БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 4, с. 496 - 510

УДК 576.385.5.

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ микроРНК 219 1

И ЕЕ АССОЦИАЦИЯ С МУЛЬТИФОРМНОЙ ГЛИОБЛАСТОМОЙ

А. Гасеми¹, А. Мохаммади², C. Фаллах²*

¹ Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences (TUMS),

14176 13151 Tehran, Iran

² Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Iran University of Medical Sciences (IUMS),

14496 14535 Tehran, Iran; e mail: fallah.s@iums.ac.ir

Поступила в редакцию 05.08.2020

После доработки 08.12.2020

Принята к публикации 29.12.2020

МикроРНК 219 1 (miR 219 1) известна как опухолевый супрессор, характерный для различных типов ра

ка, однако до сих пор не изучен эпигенетический механизм, регулирующий экспрессию генов. Используя

полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР РВ) и технологию бисульфитного секвенирова

ния генома, были определены уровни метилирования промоторного участка гена miR 219 1 и уровни

экспрессии генов miR 219 5p и miR 219 1 3p в ткани мультиформной глиобластомы (GBM) (n = 31) и близ

лежащих нормальных тканях (n = 31), а также в линии клеток GBM U87 соответственно. После обработки

клеток U87 мультиформной глиобластомы препаратом 5 аза 2′ дезоксицитидина (5 aza dC) в них были оп

ределены уровни метилирования промоторного участка гена miR 219 1, соответствующих целевых mRNA,

и белков с помощью модификации генома бисульфитом, ПЦР РВ и методики ELISA соответственно. На

ши результаты показали, что уровни экспрессии генов miR 219 5p и miR 219 1 3p были значительно ниже

у пациентов с GBM по сравнению с соседними нормальными тканями (p < 0,01). Промотор miR 219 1 имел

высокий уровень метилирования в тканях GBM (p < 0,01). Также в тканях GBM наблюдалась отрицатель

ная корреляция между экспрессией генов miRNA и уровнями метилирования (p < 0,01). Обработка клеток

GBM U87 препаратом 5 aza dC приводила к снижению уровня метилирования miR 219 1, целевых mRNA

и белков циклина A2 и муцина 4 (MUC4) и повышению уровня экспрессии miR 219 5p и miR 219 1

3p (p < 0,01). Введение miR 219 5p и miR 219 1 3p приводило к подавлению экспрессии циклина A2

и MUC4, в результате чего наблюдалось снижение уровня пролиферации линии клеток GBM U87 (p < 0,01).

Эти результаты говорят о том, что метилирование DNA играет важную роль в регуляции гена miR 219 1, а

гиперметилированная miR 219 1 может участвовать в патогенезе мультиформной глиобластомы.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: miR 219 1, эпигенетика, GBM, мультиформная глиобластома.

DOI: 10.31857/S0320972521040047

ВВЕДЕНИЕ

цированы Всемирной организацией здраво

охранения (ВОЗ) на разные стадии (I-IV) [3],

Ежегодная заболеваемость раком централь

а мультиформная глиобластома (GBM) являет

ной нервной системы (CNS) составляет при

ся наиболее агрессивной формой (стадия IV)

мерно 3,5 случаев на 100 000 человек, что дости

этих злокачественных опухолей головного моз

гает 1,9% всех вновь диагностированных случа

га [2]. Средняя выживаемость пациента с впер

ев рака и 2,3% смертей от рака во всем мире [1].

вые диагностированной GBM составляет

Глиомы являются самыми распространёнными

12-15 месяцев, а выживаемость в течение

и приводящими к летальному исходу нейроэпи

5 лет - менее 3% [4]. Поэтому изучение молеку

телиальными опухолями, и они составляют

лярных механизмов, лежащих в основе возник

большинство злокачественных опухолей голов

новения и прогрессирования GBM, необходи

ного мозга человека [2]. По клинико патоло

мо для улучшения традиционных терапевтичес

гическим показателям глиомы были классифи

ких стратегий и облегчения разработки новых

методов лечения этого агрессивного заболева

ния.

Принятые сокращения: ПЦР РВ - полимеразная

МикроRNA (miRNA) представляют собой

цепная реакция в реальном времени; 5 aza dC - 5 аза 2′

небольшие некодирующие молекулы RNA

дезоксицитидин; GBM - мультиформная глиобластома;

miRNA - микроРНК (microRNA); MUC4 - муцин 4;

(19-24 нуклеотидов), которые регулируют

U87MG - линия клеток GBM U87.

экспрессию генов на посттранскрипционном

* Адресат для корреспонденции.

уровне как у растений, так и у животных [5].

496

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

497

Они участвуют в регуляции различных биологи

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ческих процессов, протекающих при нормаль

ном развитии, включая клеточный цикл, проли

Образцы опухолевой ткани. Исследователь

ферацию, дифференцировку, апоптоз и многие

ские анализы были выполнены на 31 свежем об

другие молекулярные пути [6]. Было показано,

разце опухоли GBM и прилегающих к ним гис

что при различных патологических процессах,

тологически нормальных тканях. В данном ис

таких как рак, происходит изменение уровня

следовании приняли участие

мужчин и

экспрессии генов различных miRNA [7]. Кроме

14 женщин в возрасте 25-79 лет (средний воз

генетических механизмов, важную роль в конт

раст - 59 лет). Подробные клинико патологи

роле экспрессии miRNA играет эпигенетика:

ческие характеристики образцов GBM пред

метилирование DNA и ковалентная модифика

ставлены в таблице. Все образцы опухолевых

ция гистоновых белков [8], а гиперметилирова

тканей были получены в результате хирургичес

ние CpG островков miRNA, подавляющих раз

кой операции в отделении нейрохирургии гос

витие опухоли, вносит вклад в канцероге

питаля имама Резы (Тебриз, Иран) в соответ

нез [8, 9].

ствии с процедурой, одобренной Комитетом по

В результате процессинга предшественника

исследованиям на людях.

miR 219 1, который осуществляет фермент

Два патолога просмотрели все образцы.

Dicer, образуются две зрелых miRNA: одна с 5′

В исследовании использовались только первич

конца (miR 219 5p) и другая - с 3′ конца pre

ные образцы тканей GBM. Ни один из пациен

miR 219 1 (miR 219 1 3p). В связи с тем, что эти

тов до операции не подвергался переливанию

два зрелых продукта процессинга обладают уни

крови, лучевой терапии или химиотерапии. Па

кальными затравочными (seed) участками, каж

циенты были исключены, если у них в анамнезе

дая miRNA нацелена на разные mRNA

был диабет, фиброз печени, рассеянный скле

(http://www.mirbase.org/). Недавнее исследова

роз, шизофрения, а также некоторые виды рака

ние продемонстрировало, что miR 219 5p имеет

(такие как гепатоцеллюлярная карцинома, па

низкий уровень экспрессии гена в глиоме и

пиллярная карцинома щитовидной железы, рак

действует как опухолевый супрессор в клетках

яичников, колоректальный рак и др.). Кроме то

GBM [10].

