндотелий роговицы, гипотермическая консервация, SkQ1, внутриклеточный натрий.
DOI: 10.31857/S032097252103012X
ВВЕДЕНИЕ
повреждение которого приводит к отеку рогови!
цы, снижению её прозрачности и снижению
Пятое место в мире среди основных причин
жизнеспособности трансплантата. Эффектив!
слепоты занимают заболевания роговицы, лече!
ность восстановления роговичного трансплан!
ние тяжёлых форм которых основано на кера!
тата после операции зависит от интенсивности
топластике [1]. Успешность кератопластики
транспорта электролитов и воды через эндоте!
(сквозной, задней послойной) во многом зави!
лий роговицы, важной функцией которого яв!
сит от функционального состояния эндотелия,
ляется поддержание осмотического равновесия
матрикса роговицы [2, 3]. Необходимость вос!
становления функциональных возможностей
Принятые сокращения: ОИ - области интереса;
[Na+]i - внутриклеточная концентрация ионов натрия;
эндотелия после периода консервации делает
SkQ1 - 10!(6′!пластохинонил)децилтрифенилфосфоний.
актуальными исследования, направленные на
* Адресат для корреспонденции.
совершенствование консервационных сред и
443
444
БАТУРИНА и др.
разработку методов объективной оценки сох!
симости этого параметра от присутствия в кон!
ранности транспортных функций клеток эндо!
сервационной среде митохондриального анти!
телия роговицы. Методы определения жизне!
оксиданта 10!(6′!пластохинонил)децилтрифе!
способных клеток с применением красителя
нилфосфония (SkQ1). SkQ1 в форме глазных ка!
«трипановый синий» или тест на фрагментацию
пель «Визомитин» используется для лечения
ДНК (TUNEL assay) не позволяют оценивать
синдрома «сухого глаза», оказывает мягкий про!
собственно функциональность транспортных
тивовоспалительный эффект и ускоряет регене!
механизмов клеток эндотелия [4, 5]. В молеку!
рацию роговицы [12, 13]. Показано, что SkQ1
лярный механизм транспорта на стороне, обра!
способен снижать связанные с ишемией и ре!
щённой к матриксу роговицы, входят: Na/К!
перфузией повреждения тканей [14].
АТФаза, электрогенный натрий!бикарбонат
котранспортер (1Na+/2HCO–, SLC4A4, NBCe1),
Na+/K+/2Cl- (NKCC), ионообменники: хлорид!
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
бикарбонат (Cl-/HCO–, SLC4A2, AE2) и натрий!
протонный (Na+/H+, SLC9A6, NHE1) [6, 7]. На
Исследование проводили на дисках рогови!
апикальной поверхности идентифицированы
цы свиньи (sus scrofa domesticus). Трепанацию
хлоридные каналы CFTR (Cystic Fibrosis
проводили с помощью трепана диаметром 8 мм
Transmembrane conductance Regulator) и
через 6-8 ч после забоя животных (свинокомп!
CaCC (Calcium activated Chloride Channel -
лекс «АО “Кудряшовское”», с. Криводановка,
CLCA1), которые, по!видимому, не вносят зна!
Новосибирская обл.). Иссечённые диски рого!
чительного вклада в общий транспорт и активи!
вицы помещали в чашки Петри, заполненные
руются только в стрессовых ситуациях [8]. Кана!
средой Eusol!C («Alchimia», Италия) и на льду
лы проницаемы и для бикарбонат!иона в соот!
транспортировали в лабораторию.
ношении 4/1 (Cl-/HCO–). В эндотелиальных
Гипотермическая консервация. Исследовали
клетках отмечают высокую плотность митохон!
влияние гипотермической консервации рогови!
дрий. ATФ, производимый в клетках, является
цы свиньи на способность эндотелиоцитов вос!
не только субстратом для Na/К!АТФазы, но и
станавливать внутриклеточную концентрацию
сигнальным фактором, который, наряду с внут!
натрия ([Na+]i) после прекращения гипотермии.
