БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 5, с. 689 - 710

УДК 571.27;57.083.3

АНАЛИЗ РЕПЕРТУАРОВ АНТИГЕННЫХ СПЕЦИФИЧНОСТЕЙ

ЦИРКУЛИРУЮЩИХ АУТОАНТИТЕЛ КАК ИНСТРУМЕНТ

ПОИСКА ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ:

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ

Обзор

П.В. Белоусов^1,2

¹ Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины,

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН,

119991 Москва, Россия; электронная почта: belousp@gmail.com

² НЦМУ «Национальный центр персонализированной медицины эндокринных заболеваний»,

ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, 117036 Москва, Россия

Поступила в редакцию 27.07.2020

После доработки 17.08.2020

Принята к публикации 24.08.2020

Циркулирующие аутоантитела к опухолеассоциированным аутоантигенам (ОАА) могут служить ценными

биомаркёрами для широкого спектра диагностических целей, и современная иммунология располагает

большим количеством методов глубокого сравнительного анализа репертуаров антигенных специфичнос&

тей циркулирующих антител в норме и патологии. В то же время доля клинически успешных разработок к

общему числу опубликованных исследований в данной области крайне мала, а многочисленные данные по

репертуарам специфичностей циркулирующих аутоантител у онкологических пациентов крайне слабо ин&

тегрированы в современную картину иммунологического и молекулярного «ландшафтов» опухолей челове&

ка. Настоящий обзор является попыткой выявления и систематизации основных и в значительной мере

универсальных концептуально&методических ограничений в области идентификации мишеней циркулиру&

ющих аутоантител при онкологических заболеваниях (экспрессионное смещение, вырожденность реперту&

аров ОАА, выявление в качестве ОАА мишеней «естественных» IgG, отсутствие патогенетически релевант&

ного контекста в экспериментальных системах, используемых для выявления ОАА), а также обсуждению

потенциальных и уже известных методических усовершенствований, способных значительно повысить вы&

являемость патогенетически и диагностически значимых bona fide ОАА.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: опухолеассоциированные антигены, аутоантитела, биомаркёры рака, иммунопро&

теомика.

DOI: 10.31857/S0320972521050067

ВВЕДЕНИЕ

ря на несколько десятилетий исследований,

посвященных анализу репертуаров антигенных

Противоопухолевый B&клеточный иммун&

мишеней циркулирующих аутоантител в раз&

ный ответ, манифестирующийся появлением в

личных опухолях человека, на сегодняшний мо&

циркуляции антител к опухолеассоциирован&

мент повсеместное применение в достаточно уз&

ным аутоантигенам (ОАА), является источни&

ком клиническом контексте нашёл лишь один

ком высокоспецифичных аутоантительных био&

класс ОАА, а именно онконевральные аутоанти&

маркёров опухолевого роста с высоким потен&

гены, антитела к которым рутинно используют

циалом использования для разнообразных диаг&

для доказательства паранеопластической при&

ностических целей [1-3]. В то же время, несмот&

роды неврологических нарушений [4-6]; анало&

Принятые сокращения: 2D&ЭФ - двумерный электрофорез; ОАА - опухолеассоциированный аутоантиген; ПНС -

паранеопластический неврологический синдром; ПТМ - пост&трансляционные модификации; AMIDA - autoantibody&

mediated identification of antigens/аутоантитело&опосредованная идентификация антигенов; DIGE - difference/differential

electrophoresis/разностный электрофорез; déjà&vu&АА - déjà&vu&аутоантигены; N&IgG&aAb - natural IgG autoantibodies/

естественные IgG аутоантитела; ORF - open reading frame/открытая рамка считывания; PhIP&Seq - phage immunoprecipi&

tation-sequencing/фаговая иммунопреципитация-секвенирование; PLATO - parallel analysis of translated ORFs/парал&

лельный анализ транслированных ORF; SEREX - serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression

cloning/серологический анализ опухолевых антигенов путем экспрессионного клонирования рекомбинантной кДНК;

SERPA - serological proteome analysis/серологический протеомный анализ.

689

690

БЕЛОУСОВ

гичные разработки появляются в последние го&

тельно повысить фундаментальную и приклад&

ды также и в контексте других паранеопласти&

ную ценность выявляемых ОАА и аутоантиген&

ческих синдромов аутоиммунной природы [7,

ных сигнатур опухолей человека.

8]. С определенными оговорками [9], в список

успешных диагностических разработок можно

также включить панель из семи ОАА EarlyCDT

РАЗНООБРАЗИЕ МЕТОДОВ СИСТЕМНОГО

Lung, клинически валидированную [10, 11] и

АНАЛИЗА РЕПЕРТУАРОВ ОАА,

коммерчески доступную (https://oncimmune.

РАСПОЗНАВАЕМЫХ ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ

com/products/earlyctd&lung) в качестве компле&

АУТОАНТИТЕЛАМИ

ментарного к компьютерной томографии сред&

ства диагностики рака легких в группах средне&

SEREX. Первый высокопроизводительный

го и высокого риска [12, 13]. Однако же, в целом

скрининговый метод изучения репертуаров рас&

крайне низкое соотношение количества успеш&

познаваемых циркулирующими антителами

ных разработок к общему числу исследований в

аутоантигенов, а именно иммуноскрининг

данной области иммунологии не может не удив&

кДНК&экспрессионных библиотек на основе

лять.

бактериофага λ (табл. 1) SEREX (SERological

Более того, огромный пласт накапливаемой

Analysis of Tumor Antigens by REcombinant cDNA

информации, связанной с репертуарами специ&

EXpression Cloning), был разработан в середине

фичностей циркулирующих аутоантител у онко&

90&х годов прошлого века [20] и стал настоящим

логических пациентов, крайне слабо интегриро&

прорывом для своего времени, позволившим

ван с фундаментальными исследованиями в об&

впервые изучить феномен противоопухолевого

ласти онкоиммунологии, в т.ч. со сравнительно

гуморального иммунного ответа на системном

недавно попавшими в фокус передовых иссле&

уровне. Фактически на протяжении последую&

дований работами по роли B&клеточного звена

щих десяти лет SEREX прочно занимал пози&

иммунного ответа в противоопухолевом иммун&

цию референс&метода среди всех технологий

ном надзоре и иммунотерапии рака [14-19].

идентификации мишеней циркулирующих ау&

Вместе с тем по мере накопления данных,

тоантител, несмотря на ряд важных недостат&

получаемых при помощи различных методов

ков, таких как высокая трудоемкость и низкая

профилирования репертуаров, распознаваемых

скорость анализа, невозможность выявления

циркулирующими аутоантителами ОАА, поми&

иммуногенных пост&трансляционных модифи&

мо чисто методических ограничений каждого из

каций (ПТМ) и ряд технологических сложнос&

них, на первый план выходят серьезные концеп&

тей, связанных с выявлением ложноположи&

туальные ограничения, в той или иной мере

тельных реакций (табл. 2) [21-23]. Интересно,

прослеживающиеся в подавляющем большин&

что, с ретроспективной точки зрения, у SEREX

стве работ в этом разделе онкоиммунологии.

есть одно значительное преимущество перед

К таким ограничениям можно отнести ряд тес&

пришедшим ему на смену серологическим про&

но взаимосвязанных, однако не вырожденных

теомным анализом SEPRA (см. ниже), особенно

факторов, таких как смещение доступного для

важное в контексте обсуждаемых в настоящем

анализа аутоантигенного репертуара в сторону

обзоре проблем, а именно возможность выявле&

наиболее высокопредставленных белков (экс&

ния иммуногенных белковых продуктов низ&

прессионное смещение), эффект déjà&vu, свя&

копредставленных транскриптов и в целом ра&

занный с преимущественным выявлением од&

дикально меньшее смещение репертуара дос&

ного и того же набора аутоантигенов вне зависи&

тупных для распознавания аутоантигенов в сто&

мости от природы изучаемого заболевания, вы&

рону высокопредставленных белков (табл. 2).

явление в качестве ОАА мишеней «естествен&

Однако ряд вышеперечисленных недостатков в

ных» IgG, отсутствие патогенетически релевант&

сочетании с бурным развитием протеомных тех&

ного контекста в экспериментальных системах,

нологий в первом десятилетии XXI века (см. ни&

используемых для выявления ОАА.

же) привел к постепенному уходу SEREX с пер&

В настоящей работе приведен краткий обзор

вый ролей в данной области онкоиммунологии.

основных методов идентификации ОАА с пос&

Фаговый дисплей. В начале 2000&х годов па&

ледующим детальным анализом причин и след&

раллельно SEREX&исследованиям начали

ствий вышеперечисленных проблем и их роли в

предприниматься попытки адаптации для целей

ограничении биологической релевантности и

профилирования репертуаров ОАА, распознава&

клинической применимости идентифицируе&

емых циркулирующими антителами, классичес&

мых ОАА, а также обсуждением широкого

кого фагового дисплея антигенных пепти&

спектра концептуально&методических подхо&

дов (табл. 1) [24, 25]. Однако, несмотря на целый

дов, использование которых способно значи&

ряд преимуществ по сравнению с SEREX (быст&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

691

Таблица 1. Методические принципы основных методов систематического анализа репертуаров ОАА, распознаваемых

циркулирующими антителами

Метод

Тип библиотеки

Пул аутоантигенов

Иммунохимическая

Метод

система

идентификации

SEREX

фаговая кДНК&экспрес&

фрагменты гетерологич&

гибридизация АСП с нитро&

сэнгеровское

сионная библиотека

ных белков, высвобождае&

целлюлозной «репликой»

секвенирование

мые в ходе литической ин&

зон лизиса на газоне

фекции бактериофага

Escherichia coli

Фаговый

фаг&дисплейная RPL&

фаговая популяция, несу&

ИП АСП с антигенами или

дисплей

либо кДНК&экспресси&

щая антигенные пептиды в

антиген&содержащими

онная библиотека

виде слитных молекул с

комплексами

капсидным белком бакте&

PhIP&Seq

Библиотека синтетичес&

риофага

высокопроиз&

ких олигонуклеотидов

водительное

секвенирование

PLATO

кДНК&библиотека

комплексы мРНК&рибосо&

ORF&клонов

ма&белок, получаемые в

ходe in vitro транскрипции/

трансляции

Анализ иммун&

Н/П

присутствующие в цирку&

изоляция иммунных комп&

масс&спектромет&

ного комплексо&

ляции белки в составе

лексов с использованием

рия

ма плазмы

циркулирующих иммун&

белков A/G

ных комплексов

AMIDA

белки, напрямую выделяе&

ИП АСП с выделенными

мые из ткани либо клеточ&

белками → фракциониро&

ной линии

вание преципитированных

антигенов при помощи

2D&ЭФ

SID&DIGE

иммуноаффинная деплеция

белкового пула различными

АСП → сравнительный

анализ фильтратов при по&

мощи разностного 2D&ЭФ

SERPA/SPEAR/

фракционирование выде&

PROTEOMEX

ленных белков при помощи

2D&ЭФ → выявление имму&

нореактивных белков при

помощи Вестерн&блот&ана&

лиза с различными АСП

MAPPing

иммуноаффинная деплеция

белкового пула контроль&

ной АСП → иммуноаффин&

ный захват белков из депле&

тированного пула экспери&

ментальной АСП

Примечание. Используемые сокращения: 2D&ЭФ - двумерный электрофорез; АСП - антителосодержащая проба; ИП -

иммунопреципитация; AMIDA - autoantibody&mediated identification of antigens/аутоантитело&опосредованная идентифи&

кация антингенов; MAPPing - multiple affinity protein profiling/многомерное аффинное профилирование белков; PhIP&

Seq - phage immunoprecipitation&sequencing/фаговая иммунопреципитация-секвенирование; PLATO - parallel analysis of

translated ORFs/ параллельный анализ транслированных ORF; PROTEOMEX - proteomics + SEREX/протеоми&

ка + SEREX; SEREX - serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression cloning/серологический анализ

опухолевых антигенов путем экспрессионного клонирования рекомбинантной кДНК; SERPA - serological proteome

analysis/серологический протеомный анализ; SID&DIGE - sequential immunoaffinity depletion/последовательная иммуно&

аффинная деплеция + разностный электрофорез; SPEAR - serological and proteomic evaluation of antibody responses/серо&

логическое и протеомное исследование антительных ответов.

рота, большая вероятность выявить низкопред&

ции), данный метод не имел столь значительно&

ставленный клон за счёт селекционной приро&

го успеха, по&видимому, в силу сильнейшей сме&

ды биопэннинга, возможность интеграции в

щенности метода в сторону идентификации ан&

процесс скрининга этапа отрицательной селек&

тигенных «мимик»/мимотопов, причём не толь&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

692

БЕЛОУСОВ

Таблица 2. Сравнение аналитических характеристик основных методов систематического анализа репертуаров ОАА,

распознаваемых циркулирующими антителами

Сравнитель&

Выявление

Экспрес&

ный анализ

продуктов

Выявление

конформа&

Ресурсо&

Пропускная

Метод

сионное

на этапе

некорректных

ПТМ

ционных

емкость

способность

Стоимость

смещение

скрининга

ORF/мимо&

эпитопов

топов

SEREX

Фаговый

+++

дисплей

PhIP&Seq/

+++

-/+++

+++

++++

+++

PLATO

SERPA/

++++

+++

SPEAR/

PROTEOMEX

Иммуно&

+++

++/+++

+++

++/+++

аффинный

захват

(AMIDA и др.)

Примечание. Оценка выраженности параметра: отсутствует/невозможно (-), низкая (+), средняя (++), высокая (+++),

очень высокая (++++). Используемые сокращения: ИП - иммунопреципитация; ПТМ - пост&трансляционные модифи&

кации; AMIDA - autoantibody&mediated identification of antigens/аутоантитело&опосредованная идентификация антигенов;

MAPPing - multiple affinity protein profiling/многомерное аффинное профилирование белков; PhIP&Seq - phage immuno&

precipitation-sequencing/фаговая иммунопреципитация-секвенирование; PLATO - parallel analysis of translated ORFs/

параллельный анализ транслированных ORF; PROTEOMEX - proteomic + SEREX/протеомика + SEREX; SEREX - sero&

logical analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression cloning/серологический анализ опухолевых антигенов пу&

тем экспрессионного клонирования рекомбинантной кДНК; SERPA - serological proteome analysis/серологический про&

теомный анализ; SID&DIGE - sequential immunoaffinity depletion/последовательная иммуноаффинная деплеция + разно&

стный электрофорез; SPEAR - serological and proteomic evaluation of antibody responses/серологическое и протеомное иссле&

дование антительных ответов.