го, окружающие опухоль нормальные ткани с

Хотя исследование подтвердило, что Sal по

какими либо неопластическими опухолями

добный белок 4 является целевой mRNA miR

и/или некротическими поражениями были ис

219 5p [10], циклин A2, идентифицированный

ключены из исследования. После проведения

как прямая мишень miR 219 5p при плоско

операции все образцы мгновенно замораживали

клеточной карциноме пищевода, также может

в жидком азоте и хранили при -80 °C до даль

оказывать онкогенное действие на глиому [11].

нейшего использования в настоящей работе.

Также была показана роль в качестве опухо

Для использования образцов опухолевой ткани

левого супрессора для miR 219 1 3p, нацелен

от всех больных было получено письменное ин

ной на ген, кодирующий муцин 4 (MUC4), при

формированное согласие.

раке поджелудочной железы [12]. Однако не

Линия клеток, культивирование клеток и их об

смотря на то что способность miR 219 1 подав

работка препаратом 5 aza dC. Линия раковых

лять опухолевый рост изучалась при различных

клеток человека GBM U87 (ATCC® HTB 14™)

типах рака, не было получено данных, касаю

была приобретена в Институте Пастера (Иран), и

щихся эпигенетической модуляции miR 219 5p

её культивировали не более одного месяца после

и miR 219 1 3p при мультиформной глиоблас

покупки. Клеточную линию культивировали в

томе.

стерильных условиях при 37 °C в атмосфе

Хотя miR 219 1 является представителем

ре 5% CO₂ в модифицированной Дульбекко сре

miRNA, чья экспрессия при различных типах

де Игла (DMEM; «Life Technologies, Inc.», США),

рака в значительной степени подавлена [10, 12],

дополненной стрептомицином (100 мкг/мл), пе

до сих пор в тканях GBM не определен уровень

нициллином (100 U/мл) («Life Technologies,

её экспрессии, эпигенетическая модификация

Inc.»), 2 мМ глутамина («Life Technologies, Inc.»)

и то, как этот регуляторный механизм может

и 10% ной фетальной бычьей сывороткой (FBS,

влиять на её функцию. С этой целью в настоя

«Life Technologies, Inc.»). Чтобы выявить корре

щем исследовании изучалась связь между

ляцию между уровнем гиперметилирования

экспрессией гена miR 219 1 и уровнем гипер

промотора miR 219 1 и уровнем экспрессии ге

метилирования её промотора, а также было

нов miR 219 5p и miR 219 1 3p, определяли

проанализировано, может ли эпигенетическая

уровни метилирования CpG островка в промо

модификация этой miRNA привести к подавле

торном участке гена miRNA и экспрессию ис

нию её мишеней.

следуемых miRNA после инкубации клеток

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

498

ГАСЕМИ и др.

GBM U87 (U87MG) в присутствии или при от

ся в тимин (T), присутствие C в этих положени

сутствии 5 аза 2′ дезоксицитидина (5 aza dC),

ях было индикатором неполного превращения

используя метод бисульфитного секвенирова

бисульфита. Уровни метилирования каждого

ния генома и ПЦР в реальном времени (ПЦР

сайта CpG внутри ампликона DNA определяли

РВ) соответственно. Вкратце, клетки GBM U87

количественно путём измерения отношения

рассевали в 6 луночные планшеты по 1 × 10⁵

между значениями высоты пиков C и T, исполь

клеток на лунку и инкубировали в течение 24 ч.

зуя основное уравнение для определения про

Затем добавляли свежую среду, содержащую 1

цента метилирования: (C/(C + T) × 100).

или 5 мкМ 5 aza dC (чистота ≥ 98%) («Sigma

Экстракция RNA и ПЦР в реальном времени.

Aldrich», США) и инкубировали в течение 72 ч.

Препарат общей RNA, включающий различные

После завершения обработки агентом использо

miRNA, получали путём экстракции из всех тка

ванную среду сменяли на свежую, не содержа

ней и клеток с помощью набора MirVanaTM

щую 5 aza dC, и клетки дополнительно культи

miRNA Isolation Kit («Ambion», США) согласно

вировали в течение 48 ч. Исходные растворы 5

инструкциям производителя. При изучении

aza dC растворяли в диметилсульфокси

экспрессии miR 219 5p и miR 219 1 3p, для

де (ДМСО; «Sigma Aldrich»), и устанавливали

синтеза комплементарной DNA (cDNA) исполь

базовую линию при имитации обработки клеток

зовали набор qScript™microRNA cDNA Synthesis

тем же объёмом ДМСО в трех повторах.

Kit («Quanta Bioscience», США). Для определе

Определение уровня метилирования. Метили

ния уровня экспрессии генов miR 219 5p и miR

рование промотора CpG островков miR 219 1

219 1 3p использовали наборы PerfeCTa®

определяли методом бисульфитного геномного

microRNA Assays («Quanta Biosciences», США)

секвенирования на геномной DNA, обработан

для определения miRNA, согласно инструкциям

ной бисульфитом натрия. Вкратце, DNA

производителя для проведения ПЦР РВ на амп

экстрагировали из клеток линии U87MG и за

лификаторе Rotor Gene 6000 («Qiagen»). Малая

мороженных тканей с помощью набора DNeasy

ядерная RNA U6 (U6 snRNA) использовалась в

Blood & Tissue Kit («Qiagen», Германия). Для

качестве эндогенного контроля для нормализа

проведения бисульфитной конверсии DNA

ции уровней экспрессии miR 219 5p и miR 219

1 мкг экстрагированной DNA обрабатывали би

1 3p при применении метода сравнительно

сульфитом натрия, согласно инструкциям про

го Ct (ΔΔCt). Значения относительного уровня

изводителя набора EpiTect® Fast Bisulfite

экспрессии гена miRNA определяли с помощью

Conversion Kit («Qiagen»), и затем подвергали

метода 2-ΔCt.