риклеточным кальцием, через пуринэргические
Препараты (диски) роговицы инкубировали в
рецепторы способен повышать проводимость
консервационной среде Eusol!C в течение 1, 5 и
апикальной поверхности для HCO–, активируя
10 дней при 4 °С. В экспериментальных группах
CaCC [9]. В механизме трансэпителиального
в среде присутствовал 1 нM SkQ1 (использовали
переноса ионов и воды основным источником
глазные капли «Визомитин», предоставленные
энергии для векторного транспорта является
ООО «НИИ Митоинженерии МГУ»). Диски ин!
Na/К!АТФаза, создавая, наряду с другим элект!
кубировали индивидуально, для каждого вре!
рогенным транспортером, NBCe1, градиент
менного интервала использовали 4-5 дисков.
электрохимического потенциала натрия на
Препарат переживающих клеток. Препарат
плазматической мембране этих клеток, что яв!
переживающих клеток эндотелия роговицы по!
ляется вторичным источником энергии для вы!
лучали переносом клеток на покровное стекло.
полнения этими клетками функции «насоса».
С этой целью диск роговицы инкубировали в
В этой связи естественно рассматривать концен!
растворе 1 мг/мл коллагеназы («Sigma», США) в
трацию внутриклеточного натрия как результат
PBS
(138
мM NaCl,
4,7
мM Na2HPO4,
баланса активности натрий!калиевого насоса и
2,7 мM KCl, 1,5 мM KH2PO4, 0,5 мM MgCl2,
потоков через каналы и ионообменники плаз!
5,5 мM глюкоза, 1,0 мМ CaCl2) при 37 °С 30 мин,
матической мембраны клетки [10]. Исследова!
затем делали отпечаток эндотелия на покровное
ние динамики снижения клеточного объёма эн!
стекло, покрытое 0,1%!ным (w/v) раствором по!
дотелия роговицы, а также содержания внут!
лилизина («Sigma», США) в воде. Таким мето!
риклеточного натрия в клетках эндотелия после
дом получали препарат клеток эндотелия, обра!
прекращения гипотермической консервации
щённых базальной стороной в сторону омываю!
даёт объективное представление о транспорт!
щего раствора.
ной компетентности этих клеток [11].
Микроскопия. Экcпеpиментальная установ!
В данной работе проведено исследование
ка пpедcтавляла собой пpоточную камеpу,
влияния гипотермической консервации на рав!
pазpаботанную для иcпользования c флуоpеc!
новесную концентрацию внутриклеточного
центным микpоcкопом Observer!Z1 (объектив
натрия, устанавливающуюся в клетках эндоте!
Fluar 25×/0,8 M27, «Zeiss», Германия). Объем ка!
лия роговицы после повышения температуры до
меры составлял ~50 мкл, cкоpоcть пpотекания
37 °C. Кроме того, была проведена оценка зави!
pаcтвоpа 25 мл/мин, поддерживаемая темпера!
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
SKQ1 ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНСЕРВАЦИИ РОГОВИЦЫ
445
тура 36,80 ± 0,2 °C. Флуоресцентные изображе!
37 °C). Стекла с клетками помещали в камеру
ния клеток записывали с помощью камеры
флуоресцентного микроскопа. В ходе экспери!
AxioCam HSm, используя набор фильтров и ди!
мента первые 5 мин (период I) клетки находи!
хроическое зеркало #009 («Zeiss», Германия). Ре!
лись при температуре 10 °С, затем 5 мин - при
гистрацию изображений производили с интер!
температуре 37 °С (период II) и последующие
валом 30 с на протяжении всего эксперимента
5 мин (период III) - в среде PBS, содержащего
при низкой интенсивности возбуждающего све!
10 мМ Na+ при температуре 37 °С в присутствие
та, что позволяло избегать выгорания флуоро!
100 ед./мл Nystatin (рис. 1). Для определения
фора во время эксперимента. Серии цифровых
проницаемости плазматической мембраны для
изображений регистрировали с дигитализацией
ионов натрия создавали ступенчатый градиент
12 бит в режиме линейного преобразования па!
натрия сменой среды, содержащей 147,4 и
дающей интенсивности и сохраняли на компь!
10 мМ натрия. Экспериментальные записи из!
ютере в формате TIFF. Измерения интенсивнос!