ко при использовании универсальных рандоми&

классического фагового дисплея, в PhIP&Seq ис&

зированных пептидных библиотек (Random

пользуется только один раунд иммунопреципи&

Peptide Library, RPL) [26, 27], но и при исполь&

тации библиотеки, после чего напрямую следует

зовании экспрессионных библиотек кДНК

этап получения библиотеки для глубокого сек&

(табл. 2) [28, 29].

венирования. При этом пробоспецифичное бар&

PhIP6Seq. Однако с развитием технологий

кодирование позволяет в одном образце оцени&

высокопроизводительных вариантов олигонук&

вать антителозависимое обогащение антиген&

леотидного синтеза и секвенирования именно

ных пептидов во множестве проб, что радикаль&

фаговый дисплей антигенных пептидов дал на&

но снижает стоимость анализа в расчёте на одну

чало, пожалуй, одному из наиболее совершен&

антителосодержащую пробу.

ных из разработанных на сегодняшний день ме&

PLATO. Концептуально сходным методом,

тодов системного анализа репертуаров распоз&

однако реализованным методически иным об&

наваемых циркулирующими антителами ОАА, а

разом, является метод PLATO (Parallel Analysis of

именно методу PhIP&Seq (Phage ImmunoPrecip&

Translated ORF) [32, 33], разработанный той же

itation-Sequencing) [30, 31]. В данном методе

научной группой, что и PhIP&Seq. В этом методе

фаговая библиотека «представляет» несмещен&

ключевая «связка» антигена/эпитопа и кодиру&

ный набор пептидов в естественных рамках счи&

ющей его нуклеиновой кислоты достигается

тывания, покрывающих весь исследуемый про&

при помощи технологии рибосомального дис&

теом (к примеру, протеом человека), что дости&

плея [34], а высокое покрытие протеома и отсут&

гается за счёт использования для конструкции

ствие экспрессионного смещения - при помо&

библиотеки пула из нескольких сотен тысяч

щи использования в качестве антиген&кодирую&

олигонуклеотидов, получаемых с использовани&

щих пулов кДНК библиотек открытых рамок

ем методов высокопроизводительного олиго&

считывания (ORF&омов) (табл. 1) [35]. Исполь&

нуклеотидного синтеза (табл. 1). В отличие от

зование в качестве антигенных мишеней полно&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

693

размерных белков предоставляет данному мето&

является возможность в одном эксперименте

ду возможность выявлять широкий спектр кон&

получать исчерпывающую (в пределах чувстви&

формационных эпитопов (в т.ч. «прерывающих&

тельности и разрешающей способности метода)

ся» (discontinuous)) (табл. 2). Покрытие протеома

глобальную визуально интерпретируемую кар&

в PLATO&анализе с использованием доступных

тину иммунореактивности изучаемой антитело&

на сегодняшний день библиотек ORF приблизи&

содержащей пробы против всего выбранного

тельно в полтора раза ниже, нежели уже в первой

белкового пула. Получаемые паттерны (т.е.

работе с использованием PhIP&Seq (16 000 [35]

de facto визуальные отображения глобального

против 24 000 [30] ORF соответственно), однако

репертуара антигенов, распознаваемых аутоан&

по мере релиза новых версий ORF&ома челове&

тителами в различных антителосодержащих

ка [36] следует ожидать, что данное ограничение

пробах) могут напрямую сравниваться друг с

потеряет свою актуальность в ближайшие годы.

другом непосредственно в ходе скринингового

Следует также отметить, что как PhIP&Seq, так и

этапа исследования (табл. 2) [41-44]. Это позво&

PLATO не выявляют ПТМ&эпитопы, что, по су&

ляет в режиме реального времени контролиро&

ти, является главным методическим ограниче&

вать отбор аутоантигенов для последующего

нием этих методов (табл. 2).

включения в валидационную панель, исходя из

SERPA, PROTEOMEX и SPEAR. С середины

соотношения наблюдаемых частот и интенсив&

2000&х годов, наряду со скринингом фаговых

ностей реактивности индивидуальных точек в

библиотек, начинается бурное развитие проте&

группах изучаемого заболевания и контроля,

омных технологий, которое в полной мере зат&

что принципиально невозможно на этапе пер&

ронуло и профилирование репертуаров мише&

вичного SEREX&скрининга.

ней циркулирующих аутоантител. Прототип&

Среди недостатков SERPA обычно отмечают

ным методом в этой группе является серологи&

невозможность выявления конформационных

ческий протеомный анализ SERPA (SERological

эпитопов, слабую представленность в получае&

Proteome Analysis) [37], известный также как

мых пулах белков мембранной фракции, а также

PROTEOMEX (PROTEOMe&Based Target

сложность безошибочного внутри&эксперимен&

Evaluation Combined With Immuno&Reactive

тального (гель для переноса → мембрана → гиб&

Target Structure Identification Explored by Sera

ридизационная картина → препаративный гель)

(SerEX)) [38] и SPEAR (Serological and Proteomic

и межэкспериментального (сравнительный ана&

Evaluation of Antibody Responses) [39]. Данный

лиз гибридизационных паттернов различных

метод основан на комбинации классического

антителосодержащих проб между собой) «отсле&

двумерного электрофореза (2D&ЭФ) белковой

живания» локализации индивидуальных бел&

фракции выбранного клеточного источника

ков; для решения второй проблемы был предло&

(клеточная линия, первичная ткань опухоли и

жен и успешно использован целый ряд модифи&

т.д.), вестерн&блот&анализа с использованием в

каций [45-51]. Однако же, по&видимому, клю&

качестве гибридизационной пробы исследуемой

чевым недостатком SERPA является ограничен&

сыворотки пациента и идентификации иммуно&

ная глубина иммуномного профилирования и

реактивных белков при помощи масс&спект&

выраженная систематическая смещенность дос&

рального анализа (в настоящее время - в основ&

тупного для анализа аутоантигенного репертуа&

ном тандемной хромато&масс&спектромет&

ра в сторону высокопредставленных белков

рии) (табл. 1). Не будет преувеличением сказать,

(экспрессионная смещенность) (табл. 2) [52].

что в последние 10-15 лет наибольшее число ра&

В основе этого недостатка лежат хорошо извест&

бот по изучению репертуаров аутоантительных

ные ограничения 2D&ЭФ, как ключевой мето&

специфичностей в онкологических заболевани&

дической составляющей SERPA, а именно:

ях было выполнено при помощи различных мо&

1) ограниченная (и несопоставимая с диапазо&

дификаций SERPA, в связи с чем мы подробнее

ном представленности различных белков в клет&

остановимся на преимуществах и ограничениях

ке) чувствительность как красителей для визуа&

данного метода.

лизации белков в гелях и на мембранах, так и

Популярность SERPA (помимо того, что он в

вестерн&блот&анализа; 2) ограниченная разре&

значительной степени «поймал волну» станов&

шающая способность геля в двух направлениях;

ления и развития проекта «Протеом челове&

3) эффект «экранирования» низкопредставлен&

ка») [40] в основном диктовалась принципиаль&

ных белков более высокопредставленными бел&

ной возможностью детекции аутоантител про&

ками и их изоформами («gel crowding») с близки&

тив естественных ПТМ, а также сравнительно

ми значениями изоэлектрической точки и моле&

высокой (относительно SEREX) быстротой и

кулярной массы [53].

пропускной способностью. Однако, пожалуй,

Поскольку одной из причин экспрессионно&

главным преимуществом SERPA перед SEREX

го смещения SERPA является, таким образом,

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

694

БЕЛОУСОВ

высокая комплексность нефракционированных

смещенности носило скорее количественный,

протеомов (и, соответственно, низкая эффек&

но не качественный характер (табл. 2). Главным

тивная разрешающая способность

2D&ЭФ),

же недостатком AMIDA в его оригинальном ва&

чувствительность метода может быть увеличена

рианте является неизбежная ко&элюция имму&

за счёт префракционирования белков выбран&

ноглобулинов вместе с аутоантигенами, в ре&

ного клеточного источника антигенов. Однако

зультате которой легкие и тяжелые цепи IgG

исчерпывающее исследование всех фракций (к

формируют в 2D&электрофореграмме объемные

примеру, всех отдельных органелл), очевидно,

«цепочки» точек, экранирующие значительную

несовместимо с последующим иммунохимичес&

часть 2D&геля и делающие невозможным выяв&

ким анализом аутоантительной реактивности

ление белков в достаточно «богатых» областях

сколь&либо значимого количества антителосо&

20-30 и 50-60 кДа щелочной части геля [52].

держащих проб в разумных временных и ресурс&

Для решения этих и других проблем AMIDA

ных рамках. При этом фокусирование на какой&

был предложен ряд модификаций оригиналь&

либо отдельной фракции при отсутствии силь&

ного метода [56, 57], однако все эти подходы не

ных априорных данных о физико&химических

завоевали популярности, сопоставимой с

свойствах или внутриклеточной локализации

SERPA.

интересующих антигенов, по сути, является

Белковые и пептидные микроэрреи. Наконец,

просто заменой одного систематического сме&

нельзя обойти вниманием технологии белко&

щения другим, ещё более выраженным, при ко&

вых [58, 59] и пептидных [60] микроэрреев (мик&

тором за пределами аналитических возможнос&

рочипов). В то время как микроэрреи низ&

тей метода принципиально остаются все белки,

кой/средней плотности (десятки&сотни точек на

не входящие в состав изучаемой фракции.

эррей) являются методами, широко используе&

AMIDA. Вышеприведенные соображения,

мыми для валидации диагностической ценности

очевидным образом, не касаются тех случаев,

панелей аутоантигенов, ранее идентифициро&

когда изначальное иммуноаффинное фракцио&

ванных другими скрининговыми методами,

нирование проводится с использованием

современные микроэрреи высокой плотности (к

собственно антител, входящих в состав изучае&

примеру, HuProt^TM array, https://cdi.bio/huprot/,

мой антителосодержащей пробы. Такой подход

содержащий более 20 000 рекомбинантных бел&

реализован в методе AMIDA (Autoantibody&

ков, экспрессированных в эукариотической

Mediated Identification of Antigens) [54, 55], в ко&

системе) являются полноценными скрининго&

тором ключевое иммунохимическое событие

выми системами, и практически по всем анали&

метода (образование комплекса антиген-анти&

тическим параметрам (прежде всего - по глуби&

тело) и снижение комплексности анализируе&

не/покрытию протеома и отсутствию проблемы

мого протеома объединены в единый этап им&

экспрессионного смещения, детально обсужда&

мунопреципитации антигенов нативного лиза&

емой в настоящем обзоре) конкуренцию им мо&

та клеток иммобилизованными на носителе

гут составить лишь PhIP&Seq и PLATO. Однако

(частицах, функционализированных белком А

ключевым недостатком белковых/пептидных

и/или белком G) IgG. Элюат преципитирован&

микроэрреев является их стоимость. Так, в ис&

ных белков далее разделяют при помощи 2D&

следовании минимально&репрезентативной вы&

ЭФ, белки визуализируют в геле высокочув&

борки пациентов и контролей (15-20 проб в

ствительным красителем и напрямую иденти&

каждой группе) без включения технических и

фицируют при помощи тандемной хромато&

биологических повторов прямые расходы толь&

масс&спектрометрии (табл. 1). Проведенный

ко на сами микроэрреи составят от 50 до 100%

Ganesan et al. [52] мета&анализ достаточно ярко

годовой суммы, выделяемой в рамках грантов

демонстрирует значительно лучшую сбаланси&

класса NIH R03 или РНФ на исследования, про&

рованность AMIDA и концептуально сходных

водимые отдельными научными группами. С

методов в выявлении низко& и высокопредстав&

учётом необходимости доступа к высокоспециа&

ленных белков по сравнению с SERPA. Допол&

лизированному оборудованию и программному

нительными преимуществами AMIDA являют&

обеспечению для анализа данных, исследование

ся отсутствие необходимости многоэтапного

сколь&либо адекватной выборки с использова&

совмещения гелей, мембран и гибридизацион&

нием белковых микроэрреев высокой плотнос&

ных реплик (см. выше), а также возможность

ти в рамках относительно небольшого исследо&

выявления

конформационных

эпито&

вания не представляется выполнимым.

пов (табл. 2). В то же время нижний предел

Данный раздел, разумеется, не претендует

представленности выявляемых аутоантигенов

как на полноту цитирования всех работ, выпол&

оказался приблизительно таким же, как и в слу&

ненных с использованием обсуждаемых мето&

чае SERPA, а сглаживание экспрессионной

дов, так и на исчерпывающее описание всех тех&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

695

нологий, применяемых в данной области имму&

Поэтому преимущественное выявление в каче&

нологии. Так, мы не касались методов дрожже&

стве ОАА наиболее высокопредставленных бел&

вого дисплея [61, 62], анализа иммунного комп&

ков (по сути, в основном продуктов хаускипинг&

лексома плазмы крови [63-66], методов много&

генов) является качественным фактором, зна&

мерной иммуноаффинной хроматографии

чительно ограничивающим как клиническую

MAPPing (Multiple Affinity Protein Profiling)

применимость выявляемых мишеней аутоим&

[67, 68] и последовательной иммуноаффинной

мунного ответа, так и возможности научной ин&

деплеции c разностным электрофорезом SID&

теграции получаемых данных с фундаменталь&

DIGE (Sequential Immunoaffinity Depletion +

ными механистическими исследованиями в об&

DIfference Gel Electrophoresis) [69] (табл. 1), а

ласти опухолевой иммунологии.

также большого количества модификаций вы&

Одним из ярких следствий данного ограни&

шеперечисленных методов, некоторые из кото&

чения является вырожденность аутоантигенных

рых описаны более детально в нижеследующих

репертуаров, выявляемых в совершенно не свя&

разделах настоящего обзора. Однако именно

занных между собой заболеваниях и патологи&

этот набор наиболее часто используемых и/или

ческих состояниях [51]. Данный эффект, оче&

концептуально важных методов дает достаточ&

видно, является феноменом, родственным так

ное представление о структуре методологичес&

называемому «эффекту déjà&vu», описанному

кого спектра в области систематического анали&

ещё в 2008 г. Petrak et al. [70] в контексте класси&

за репертуаров ОАА, а также очерчивает базовую

ческой дифференциальной протеомики и зак&

проблематику в этой области, анализу которой и

лючающемуся в повторной идентификации в

посвящен настоящий обзор.