полимеразной цепной реакции (ПЦР) с исполь

Универсальный праймер, обычно входив

зованием набора праймеров: прямой прай

ший в набор, служил в качестве обратного прай

мер (5′ GTGATTTTTGATTTTTGTTTTTTTT

мера, а miRNA амплифицировали с помощью

3′) и обратный праймер (5′ TTCACCTACACT

специфического прямого праймера. Наши спе

TATTCCAACAAAC 3′). Условия термоциклиро

цифические прямые праймеры для определения

вания состояния бисульфита DNA были следу

miR 219 5p и miR 219 1 3p были 5′ TGATTG

ющие: 95°C - 5 мин, 60°C - 10 мин; 95°C -

TCCAAACGCAATTCT 3′ и 5′ AGAGTTGAG

5 мин, 60°C - 10 мин. Образцы очищали на ко

TCTGGACGTCCCG 3′ соответственно. Также

лонке EpiTect spin column и элюировали

прямым праймером U6 snRNA был 5′ ATTG

15 мкл Buffer EB, прилагаемого в наборе. Чтобы

GAACGATACAGAGAAGATT 3′, а обратным -

определить картину метилирования в отдельной

5′ GGAACGCTTCACGAATTTG 3′. Каждую ко

молекуле, для клонирования очищенных про

личественную ПРЦ РВ проводили в двух повто

дуктов ПЦР в вектор pGEM T Easy Vector мы

рах, и U6 snRNA использовали для нормализа

использовали систему pGEM T Easy Vector

ции уровня экспрессии miR 219 1.

System II («Promega», США). С помощью скри

Чтобы изучить уровни экспрессии генов, ко

нинга

«синий/белый» и анализатора DNA

дирующих белки MUC4 и циклин A2, 1 мкг об

ABI 3730 XL («Applied Biosystem», США) секве

щей RNA подвергали обратной транскрипции в

нировали 8-10 клонов из каждого образца. Что

комплементарную DNA. Затем раствор разводи

бы контролировать полное превращение DNA в

ли в 10 раз. ПЦР РВ осуществляли, используя

результате действия бисульфита, цитозины (C),

специфические праймеры и метод SYBR Green

за которыми не следуют гуанины (цитозины, не

detection technology, как было описано ранее [12,

входящие в состав CpG), были просмотрены в

13]. Значения относительного уровня экспрес

анализируемом участке после проведения сек

сии miR 219 1 определяли с помощью мето

венирования. Так как после обработки бисуль

да ΔΔCt.

фитом и проведения ПЦР такие цитозины (не

Иммуноферментный анализ (ELISA). Опреде

входящие в CpG островки) должны превратить

ление содержания MUC4 и циклина A2 прово

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

499

дили, используя наборы Human MUC4 ELISA

экспрессией гена miR 219 1 (n = 62), уровнем

Kit («My BioSource», США) и Rat Cycline A2

метилирования (n = 31) и клинико патологи

ELISA Kit («My BioSource») соответственно, в

ческими характеристиками больных GBM. На

которых применялся количественный стандарт

основании среднего значения уровней экспрес

ный метод иммуноферментного анализа (ме

сии и метилирования miR 219 1 все пациенты с

тод ELISA).

GBM были разделены на четыре группы: паци

Трансфекция клеток и определение уровня

енты с низким (n = 37) и высоким (n = 25) уров

пролиферации. Обычно 10 нМ молекул предше

нем экспрессии гена miR 219 1 и пациенты с

ственников miR 219 5p и miR 219 1 3p, имити

низким (n = 13) и высоким уровнями метилиро

рующих miR 219 5p и miR 219 1 3p соответ

вания miR 219 1 (n = 18). Как показано в табли

ственно, и неспецифическую miRNA, служа

це, в исследуемой группе пациентов не было вы

щую в качестве отрицательного контроля (NC),

явлено статистически достоверных различий

трансфицировали в клетки линии U87MG с ис

между экспрессией гена miR 219 1, уровнем ме

пользованием Lipofectamine TM RNAiMAX

тилирования и возрастом (<50 и ≥50), по

(«Invitrogen», США). За день до трансфекции

лом (мужской/женский), расположением опу

клетки помещали в среду, не содержащую анти

холи (лобная доля, височная доля, теменная до

биотики. Клетки U87MG, трансфицированные

ля и затылочная доля). Однако проведённый на

miR 219 5p и miR 219 1 3p, культивировали, а

ми статистический анализ показал, что пони

затем инкубировали с 20 мкл бромдезоксиури

женный уровень экспрессии гена и высокий

дина (BrdU) в течение 2 ч. Клетки фиксировали,

уровень метилирования miR 219 1 в образцах

и включённую метку BrdU регистрировали с по

пациентов ассоциированы с размером опухо

мощью набора BrdU Cell Proliferation Kit

ли (<5 см против ≥5 см) и шкалой Карновско

(«Abcam», США) согласно инструкции произво

го (KPS - Karnofsky Performance Scale; <80 про

дителя.

тив ≥80).

Статистическая обработка данных. Для срав

Уровни экспрессии miR 219 1 и её генов ми

нения усреднённых значений уровня метилиро

шеней в тканях GBM. С помощью метода ПЦР

вания и экспрессии гена miR 219 1 в тканях

РВ мы определили уровни экспрессии miR 219

GBM и прилегающих нормальных тканях ис

5p, miR 219 1 3p, циклина A2 и MUC4 у паци

пользовали t критерий Стьюдента. Для сравне

ентов с GBM в опухолевой ткани и в близлежа

ния средних значений уровня метилирования и

щих нормальных тканях. Для сопоставления

экспрессии гена miR 219 1, MUC4 и цикли

экспрессии miRNA и их генов мишеней в об

на A2 в клетках до и после их обработки 5 аza

разцах опухолевой ткани и прилегающих нор

dC использовали метод ANOVA. Коэффициент

мальных тканей мы использовали сравнитель

линейной корреляции Пирсона был использо

ный метод Ct. Нами было выявлено снижение

ван для изучения взаимосвязи между метилиро

уровня экспрессии генов miR 219 5p и miR

ванием промоторного участка miR 219 1 и

219 1 3p в 27 (87%) и 25 (80%) образцах тканей

уровнем экспрессии гена, кодирующего

GBM по сравнению с прилегающими нормаль

эту miRNA. Статистический анализ был прове

ными тканями соответственно.

дён с использованием программы SPSS version

Как показано на рис. 1, а и b, у пациентов в

22.0, и значение p < 0,05 рассматривалось как

образцах GBM наблюдалось значительное сни

статистически достоверное различие.

жение уровня экспрессии генов miR 219 5p и

miR 219 1 3p по сравнению с прилегающими

нормальными тканями (t критерий Стьюдента,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

p < 0,01). Как показано на рис. 1, c и d, мы также

обнаружили повышенную экспрессию генов,

MiR 219 1 и клинико патологические харак

кодирующих циклин A2 (1,60 против 0,39; t

теристики пациентов с мультиформной глиоблас

критерий Стьюдента, p < 0,01) и MUC4 (1,71

томой. Взаимосвязь между экспрессией гена

против 0,62; t критерий Стьюдента, p < 0,05) в

miR 219 1, уровнями метилирования и клини

образцах GBM по сравнению с близлежащими

ко патологическими характеристиками была

нормальными тканями. Высокие уровни

оценена у 31 пациента с GBM. Поскольку наша

экспрессии циклина A2 и MUC4 в тканях GBM

группа пациентов состояла из относительно не

указывают на то, что эти онкогены могут прини

большого количества образцов опухоли GBM

мать участие в канцерогенезе глиомы.