менения флуоресценции Sodium Green для
ти флуоресценции проводили c помощью прог!
оценки скорости изменения внутриклеточного
раммного пакета «CytoDynamics» c запиcью ре!
натрия нормировали по амплитуде и находили
зультатов измерения динамики интенсивностей
коэффициент линейной регрессии начального
индивидуальных клеток в формате таблиц Excel
участка кривой флуоресценции, как это описа!
(Программа для ЭВМ 2016612766 РФ).
но нами ранее [16].
Измерение концентрации внутриклеточного
Анализ экспериментальных данных по дина!
натрия. Концентрацию [Na+]i в клетках опреде!
мике внутриклеточной концентрации ионов Na+
ляли флуориметрическим методом с помощью
с целью получения количественных оценок
флуоресцентного красителя Sodium Green
проницаемости мембраны клеток для ионов
AM («Molecular Probes», США), согласно уста!
натрия производили с помощью математичес!
новленному ранее протоколу [15].
кой модели главных клеток собирательных тру!
Сигнал калибровали, помещая клетки в фос!
бок почки, разработанной нами ранее [17]. Ус!
фатный солевой буфер (PBS) с различной кон!
реднённые профили флуоресценции клеток в
центрацией Na+ (147,4 мМ, и 10 мМ в присут!
экспериментальных группах (M ± SD) строили,
ствие
100
ед./мл Na+!ионофора Nystatin
рассчитывая средние значения соответствую!
(«AppliChem», Германия). Гипонатриевый раст!
щих точек профилей области интереса (ОИ).
вор (10 мМ NaCl) готовили на основе изотони!
В каждой экспериментальной группе рассчиты!
ческого PBS, в котором часть натрия замещали
вали стационарную концентрацию натрия в
на
137,4
мМ n!methyl!D!glucamine
(«ICN
клетках при 37 °С в интервале II, исходя из сред!
Biomedicals», США). Для измерения покровное
них значений интенсивности флуоресценции на
стекло с клетками эндотелия переносили в раст!
квазистационарных участках профиля, соответ!
вор PBS. Клетки загружали флуоресцентным
ствующих интервалам I и III, и внутриклеточ!
красителем Sodium Green AM (10 мкM, 40 мин,
ной концентрации натрия, равной 147,4 мМ при
Рис. 1. Схема эксперимента по измерению стационарной концентрации внутриклеточного натрия
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
446
БАТУРИНА и др.
температуре 10 °С и 10 мМ в присутствие
100 ед./мл Nystatin.
Анализ микроизображений с помощью прогA
раммы «CytoDynamics». Для реализации компью!
терной флуориметрии применяли специализи!
рованный программный пакет «CytoDynamics»
(госрегистрация № 2016612766). Для цифровой
обработки берутся файлы, получаемые непосред!
ственно с камеры. «CytoDynamics» определяет
контуры групп и индивидуальных клеток - об!
ласти интереса (ОИ) - на начальном кадре се!
рии и удерживает контур изображения на после!
дующих во времени снимках (рис. 2) [18].
На изображении каждой ОИ программа оп!
ределяет периметр, площадь и интегральную
интенсивность флуоресценции, которая про!
порциональна внутриклеточной концентрации
натрия [19]. Соответствие интенсивности флуо!
ресценции и [Na+]i определяли в каждой экспе!
риментальной группе.
Статистический анализ. Усреднённые профи!
ли флуоресценции строили по средним значе!
ниям точек индивидуальных профилей ОИ. На
графиках усреднённых профилей точки пред!
ставлены в виде среднего значения и стандартно!
го отклонения (M ± SD). Количество профилей,
усредняемых в каждой точке эксперименталь!
ного профиля в группе с соответствующим вре!
менем консервации, указано в разделе. Средние
величины, полученные таким образом, рассмат!
ривали как независимые. Размер выборки (n)
для определения статистических достовернос!
тей различия [Na+]i определялся количеством
точек на плато в периоде II и был равен 9 (n = 9).
Достоверности различий определяли с приме!
нением t!критерия Стьюдента для двух незави!
симых групп. Соответствие полученных значе!
ний флуоресценции нормальному распределе!