качестве «дифференциально экспрессируемых»

одного и того же «хит&парада» белков практи&

чески вне зависимости от типа сравниваемых

ПРОБЛЕМА ЭКСПРЕССИОННОГО

объектов, состояний, тканей, стимулов и даже

СМЕЩЕНИЯ И «ЭФФЕКТ DÉJÀ6VU»

видовой принадлежности исследуемого биома&

териала. Для отдельных классов белков попада&

Систематическая смещенность изначально

ние в этот «хит&парад», очевидно, обусловлено

доступного для анализа аутоантигенного репер&

аналитическими артефактами протеомных ме&

туара в сторону наиболее высокопредставлен&

тодов (эпидермальные кератины как убиквитар&

ных белков является характерной и неотъемле&

ные «средовые» контаминанты; неэпидермаль&

мой чертой всех методов, использующих в каче&

ные белки цитоскелета (актины, тубулины, ви&

стве исходного материала естественно&распре&

ментин), изоформы которых могут опосредо&

деленный пул транскриптов или белков той или

вать эффект «gel crowding» [51, 53]). Однако для

иной первичной ткани или устойчивой клеточ&

большинства белков в списках Petrak et al. попа&

ной линии (табл. 2). Однако же, если при имму&

дание в них, очевидно, обусловлено тем, что они

носкрининге фаговых библиотек данный эф&

являются универсальными сенсорами клеточ&

фект может быть в значительной степени ском&

ного стресса практически любой природы, вы&

пенсирован за счёт высокой численности

сокая представленность которых в клетке при&

проскринированных клонов (SEREX) либо аф&

водит к их первоочередному выявлению в лю&

финной селекции (фаговый дисплей), то в слу&

бом дифференциальном протеомном экспери&

чае наиболее популярных иммунопротеомных

менте.

подходов (прежде всего, SERPA) в основе дан&

В контексте же обсуждаемых в настоящем

ного смещения лежат слабомодифицируемые (в

обзоре проблем крайне интересным представля&

рамках сохранения основных преимуществ ме&

ется то, что практически все индивидуальные

тода) аналитические характеристики используе&

белки и белковые классы, входящие в «хит&па&

мых подходов (cм. предыдущий раздел).

рад» Petrak et al., также идентифицируются из

Важность этого ограничения сложно пере&

работы в работу как аутоантигены, ассоцииро&

оценить, поскольку оно заключается даже не в

ванные с патологическими состояниями самого

простой недоступности для анализа значитель&

широкого спектра [51]. Пожалуй, наиболее по&

ной части клеточного протеома, но в недоступ&

казательным в этом смысле аутоантигеном яв&

ности как раз той его части, которая содержит

ляется фермент α&енолаза (ENOA, ENO1), ката&

белки, наиболее важные в отношении тонкой

лизирующая превращение 2&фосфо&D&глицери&

регуляции клеточных процессов в норме и пато&

новой кислоты в фосфоенолпируват на пред&

логии, в том числе и в онкологических заболева&

последней стадии гликолиза. Занимая ранги

ниях. Иными словами, смещение анализируе&

№ 1 (32% экспериментов) и № 2 (29% экспери&

мой выборки белков носит не только концент&

ментов) в скомпилированных Petrak et al. [70]

рационный, но и функциональный характер.

списках индивидуальных белков, наиболее час&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

696

БЕЛОУСОВ

то идентифицируемых, как дифферециально&

видов) в работе Li et al. [77], посвященной ис&

экспрессируемые в клетках грызунов и человека

следованию репертуаров антигенных специ&

соответственно, этот же белок является наибо&

фичностей циркулирующих IgG у 35 условно&

лее часто идентифицируемой антигенной ми&

здоровых индивидов при помощи SERPA&ана&

шенью диагностически значимых аутоантител

лиза. Следует отметить, что все остальные ауто&

практически вне зависимости от природы изу&

антигены, выявленные в работе Li et al., также

чаемой патологии. Аутоантитела против ENO1

многократно выявлялись в качестве ОАА в дру&

были идентифицированы как «кандидатный био&

гих исследованиях. В силу того, что количество

маркёр» при привычном невынашивании бере&

таких работ составляет по меньшей мере нес&

менности [71], мембранозном гломерулонефри&

колько десятков, а их упоминание в данном

те [72], фиброзе печени [73], эндометриозе [74],

контексте имеет исключительно иллюстратив&

лимфоцитарном гипофизите [75], раке подже&

ную цель, в настоящем обзоре соответствующие

лудочной железы [76] и ещё более чем в двух де&

публикации не процитированы, однако могут

сятках никак не связанных между собой заболе&

быть легко найдены при помощи обсуждаемой

ваний и патологических состояний [51].

ниже базы данных AAgAtlas (http://biokb.ncpsb.

org/aagatlas_portal/).

Общепризнанных объяснений, почему одни

DÉJÀ6VU6АУТОАНТИГЕНЫ (DÉJÀ6VU6АА)

и те же белки в одних исследованиях демонстри&

КАК МИШЕНИ ЕСТЕСТВЕННЫХ

руют значимую аутоантительную реактивность в

IgG6АУТОАНТИТЕЛ (N6IgG6aAB)

группе условно&здоровых доноров, а в других -

нет, в литературе не представлено. Однако зна&

Представляется крайне важным, что многие

чимыми факторами вариативности могут быть

из таких «универсальных» аутоантигенов (да&

различия в клинико&демографических, средо&

лее - déjà&vu&АА) также идентифицируются как

вых и генетических факторах изучаемых попу&

мишени «естественных» IgG (N&IgG&aAb) в ра&

ляций, а также в используемых для исследова&

ботах по таргетному изучению репертуаров ау&

ния аналитических платформах. Так, в ходе изу&

тоантительных специфичностей у условно&здо&

чения спектра антигенных специфичностей N&

ровых индивидов [77-82]. В рамках данного об&

IgG&aAb при помощи микроэрреев высокой

зора мы не будем обсуждать многочисленные

плотности Nagele et al. [81] продемонстрирова&

аспекты иммунобиологии N&IgG&aAb (в том

ли, что базовый репертуар N&IgG&aAb значи&

числе терминологические тонкости), которые

тельно шире у женщин (что согласуется с тем,

детально изложены в ряде обзорных статей пос&

что женщины в гораздо большей степени под&

ледних лет [83-85]; некоторые важные для изло&

вержены абсолютному большинству аутоим&

жения детали будут обсуждены отдельно в ни&

мунных заболеваний) и расширяется с возрас&

жеследующих разделах. В контексте настоящего

том у обоих полов. В свою очередь, Sanchez

обзора, под N&IgG&aAb мы будем понимать лю&

et al. [86] показали, что в вестерн&блот&анализе с

бые IgG&аутоантитела, присутствующие в цир&

белками линии рака простаты PC3 в качестве

куляции у условно&здоровых индивидов при от&

источника антигенов сыворотки афроамерикан&

сутствии анамнестических данных о любых за&

цев с раком простаты демонстрируют намного

болеваниях, в которых присутствует выражен&

более выраженную общую и анти&ENO1 аутоан&

ный компонент аутоиммунного ответа (нейро&

тительную реактивность, нежели сыворотки

дегенеративные, неинфекционные воспали&

американцев европейского происхождения c

тельные, онкологические и собственно аутоим&

аналогичным диагнозом. Однако в ELISA&ана&

мунные заболевания).

лизе с использованием очищенного рекомбинант&

В наших собственных исследованиях (Бело&

ного ENO1 в качестве антигена паттерн распоз&

усов с соавт., неопубликованные данные) при

навания менялся на прямо противоположный.

помощи выборочной идентификации антиге&

Так или иначе и вне зависимости от конкретного

нов, демонстрирующих в SERPA&анализе высо&

объяснения того, почему одни и те же белки в од&

коинтенсивные реакции у >10% условно&здоро&

них исследованиях идентифицируются как ОАА,

вых доноров, нам удалось выявить по меньшей

а в других - как мишени N&IgG&aAb, очевидно,

мере восемь аутоантигенов, ранее идентифици&

что множества déjà&vu&АА и мишеней N&IgG&aAb

рованных другими группами в качестве

значительно пересекаются друг с другом.

ОАА (ANXA2, ENO1, HSPA8, HSPA9, HSPD1,

Следует специфически обратить внимание

PGAM1, SOD2 и TIM); четыре из них (ANXA2,

на то, что значительное пересечение множеств,

ENO1, PGAM1 и TIM) также были выявлены в

идентифицируемых в отдельных исследованиях

качестве мишеней N&IgG&aAb с умеренными и

кандидатных ОАА, déjà&vu&АА и мишеней N&

высокими частотами реактивности (>10% инди&

IgG&aAb, в абсолютном большинстве случаев,

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

697

по&видимому, не является признаком грубых ар&

ческие клеточные и тканевые процессы, сопро&

тефактов, связанных с дизайном или методоло&

вождающие широкий спектр патологических

гией исследований. Крайне интересные в этом

состояний и гомеостатических процессов, таких

смысле данные получают в работах с использо&

как воспаление, компрессия здоровой ткани па&

ванием генноинженерных мышиных моделей

тологическим очагом с последующей её атрофи&

онкологических заболеваний, в которых влия&

ей, некротические процессы, вторичное инфи&

ние средовых и генетических факторов сведено

цирование, различные виды стресса, дисбаланс

практически к нулю. Так, Cappello et al. [87] ис&

различных видов клеточной гибели, гиперакти&

пользовали метод SERPA для выявления аутоан&

вация тканевых протеиназ, репаративные про&

тигенов, вызывающих аутоантительный ответ

цессы в тканях, недостаточность фагоцитоза

по мере взросления мышей KC (LSL4

апоптотических клеток и т.д. [2]. Очевидно так&

Trp53R172H/+; Pdx414Cre) и KPC (LSL4KrasG12D/+;

же, что диагностическая точность подобных

LSL4Trp53R172H/+; Pdx414Cre), спонтанно разви&

кандидатных биомаркёров, демонстрируя порой

вающих предопухолевые изменения протоков

весьма высокие значения в модельных условиях

поджелудочной железы и протоковый рак. Из

(к примеру, в сравнении пациентов с запущен&

девяти антигенов, демонстрировавших значи&

ными формами рака и условно&здоровых инди&

мые различия в частотах сывороточной реактив&

видов), не может не быть скомпрометирована в

ности между KC/KPC и контрольными Pdx414

реальных клинических ситуациях, в которых,

Cre&мышами, лишь один (11%) демонстрировал

как правило, речь идёт о необходимости дис&

тотальное отсутствие реактивности в контроль&

криминации локализованной формы рака и не&

ных мышах, в то время как восемь осталь&

онкологической патологии на фоне множества

ных (89%) демонстрировали повышение титра

сопутствующих заболеваний.

соответствующих аутоантител и частот их выяв&

Следует отметить, что сама по себе иденти&

ления с изначально ненулевых значений у Pdx4

фикация мишеней N&IgG&aAb является чрезвы&

14Cre&мышей. Ещё более интересно, что два из

чайно важной задачей в контексте изучения ро&

девяти (22%) идентифицированных аутоантиге&

ли таких антител в иммунной защите, тканевом

нов (ANXA2 и HNRNPL) также были выявлены

гомеостазе и патогенезе неинфекционных

в вышеупомянутой работе Li et al. [77] в качест&

(и прежде всего - аутоиммунных) заболеваний в

ве мишеней N&IgG&aAb человека с умеренными

целом. Однако же в контексте изучения «имму&

и высокими частотами реактивности.

нома» конкретных онкологических патологий -

Таким образом, в смысле соотношения мно&

как с точки зрения иммунобиологии рака, так и

жеств déjà&vu&АА и мишеней N&IgG&aAb друг с

с точки зрения клинической онкологии, инте&

другом, по&видимому, речь идёт об иммунологи&

рес представляют bona fide ОАА, т.е. те аутоанти&

чески консервативном феномене, при котором

гены, иммуногенность которых максимально

концентрация и частота выявления некоторых

тесно связана с процессом злокачественной

концентрационно лабильных N&IgG&aAb резко

трансформации и прогрессии; при этом выявле&

возрастает при развитии в организме относи&

ние déjà&vu&АА/мишеней N&IgG&aAb, очевидно,

тельно серьёзных патологических изменений.

должно быть сведено к минимуму. В нижеследу&

При этом широкий спектр таких измене&

ющих разделах обзора причины преимущест&

ний (см. ниже) и высокая представленность со&

венного выявления déjà&vu&АА/мишеней N&

ответствующих белков в протеоме приводит к их

IgG&aAb будут рассмотрены более подробно в

первоочередному выявлению в качестве канди&

непосредственном контексте концептуальных и

датных аутоантигенов в большом количестве ра&

методических усовершенствований, способных

бот, выполненных на методических платфор&

изменить соотношение выявляемости déjà&vu&

мах, характеризующихся экспрессионной сме&

АА/мишеней N&IgG&aAb, с одной стороны, и

щённостью (табл. 2), что и приводит к выше&

bona fide ОАА - c другой, в сторону преимущест&

описанной проблеме вырожденности/эффек&

венного выявления последних.

ту déjà&vu.

Основная же проблема, связанная с выявле&

нием déjà&vu&АА/мишеней концентрационно

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕСМЕЩЕННЫХ

лабильных N&IgG&aAb, заключается в том, что

МЕТОДОВ ИММУНОМНОГО

такие аутоантитела в реальности не являются

ПРОФИЛИРОВАНИЯ

истинным (bona fide) «маркёрным» феноменом

ни одного из заболеваний, в контексте которых

Современные методы несмещённого анали&

они идентифицируются. При этом триггером

за репертуаров, распознаваемых циркулирую&

активации B&клеточного ответа являются, по&

щими аутоантителами ОАА (белковые микроэр&

видимому, в значительной степени неспецифи&

реи высокой плотности

[58,

59], PhIP&Seq

6 БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

698

БЕЛОУСОВ

[30, 31] и PLATO [32, 33]), по определению ли&

В завершение данного раздела следует отме&

шены проблемы экспрессионного смещения (и,

тить, что множество мишеней N&IgG&aAb, хотя

соответственно, в значительной степени

и демонстрирует выраженную ассоциацию с

проблемы вырожденности/эффекта déjà&vu) и

группами déjà&vu&АА и/или высокопредставлен&

являются в этом смысле идеальной альтернати&

ных белков, однако последними отнюдь не ог&

вой методам классической иммунопротеоми&

раничивается. Справедливо и обратное - сама

ки (табл. 2). В то же время крайне высокая стои&

по себе высокая представленность белка в орга&

мость белковых микроэрреев высокой плотнос&

низме или конкретной клеточной популяции

ти фактически делает невозможным их исполь&

отнюдь не является автоматическим указанием

зование в небольших поисковых исследованиях.