(n = 31), для получения более точных результа

Статус метилирования промотора гена miR

тов мы объединили miR 219 5p (n = 31) и miR

219 1 в тканях GBM. Используя программу

219 1 3p (n = 31) уровни экспрессии гена как

methprimer (www.urogene.org/methprimer/) и

miR 219 1 и изучили взаимосвязь между

вставив 3000 нуклеотидов из вышележащей об

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

500

ГАСЕМИ и др.

Корреляция уровня экспрессии и метилирования гена miR 219 1 с клинико патологическими показателями больных с

мультиформной глиобластомой

Уровень экспрессии гена

miR 219 1 (n = 62*)

miR 219 1 (n = 31)

Характеристика

Значение p

Низкий

Высокий

Низкий

Высокий

(n = 37)

(n = 25)

(n = 13)

(n = 18)

n (%)

Возраст (годы)

<50

16 (43)

12 (48)

0,61

6 (46)

8 (44)

0,61

≥50

21 (57)

13 (52)

7 (54)

10 (56)

Пол

Мужской

21 (57)

13 (52)

0,53

7 (54)

10 (55)

0,69

Женский

16 (43)

12 (48)

6 (46)

8 (45)

Расположение опухоли

Лобная доля

9 (24)

5 (20)

0,42

3 (23)

4 (22)

0,71

Височная доля

10 (27)

6 (24)

3 (23)

5 (28)

Теменная доля

10 (27)

8 (32)

4 (31)

5 (28)

Затылочная доля

8 (22)

6 (24)

3 (23)

4 (22)

Размер опухоли

<5 см

11 (30)

17 (68)

0,016

9 (69)

5 (28)

0,023

≥5 см

26 (70)

8 (32)

4 (31)

13 (72)

KPS

<80

23 (62)

9 (36)

0,021

4 (31)

12 (67)

0,017

≥80

14 (38)

16 (64)

9 (69)

6 (23)

* Общее число определений уровня экспрессии генов miR 219 5p и miR 219 1 3p; GBM - мультиформная глиобластома;

KPS - шкала Карновского для оценки общего состояния онкобольного.

ласти miR 219 1, мы обнаружили CpG островок

ляционный анализ Пирсона показал, что уров

в промоторном участке miR 219 1 (от -2802 до

ни экспрессии генов miR 219 5p (R = -0,82,

-2952), на котором локализуются 22 CpG пов

p < 0,01) и miR 219 1 3p (R = -0,75, p < 0,01) от

тора (рис. 2, а). Анализ относительного уровня

рицательно коррелировали с гиперметилирова

метилирования с использованием субклониро

нием промотора miR 219 1. Эти данные пред

вания продуктов ПЦР и метода бисульфитного

полагают, что гиперметилирование промотор

секвенирования выявил повышение уровня ме

ного участка гена miR 219 1 в тканях GBM мо

тилирования гена miR 219 1 у пациентов с

жет привести к снижению уровня экспрессии

GBM (70,7%) по сравнению с прилегающими

гена.

нормальными тканями (16,4%; t критерий Стью

Влияние 5 aza dC на уровни метилирования и

дента, p < 0,01; рис. 2, b и c).

экспрессии генов miR 219 1. Чтобы оценить вли

Чтобы определить, является ли подавление

яние 5 aza dC на уровень метилирования про

miR 219 1 в GBM результатом гиперметилиро

мотора гена miR 219 1, был определен средний

вания его промотора, мы дополнительно прове

уровень метилирования промотора miRNA до и

ли анализ корреляции между метилированием

после обработки (в течение 72 ч) клеточной ли

промотора miR 219 1 и уровнями экспрессии

нии U87MG с помощью 1 или 5 мкМ препарата

генов miR 219 5p и miR 219 1 3p в образце па

5 aza dC. Перед началом эксперимента метод

циента GBM. Как показано на рис. 2, d, корре

секвенирования геномных бисульфитов показал

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

501

в промоторном участке гена mir 219 1 средний

ни экспрессии miR 219 5p и miR 219 1 3p до и

уровень метилирования - 64,5%. Однако обра

после обработки клеток препаратом 5 aza dC в

ботка клеток (в течение 72 ч) препаратом 5 aza

концентрации 1 или 5 мкМ. Как показано на

dC в концентрации 1 или 5 мкМ снизила уро

рис. 3, b, в результате деметилирования DNA с

вень метилирования miR 219 1 на 26% и 51%

помощью 1 или 5 мкМ 5 aza dC происходит по

соответственно. Эти результаты показали, что 5

вышение уровня экспрессии miR 219 5p в клет

aza dC способен снижать средний уровень ме

ках U87MG в 1,9 и 4,1 раза соответственно. Так

тилирования miR 219 1 в промоторном участ

же обработка клеток 1 или 5 мкМ 5 aza dC вы

ке (рис. 3, а). Кроме того, чтобы изучить влия

зывала повышение уровня экспрессии генов

ние 5 aza dC на уровень экспрессии гена miR

miR 219 1 3p в 1,8 и 3,2 раза соответственно

219 1, используя ПЦР РВ, мы определили уров

(рис. 3, c).

Рис. 1. Уровни экспрессии генов miR 219 5p, miR 219 1 3p, циклина A2 и MUC4 в образцах GBM. Для определения с по

мощью метода 2-ΔCT уровня экспрессии miRNA и генов мишеней в образцах GBM и прилегающих нормальных тканей

использовали метод ПЦР РВ. MiR 219 5p (а) и miR 219 1 3p (b) имели низкие уровни экспрессии генов у пациентов с

GBM (n = 31) по сравнению с соседней нормальной тканью без GBM (n = 31). Экспрессию miRNA в отдельных образцах

опухолевой ткани выражали относительно U6 snRNA (* p < 0,01). Также наблюдалось значительное увеличение уровней

экспрессии генов циклина A2 (c) и MUC4 (d) у пациентов с GBM в сравнении с нормальными прилегающими тканями.

Результаты были нормализованы относительно уровня mRNA β актина (ACTB). Все данные по экспрессии генов, каса

ющиеся индивидуальных образцов тканей человека, представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение;

p < 0,01 для всех образцов опухолей GBM в сравнении с образцами без GBM

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

502

ГАСЕМИ и др.

Рис. 2. Метилирование участков DNA, расположенных выше гена miR 219 1, и его связь с уровнем экспрессии гена.

а - Картирование CpG островков, показывающее их количество и расположение относительно промотора miR 219 1.