нию определяли с помощью теста Shapiro-
Wilk (Statistica 6.1, statsoft.com).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Экспериментальный профиль флуоресцен!
ции Sodium Green имеет три характерных ква!
зистационарных участка, которые соответству!
ют внутриклеточной концентрации натрия в
этих участках (рис. 3). В интервалах I и III внут!
риклеточная концентрация натрия соответству!
ет его концентрации в среде. В интервале I энер!
Рис. 2. Фрагмент препарата переживающих клеток эндоте!
гозависимый транспорт остановлен, поскольку
лия роговицы. (×25/0,8 Plan!apochromat, Zeiss). а - Фазово!
при температуре 10 °С активность Na/К АТФазы
контрастное изображение; б - флуоресцентное изображе!
подавлена, и в клетках устанавливается [Na+]i,
ние; в - флуоресцентное изображение с выделенными зо!
равновесная со средой (147,4 мM). В интервале
нами интереса. (С цветным вариантом рис. 2 можно озна!
комиться в электронной версии статьи на сайте: http://
III равновесие со средой устанавливается в ре!
sciencejournals.ru/journal/biokhsm/.)
зультате повышения проницаемости плазмати!
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
SKQ1 ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНСЕРВАЦИИ РОГОВИЦЫ
447
Рис. 3. Усреднённые профили интенсивности флуоресценции Sodium Green (условные единицы - УЕ). Влияние присут!
ствия 1 нM SkQ1 в среде консервации. а - 1 день (количество индивидуальных профилей ОИ: контроль - 110; экспери!
мент - 90), б - 5 дней (количество индивидуальных профилей ОИ: контроль - 100; эксперимент - 70), в - 10 дней (ко!
личество индивидуальных профилей ОИ: контроль - 70; эксперимент - 60). Сплошная линия - профиль препаратов, ин!
кубированных в среде Eusol!C; пунктирная линия - профиль препаратов, инкубированных в среде Eusol!C, содержащей
1 нM SkQ1
ческой мембраны, вызванной присутствием
экспериментальная (1 нM SkQ1) группы соответ!
Nystatin. Интенсивность флуоресценции в ин!
ственно) (p < 0,01, n = 9). Присутствие в консер!
тервале II соответствует величинам равновесной
вационной среде 1 нM SkQ1 обусловило пони!
внутриклеточной концентрации натрия, кото!
женный по сравнению с контролем стационар!
рая устанавливается в клетке в результате балан!
ный уровень [Na+]i в клетках эндотелия при тем!
са потоков ионов натрия в клетку и из клетки.
пературе 37 °С.
Таким образом, величина [Na+]i определяется
Клетки эндотелия роговицы формируют
активностью Na/К АТФазы и скоростью входа,
клеточный монослой, важной функцией кото!
которая зависит от проницаемости плазмати!
рого является регуляция осмотического баланса
ческой мембраны (интервал II). В клетках эндо!
стромы роговицы. В настоящее время принято
телия, подвергавшихся гипотермическому воз!
описание функции эндотелия посредством так
действию в консервационной среде EusolC, при
называемой «pump!leak» модели [7, 8], которая
37 °С устанавливалась равновесная концентра!
разделяет потоки активного и осмотического
ция внутриклеточного натрия в зависимости от
переноса. Нарушение целостности клеточного
времени консервации и присутствия в консер!
монослоя эндотелия приводит к резкому воз!
вационной среде 1 нM SkQ1: 1 день - 27,3 ± 1,9
растанию парацеллюлярных потоков, описыва!
и 44,2 ± 3,1; 5 дней - 63,2 ± 4,8 и 47,3 ± 3,2;
емых как «утечка», что вызывает отёк и сниже!
10 дней - 69,2 ± 4,7 и 44,1 ± 3,5 (контрольная и
ние прозрачности роговицы. Клетки эндотелия
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
448
БАТУРИНА и др.
ного иона адекватным показателем функцио!
нальной возможности транспортного механиз!
ма клетки. Результаты исследования этого пока!
зателя в контрольных образцах позволяют гово!
рить о значительном возрастании величины
равновесной [Na+]i, устанавливающейся при
37 °С в клетках эндотелия по мере нарастания
срока гипотермической консервации. Как пока!