на то, что такой аутоантиген является мишенью

Важными исключениями являются исследова&

N&IgG&aAb. Таким образом, проблема дискри&

ния, дизайн которых изначально предполагает

минации bona fide ОАА и N&IgG&aAb актуальна и

использование крайне ограниченного набора

для несмещённых методов профилирования, в

проб в скрининговой части, а также прикладные

особенности при анализе небольших выборок,

научно&клинические задачи по идентификации

которые наиболее часто используются в контек&

мишеней аутоиммунного ответа у отдельных па&

сте таких методов (в силу высокой стоимости

циентов (к примеру, у пациента с вероятным па&

анализа) и в которых невозможность адекватно&

ранеопластическим неврологическим синдро&

го контроля частот аутоантительной реактив&

мом (ПНС) и неопределяемым уровнем аутоан&

ности к кандидатным ОАА в обеих исследуемых

тител к известным онконевральным аутоантиге&

группах закономерным образом приводит к обо&

нам). В таких случаях современные несмещён&

гащению набора идентифицируемых антигенов

ные методы (в т.ч. белковые микроэрреи высо&

нерекуррентно реагирующими ОАА и мишеня&

кой плотности) являются, пожалуй, наилучшей

ми N&IgG&aAb.

альтернативой - с оговоркой на то, что чрезмер&

ное ограничение числа антителосодержащих

проб на скрининговом этапе исследования чре&

МОДИФИКАЦИЯ КРИТЕРИЕВ ПОДБОРА

вато дополнительными ограничениями, способ&

КОНТРОЛЬНЫХ ГРУПП

ными значительно нивелировать преимущества

несмещённых методов (см. ниже).

Важно отметить, что в силу вышеописанной

Крайне привлекательной альтернативой

вариабельности иммунореактивности N&IgG&

белковым микроэрреям являются методы PhIP&

aAb в зависимости от клинико&демографичес&

Seq [30, 31] и PLATO [32, 33] (табл. 1 и 2). По

ких, средовых и генетических факторов наличие

оценкам авторов, при пробоспецифичном бар&

статистически достоверных отличий в частотах

кодировании стоимость анализа в расчёте на од&

встречаемости аутоантител определенной спе&

ну антителосодержащую пробу в 10-100 раз

цифичности между двумя анализируемыми

меньше, нежели при использовании белковых

группами само по себе не является индикатором

микроэрреев. Тем не менее синтез олигонуклео&

того, что идентифицированный аутоантиген

тидной библиотеки или покупка ORF&библио&

представляет собой bona fide ОАА. Действитель&

теки требует значительных разовых финансовых

но, во всех вышеупомянутых исследованиях,

вложений (несколько десятков тысяч долла&

приводивших к идентификации déjà&vu&АА/ми&

ров CША), а сами методы базируются на после&

шеней N&IgG&aAb, кандидатные ОАА демон&

довательном использовании нескольких высо&

стрировали высокозначимые отличия по встре&

котехнологичных подходов (табл. 1). Это требу&

чаемости соответствующих аутоантител между

ет не только доступа к широкому спектру специ&

группой изучаемого заболевания и корректно

ализированного оборудования и программного

подобранной контрольной группой.

обеспечения, но ещё и наличия мультидисцип&

Таким образом, первой стратегией, реализу&

линарной исследовательской группы с широ&

емой еще на этапе продумывания дизайна ис&

ким спектром экспертиз. Наконец, относитель&

следовании и потенциально способной снизить

но небольшое количество опубликованных ра&

долю déjà&vu&АА/мишеней N&IgG&aAb в резуль&

бот, посвящённых профилированию репертуа&

татах скрининга, является вытекающая из вари&

ров, распознаваемых циркулирующими аутоан&

абельности аутоантительной реактивности та&

тителами ОАА при помощи PhIP&Seq [8, 30,

ких антигенов в зависимости от различных фак&

88-91] и PLATO [32, 88], пока не позволяют в

торов (см. выше) максимально возможная кли&

полной мере оценить все положительные и от&

нико&демографическая, средовая и генетичес&

рицательные стороны этих методов, а также их

кая диверсификация контрольной группы, ре&

реализуемость в контексте небольших пилотных

активность в которой и составляет определяю&

исследований.

щее свойство N&IgG&aAb. Классический дизайн

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

699

контрольной группы, в котором распределение

должны рассматриваться исключительно как

клинико&демографических (возраст, пол) и, по

нижняя граница оценки данного параметра; ре&

возможности, других факторов (средовые, гене&

альные значения этих долей, разумеется, значи&

тические) в максимальной степени соответству&

тельно больше. Таким образом, значительная

ет таковому в группе изучаемого заболевания,

часть антигенов, демонстрирующих «добавлен&

по&видимому, является субоптимальным в кон&

ную» реактивность в группах пациентов с хро&

тексте идентификации ОАА. В действительнос&

ническим гепатитом и циррозом печени, оче&

ти такой дизайн заведомо занижает вариабель&

видно, представляет собой déjà&vu&АА/мишени

ность концентрации аутоантител в контрольной

N&IgG&aAb. «Индекс подозрительности» в отно&

группе по сравнению с общепопуляционным,

шении таких антигенов должен быть в особен&

тем самым создавая благоприятные условия для

ности высоким, и без каких&либо мощных пред&

первоочередного выявления déjà&vu&АА/мише&

посылок к их более глубокому изучению они

ней N&IgG&aAb. В особенности данный пункт

должны исключаться из дальнейшего анализа.

может оказаться актуальным в контексте онко&

Заметим, что даже вне контекста концепции

заболеваний, возникающих в группах с относи&

déjà&vu&АА/мишенях N&IgG&aAb диагностичес&

тельно узким спектром специфичностей N&IgG&

кая ценность соответствующих аутоантител бу&

aAb - дети и молодые взрослые мужчины [81].

дет по очевидным причинам минимальной.

К этому же пункту вплотную примыкает не&

Интересно, что в обсуждаемой работе оче&

обходимость тщательного и продуманного

видный прирост обогащения кандидатных ОАА

контроля коморбидных, фоновых и сопутствую&

мишенями N&IgG&aAb с умеренными и высоки&

щих заболеваний, в особенности если послед&

ми частотами реактивности происходит лишь в

ние имеют воспалительную или аутоиммунную

группе кандидатных ОАА, выявляемых цирку&

природу (что является крайне частой ситуацией

лирующими аутоантителами во всех трех когор&

при злокачественных поражениях самой разной

тах (гепатоцеллюлярный рак, цирроз печени,

тканевой и органной принадлежности), пос&

хронический гепатит). При этом в группе анти&

кольку именно в таких ситуациях шанс выявле&

генов, выявляемых в двух когортах (гепатоцел&

ния déjà&vu&АА/мишеней N&IgG особенно вы&

люлярный рак + хронический гепатит или цир&

сок. Так, Looi et al. [92] использовали метод

роз печени), доля подобных N&IgG&aAb факти&

SERPA для профилирования репертуаров ауто&

чески не отличается от таковой в группе наибо&

антительных специфичностей у пациентов с ге&

лее опухолеспецифичных аутоантигенов. Наи&

патоцеллюлярной карциномой. Из 28 антиге&

более вероятно, в данном исследовании это свя&

нов, демонстрировавших аутоантительную ре&

зано с тем, что среди антигенов, выявляемых в

активность у пациентов с раком печени при от&

двух когортах, для 8/9 (89%) антигенов речь идет

сутствии таковой в пулированной пробе сыво&

о «добавленной» реактивности в когорте паци&

роток здоровых доноров, 17 антигенов (61%)

ентов с циррозом печени, который является од&

также демонстрировали значимые частоты ре&

ним из главных факторов риска развития гепа&

активности хотя бы в одной из групп пациентов

тоцеллюлярного рака; поэтому в данном случае

с хроническим гепатитом или циррозом печени,

речь может идти об аутоантителах, являющихся

и 8 антигенов (29%) значимо реагировали во

биомаркёрами наиболее ранних стадий злокаче&

всех трех исследованных группах.

ственной трансформации. Данную возможность

Весьма интересные данные получаются при

следует иметь в виду при включении в дополни&

сопоставлении набора идентифицированных в

тельные группы контроля пациентов с предра&

данной работе кандидатных ОАА с объединён&

ковыми заболеваниями и пограничными опухо&

ным списком выявляемых при помощи SERPA

лями, и «индекс подозрительности» в плане от&

мишеней N&IgG&aAb с умеренными и высокими

несения антигенов, демонстрирующих иммуно&

частотами реактивности (Li et al. [77], Белоу&

реактивность в таких группах, к потенциальным

сов с соавт., неопубликованные данные; cум&

déjà&vu&АА/мишеням N&IgG&aAb должен быть

марно 13 антигенов, см. выше). Доля таких ми&

закономерно ниже, нежели в ситуации, описан&

шеней N&IgG&aAb в группах кандидатных ОАА,

ной абзацем выше.

реагирующих в одной (только у пациентов с

карциномами), двух и трех проанализирован&

ных когортах, составляет 1/11 (9%), 1/9 (11%) и

ЭФФЕКТ DÉJÀ6VU И ПРОБЛЕМЫ

3/8 (38%) соответственно. Следует отметить,

ОНКО6 И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОГО

что, поскольку вышеописанный референсный

КОНТЕКСТА

список из 13 антигенов составляет крайне не&

большую часть от тотального репертуара N&IgG&

Отдельной, однако же тесно связанной с вы&

aAb, приведённые доли мишеней N&IgG&aAb

шеописанным эффектом déjà&vu, проблемой яв&

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

700

БЕЛОУСОВ

ляется выраженная феноменологичность и

воссоздание патогенетически релевантного

чрезмерная клинико&диагностическая ориенти&

контекста на уровне клеточной системы, ис&

рованность подавляющего большинства иссле&

пользуемой для получения пула антигенов для

дований репертуаров распознаваемых циркули&

скрининга. При этом сравнение двух сингенных

рующими аутоантителами ОАА. Действительно,

систем, единственным отличием которых друг

в большинстве случаев речь идёт о простом

от друга является «включение» той или иной

сравнительном анализе репертуаров антигенов,

транскрипционной программы, может пред&

распознаваемых циркулирующими аутоантите&

ставлять собой мощный аналитический фильтр

лами в группе морфологически и молекулярно

для фокусирования анализа на аутоантигенах,

гетерогенных опухолей того или иного органа и

экспрессия которых непосредственно связана с

группе контрольных индивидов.

воссоздаваемым in vitro аспектом патогенеза

Причины преимущественного выбора имен&

изучаемого заболевания.

но такого дизайна лежат на поверхности: во&

По&видимому, прототипным методом в рам&

первых, узкая функционально&биологическая

ках данной стратегии следует считать «метод

«контекстуализация» исследования (см. ниже)

триангуляции», разработанный Cottrell et al. [93]

значительно усложняет либо эксперименталь&

для идентификации патогенетически значимых

ную систему, либо процесс набора выборки для

аутоантигенов, распознаваемых циркулирую&

исследования, либо и то и другое. Во&вторых,

щими антителами у пациентов с миозитом.

морфологическая, молекулярная и иммунобио&

В данном методе иммунопатологическая контек&

логическая гетерогенность опухолей в группе

стуализация достигалась путем in vitro воссозда&

изучаемого заболевания создает теоретические

ния в клеточной системе, используемой как ис&

предпосылки для выявления «универсального»

точник аутоантигенного пула, одного из двух со&

биомаркёра той или иной нозологии без «при&

бытий, тесно связанных с патогенезом изучае&

вязки» к конкретному гистологическому вари&

мого заболевания, а именно гиперстимуляции

анту, онкогенному событию или молекулярной

клеток IFN&α [94] либо дифференцировки мио&

сигнатуре, что для подавляющего большинства

цитов из миобластов как компонента регенера&

клинико&диагностических целей является од&

ции скелетных мышц [95]. Авторы использова&

нозначным преимуществом. Однако же обрат&

ли пре&скрининг сывороток крови пациентов с

ной стороной медали такой универсальности за&

миозитом при помощи стандартного одномер&

кономерным образом является опять&таки пер&

ного вестерн&блот&анализа на способность спе&

воочередное выявление «максимально универ&

цифично распознавать аутоантигены, экспрес&

сальных» déjà&vu&АА.

сия которых индуцировалась в клетках в резуль&

В связи с этим ещё одним подходом к сниже&

тате обработки IFN&α либо in vitro дифференци&

нию частоты выявления déjà&vu&АА/мишеней

ровки миобластов. Дальнейший классический

N&IgG&aAb является онко& и/или иммунобиоло&

SERPA&анализ использовали для целенаправ&

гическая «контекстуализация» исследования,

ленной идентификации «новых» антигенных

при которой отдельные компоненты экспери&

специфичностей аутоантител в отобранных по

ментальной системы, дизайна исследования,

результатам пре&скрининга сыворотках. В ре&

критериев отбора пациентов и т.д. будут оказы&

зультате проведенного анализа были идентифи&

вать значительное селекционное давление в сто&

цированы антигены IFIT3 и MYL4, распознава&

рону отбора bona fide ОАА, иммуногенность ко&

емые сывороточными аутоантителами пациен&

торых максимально тесно связана с процессами

тов с миозитом, экспрессия которых специфи&

злокачественной трансформации, прогрессии

чески индуцировалась в ходе стимуляции IFN&α

и/или заведомо высокоэффективного противо&

и регенеративного процесса в мышцах соответ&

опухолевого иммунного ответа.

ственно.

Концептуально схожий подход, однако уже в

контексте онкологического заболевания, был

ВОССОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО

несколько позже использован Grandjean et al.