Для проведения анализа метилирования был использован CpG островок, включающий 151 п.н. (от -2802 до -2952 п.н.,

расположенных ниже кодона инициации pre miR 219 1, охватывающий 22 сайта CpG). b - Схема распределения CpG

островков в промоторном участке miR 219 1 в случайно выбранном образце ткани GBM, соответствующей прилегающей

нормальной ткани и клетках линии U87MG. Для каждого образца секвенировали по 8 отдельных клонов. Каждая строка

представляет уровень метилирования отдельных CpG (в диапазоне от 0 до 1) в отдельном клоне, за исключением послед

ней строки, которая представляет положение каждого CpG на хромосоме 6. Для упрощения первые четыре цифры каж

дой позиции CpG (3320) были удалены из сайтов CpG. Поэтому положение 4867 для CpG точно представляет 33204867 й

нуклеотид на хромосоме 6

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

504

ГАСЕМИ и др.

Рис. 3. Влияние 5 aza dC на уровни метилирования и экспрессии гена miR 219 1. Клетки линии U87MG были обработа

ны 5 aza dC в концентрации 1 или 5 мкМ в течение 72 ч. Как видно (a), различные концентрации 5 aza dC через 72 ч по

нижали уровень метилирования промотора miR 219 1. Противоположные результаты были получены при изучении зави

симости от дозы и времени обработки в случае уровня экспрессии miR 219 5p и miR 219 1 3p, когда гипометилирование

под воздействием 5 aza dC индуцировало экспрессию генов (b и c). Столбики ошибок представляют стандартные откло

нения трех повторностей ПЦР из одного экспериментального набора, а p представляет собой статистическую разницу

между группами клеток (* p < 0,05, ** p < 0,01); aza - 5 aza dC

Влияние 5 aza dC на экспрессию генов цикли

и 0,81 раза соответственно; рис. 4, b). Однако,

на A2 и MUC4 и уровни этих белков. Чтобы изу

как показано на рис. 4, c и d, обработка клеток

чить влияние 5 aza dC на уровни экспрессии ге

1 мкМ 5 aza dC не приводила к снижению уров

нов циклина A2 и MUC4 и уровни самих белков,

ня циклина A2 и MUC4, а восстановление уров

клетки U87MG обрабатывали 1 или 5 мкМ 5

ня этих белков происходило только в случае об

aza dC в течение 72 ч, далее использовали мето

работки клеток 5 мкМ 5 aza dC. С помощью

ды ПЦР РВ и ELISA соответственно. Наши ре

метода ELISA был определен уровень цикли

зультаты показали, что после обработки клеток

на A2 в необработанных клетках U87MG, он

1 или 5 мкМ 5 aza dC происходило снижение

составлял 310,8 пкг/мл. Обработка клеток пре

уровня экспрессии гена циклина A2 (в 0,29 и

паратом 5 aza dC в концентрации 1 или 5 мкМ

0,72 раза соответственно; рис. 4, а). Кроме того,

вызывала снижение уровня циклина A2 на

деметилирование DNA с помощью

1 или

12,1 пкг/мл (p > 0,05) и 112,7 пкг/мл (p < 0,01)

5 мкМ 5 aza dC приводило к снижению уровня

соответственно. Концентрация белка MUC4 в

экспрессии гена MUC4 в клетках U87MG (в 0,11

необработанных клетках U87MG составляла

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

505

12 нг/мл, и наблюдалось снижение его содержа

1 3p, в клетки U87MG, привести к подавлению

ния на 1,2 нг/мл (p > 0,05) и 6,3 нг/мл (p < 0,01)

клеточной пролиферации. Полученные нами

после обработки клеток 1 или 5 мкМ 5 aza dC

результаты подтверждают, что трансфекция кле

соответственно (рис. 4, d).

ток dsRNA, имитирующей miR 219 5p и miR

Подавляющее влияние эктопической экспрес

219 1 3p, приводит к повышению уровня экс

сии miR 219 1 на гены мишени и скорость проли

прессии генов кандидатных miRNA в 4 и 5 раз

ферации клеток. Поскольку в нашей работе по

соответственно, и восстановление уровня этих

лучены доказательства того, что в клетках

miRNA вызывает значительное снижение уров

U87MG понижены уровни экспрессии генов

ня пролиферации клеток U87MG (рис. 5, a и b;

miR 219 5p и miR 219 1 3p, а их промоторный

p < 0,01). Эти данные позволяют предположить,

участок гиперметилирован, мы исследовали, мо

что miR 219 15p и miR 219 1 3p могут обладать

жет ли восстановление экспрессии miR 219 5p

антипролиферативным влиянием в клетках

и miR 219 1 3p, опосредованное временной

U87MG. Чтобы подтвердить роль циклина A2 и

трансфекцией клеток двуцепочечной RNA

MUC4 в качестве мишеней действия miR 219

(dsRNA), имитирующей miR 219 5p и miR 219

5p и miR 219 1 3p, мы провели ПЦР РВ на

Рис. 4. Влияние 5 aza dC на экспрессию генов, кодирующих циклин A2 и MUC4, и на уровни самих белков. Клетки глио

бластомы линии U87MG были обработаны 1 или 5 мкМ 5 aza dC в течение 72 ч. Уровни экспрессии генов циклина A2 (а)

и MUC4 (b) снижались после обработки клеток 1 или 5 мкМ 5 aza dC, но при этом не было выявлено статистически дос

товерных различий между уровнями белков циклин A2 (c) и MUC4 (d) после обработки клеток 1 мкМ 5 aza dC в течение

72 ч. Понижение уровня циклина A2 (c) и MUC4 (d) наблюдалось только после обработки клеток 5 мкМ 5 aza dC в течение

72 ч (* p < 0,05, ** p < 0,01); aza - 5 aza dC

4 БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

506

ГАСЕМИ и др.

Рис. 5. Подавление опухолевых клеток U87MG с помощью miR 219 1. В клетки трансфицировали 10 нМ молекулы пред

шественника pre miR miRNA, имитирующей miR 219 5p, miR 219 1 3p или контрольную неспецифическую dsRNA (pre

miR NC #1) с использованием реагента Lipofectamine TM RNAiMAX. Количество жизнеспособных клеток через 24-96 ч

после трансфекции оценивали с помощью анализа пролиферации клеток, используя бромдезоксиуридин (Brdu). Точки -

средние значения трех измерений в этих экспериментах; * p < 0,05 по сравнению с клетками, трансфицированными pre

miR NC # 1, в статистическом анализе с помощью U критерия Манна-Уитни (a). Трансфекция 10 нМ miR 219 5p и miR

219 1 3p через 48 ч вызывала снижение уровня транскриптов циклина A2 и MUC4 на 43% и 51% соответственно в клет

ках U87MG по сравнению с клетками, трансфицированными 10 нМ контрольного олигонуклеотида (b). Уровни экспрес

сии генов циклина A2 и MUC4 определяли с помощью ПЦР РВ с использованием β актина в качестве контроля. Данные

представлены в виде среднего значения ± SD независимых экспериментов (* p < 0,05, ** p < 0,01)

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

507

клетках U87MG, трансфицированных молеку

сии генов наших кандидатных miRNA имеет от

лами, имитирующими miR 219 5p и miR 219 1

ношение к прогнозу исхода заболевания паци

3p. Наши результаты показали, что трансфекция

ента.