зали результаты наших экспериментов, прони!
цаемость плазматической мембраны клеток эн!
дотелия для натрия после гипотермической
консервации в течение 10 дней снижается в
контрольных группах, но остаётся повышенной
в группах с SkQ1 (рис. 4).
Это позволяет сделать вывод, что повыше!
ние в клетках равновесной [Na+]i в контрольных
группах связано со снижением транспортной
Рис. 4. Влияние гипотермической консервации на прони!
функции Na/K!ATФазы. Присутствие в консер!
цаемость плазматической мембраны клеток эндотелия ро!
вационной среде SkQ1 оказывает значительное
говицы для ионов натрия. Неокрашенные столбцы - конт!
и несколько неоднозначное влияние на равно!
роль; серые столбцы - присутствие 1 нM SkQ1 в среде кон!
сервации. * Снижение проницаемости в контрольной
весную [Na+]i, которая устанавливается при
группе (p < 0,05); ** превышение над контрольной группой
37 °С в зависимости от длительности гипотер!
(p < 0,01)
мической консервации.
Как можно видеть из результатов экспери!
ментов, препараты, хранившиеся в присут!
остановлены в фазе клеточного цикла G1, и по
ствии SkQ1, показывают близкие значе!
этой причине не проходят митотическое деле!
ния [Na+]i во всех экспериментальных группах.
ние [20]. С возрастом часть клеток гибнет, и це!
И если для одного дня гипотермической кон!
лостность клеточного слоя сохраняется за счёт
сервации эти значения превышают показатели
оставшихся живых клеток, которые также фор!
контрольной группы (рис. 3, а), что, по!видимо!
мируют сплошной клеточный слой, но с мень!
му, связано с повышенной проницаемостью
шим количеством клеток [21, 22]. В этой связи
плазматической мембраны для натрия, то в экс!
до настоящего времени одним из основных кри!
периментальных группах 5 и 10 дней они значи!
териев функциональности эндотелия и пригод!
тельно ниже значений в контрольных груп!
ности роговицы для трансплантации является
пах (рис. 3, б и в). Наиболее вероятным механиз!
морфологический критерий - плотность эндо!
мом такого эффекта может быть протекторное
телиальных клеток, которая снижается с возрас!
действие SkQ1 на функции митохондрий и обес!
том донора [23]. Однако этот показатель не поз!
печение энергией функции натрий!калиевого
воляет оценивать функциональные возможнос!
насоса. Как было показано в ряде работ по ис!
ти эндотелия как регулятора осмотического ба!
следованию катионных производных пластохи!
ланса матрикса. Возможность определить
нона (SkQ, «Скулачев!ионов»), эти производ!
транспортный потенциал клеток эндотелия мо!
ные, обладающие высокой антиоксидантной
жет иметь значение как для определения при!
активностью, являются возобновляемыми анти!
годности ткани для трансплантации после пери!
оксидантами [24, 25].
ода консервации, так и в исследовательских це!
Заметный антиоксидантный эффект SkQ
лях для проверки эффективности создаваемых
наблюдался уже при концентрации 1 нM. Было
рецептур новых сред для консервации.
показано, что соединения группы SkQ (в част!
В настоящей работе проводили изучение
ности, SkQ1) способны проникать через плос!
влияния присутствия в среде консервации SkQ1
кие бислойные мембраны, электрофоретически
на восстановление баланса потоков натрия ин!
накапливаться в митохондриях с высокой изби!
дивидуальных клеток эндотелия после оконча!
рательностью и восстанавливаться дыхательной
ния гипотермического хранения. Трансмемб!
цепью. В изолированных митохондриях в нано!
ранный электрохимический градиент натрия
молярных концентрациях SkQ1 чрезвычайно
создаётся Na/К!АТФазой и является значимым
эффективно снижает активность радика!
вторичным источником энергии для транспорт!
лов OH• [26]. Можно предположить, что при ги!
ных процессов в клетке. Таким образом, можно
потермической консервации эффект SkQ1,
считать внутриклеточную концентрацию дан!
обуславливающий высокую эффективность нат!