КОНТЕКСТА ИЗУЧАЕМОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ

[96]. В данном исследовании авторы сфокусиро&

В КЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ,

вали свое внимание на возможном влиянии на

ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В КАЧЕСТВЕ

аутоантигенный репертуар условий гипоксии,

ИЗНАЧАЛЬНОГО ПУЛА АУТОАНТИГЕНОВ

одного из ключевых параметров микроокруже&

ния опухоли, определяющих ее транскрипцион&

Наиболее очевидным способом контекстуа&

ную программу, фенотипические особенности,

лизации исследований по изучению репертуа&

агрессивность и устойчивость к терапии [97].

ров аутоантительных специфичностей в онко&

Авторы культивировали клеточные линии коло&

логических заболеваниях человека является

ректального рака HCT116 и HT29 в условиях

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

701

нормоксии либо 48&часовой гипоксии. Тоталь&

индукцией той или иной транскрипционной (в

ные белковые фракции полученных клеток ис&

т.ч. онкогенной) программы.

пользовали как источники антигенов в SERPA&

Наконец, для фокусирования иммунопроте&

анализе для гибридизации с пулированными

омного анализа на патогенетически значимых

сыворотками крови бестимусных мышей

аутоантигенах наша группа разработала метод

(NMRI&Foxn1nu/nu), несущих подкожные ксено&

DISER (2D&DIGE+SERPA) [102]. В данном

графты HCT116 или HT29, либо сингенных

подходе конкретная онкогенная транскрипци&

контрольных мышей без опухоли. В этом комп&

онная программа воссоздается in vitro в клеточ&

лексном сравнительном анализе авторов специ&

ной системе при помощи трансдукции иммор&

фически интересовали белки, выявляемые толь&

тализованной линии нормального эпителия

ко сыворотками мышей с опухолями (исключе&

лентивирусным конструктом, кодирующим му&

ние мишеней N&IgG&aAb с высокими частотами

тантный онкоген, специфичный для определен&

реактивности) и только в клетках, культивируе&

ного морфомолекулярного класса опухолей.

мых в условиях гипоксии («фокусировка» иссле&

Ключевым отличием DISER от SERPA при этом

дования на аутоантигенах, экспрессия которых

является замена классического 2D&ЭФ на раз&

непосредственно индуцируется гипоксией). Та&

ностный электрофорез (2D&DIGE) c двумя диф&

кой аутоантиген был идентифицирован как

ференциально мечеными белковыми фракция&

фосфорилированная (Thr56) форма фактора

ми, одна из которых соответствует клеткам,

элонгации eEF2, при этом распознавания не&

трансдуцированным контрольным вектором, а

фосфорилированной формы eEF2 не наблюда&

другая - клеткам, трансдуцированным онкоге&

лось. Опосредованное eEF2K&зависимым фос&

ном. Таким образом, в каждом из эксперимен&

форилированием eEF2 ингибирование элонга&

тов появляется опция фокусирования анализа

ции полипептидной цепи является важным

на тех белках, экспрессия которых специфичес&

компонентом клеточного ответа на гипоксичес&

ки индуцируется конкретным онкогенным со&

кий стресс [98-101]. Таким образом, аутоанти&

бытием. С использованием данного метода мы

тельный ответ против p&eEF2 является феноме&

идентифицировали гликолитический фермент

ном, непосредственно связанным с внутриопу&

фосфоглицераткиназу 1 (PGK1) как bona fide

холевой гипоксией на молекулярно&патогенети&

ОАА, специфически индуцируемый мутантным

ческом уровне. Титр аутоантител против p&eEF2

онкогеном NRAS^Q61R, аутоантитела к которому

нарастал по мере прогрессии опухоли в мышах,

селективно маркируют группу неинвазивных

причём детектируемый их уровень определялся

опухолей щитовидной железы RAS&подобного

уже на седьмой день после введения опухолевых

фенотипа.

клеток, когда пальпируемая опухоль ещё не оп&

ределялась; таким образом, аутоантитела против

p&eEF2 потенциально могут быть использованы

ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫЙ

для ранней диагностики. Это соотносилось с

АУТОИММУНИТЕТ КАК КЛИНИКО6

данными, полученными на панели сывороток

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТЕКСТ

пациентов с аденомами толстой кишки, коло&

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ bona fide ОАА

ректальным раком, а также здоровых доноров, у

которых аутоантитела против p&eEF2 выявля&

Другим эффективным способом имму&

лись исключительно в группах пациентов с опу&

но/онкобиологической контекстуализации ис&

холями толстой кишки. Однако следует отме&

следований по изучению репертуаров распозна&

тить, что практически идентичные частоты вы&

ваемых циркулирующими аутоантителами ОАА

явления и распределения концентрации таких

является отбор для скрининговой части иссле&

аутоантител в группах пациентов с аденомами и

дования пациентов с клиническими или морфо&

карциномами несколько компрометируют их

логическими (по данным гистологического/им&

клинико&диагностический потенциал. Также

муногистохимического анализа биопсий) приз&

авторы справедливо отмечают, что не вполне яс&

наками аномально сильного противоопухолево&

но, является ли обнаруженный ими феномен ау&

го иммунного ответа либо, в экстремальном ва&

тоантительной реактивности против p&eEF2

рианте последнего, - паранеопластического ау&

специфичным к опухолевым заболеваниям либо

тоиммунного синдрома. Следует отметить, что

же универсальным сенсором любого состояния

именно аутоантигены, ассоциированные с

выраженной тканевой гипоксии. Так или иначе,

ПНС, фактически являются единственным

данное исследование ярко демонстрирует по&

классом ОАА, находящим рутинное примене&

тенциал такого многомерного сравнительного

ние в клинической онкологии [4-6].

подхода для идентификации bona fide аутоанти&

В исследовании Nagele et al. [81] абсолютная

генов, неспосредственно ассоциированных с

численность индивидуальных специфичностей

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

702

БЕЛОУСОВ

N&IgG&aAb значительно снижалась в группах

плексными паттернами (от 10 до >100 индиви&

пациентов с нейродегенеративными заболева&

дуальных точек на блот), получаемыми в

ниями аутоиммунной/воспалительной приро&

SERPA&анализе сывороток крови индивидов без

ды (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона

активного иммунного процесса, в т.ч. условно&

и рассеянный склероз) по сравнению с группа&

здоровых индивидов и неселектированных па&

ми контроля с аналогичными показателями

циентов со злокачественными заболеваниями.

распределения возраста и соотношения полов.

Хотя в основном такой подход используется

В наиболее простой интерпретации этого на

в узком контексте выявления аутоантигенных

первый взгляд отчасти парадоксального фено&

мишеней различных ПНС, его реальный потен&

мена антиген&специфичная пролиферация им&

циал значительно шире. Так, большинство де&

мунных клеток (в т.ч. антителопродуцирующих

тально изученных к настоящему моменту онко&

плазмабластов) неизбежно приводит к конку&

невральных аутоантигенов являются полноцен&

ренции за анатомические и функциональные

ными bona fide ОАА, иммунный ответ на кото&

ниши, «победу» в которой имеет тенденцию

рые в первую очередь ассоциирован с наличием

одерживать потомство клеток, подвергшихся

онкологического заболевания, а не ПНС

антигенной стимуляции сравнительно недав&

per se [108]. К примеру, анти&Hu (ANNA1) - ау&

но [103]. Таким образом, мощная антигенная

тоантитела, антигенными мишенями которых

стимуляция при острой инфекции, вакцинации

являются онконевральные антигены HuB/

или аутоиммунном процессе будет закономер&

ELAVL2, HuC/ELAVL3 и HuD/ELAVL4, выяв&

ным образом приводить к гомеостатическому

ляются в 10-20% случаев мелкоклеточного рака

сужению репертуара выявляемых антигенных

легких, не сопровождающихся клинической

специфичностей N&IgG&aAb; при этом обога&

картиной анти&Hu/ANNA1 - ассоциированно&

щаемыми специфичностями окажутся bona fide

го энцефалита [109-112]. Аналогично, антитела

мишени активного иммунного ответа (в кон&

к раково&сетчаточному аутоантигену рековери&

тексте паранеопластического аутоиммуните&

ну выявляются в 15 и 20% случаев мелкоклеточ&

та - bona fide ОАА). Интересно, что в неселек&

ного и немелкоклеточного рака легких соответ&

тированных выборках онкологических пациен&

ственно, не сопровождающихся клиническими

тов (по крайней мере, в отдельных нозологиях в

признаками раково&ассоциированной ретино&

работе Nagele et al. [81] - рак молочной железы)

патии [113].

феномена сужения репертуара специфичностей

Важно отметить, что лишь у крайне неболь&

N&IgG&aAb не наблюдается, что может объяс&

шой доли онкологических пациентов без приз&

няться сравнительно низкой иммуногенностью

наков ПНС титры аутоантител к онконевраль&

таких опухолей [104]. Крайне важно отметить,

ным антигенам сопоставимы с таковыми у па&

что данный факт отнюдь не говорит о том, что

циентов с ПНС [110]. Данный факт никак не

аутоантительный репертуар таких пациентов не

интерферирует с рутинным определением таких

содержит антител против bona fide ОАА, речь

антител при их известной антигенной специ&

идёт лишь о том, что мощность соответствую&

фичности, однако, в сочетании с широким ре&

щих антигенспецифичных ответов недостаточ&

пертуаром N&IgG&aAb у таких пациентов, дра&

на для значимого гомеостатического сужения

матически снижает выявляемость соответству&

репертуара N&IgG&aAb.

ющих мишеней в скрининговом сеттинге, осо&

Наиболее ярко данный эффект (следует

бенно с использованием методов гелевой протео&

признать, отчасти гипотетический) прослежи&

мики, таких как SERPA. Таким образом, опухо&

вается в визуализационных методах анализа (та&

леассоциированный аутоиммунитет может слу&

ких как SERPA). Так, при использовании в каче&

жить своего рода «линзой», фокусирующей ана&

стве гибридизационных проб сывороток паци&

литические мощности используемого метода на

ентов с ПНС сигнал, соответствующий распоз&

выявлении аберрантно/эктопически экс&прес&

наваемому онконевральному антигену, часто

сированных bona fide ОАА за счёт высоких тит&

оказывается наиболее интенсивным (и иногда

ров соответствующих аутоантител и выраженно&

единственным) во всей 2D&гибридизационной

го гомеостатического сужения репертуара N&

реплике [105, 106], несмотря на сравнительно

IgG&aAb.

низкую представленность соответствующих ауто&

Наконец, следует отдельно упомянуть, что

антигенов даже при использовании в качестве

потенциал данного подхода отнюдь не ограни&

исходного аутоантигенного пула лизатов мозга

чивается идентификацией ОАА, профиль

или его отделов (по данным базы PaxDb [107],

экспрессии которых в нормальных тканях соот&

https://pax&db.org/). Получаемые в таких экспе&

ветствует органной тропности паранеопласти&

риментах низкокомплексные гибридизацион&

ческого аутоиммунного процесса. Теоретичес&

ные паттерны резко контрастируют с высококом&

ки, активный иммунный процесс, запускаемый

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

703

непосредственно опухолевыми клетками, зако&

идентификации аутоантигенов, одновременно

номерным образом должен вовлекать B&лимфо&

являющихся мишенями опухоль&инфильтриру&

цитарные клоны как минимум нескольких ан&

ющих CD4⁺ и CD8⁺ Т&клеток.

тигенных специфичностей, в т.ч. отличных от

Ряд авторов продемонстрировали в тканях

специфичности клонов, ответственных за пос&

карцином молочной железы in situ синтез ауто&

ледующее возникновение аутоиммунного пора&

антител против продуктов гранзим B&опосредо&

жения отделенных органов. Так, Larman et al.

ванного протеолиза β&актина [116], ганглиозида

[30] в своей пионерской статье по разработке

D3 [117], раково&эмбрионального антигена, му&

метода PhIP&Seq проанализировали спектр спе&

цина&1 и фибронектина&1 [118], раково&семен&

цифичностей аутоантител в спинномозговой

никового антигена CTAG1B (NY&ESO&1) и не&

жидкости трех пациенток с немелкоклеточным

которых других [119]. Однако следует отметить,

раком легкого и доказанным (n = 1) либо веро&

что данные исследования ограничены одной ло&

ятным (n = 2) ПНС и, наряду с известными

кализацией, и их методология не предусматри&

(NOVA1) и выявленными впервыe (TRIM67/

вала анализа спектра специфичностей на пол&

TRIM9) онконевральными специфичностями,

нопротеомном уровне.

идентифицировали новый ОАА - TGIF2LX.

Недостатком данного подхода является то,

Аутоантитела против TGIF2LX выявлялись в

что выявляемые с его помощью аутоантитела

спинномозговой жидкости двух из трех пациен&

могут выходить в кровоток в крайне небольших

ток, однако данный аутоантиген не экспресси&

количествах, что очевидным образом компро&

руется в центральной нервной системе и, таким

метирует их использование в качестве биомар&

образом, не мог являться bona fide мишенью ау&

кёров. Аналогично за пределами выявляемого в

тоиммунного ответа, приведшего к развитию

данном подходе спектра оказываются ОАА, ау&

ПНС (т.е. собственно онконевральным антиге&

тоантитела к которым продуцируются плазма&

ном); в настоящее время TGIF2LX относят к

тическими клетками, дифференцировавшимися

группе раково&семенниковых аутоантиге&

из B&клеток в регионарных лимфоузлах и лока&

нов [114]. Таким образом, «фокусирующая» спо&

лизованными в классических костно&мозговых

собность опухолеассоциированного аутоимму&

нишах. Подтверждением данных тезисов могут

нитета, по&видимому, реализуется в отношении

служить результаты вышепроцитированной ра&

идентификации bona fide ОАА широкого спект&

боты Garaud et al. [119], продемонстрировавших

ра, не ограничивающегося антигенами, в норме

значительные отличия в репертуарах ОАА, вы&

экспрессирующимися в органах&мишенях пара&

являемых продуцируемыми in situ и аутологич&

неопластической аутоиммунной атаки.

ными циркулирующими аутоантителами. Таким

образом, для оценки реального потенциала дан&

ного подхода в выявлении диагностически зна&

АНАЛИЗ РЕПЕРТУАРОВ

чимых ОАА необходимы дальнейшие исследо&

СПЕЦИФИЧНОСТЕЙ АУТОАНТИТЕЛ,

вания с использованием обсуждаемых в настоя&

ПРОДУЦИРУЕМЫХ in situ

щем обзоре высокопроизводительных методов с

В ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ

достаточной глубиной анализа в широком

спектре онконозологий.