клеток miR 219 5p и miR 219 1 3p через 48 ч

Мы обнаружили гиперметилирование CpG

приводит к снижению уровня mRNA цикли

островков в промоторном участке miR 219 1 в

на A2 и MUC4 (рис. 5, c; p < 0,01) по сравнению

тканях GBM по сравнению с нормальными

с клетками, трансфицированными miRNA, слу

близлежащими тканями, что может объяснять,

жащей в качестве отрицательного контроля.

по крайней мере частично, эпигенетическое

молчание miR 219 1 в тканях GBM. Появляется

все больше данных о том, что гиперметилирова

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ние промоторного участка DNA может участво

вать в подавлении генов супрессоров опухолей

В последние годы были проведены несколь

в отдельных раковых клетках [17]. Интересно,

ко исследований с целью определения профиля

что в некоторых исследованиях было показано,

экспрессии miRNA при GBM [14, 15]. В этих ра

что экспрессия многих miRNA, выступающих в

ботах было продемонстрировано, что в тканях

раковых клетках в качестве опухолевых супрес

GBM картина экспрессии генов miRNA отлича

соров, снижается при гиперметилировании их

ется от таковой в нормальных тканях. Было вы

промоторов [18-20]. Вероятно, опосредованное

сказано предположение, что нарушение регуля

метилированием DNA подавление miRNA суп

ции экспрессии miRNA может быть связано с

рессоров опухолей может вносить свой вклад в

патогенезом GBM. В настоящей работе нами

качестве нового механизма на разных стадиях

была выявлена пониженная экспрессия miR

рака. Отклоняющееся от нормы метилирование

219 5p и miR 219 1 3p в GBM по сравнению с

DNA miR 219 1 связывалось со случаями, не от

прилегающими нормальными тканями. Резуль

носящимся к раку, в том числе при хронической

тат низкого уровня экспрессии гена miR 219 5p

боли, связанной с воспалением, и длительными

согласуется с предыдущими исследования

рабочими сменами в ночное время [21, 22]. Од

ми [16]. Но хотя было показано снижение уров

нако до сих пор не было исследований метили

ня экспрессии гена miR 219 1 3p при раке под

рования DNA в случае miR 219 1 (miR 219 5p и

желудочной железы [12], не было данных об

miR 219 1 3p) при GBM. Поэтому в настоящее

уровне экспрессии гена miR 219 1 3p в тка

время наша работа является единственным ис

нях GBM.

следованием, направленным на изучение стату

Мы также обнаружили, что низкий уровень

са метилирования miR 219 1 у пациентов

экспрессии генов miR 219 5p и miR 219 1 3p

с GBM. Причина, по которой мы выбрали miR

ассоциирован с размером опухоли пациентов с

219 1 в качестве гена кандидата для изучения

GBM и индексом KPS (шкала Карновского).

эпигенетической модификации, заключается в

Ранее была определена связь между низким

том, что анализ промоторов с помощью прог

уровнем экспрессии гена miR 219 1 (miR 219

раммы methprimer (www.urogene.org/meth

5p) и клинико патологическими характеристи

primer/) выявил большой CpG островок внутри

ками пациента, такими как продвинутая стадия

её промоторного участка. Поэтому было пред

по классификации ВОЗ и индекс KPS [10]. По

положено, что гиперметилирование промотор

скольку в нашу группу пациентов входили люди

ного участка этой miRNA может иметь отноше

с наиболее агрессивными стадиями глиомы

ние к снижению уровня её экспрессии. По

(стадия IV или GBM) не относящимися к глио

скольку регуляция экспрессии miRNA с по

мам, классифицированным ВОЗ (I, II, III и IV),

мощью метилирования молекулы DNA носит

мы не могли использовать классификацию ВОЗ

сложный характер, необходимы дальнейшие ис

в качестве переменной величины в нашей рабо

следования паттернов метилирования miRNA

те по изучению экспрессии генов. KPS является

при GBM.

простым методом определения функционально

В нашем исследовании показано, что обра

го статуса. Он может быть использован для

ботка клеток мультиформной глиобластомы ли

оценки эффективности лечения рака, качества

нии U87MG препаратом 5 aza dC привела к по

жизни пациентов и прогноза. Величина индекса

вышению уровня экспрессии miR 219 5p и

Карновского (KPS) варьирует от 100 до 0, где 100

miR 219 1 3p и снижению уровня экспрессии

означает «отсутствие признаков заболевания» и

генов, кодирующих циклин A2 и MUC4 соответ

0 - «смерть». В связи с обнаружением ассоциа

ственно. Была предсказана тесная связь между

ции между уровнем экспрессии генов miR 219

нарушением экспрессии циклина A2, неста

5p и miR 219 1 3p и индексом KPS можно

бильностью хромосом и пролиферацией опухо

предположить, что снижение уровня экспрес

левых клеток, а повышенная экспрессия гена

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

508

ГАСЕМИ и др.

циклина A2 была обнаружена при различных

ной экспрессии miR 219 1 3p в линии клеток

типах рака [23]. Также было показано, что повы

рака поджелудочной железы также выявили по

шенная экспрессия мембраносвязанного гли

давление клеточной пролиферации, ассоцииро

копротеина MUC4 может привести к прогрес

ванное с пониженной миграцией клеток.

сированию рака эпителия, агрессивному пове

MiRNA оказывают огромное влияние на разви

дению опухоли, снижению эффективности ме

тие и прогрессирование рака путём подавления

тодов лечения и плохому исходу [24]. Поскольку

репрессии mRNA онкогена и/или опухолевого

нарушение процесса метилирования DNA мо

супрессора или блокирования трансляции бел

жет привести к снижению экспрессии miRNA,

ка. Воздействуя на свои мишени (онкогены или

вполне разумно, что деметилирующий агент, 5

опухолевые супрессоры), miRNA действуют как

aza dC, имеет отношение к восстановлению

онкогенные (влияя на опухолевый супрессор)

уровня miR 219 1, что может, в свою очередь,

или подавляющие развитие опухоли (влияя на

привести к снижению уровня мишеней для

онкоген) молекулы [27]. Поскольку онкогенные

действия miRNA (циклина A2 и MUC4, которые

функции mRNA мишеней miR 219 5p и miR

являются мишенями miR 219 5p и miR 219 1

219 1 3p, циклина A2 (в плоскоклеточных клет

3p соответственно). 5 aza dC, аналог нуклеози

ках пищевода) и MUC4 (в клетках опухоли под

да, включается в DNA быстрорастущих опухоле

желудочной железы) были описаны в предыду

вых клеток во время репликации и ингибирует

щих работах [23, 24], было предположено, что

метилирование DNA, улавливая DNA метил

наши кандидатные miRNA в качестве молекул

трансферазы на DNA, что приводит к их исто

супрессоров опухолей способны останавливать

щению внутри клетки [25].