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
SKQ1 ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНСЕРВАЦИИ РОГОВИЦЫ
449
рий!калиевого насоса, объясняется высокой
Резюмируя результаты настоящей работы,
степенью восстановления энергетической
можно сказать, что они дают основания для раз!
функции митохондрий в клетках эндотелия.
вития дальнейших исследований механизма
Производные пластохинона, включая SkQ1, в
действия SkQ1 на эндотелии роговицы и воз!
низких концентрациях способны блокировать
можности применения этого агента в консерва!
развитие апоптоза, вызванного оксидативным
ционных средах.
стрессом: транслокацию проапоптозного белка
bax в митохондрии и выход цитохрома с из ми!
тохондрий [26, 27]. Антиапоптозный эффект
Финансирование. Работа выполнена при фи!
SkQ1, по!видимому, также может способство!
нансовой поддержке Российского фонда фунда!
вать сохранению целостности клеточного мо!
ментальных исследований (гранты №№ 19!08!
нослоя и тем самым сохранению осморегулиру!
00874 и 20!015!00147!а) и бюджетного финанси!
ющей функции эндотелия в процессе гипотер!
рования по государственному заданию (проект
мической консервации. Эффект SkQ1 на прони!
№ 0259!2021!0016).
цаемость клеток для ионов натрия, вероятно,
Конфликт интересов. Авторы заявляют об от!
вызван тем, что катионные производные плас!
сутствии конфликта интересов.
тохинона способны взаимодействовать с транс!
Соблюдение этических норм. Все примени!
портерами плазматической мембраны и влиять
мые международные, национальные и/или инс!
на их функцию, но эти механизмы нуждаются в
титуциональные принципы ухода и использова!
более глубоком исследовании.
ния животных были соблюдены.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Maghsoudlou, P., Sood, G., and Akhondi, H. (2020)
Oftal’mologii, 5, 262!265, doi: 10.25276/2312!4911!2019!
Cornea transplantation, in StatPearls
[Internet],
5!262!265.
StatPearlsPublishing, Treasure Island (FL).
12. Wei, Y., Troger, A., Spahiu, V., Spahiu, V.,
2.
Bourne, W. M. (1998) Clinical estimation of corneal
Perekhvatova, N., et al. (2019) The role of SKQ1
endothelial pump function, Trans. Am. Ophthalmol. Soc.,
(Visomitin) in inflammation and wound healing of the
96, 229!239.
ocular surface, Ophthalmol. Ther., 8, 63!73, doi: 10.1007/
3.
Riley, M. V., Winkler, B. S., and Starnes, C. A. (1998)
s40123!018!0158!2.
Regulation of corneal endothelial barrier function by
13. Brzheskiy, V. V., Efimova, E. L., Vorontsova, T. N.,
adenosine, cyclic AMP, and protein kinases, Invest.
Alekseev, V. N., gusarevich, O. G., et al. (2015) Results of
Ophthalmol. Vis. Sci., 39, 2076.
a multicenter, randomized, double!masked, placebo!con!
4.
Bonanno, J. A. (2012) Molecular mechanisms underlying
trolled clinical study of the efficacy and safety of Visomitin
the corneal endothelial pump, Exp. Eye Res., 95, 2!7,
eye drops in patients with dry eye syndrome, Adv. Ther., 32,
doi: 10.1016/j.exer.2011.06.004.
1263!1279, doi: 10.1007/s12325!015!0273!6.
5.
Schmedt, T., Silva, M. M., Ziaei, A., and Jurkunas, U.
14. Silachev, D. N., Plotnikov, E. Y., Pevzner, I. B., Zorova,
(2012) Molecular bases of corneal endothelial dystrophies,
L. D., Balakireva, A. V., et al. (2018) Neuroprotective
Exp. Eye Res., 95, 24!34, doi: 10.1016/j.exer.2011.08.002.
effects of mitochondria!targeted plastoquinone in a rat
6.