Опухолеассоциированные третичные лим&

фоидные структуры (TLS) являются важнейшей

составляющей тканевого окружения опухоли.

АНАЛИТИЧЕСКАЯ

Наличие и плотность TLS являются практичес&

И ПОСТ6АНАЛИТИЧЕСКАЯ

ки универсальными и независимыми от клини&

ФИЛЬТРАЦИЯ КАК СПОСОБ

ко&морфологических характеристик маркёрами

СНИЖЕНИЯ ЧАСТОТ ВЫЯВЛЕНИЯ

относительно благоприятного прогноза во всех

DÉJÀ6VU6АА/МИШЕНЕЙ N6IgG6aAB

изученных локализациях. Как и дренирующие

опухоль регионарные лимфоузлы, TLS являют&

Последней группой подходов, потенциально

ся сайтами презентации/кросс&презентации

способных снизить долю déjà&vu&АА/мишеней

опухолевых антигенов Т&клеткам, созревания и

N&IgG&aAb в результатах скрининговых иссле&

дифференцировки Т& и B&клеток, в т.ч. генери&

дований по идентификации ОАА, является

рования плазматических клеток [115]. Таким об&

фильтрация выявляемых кандидатов на финаль&

разом, крайне интересным способом обогаще&

ных этапах иммуноскрининга.

ния выявляемых мишеней аутоантител

Интересным наблюдением, сделанным нами

bona fide ОАА является анализ репертуаров анти&

в ходе собственных исследований, является то,

тел, продуцируемых in situ в опухолевой и/или

что обилие слабых реакций в ограниченной

перитуморальной ткани, в т.ч. с точки зрения

контрольной выборке (даже при значительном

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

704

БЕЛОУСОВ

их отличии от сильных реакций в группе изуча&

к разработке нового способа высокоэффектив&

емого заболевания) часто является предиктором

ного дифференцирования мишеней N&IgG&aAb

провала кандидатного аутоантигена на этапе

и bona fide ОАА, адаптируемого к широкому

внешней валидации за счёт выявления значимо&

спектру аналитических платформ.

го процента сильных реакций во внешней/рас&

После достоверной идентификации мише&

ширенной контрольной выборке (Белоусов с со&

ней аутоантительного ответа (к примеру, при по&

авт., неопубликованные данные). Таким обра&

мощи тандемной хромато&масс&спектрометрии)

зом, важным компонентом идентификации

наиболее очевидным фактором, который дол&

bona fide ОАА, по&видимому, является мини&

жен порождать высокий «индекс подозритель&

мальная толерантность к слабым и относитель&

ности» в отношении того, что идентифициро&

но низко рекуррентным реакциям в контроль&

ванный аутоантиген может принадлежать к од&

ных группах.

ной или обеим группам déjà&vu&АА/мишеней N&

Ещё один потенциально крайне интересный

IgG, является собственно факт его повторной

подход, который, однако, до сих пор не исследо&

идентификации во множестве исследований в

ван систематически, связан с фундаментальны&

совершенно различных клинических контекс&

ми аспектами иммунобиологии N&IgG&aAb.

тах. Сравнительно недавно созданная база дан&

В рамках настоящего обзора мы определяли N&

ных AAgAtlas

[120] (http://biokb.ncpsb.org/

IgG&aAb в достаточно широком смысле, как лю&

aagatlas_portal/) предоставляет удобный интер&

бые аутоантитела, присутствующие в циркуля&

фейс для глубокого поиска текстовых упомина&

ции условно&здоровых индивидов при отсут&

ний индивидуальных белков в контексте аутоан&

ствии анамнестических данных об аутоиммун&

тительной реактивности в широком спектре за&

ных/воспалительных/онкологических заболева&

болеваний человека. Эта база данных не являет&

ниях. Однако во многих работах под N&IgG&aAb

ся исчерпывающей, однако в контексте выявле&

в узком смысле понимают аутоантитела изоти&

ния déjà&vu&АА данный инструмент является

па IgG3, продуцируемые, наряду с естественны&

практически идеальным.

ми IgM, популяцией B&1&клеток [83]. Подобно

Не последнюю роль в персистирующем вы&

последним, такие bona fide N&IgG&aAb полиреак&

явлении мишеней N&IgG&aAb в качестве антиге&

тивны, продуцируются в отсутствие антигенной

нов, ассоциированных с тем или иным заболе&

стимуляции и Т&клеточной помощи и, с функ&

ванием, играет отсутствие каталогизированных

циональной точки зрения, более близки к систе&

данных по идентифицированным в вышепро&

ме врожденного иммунитета. Ключевым их

цитированных исследованиях мишеням N&IgG&

свойством в контексте проблематики настояще&

aAb в удобном для быстрого и исчерпывающего

го обзора является их полиреактивность. Разум&

поиска интерфейсе. Определенным важным

но предположить, что значительная часть выяв&

шагом к такому «каталогу» является вышеупо&

ляемого высококомплексного репертуара спе&

мянутая база данных AAgAtlas, в которой о веро&

цифичностей N&IgG&aAb [77-82] в реальности

ятной принадлежности интересующего белка к

обусловлена полиреактивными bona fide N&IgG&

этой группе аутоантигенов можно судить по

aAb изотипа IgG3. В этом случае дискриминация

аномально широкому спектру заболеваний и

реактивности таких антител от реактивности ау&

патологических состояний, в которых он был

тоантител, продуцируемых потомством B&2&кле&

идентифицирован (déjà&vu&АА). Однако такой

ток в результате Т&зависимого иммунного ответа

суррогатный подход очевидным образом не яв&

на bona fide ОАА, - это вопрос дифференциаль&

ляется исчерпывающим решением данной

ного выявления IgG3 и всех остальных подклас&

проблемы, и крайне актуальной задачей являет&

сов IgG. В настоящее время это не представляет

ся подробная и аннотированная каталогизация

ни малейшей проблемы и легко выполняется

уже полученных данных о мишенях N&IgG&aAb,

при использовании в качестве реагента для вы&

равно как и получение новых первичных дан&

явления или захвата иммунного комплекса бел&

ных в различных популяциях и кроссплатфор&

ка А (вместо наиболее часто используемых в

менных аналитических сеттингах.

настоящее время белка G или смесей A/G), не

связывающего подавляющее большинство IgG3,

либо множества коммерчески доступных вто&

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ричных подкласс&специфичных антител. Удиви&

тельно, но ни в одной работе по системному изу&

В области идентификации распознаваемых

чению репертуаров N&IgG&aAb [77-82] распре&

циркулирующими аутоантителами ОАА и их

деление подклассов IgG не изучалось. Это явля&

применения в диагностических целях проблем&

ется крайне интересным вопросом для дальней&

ные моменты и ограничения, разумеется, не ис&

шего изучения и, возможно, способно привести

черпываются факторами, рассмотренными в

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

705

настоящем обзоре. Однако именно концепту&

генных популяциях, а использование опухоле&

альные проблемы экспрессионного смещения,

ассоциированного аутоиммунитета в качестве

эффекта déjà&vu/вырожденности репертуаров

«функционально&фокусировочного» фактора

ОАА, преимущественной идентификации ми&

возможно только при анализе нозологий, в ко&

шеней N&IgG&aAb и отсутствия корректного био&

торых паранеопластический аутоиммунитет

логического контекста являются, по мнению ав&

встречается сравнительно часто. Однако среди

тора, теми факторами, которые принципиально

всего многообразия описанных подходов прак&

ограничивают как клиническую валидность, так

тически для любого исследования в этой облас&

и биологическую значимость идентифицируе&

ти возможно найти по крайней мере несколько

мых ОАА и аутоантигенных/аутоантительных

подходящих пунктов. Использование таких

сигнатур. Как продемонстрировано в настоя&

подходов в различных сочетаниях и экспери&

щем обзоре, влияние всех этих факторов может

ментальных контекстах, а также исследование

быть в той или иной степени снижено с исполь&

ряда плохо изученных вопросов в этой области

зованием широкого спектра подходов на всех

могут как значительно повысить клиническую

основных этапах исследования, начиная от ди&

применимость выявляемых аутоантительных

зайна, выбора методологии и формирования

биомаркёров, так и радикально улучшить интег&

опытных и контрольных групп и заканчивая

рацию получаемых данных в современную кар&

пост&аналитической фильтрацией списка выяв&

тину иммунологического и молекулярного

ленных кандидатных ОАА. Важно отметить, что

«ландшафтов» опухолей человека.

все описанные подходы не являются взаимо&

исключающими, и их комбинированное ис&

пользование вполне может демонстрировать ад&

Финансирование. Исследование выполнено

дитивный характер в плане повышения вероят&

при финансовой поддержке Российского фонда

ности идентификации bona fide ОАА либо доли

фундаментальных исследований в рамках науч&

таких аутоантигенов среди идентифицируемых

ного проекта № 19&115&50248.

кандидатных ОАА.

Благодарности. Автор выражает благодар&

Разумеется, далеко не каждый из вышеопи&

ность А.В. Боголюбовой&Кузнецовой за помощь

санных подходов может быть применен в рам&

в оформлении рукописи.

ках конкретного исследования. Очевидно, что

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсут&

использование несмещённых методов плохо

ствии конфликта интересов.

подходит для небольших пилотных исследова&

Соблюдение этических норм. Настоящая

ний, компонент популяционно&генетической

статья не содержит описания выполненных ав&

диверсификации контрольной группы будет

тором исследований с участием людей или ис&

крайне сложно реализовать в этнически гомо&

пользованием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Anderson, K. S., and LaBaer, J. (2005) The sentinel with&

6. Zoccarato, M., Gastaldi, M., Zuliani, L., Biagioli, T.,

in: exploiting the immune system for cancer biomarkers,

Brogi, M., et al. (2017) Diagnostics of paraneoplastic neu&

J. Proteome Res., 4, 1123&1133, doi: 10.1021/pr0500814.

rological syndromes, Neurol. Sci.,

38,

237&242,

Zaenker, P., Gray, E. S., and Ziman, M. R. (2016) Autoanti&

doi: 10.1007/s10072&017&3031&5.

body production in cancer - the humoral immune

7. Lu, X., Peng, Q., and Wang, G. (2019) The role of cancer&

response toward autologous antigens in cancer patients,

associated autoantibodies as biomarkers in paraneoplastic

Autoimmun. Rev., 15, 477&483, doi: 10.1016/j.autrev.2016.01.017.

myositis syndrome, Curr. Opin. Rheumatol., 31, 643&649,

Wu, J., Li, X., Song, W., Fang, Y., Yu, L., et al. (2017) The

doi: 10.1097/BOR. 0000000000000641.

roles and applications of autoantibodies in progression,

8. Xu, G. J., Shah, A. A., Li, M. Z., Xu, Q., Rosen, A., et al.

diagnosis, treatment and prognosis of human malignant

(2016) Systematic autoantigen analysis identifies a distinct

tumours, Autoimmun Rev., 16, 1270&1281, doi: 10.1016/

subtype of scleroderma with coincident cancer, Proc. Natl.

j.autrev.2017.10.012.

Acad. Sci. USA, 113, E7526&E7534, doi: 10.1073/pnas.

Vedeler, C. A., Antoine, J. C., Giometto, B., Graus, F.,

1615990113.

Grisold, W., et al. (2006) Management of paraneoplastic

9. Chu, G. C. W., Lazare, K., and Sullivan, F. (2018) Serum

neurological syndromes: report of an EFNS task force,

and blood based biomarkers for lung cancer screening: a

Eur. J. Neurol.,

13,

682&690, doi:

10.1111/j.1468&

systematic review, BMC Cancer, 18, 181, doi: 10.1186/

1331.2006.01266.x.

s12885&018&4024&3.

Zuliani, L., Graus, F., Giometto, B., Bien, C., and

10. Macdonald, I. K., Allen, J., Murray, A., Parsy&Kowalska,

Vincent, A. (2012) Central nervous system neuronal sur&

C. B., Healey, G. F., et al. (2012) Development and valida&

face antibody associated syndromes: review and guidelines

tion of a high throughput system for discovery of antigens

for recognition, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry., 83, 638&

for autoantibody detection, PLoS One,

7, e40759,

645, doi: 10.1136/jnnp&2011&301237.

doi: 10.1371/journal.pone.0040759.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

706

БЕЛОУСОВ

11.

Jett, J. R., Peek, L. J., Fredericks, L., Jewell, W., Pingleton,

lines, solid tumors and testis cDNA libraries displayed on

W. W., and Robertson, J. F. R. (2014) Audit of the autoan&

lambda phage, BMC Cancer, 4, 78, doi: 10.1186/1471&

tibody test, EarlyCDT®&Lung, in 1600 patients: an evalua&

2407&4&78.

tion of its performance in routine clinical practice, Lung

26.

Jiang, B., Ren, T., Dong, B., Qu, L., Jin, G., et al. (2010)

Cancer, 83, 51&55, doi: 10.1016/j.lungcan.2013.10.008.

Peptide mimic isolated by autoantibody reveals human

12.

Edelsberg, J., Weycker, D., Atwood, M., Hamilton&

arrest defective 1 overexpression is associated with poor

Fairley, G., and Jett, J. R. (2018) Cost&effectiveness of an

prognosis for colon cancer patients, Am. J. Pathol., 177,

autoantibody test (EarlyCDT&Lung) as an aid to early

1095&1103, doi: 10.2353/ajpath.2010.091178.

diagnosis of lung cancer in patients with incidentally

27.

Mintz, P. J., Rietz, A. C., Cardó Vila, M., Ozawa, M. G.,

detected pulmonary nodules, PLoS One, 13, e0197826,

Dondossola, E., et al. (2015) Discovery and horizontal fol&

doi: 10.1371/journal.pone.0197826.

low&up of an autoantibody signature in human prostate

13.

Sullivan, F. M., Mair, F. S., Anderson, W., Armory, P.,

cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 2515&2520,

Briggs, A., et al. (2020) Earlier diagnosis of lung cancer in

doi: 10.1073/pnas.1500097112.

a randomised trial of an autoantibody blood test followed

28.

Wang, X., Yu, J., Sreekumar, A., Varambally, S., Shen, R.,

by imaging, Eur. Respir. J., 56, 2000670, doi: 10.1183/

et al. (2005) Autoantibody signatures in prostate cancer,

13993003.00670&2020.