клеточную пролиферацию раковых клеток,

В настоящем исследовании было показано,

включая GBM. Наиболее очевидные отличия

что уровни белков циклин A2 и MUC4 снижа

между нашим исследованием и предыдущими

лись только при обработке клеток высокими

исследованиями заключаются в следующем: 1) в

концентрациями 5 aza dC (5 мкМ). Низкие

предыдущих работах не предоставлены доказа

концентрации

деметилирующего

аген

тельства существования механизма, лежащего в

та (1 мкМ) не оказывали влияния на уровни бел

основе низкого уровня экспрессии miR 219 5p и

ков мишеней. Кроме того, не было выявлено

miR 219 1 3p и 2) не было данных, касающихся

корреляции между различными концентрация

восстановления активности супрессированной

ми 5 aza dC и снижением уровня белков мише

кандидатной miRNA с использованием эпигене

ней. Другими словами, уровни белков цик

тических факторов, и последующего влияния

лин A2 и MUC4 не снижались в 5 раз по сравне

восстановления этой активности на способность

нию с 1 кратным снижением уровней белка на

miRNA подавлять развитие опухоли.

1 мкМ 5 aza dC. В целом не было выявлено

Есть несколько ограничений в нашем иссле

строгой корреляции между уровнем белков в

довании, которые могут быть рассмотрены в бу

клетке и обилием соответствующих mRNA. Час

дущих исследованиях. Во первых, это исследо

то величина корреляции составляет ~0,40, и это

вание было разработано на относительно не

означает, что только ~40% различий в концент

большом размере выборки, что ограничило нас

рации белка можно объяснить, зная значение

в получении более точных результатов, особен

концентрации mRNA [26]. Чтобы объяснить ос

но в области взаимосвязи между характеристи

тавшиеся ~60% вариаций, нужно учесть вклад

ками пациента и экспрессией генов miRNA.

некоторой комбинации посттранскрипционной

Поэтому для подтверждения полученных нами

регуляции и шума измерения.

результатов потребуется проведение других ис

Полученные нами результаты подтвердили,

следований с использованием выборки больше

что miR 219 5p и miR 219 1 3p оказывают ан

го размера. Во вторых, мы исследовали только

типролиферативное действие в отношении ли

онкогенные мишени кандидатных miRNA, ко

нии клеток U87MG. С помощью метода усиле

торых коснулось метилирование DNA. В связи с

ния функции (gain of function approach)

тем, что у каждой отдельной miRNA имеются

Jiang et al. [10] трансфицировали клетки глиомы

многочисленные онкогенные или подавляющие

имитаторами miR 219 5p и определяли проли

опухоль мишени, необходимо провести обшир

ферацию, миграцию и инвазию клеток. Эти ав

ный анализ, чтобы картировать сеть взаимосвя

торы показали, что эктопическая miR 219 5p

зей между эпигенетической модификацией

вызывает снижение скорости роста клеток, и

miRNA и экспрессией их mRNA мишеней. На

пришли к заключению, что miR 219 5p прини

конец, в настоящей работе мы использовали

мает участие в негативной регуляции клеточно

близлежащую нормальную ткань в качестве

го роста. В аналогичном исследовании

контроля. Отсутствие обширных исследований,

Lahdoui et al. [12] после обнаружения повышен

ограниченность данных и малоизвестность гло

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

MiR 219 1: МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И АССОЦИАЦИЯ С GBM

509

бального профиля экспрессии генов этого типа

разработки новых потенциальных методов лече

контрольных субъектов в GBM не позволяет

ния GBM, и мы ожидаем в ближайшем будущем

нам сделать однозначные выводы. Следователь

проведения дальнейших исследований и разра

но, для получения более реалистичных резуль

боток в области эпигенетических лекарств.

татов в будущих исследованиях необходимо

подготовить транскриптомное профилирование

нормальной прилегающей ткани при GBM.

Финансирование. Выполнение данной рабо

ты было поддержано IUMS (IRNA University of

В заключение мы изучили роль эпигенети

Medical Sciences) (проект № 24756).

ческой регуляции miR 219 1 в патогенезе GBM

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

человека. По нашему мнению, наши исследова

сутствии конфликта интересов.

ния впервые показали, что 1) miR 219 5p и miR

Соответствие этическим стандартам. Все про

219 1 3p представляют собой чувствительные к

цедуры, выполненные в исследованиях с учас

метилированию miRNA при развитии GBM;

тием людей, соответствовали этическим стан

2) восстановление уровня экспрессии кандидат

дартам институционального и/или националь

ных miRNA с помощью деметилирующих аген

ного исследовательского комитета, а также

тов приводит к снижению уровня онкогенных

Хельсинкской декларации 1964 года и более

mRNA мишеней и соответствующих белков.

поздним поправкам к ней или сопоставимым

Полученные результаты показывают, что карти

этическим стандартам. От каждого из включён

на лечения, основанная на анализе экспрессии

ных в исследование участников было получено

miRNA, может служить в качестве основы для

информированное добровольное согласие.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. International Agency for Research on Cancer (IARC).

13. Lee, R. S., Sohn, S., Shin, K. H., Kang, M. K., Park,

GLOBOCAN 2008. Estimated Incidence, Mortality and

N. H., and Kim, R. H. (2017) Bisphosphonate inhibits the

5 Year Prevalence: Both Sexes. Available online:

expression of cyclin A2 at the transcriptional level in normal

http://globocan.iarc.fr (accessed on 16 October 2013).

human oral keratinocytes, Int. J. Mol. Med., 40, 623 630.

2. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., and

14. Piwecka, M., Rolle, K., Belter, A., Barciszewska, A. M.,

Kruchko, C. (2012) CBTRUS statistical report: primary

Żywicki, M., et al. (2015) Comprehensive analysis of

brain and central nervous system tumors diagnosed in the

microRNA expression profile in malignant glioma tissues,

United States in 2005 2009, Neuro Oncol., 14, v1 v49.

Mol. Oncol., 9, 1324 1340.

3. Louis, D. N., Ohgaki, H., Wiestler, O. D., Cavenee, W. K.,

15. Ondracek, J., Fadrus, P., Sana, J., Besse, A., Loja, T., et al.

Burger, P. C., et al. (2007) The 2007 WHO classification of

(2017) Global microRNA expression profiling identifies

tumours of the central nervous system, Acta. Neuropathol.,

unique microRNA pattern of radioresistant glioblastoma

114, 97 109.

cells, Anticancer Res., 37, 1099 1104.