Kuang, K., Li, Y., Yiming, M., Sánchez, J. M., Iserovich, P.,
model of neonatal hypoxic!ischemic brain injury,
et al. (2004) Intracellular [Na+], Na+ pathways, and fluid
Molecules, 23, 1871, doi: 10.3390/molecules23081871.
transport in cultured bovine corneal endothelial cells,
15. Solenov, E. I. (2008) Cell volume and sodium content in rat
Exp. Eye. Res., 79, 93!103, doi: 10.1016/j.exer.2004.02.
kidney collecting duct principal cells during hypotonic
014.
shock, J. Biophys., 2008, 420963, doi: 10.1155/2008/420963.
7.
Riley, M., Winkler, B., Czajkowski, C., and Peters, M.
16. Ilyaskin, A. V., Karpov, D. I., Medvedev, D. A., Ershov,
(1995) The roles of bicarbonate and CO2 in transendothe!
A. P., Baturina, G. S., et al. (2014) Quantitative estimation
lial fluid movement and control of corneal thickness,
of transmembrane ion transport in rat renal collecting duct
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 103!112.
principal cells, Gen. Physiol. Biophys.,
33,
13!28,
8.
Bonanno, J. A. (2003) Identity and regulation of ion trans!
doi: 10.4149/gpb_2013063.
port mechanisms in the corneal endothelium, Prog. Retin
17. Ilyackin, A. V., Batupina, G. C., Medvedev, D. A., Epshov,
Eye Res., 22, 69!94, doi: 10.1016/s1350!9462(02)00059!9.
A. P., Colenov, E. I. (2011) Examining reaction of renal
9.
Bonanno, J. A., Guan, Y., Jelamskii, S., and Kang, X. J.
collecting duct main cells to hypotonic shock. Experiment
(1999) Apical and basolateral CO2!HCO3! permeability in
and mathematical modeling [in Russian], Biofizika, 56,
cultured bovine corneal endothelial cells, Am. J. Physiol.,
550!560, doi: 10.1134/S0006350911030092.
277, C545!C553, doi: 10.1152/ajpcell.1999.277.3.C545.
18. Palchikova, I. G., Smirnov, E. S., and Konev, A. A. (2017)
10.
Baturina, G. S., Pal’chikova, I. G., Konev, A. A., Smirnov,
Analyses of DNA image cytometry uncertainty caused by
E. S., Katkova, L. E., et al. (2018) Examining effects of
diffractive blurring, Appl. Mech. Mater., 870, 369!374,
hypothermic conservation on sodium level in corneal graft
endothelial cells [in Russian], Vavilovskiy Zhurnal Genetiki
19. Winslow, J. L., Cooper, R. L., and Atwood, H. L. (2002)
i Selektsii, 22, 433!437, doi: 10.18699/VJ18.379.
Intracellular ionic concentration by calibration from fluo!
11.
Baturina, G. S., Katkova, L. E., Pal’chikova, I. G.,
rescence indicator emission spectra, its relationship to the
Solenov, E. I., and Iskakov, I. A. (2019) New approaches to
K(d), F(min), F(max) formula, and use with Na!Green for
examining functional activity of endothelial cells in corneal
presynaptic sodium, J. Neurosci. Methods., 118, 163!175,
preparations [in Russian], Sovremennye Tekhnologii v
doi: 10.1016/s0165!0270(02)00100!0.
11 БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
450
БАТУРИНА и др.
20.
Maycock, N. J., and Marshall, J. (2014) Genomics of
tem II in situ, Photosynth. Res.,
142,
229!240,
corneal wound healing: a review of the literature, Acta
doi: 10.1007/s11120!019!00657!2.
Ophthalmol., 92, e170!e184, doi: 10.1111/aos.12227.
25. Rokitskaya, T. I., Murphy, M. P., Skulachev, V. P., and
21.
Edelhauser, H. F. (2000) The resiliency of the corneal
Antonenko, Y. N. (2016) Ubiquinol and plastoquinol
endothelium to refractive and intraocular surgery, Cornea,
triphenylphosphonium conjugates can carry electrons
19, 263-273, doi: 10.1097/00003226!200005000!00002.
through phospholipid membranes, Bioelectrochemistry,
22.