N. Engl. J. Med.,

353,

1224&1235, doi:

10.1056/

14.

Tsou, P., Katayama, H., Ostrin, E. J., and Hanash, S. M.

NEJMoa051931.

(2016) The emerging role of B cells in tumor immunity, Cancer

29.

Chen, G., Wang, X., Yu, J., Varambally, S., Yu, J., et al.

Res., 76, 5591&5601, doi: 10.1158/0008&5472.CAN&16&0431.

(2007) Autoantibody profiles reveal ubiquilin 1 as a

15.

Tokunaga, R., Naseem, M., Lo, J. H., Battaglin, F.,

humoral immune response target in lung adenocarcinoma,

Soni, S., et al. (2019) B cell and B cell&related pathways for

Cancer Res.,

67,

3461&3467, doi:

10.1158/0008&

novel cancer treatments, Cancer Treat Rev., 73, 10&19,

5472.CAN&06&4475.

doi: 10.1016/j.ctrv.2018.12.001.

30.

Larman, H. B., Zhao, Z., Laserson, U., Li, M. Z.,

16.

Corsiero, E., Delvecchio, F. R., Bombardieri, M., and

Ciccia, A., et al. (2011) Autoantigen discovery with a syn&

Pitzalis, C. (2019) B cells in the formation of tertiary lym&

thetic human peptidome, Nat. Biotechnol., 29, 535&541,

phoid organs in autoimmunity, transplantation and

doi: 10.1038/nbt.1856.

tumorigenesis, Curr. Opin. Immunol.,

57,

46&52,

31.

Mohan, D., Wansley, D. L., Sie, B. M., Noon, M. S., Baer,

doi: 10.1016/j.coi.2019.01.004.

A. N., et al. (2018) PhIP&Seq characterization of serum

17.

Largeot, A., Pagano, G., Gonder, S., Moussay, E., and

antibodies using oligonucleotide&encoded peptidomes, Nat.

Paggetti, J. (2019) The B&side of cancer immunity: the

Protoc., 13, 1958&1978, doi: 10.1038/s41596&018&0025&6.

underrated tune, Cells, 8, 449, doi: 10.3390/cells8050449.

32.

Zhu, J., Larman, H. B., Gao, G., Somwar, R., Zhang, Z.,

18.

Zhao, K.&L., Yang, X.&J., Jin, H.&Z., Zhao, L., Hu, J.&L.,

et al. (2013) Protein interaction discovery using parallel

and Qin, W.&J. (2019) Double&edge role of B cells in tumor

analysis of translated ORFs (PLATO), Nat. Biotechnol., 31,

immunity: potential molecular mechanism, Curr. Med.

331&334, doi: 10.1038/nbt.2539.

Sci., 39, 685&689, doi: 10.1007/s11596&019&2092&5.

33.

Larman, H. B., Liang, A. C., Elledge, S. J., and Zhu, J.

19.

Sharonov, G. V., Serebrovskaya, E. O., Yuzhakova, D. V.,

(2014) Discovery of protein interactions using parallel

Britanova, O. V., and Chudakov, D. M. (2020) B cells, plas&

analysis of translated ORFs (PLATO), Nat. Protoc., 9, 90&

ma cells and antibody repertoires in the tumour microenvi&

103, doi: 10.1038/nprot.2013.167.

ronment, Nat. Rev. Immunol., 20, 294&307, doi: 10.1038/

34.

Li, R., Kang, G., Hu, M., and Huang, H.

(2019)

s41577&019&0257&x.

Ribosome display: a potent display technology used for

20.

Sahin, U., Türeci, Ö., Schmitt, H., Cochlovius, B.,

selecting and evolving specific binders with desired proper&

Johannes, T., et al. (1995) Human neoplasms elicit multi&

ties, Mol. Biotechnol., 61, 60&71, doi: 10.1007/s12033&018&

ple specific immune responses in the autologous host, Proc.

0133&0.

Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11810&11813, doi: 10.1073/pnas.

35.

Yang, X., Boehm, J. S., Yang, X., Salehi&Ashtiani, K.,

92.25.11810.

Hao, T., et al. (2011) A public genome&scale lentiviral

21.

Desmetz, C., Maudelonde, T., Mangé, A., and Solassol, J.

expression library of human ORFs, Nat. Methods., 8, 659&

(2009) Identifying autoantibody signatures in cancer: a

661, doi: 10.1038/nmeth.1638.

promising challenge, Expert Rev. Proteomics, 6, 377&386,

36.

Luck, K., Kim, D.&K., Lambourne, L., Spirohn, K.,

doi: 10.1586/epr.09.56.

Begg, B., et al. (2019) A reference map of the human pro&

22.

Sahin, U., and Türeci, Ö. (2013) Antigen identification

tein interactome, bioRxiv, 12, 605451, doi: 10.1101/

using SEREX, Methods Mol. Biol.,

1061,

59&77,

605451.

doi: 10.1007/978&1&62703&589&7_3.

37.

Klade, C. S., Voss, T., Krystek, E., Ahorn, H.,

23.

Kiyamova, R., Kostianets, O., Malyuchik, S.,

Zatloukal, K., et al. (2001) Identification of tumor antigens

Filonenko, V., Usenko, V., et al. (2010) Identification of

in renal cell carcinoma by serological proteome analysis,

tumor&associated antigens from medullary breast carcino&

Proteomics,

890&898,

doi:

10.1002/1615&

ma by a modified SEREX approach, Mol. Biotechnol., 46,

9861(200107)1:7<890::AID&PROT890>3.0.CO;2&Z.

105&112, doi: 10.1007/s12033&010&9285&2.

38.

Lichtenfels, R., Kellner, R., Bukur, J., Beck, J.,

24.

Somers, V. A., Brandwijk, R. J., Joosten, B., Moerkerk,

Brenner, W., et al. (2002) Heat shock protein expression

P. T., Arends, J.&W., et al. (2002) A panel of candidate

and anti&heat shock protein reactivity in renal cell carcino&

tumor antigens in colorectal cancer revealed by the sero&

ma, Proteomics,

561&570, doi:

10.1002/1615&

logical selection of a phage displayed cDNA expression

9861(200205)2:5<561::AID&PROT561>3.0.CO;2&K.

library, J. Immunol., 169, 2772&2780, doi: 10.4049/

39.

Unwin, R. D., Harnden, P., Pappin, D., Rahman, D.,

jimmunol.169.5.2772.

Whelan, P., et al. (2003) Serological and proteomic evalu&

25.

Pavoni, E., Vaccaro, P., Pucci, A., Monteriù, G.,

ation of antibody responses in the identification of tumor

Beghetto, E., et al. (2004) Identification of a panel of

antigens in renal cell carcinoma, Proteomics, 3, 45&55,

tumor&associated antigens from breast carcinoma cell

doi: 10.1002/pmic.200390008.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

707

40.

Legrain, P., Aebersold, R., Archakov, A., Bairoch, A.,

53.

Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., and Lelong, C.

Bala, K., et al. (2011) The human proteome project: cur&

(2010) Two&dimensional gel electrophoresis in proteomics:

rent state and future direction, Mol. Cell. Proteomics, 10,

past, present and future, J. Proteomics, 73, 2064&2077,

M111.009993, doi: 10.1074/mcp.o111.009993.

doi: 10.1016/j.jprot.2010.05.016.

41.

Gao, H., Zheng, Z., Mao, Y., Wang, W., Qiao, Y., et al.

54.

Gires, O., Münz, M., Schaffrik, M., Kieu, C., Rauch, J.,

(2014) Identification of tumor antigens that elicit a

Ahlemann, M., et al. (2004) Profile identification of dis&

humoral immune response in the sera of Chinese

ease&associated humoral antigens using AMIDA, a novel

esophageal squamous cell carcinoma patients by modified

proteomics&based technology, Cell. Mol. Life Sci., 61,

serological proteome analysis, Cancer Lett., 344, 54&61,

1198&1207, doi: 10.1007/s00018&004&4045&8.

doi: 10.1016/j.canlet.2013.10.007.

55.

Rauch, J., Ahlemann, M., Schaffrik, M., Mack, B.,

42.

Dai, L., Qu, Y., Li, J., Wang, X., Wang, K., et al. (2017)

Ertongur, S., et al. (2004) Allogenic antibody&mediated

Serological proteome analysis approach&based identifica&

identification of head and neck cancer antigens, Biochem.

tion of ENO1 as a tumor&associated antigen and its

Biophys. Res. Commun., 323, 156&162, doi: 10.1016/j.bbrc.

autoantibody could enhance the sensitivity of CEA and

2004.08.071.

CYFRA 21&1 in the detection of non&small cell lung can&

56.

Ganesan, V., Schmidt, B., Avula, R., Cooke, D.,

cer, Oncotarget, 8, 36664&36673, doi: 10.18632/oncotarget.

Maggiacomo, T., et al. (2015) Immuno&proteomics: devel&

17067.

opment of a novel reagent for separating antibodies from

43.

Gao, H., Zheng, M., Sun, S., Wang, H., Yue, Z., et al.

their target proteins, Biochim. Biophys. Acta, 1854, 592&

(2017) Chaperonin containing TCP1 subunit 5 is a tumor

600, doi: 10.1016/j.bbapap.2014.10.011.

associated antigen of non&small cell lung cancer, Oncotarget,

57.

Kamhieh&Milz, J., Sterzer, V., Celik, H.,

8, 64170&64179, doi: 10.18632/oncotarget.19369.

Khorramshahi, O., Moftah, R. F. H., and Salama, A.

44.

Rezaei, M., Nikeghbalian, S., Mojtahedi, Z., and

(2017) Identification of novel autoantigens via mass spec&

Ghaderi, A. (2018) Identification of antibody reactive pro&

troscopy&based antibody&mediated identification of

teins in pancreatic cancer using 2D immunoblotting and

autoantigens (MS&AMIDA) using immune thrombocy&

mass spectrometry, Oncol. Rep.,

39,

2413&2421,

topenic purpura (ITP) as a model disease, J. Proteomics.,

doi: 10.3892/or.2018.6285.

157, 59&70, doi: 10.1016/j.jprot.2017.01.012.

45.

Almeras, L., Lefranc, D., Drobecq, H., De Seze, J.,

58.

Atak, A., Mukherjee, S., Jain, R., Gupta, S., Singh, V. A.,

Dubucquoi, S., et al. (2004) New antigenic candidates in

et al. (2016) Protein microarray applications: autoantibody

multiple sclerosis: Identification by serological proteome

detection and posttranslational modification, Proteomics,

analysis, Proteomics, 4, 2184&2194, doi: 10.1002/pmic.

16, 2557&2569, doi: 10.1002/pmic.201600104.

200300732.

59.

Ayoglu, B., Schwenk, J. M., and Nilsson, P. (2016) Antigen

46.

Canelle, L., Bousquet, J., Pionneau, C., Deneux, L.,

arrays for profiling autoantibody repertoires, Bioanalysis, 8,

Imam&Sghiouar, N., et al. (2005) An efficient proteomics&

1105&1126, doi: 10.4155/bio.16.31.

based approach for the screening of autoantibodies,

60.

Grötzinger, C. (2016) Peptide microarrays for medical

J. Immunol. Methods, 299, 77&89, doi: 10.1016/j.jim.2005.

applications in autoimmunity, infection, and cancer,

01.015.

Methods Mol. Biol., 1352, 213&221, doi: 10.1007/978&1&

47.

Terrier, B., Tamby, M. C., Camoin, L., Guilpain, P.,

4939&3037&1_16.

Broussard, C., et al. (2008) Identification of target antigens

61.

Mischo, A., Wadle, A., Wätzig, K., Jäger, D., Stockert, E.,

of antifibroblast antibodies in pulmonary arterial hyperten&

et al. (2003) Recombinant antigen expression on yeast sur&

sion, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 177, 1128&1134,

face (RAYS) for the detection of serological immune

doi: 10.1164/rccm.200707&1015OC.

responses in cancer patients, Cancer Immunol., 3, 5.

48.

Guilpain, P., Servettaz, A., Tamby, M. C., Chanseaud, Y.,

62.

Wadle, A., Mischo, A., Imig, J., Wüllner, B., Hensel, D.,

Tamas, N., et al. (2007) A combined SDS&PAGE and pro&

et al. (2005) Serological identification of breast cancer&

teomics approach to identify target autoantigens in healthy

related antigens from a Saccharomyces cerevisiae surface

individuals and patients with autoimmune diseases, Ann.

display library, Int. J. Cancer., 117, 104&113, doi: 10.1002/

N.Y. Acad. Sci., 1109, 538&549, doi: 10.1196/annals.1398.

ijc.21147.

060.

63.

Raju, R., Rakocevic, G., Chen, Z., Hoehn, G., Semino&

49.

Beyer, N. H., Milthers, J., Lauridsen, B. A. M., Houen, G.,

Mora, C., et al. (2006) Autoimmunity to GABAA&recep&

and Frederiksen, L. J. (2007) Autoantibodies to the protea&

tor&associated protein in stiff&person syndrome, Brain,

some in monosymptomatic optic neuritis may predict pro&

129, 3270&3276, doi: 10.1093/brain/awl245.

gression to multiple sclerosis, Scand. J. Clin. Lab. Invest.,

64.

Yamamoto, M., Naishiro, Y., Suzuki, C., Kokai, Y.,

67, 696&706, doi: 10.1080/00365510701342062.

Suzuki, R., et al. (2010) Proteomics analysis in 28 patients

50.

Tamesa, M. S., Kuramitsu, Y., Fujimoto, M., Maeda, N.,

with systemic IgG4&related plasmacytic syndrome,

Nagashima, Y., et al. (2009) Detection of autoantibodies

Rheumatol. Int., 30, 565&568, doi: 10.1007/s00296&009&

against cyclophilin A and triosephosphate isomerase in sera

1030&4.

from breast cancer patients by proteomic analysis,

65.

Ohyama, K., and Kuroda, N. (2013) Immune complex&

Electrophoresis, 30, 2168&2181, doi: 10.1002/elps.200800675.

ome analysis, Adv. Clin. Chem., 60, 129&141, doi: 10.1016/

51.

Dutoit&Lefèvre, V., Dubucquoi, S., Launay, D.,

B978&0&12&407681&5.00004&0.

Sobanski, V., Dussart, P., et al. (2015) An optimized fluo&

66.