4. Wen, P. Y., and Kesari, S. (2008) Malignant gliomas in

16. Rao, S. A. M., Arimappamagan, A., Pandey, P., Santosh, V.,

adults, N. Engl. J. Med., 359, 492 507.

Hegde, A. S., et al. (2013) miR 219 5p inhibits receptor

5. Bartel, D. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis,

tyrosine kinase pathway by targeting EGFR in glioblastoma,

mechanism, and function, Cell, 116, 281 297.

PLoS One, 8, e63164, doi: 10.1371/journal.pone.0063164.

6. Vidigal, J. A., and Ventura, A. (2015) The biological func

17. Guo, M., Peng, Y., Gao, A., Du, C., and Herman, J. G.

tions of miRNAs: lessons from in vivo studies, Trends Cell.

(2019) Epigenetic heterogeneity in cancer, Biomark Res.,

Biol., 25, 137 147.

7, 23.

7. Reddy, K. B. (2015) MicroRNA (miRNA) in cancer,

18. Ghasemi, A., Fallah, S., and Ansari, M. (2016) MiR 153

Cancer Cell Int., 15, 38.

as a tumor suppressor in glioblastoma multiforme is down

8. Liu, X., Chen, X., Yu, X., Tao, Y., Bode, A. M., et al.

regulated by DNA methylation, Clin. Lab., 62, 573 580.

(2013) Regulation of microRNAs by epigenetics and their

19. Wang, L. Q., and Chim, C. S. (2015) DNA methylation of

interplay involved in cancer, J. Exp. Clin. Cancer. Res., 32,

tumor suppressor miRNA genes in chronic lymphocytic

96.

leukemia, Epigenomics, 7, 461 473.

9. Konno, M., Koseki, J., Asai, A., Yamagata, A.,

20. Serra, P. L., and Esteller, M. (2012) DNA methylation

Shimamura, T., et al. (2019) Distinct methylation levels of

associated silencing of tumor suppressor microRNAs in

mature microRNAs in gastrointestinal cancers, Nat.

cancer, Oncogene, 31, 1609 1622.

Commun., 10, 3888.

21. Pan, Z., Zhu, L. J., Li, Y. Q., Hao, L. Y., Yin, C., et al.

10. Jiang, B., Li, M., Ji, F., and Nie, Y. (2017) MicroRNA 219

(2014) Epigenetic modification of spinal miR 219 expres

exerts a tumor suppressive role in glioma via targeting

sion regulates chronic inflammation pain by targeting

Sal like protein 4, Exp. Ther. Med., 14, 6213 6221.

CaMKIIγ, J. Neurosci., 16, 9476 9483.

11. Ma, Q. (2019) MiR 219 5p suppresses cell proliferation

22. Shi, F., Chen, X., Fu, A., Hansen, J., Stevens, R., et al.

and cell cycle progression in esophageal squamous cell car

(2013) Aberrant DNA methylation of miR 219 promoter

cinoma by targeting CCNA2, Cell. Mol. Biol. Lett., 24, 4.

in long term night shiftworkers, Environ. Mol. Mutagen,

12. Lahdaoui, F., Delpu, Y., Vincent, A., Renaud, F.,

54, 406 413.

Messager, M., et al. (2015) miR 219 1 3p is a negative reg

23. Malumbres, M., and Barbacid, M. (2009) Cell cycle,

ulator of the mucin MUC4 expression and is a tumor sup

CDKs and cancer: a changing paradigm, Nat. Rev. Cancer,

pressor in pancreatic cancer, Oncogene, 34, 780 788.

9, 153 166.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021

510

ГАСЕМИ и др.

24. Xia, P., Choi, A. H., Deng, Z., Yang, Y., Zhao, J., and

26. De, Sousa, Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E., and

Wang, Y. (2017) Cell membrane anchored MUC4 pro

Vogel, C. (2009) Global signatures of protein and mRNA

motes tumorigenicity in epithelial carcinomas, Oncotarget,

expression levels, Mol. Biosyst., 5, 1512 1526.

8, 14147 14157.

27. Svoronos, A. A., Engelman, D. M., and Slack, F. J. (2016)

25. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., and Jones, P. A. (2004)

OncomiR or tumor suppressor? The duplicity of

Epigenetics in human disease and prospects epigenetic

MicroRNAs in cancer, Cancer Res., 76, 3666 3670.

therapy, Nature, 429, 457 463.

EPIGENETIC MODIFICATION OF microRNA 219 1

AND ITS ASSOCIATION WITH GLIOBLASTOMA MULTIFORME

A. Ghasemi¹, A. Mohammadi², and S. Fallah²*

¹ Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences (TUMS),

14176 13151 Tehran, Iran

² Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Iran University of Medical Sciences (IUMS),

14496 14535 Tehran, Iran; E mail: fallah.s@iums.ac.ir

MicroRNA 219 1 (miR 219 1) acts as a tumor suppressor in a variety of cancer but, the regulatory epigenetic mech

anism involved in its gene expression level has not been studied. Using real time polymerase chain reaction (real time

PCR) and bisulfite genomic sequencing technology, promoter methylation level of miR 219 1 and gene expression

levels of miR 219 5p and miR 219 1 3p were determined respectively, in glioblastoma multiforme (GBM) (n = 31),

their adjacent normal tissues (n = 31), and GBM U87 cell line. Following treatment of GBM U87 cells with 5 aza

2′ deoxycitidine (5 aza dC), miR 219 1 promoter methylation, their target mRNA and protein levels were deter

mined by genomic bisulfite modification, real time PCR and ELISA techniques, respectively. Our results showed that

gene expression levels of miR 219 5p and miR 219 1 3p were significantly lower in GBM patients relative to their

adjacent normal tissues (p < 0.01). MiR 219 1 promoter had a high level of methylation in GBM tissues (p < 0.01)

and a negative correlation was observed between miRNAs gene expression and methylation levels in GBM tissues

(p < 0.01). Treatment of GBM U87 cells by 5 aza dC decreased the methylation level of miR 219 1, target mRNA

and protein levels, cyclin A2 and mucin 4 (MUC4), and increased the expression levels of miR 219 5p and miR 219

1 3p (p < 0.01). Using external miR 219 5p and miR 219 1 3p, the expression of cyclin A2 and MUC4 were sup

pressed and proliferative activities of the U87MG cell line was reduced (p < 0.01). These findings suggested that DNA

methylation has a crucial role in the regulation of miR 219 1 gene and hyper methylated miR 219 1 may be involved

in GBM pathogenesis.

Keywords: miR 219 1, epigenetic, GBM

БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021