Joyce, N. C. (2003) Proliferative capacity of the corneal
111, 23!30, doi: 10.1016/j.bioelechem.2016.04.009.
endothelium, Prog. Retin. Eye Res.,
22,
359!389,
26. Antonenko, Y. N., Avetisyan, A. V., Bakeeva, L. E.,
doi: 10.1016/s1350!9462(02)00065!4.
Chernyak, B. V., Chertkov, V. A., et al.
(2008)
23.
Vianna, L. M., Li, H. D., Holiman, J. D., Stoeger, C.,
Mitochondria!targeted plastoquinone derivatives as tools
Belfort, R. Jr., and Jun, A. S. (2016) Characterization of
to interrupt execution of the aging program. 1. Cationic
cryopreserved primary human corneal endothelial cells
plastoquinone derivatives: synthesis and in vitro studies,
cultured in human serum!supplemented media, Arq.
Biochemistry (Moscow), 73, 1273!1287, doi: 10.1134/
Bras. Oftalmol., 79, 37!41, doi: 10.5935/0004!2749.
s0006297908120018.
20160011.
27. Saretzki, G., Murphy, M. P., and von Zglinicki, T. (2003)
24.
Ptushenko, V. V., Solovchenko, A. E., Bychkov, A. Y.,
MitoQ counteracts telomere shortening and elon!
Chivkunova, O. B., Golovin, A. V., et al. (2019) Cationic
gates lifespan of fibroblasts under mild oxidative stress, Aging
penetrating antioxidants switch off Mn cluster of photosys!
Cell, 2, 141!143, doi: 10.1046/j.1474!9728.2003.00040.x.
MITOCHONDRIAL ANTIOXIDANT SkQ1 IMPROVES
HYPOTERMIC PRESERVATION OF CORNEA
G. S. Baturina1,2, L. E. Katkova1, I. G. Palchikova2,3,
N. G. Kolosova1, E. I. Solenov1,2,4*, and I. A. Iskakov5
1 Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences,
630090 Novosibirsk, Russia; E(mail: eugsol@bionet.nsc.ru
2 Novosibirsk State University, 630090 Novosibirsk, Russia
3 Technological Design Institute of Scientific Instrument Engineering of the Siberian Branch
of the Russian Academy of Sciences 630058 Novosibirsk, Russia
4 Novosibirsk State Technical University, 630087 Novosibirsk, Russia
5 Fedorov NMRC MNTK “Eye Microsurgery”, 630096 Novosibirsk, Russia
Diseases affecting the cornea are frequent cause of blindness worldwide and keratoplasty is important way for healing
of heavy affected cornea. For successful grafting functional competence of cornea endothelial cells is crucial. It makes
important improvement the mediums for hypothermic storage and methods for evaluation of functional competence
of cornea. Transport of water and ions by cornea endothelium is important for viability and optic properties of cornea.
The effect of SkQ1 on recovering sodium concentration in endothelial cells after hypothermic preservation of cornea
was studied. For this purpose, the effect of SkQ1 on intracellular sodium concentration of pig corneal endothelium
cells after hypothermic preservation at 4°С during 1, 5, and 10 days in standard Eusol!C solution was determined.
Concentration of intracellular sodium in preparation of endothelial cells was assayed using fluorescent dye Sodium
Green. The fluorescent images were analyzed with custom made computer program “CytoDynamics”. The estima!
tion of sodium concentrations in pig corneal endothelium cells revealed a significant increase in the level of intracel!
lular sodium in control samples after 10 days of hypothermic preservation. Preservation in the presence of 1.0 nM
SkQ1 led to set up a lower level of the equilibrium concentration of intracellular sodium in comparison with the con!
trol at the temperature 37°С. Statistically significant decrease of plasma membrane sodium permeability of endothe!
lial cells after 10 days of hypothermic preservation in control samples was shown. No decrease in permeability was
observed in samples subjected to preservation in the presence of 1 nM SkQ1. The presence of SkQ1 increases the abil!
ity of endothelial cells to restore the concentration of intracellular sodium. SkQ1 is a promising agent that helps to
preserve the functional competence of endothelial cells during cold preservation.
Keywords: corneal endothelium, hypothermic preservation, SkQ1, intracellular sodium
БИОХИМИЯ том 86 вып. 3 2021