Ohyama, K., Baba, M., Tamai, M., Aibara, N.,

rescence&based

bidimensional

immunoproteomic

Ichinose, K., et al. (2015) Proteomic profiling of antigens

approach for accurate screening of autoantibodies, PLoS

in circulating immune complexes associated with each of

One, 10, e0132142, doi: 10.1371/journal.pone.0132142.

seven autoimmune diseases, Clin. Biochem., 48, 181&185,

52.

Ganesan, V., Ascherman, D. P., and Minden, J. S. (2016)

doi: 10.1016/j.clinbiochem.2014.11.008.

Immunoproteomics technologies in the discovery of

67.

Hardouin, J., Lasserre, J.&P., Canelle, L., Duchateau, M.,

autoantigens in autoimmune diseases, Biomol. Concepts, 7,

Vlieghe, C., et al. (2007) Usefulness of autoantigens deple&

133&143, doi: 10.1515/bmc&2016&0007.

tion to detect autoantibody signatures by multiple affinity

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

708

БЕЛОУСОВ

protein profiling, J. Sep. Sci., 30, 352&358, doi: 10.1002/

81.

Nagele, E. P., Han, M., Acharya, N. K., DeMarshall, C.,

jssc.200600324.

Kosciuk, M. C., and Nagele, R. G. (2013) Natural IgG

68.

Hardouin, J., Lasserre, J.&P., Sylvius, L., Joubert&

autoantibodies are abundant and ubiquitous in human

Caron, R., and Caron, M. (2007) Cancer immunomics:

sera, and their number is influenced by age, gender, and

from serological proteome analysis to multiple affinity pro&

disease, PLoS One, 8, e60726, doi: 10.1371/journal.pone.

tein profiling, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1107, 223&230,

0060726.

doi: 10.1196/annals.1381.024.

82.

Neiman, M., Hellström, C., Just, D., Mattsson, C.,

69.

Grandjean, M., Dieu, M., Raes, M., and Feron, O. (2013)

Fagerberg, L., et al. (2019) Individual and stable autoanti&

A new method combining sequential immunoaffinity

body repertoires in healthy individuals, Autoimmunity, 52,

depletion and differential in gel electrophoresis to identify

1&11, doi: 10.1080/08916934.2019.1581774.

autoantibodies as cancer biomarkers, J. Immunol. Methods,

83.

Lobo, P. I. (2016) Role of natural autoantibodies and natur&

396, 23&32, doi: 10.1016/j.jim.2013.07.006.

al IgM anti&leucocyte autoantibodies in health and disease,

70.

Petrak, J., Ivanek, R., Toman, O., Cmejla, R.,

Front. Immunol., 7, 198, doi: 10.3389/fimmu.2016.00198.

Cmejlova, J., et al. (2008) Déjà vu in proteomics. A hit

84.

Siloşi, I., Siloşi, C. A., Boldeanu, M. V., Cojocaru, M.,

parade of repeatedly identified differentially expressed pro&

Biciuşcă, V., et al. (2016) The role of autoantibodies in

teins, Proteomics, 8, 1744&1749, doi: 10.1002/pmic.

health and disease, Rom. J. Morphol. Embryol., 57, 633&638.

200700919.

85.

Maddur, M. S., Lacroix&Desmazes, S., Dimitrov, J. D.,

71.

Ye, Y., Kuhn, C., Kösters, M., Arnold, G. J., Ishikawa&

Kazatchkine, M. D., Bayry, J., and Kaveri, S. V. (2020)

Ankerhold, H., et al. (2019) Anti α&enolase antibody is a

Natural antibodies: from first&line defense against

novel autoimmune biomarker for unexplained recurrent

pathogens to perpetual immune homeostasis, Clin. Rev.

miscarriages, EBioMedicine, 41, 610&622, doi: 10.1016/

Allergy Immunol., 58, 213&228, doi: 10.1007/s12016&019&

j.ebiom.2019.02.027.

08746&9.

72.

Bruschi, M., Carnevali, M. L., Murtas, C., Candiano, G.,

86.

Sanchez, T. W., Zhang, G., Li, J., Dai, L., Mirshahidi, S.,

Petretto, A., et al. (2011) Direct characterization of target

et al. (2016) Immunoseroproteomic profiling in African

podocyte antigens and auto&antibodies in human membra&

American men with prostate cancer: evidence for an

nous glomerulonephritis: alfa&enolase and borderline anti&

autoantibody response to glycolysis and plasminogen&asso&

gens, J. Proteomics, 74, 2008&2017, doi: 10.1016/j.jprot.

ciated proteins, Mol. Cell. Proteomics, 15, 3564&3580,

2011.05.021.

doi: 10.1074/mcp.M116.060244.

73.

Peng, B., Huang, X., Nakayasu, E. S., Petersen, J. R.,

87.

Capello, M., Cappello, P., Linty, F. C., Chiarle, R.,

Qiu, S., et al. (2013) Using immunoproteomics to identify

Sperduti, I., et al. (2013) Autoantibodies to Ezrin are an

alpha&enolase as an autoantigen in liver fibrosis,

early sign of pancreatic cancer in humans and in genetical&

J. Proteome Res., 12, 1789&1796, doi: 10.1021/pr3011342.

ly engineered mouse models, J. Hematol. Oncol., 6, 67,

74.

Nabeta, M., Abe, Y., Kagawa, L., Haraguchi, R., Kito, K.,

doi: 10.1186/1756&8722&6&67.

et al. (2009) Identification of anti&α&enolase autoantibody

88.

Larman, H. B., Laserson, U., Querol, L., Verhaeghen, K.,

as a novel serum marker for endometriosis, Proteomics Clin.

Solimini, N. L., et al. (2013) PhIP&Seq characterization of

Appl., 3, 1201&1210, doi: 10.1002/prca.200900055.

autoantibodies from patients with multiple sclerosis, type 1

75.

O’Dwyer, D. T., Smith, A. I., Matthew, M. L., Andronicos,

diabetes and rheumatoid arthritis, J. Autoimmun., 43, 1&9,

N. M., Ranson, M., et al. (2002) Identification of the 49&

doi: 10.1016/j.jaut.2013.01.013.

kDa autoantigen associated with lymphocytic hypophysitis

89.

Davoudi, S., Ahmadi, T., Papavasilieou, E., Leskov, I., and

as α&enolase, J. Clin. Endocrinol. Metab., 87, 752&757,

Sobrin, L. (2018) Phage immunoprecipitation sequencing

doi: 10.1210/jcem.87.2.8205.

of autoantigens in autoimmune retinopathy, Ocul.

76.

Cappello, P., Tomaino, B., Chiarle, R., Ceruti, P.,

Immunol. Inflamm., 26, 417&424, doi: 10.1080/09273948.

Novarino, A., et al. (2009) An integrated humoral and cel&

2016.1232738.

lular response is elicited in pancreatic cancer by α&enolase,

90.

Vazquez, S. E., Ferré, E. M. N., Scheel, D. W.,

a novel pancreatic ductal adenocarcinoma&associated anti&

Sunshine, S., Miao, B., et al. (2020) Identification of

gen, Int. J. Cancer, 125, 639&648, doi: 10.1002/ijc.24355.

novel, clinically correlated autoantigens in the monogenic

77.

Li, W.&H., Zhao, J., Li, H.&Y., Liu, H., Li, A.&L., et al.

autoimmune syndrome APS1 by proteome&wide Phip&Seq,

(2006) Proteomics&based identification of autoantibodies

eLife, 9, doi: 10.7554/eLife.55053.

in the sera of healthy Chinese individuals from Beijing,

91.

Mandel&Brehm, C., Dubey, D., Kryzer, T. J., O’Donovan,

Proteomics, 6, 4781&4789, doi: 10.1002/pmic.200500909.

B. D., Tran, B., et al. (2019) Kelch&like Protein 11 anti&

78.

Servettaz, A., Guilpain, P., Camoin, L., Mayeux, P.,

bodies in seminoma&associated paraneoplastic encephali&

Broussard, C., et al. (2008) Identification of target antigens

tis, N. Engl. J. Med.,

381,

47&54, doi:

10.1056/

of antiendothelial cell antibodies in healthy individuals: a

NEJMoa1816721.

proteomic approach, Proteomics.,

1000&1008,

92.

Looi, K. S., Nakayasu, E. S., De Diaz, R. A., Tan, E. M.,

doi: 10.1002/pmic.200700794.

Almeida, I. C., and Zhang, J. Y. (2008) Using proteomic

79.

Merbl, Y., Zucker&Toledano, M., Quintana, F. J., and

approach to identify tumor&associated antigens as markers

Cohen, I. R. (2007) Newborn humans manifest autoanti&

in hepatocellular carcinoma, J. Proteome Res., 7, 4004&

bodies to defined self molecules detected by antigen

4012, doi: 10.1021/pr800273h.

microarray informatics, J. Clin. Invest., 117, 712&718,

93.

Cottrell, T. R., Hall, J. C., Rosen, A., and Casciola&

doi: 10.1172/JCI29943.

Rosen, L. (2012) Identification of novel autoantigens by a

80.

Madi, A., Hecht, I., Bransburg&Zabary, S., Merbl, Y.,

triangulation approach, J. Immunol. Methods, 385, 35&44,

Pick, A., et al. (2009) Organization of the autoantibody

doi: 10.1016/j.jim.2012.07.024.

repertoire in healthy newborns and adults revealed by sys&

94.

Greenberg, S. A., Higgs, B. W., Morehouse, C., Walsh,

tem level informatics of antigen microarray data, Proc.

R. J., Won Kong, S., et al. (2012) Relationship between

Natl. Acad. Sci. USA, 106, 14484&14489, doi: 10.1073/

disease activity and type 1 interferon& and other cytokine&

pnas.0901528106.

inducible gene expression in blood in dermatomyositis and

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

709

polymyositis, Genes Immun., 13, 207&213, doi: 10.1038/

108. Pittock, S. J., Kryzer, T. J., and Lennon, V. A. (2004)

gene.2011.61.

Paraneoplastic antibodies coexist and predict cancer, not

95. Mammen, A. L. (2011) Autoimmune myopathies: autoan&

neurological syndrome, Ann. Neurol.,

56,

715&719,

tibodies, phenotypes and pathogenesis, Nat. Rev. Neurol.,

doi: 10.1002/ana.20269.

7, 343&354, doi: 10.1038/nrneurol.2011.63.

109. Dalmau, J., Furneaux, H. M., Gralla, R. J., Kris, M. G.,

96. Grandjean, M., Sermeus, A., Branders, S., Defresne, F.,

and Posner, J. B. (1990) Detection of the anti&Hu antibody

Dieu, M., et al. (2013) Hypoxia integration in the serologi&

in the serum of patients with small cell lung cancer - a

cal proteome analysis unmasks tumor antigens and fosters

quantitative western blot analysis, Ann. Neurol., 27, 544&

the identification of anti&phospho&EEF2 antibodies as

552, doi: 10.1002/ana.410270515.

potential cancer biomarkers, PLoS One, 8, e76508,

110. Graus, F., Dalmau, J., Reńé, R., Tora, M., Malats, N.,

doi: 10.1371/journal.pone.0076508.

et al. (1997) Anti&Hu antibodies in patients with small&cell

97. Höckel, M., and Vaupel, P. (2001) Tumor hypoxia: defini&

lung cancer: association with complete response to therapy

tions and current clinical, biologic, and molecular aspects,

and improved survival, J. Clin. Oncol., 15, 2866&2872,

J. Natl. Cancer Inst., 93, 266&276, doi: 10.1093/jnci/

doi: 10.1200/JCO.1997.15.8.2866.

93.4.266.

111.

Verschuuren, J. J., Perquin, M., Ten Velde, G., De

98. Wouters, B. G., and Koritzinsky, M. (2008) Hypoxia sig&

Baets, M., Van Breda Vriesman, P., and Twijnstra, A.

nalling through mTOR and the unfolded protein response

(1999) Anti&Hu antibody titre and brain metastases before

in cancer, Nat. Rev. Cancer, 8, 851&864, doi: 10.1038/

and after treatment for small cell lung cancer, J. Neurol.

nrc2501.

Neurosurg. Psychiatry, 67, 353&357, doi: 10.1136/jnnp.67.

99. Connolly, E., Braunstein, S., Formenti, S., and Schneider,

3.353.

R. J. (2006) Hypoxia inhibits protein synthesis through a

112. Matsumoto, T., Ryuge, S., Kobayashi, M., Kageyama, T.,

4E&BP1 and elongation factor 2 kinase pathway controlled

Hattori, M., et al. (2012) Anti&HuC and &HuD autoanti&

by MTOR and uncoupled in breast cancer cells, Mol. Cell.

bodies are differential sero&diagnostic markers for small

Biol.,

26,

3955&3965, doi:

10.1128/mcb.26.10.3955&

cell carcinoma from large cell neuroendocrine carcinoma

3965.2006.

of the lung, Int. J. Oncol., 40, 1957&1962, doi: 10.3892/

100. Romero&Ruiz, A., Bautista, L., Navarro, V., Heras

ijo.2012.1405.

Garv n, A., March D az, R., et al. (2012) Prolyl hydroxy&

113. Bazhin, A. V., Savchenko, M. S., Shifrina, O. N.,

lase&dependent modulation of eukaryotic elongation fac&

Demoura, S. A., Chikina, S. Y., et al. (2004) Recoverin as

tor 2 activity and protein translation under acute hypoxia,

a paraneoplastic antigen in lung cancer: the occurrence of

J. Biol. Chem., 287, 9651&9658, doi: 10.1074/jbc.M111.

anti&recoverin autoantibodies in sera and recoverin in

299180.

tumors, Lung Cancer, 44, 193&198, doi: 10.1016/j.lungcan.

101. Arora, S., Yang, J. M., Craft, J., and Hait, W. (2002)

2003.10.006.

Detection of anti&elongation factor 2 kinase (calmodulin&

114. Djureinovic, D., Hallström, B. M., Horie, M., Margareta

dependent protein kinase III) antibodies in patients with

Mattsson, J. S., Fleur, L., et al. (2019) Profiling cancer

systemic lupus erythematosus, Biochem. Biophys. Res.

testis antigens in non&small&cell lung cancer, JCI Insight.,

Commun.,

293,

1073&1076, doi:

10.1016/S0006&

1, 86837, doi: 10.1172/jci.insight.86837.

291X(02)00324&8.

115. Sautès&Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J., and

102. Belousov, P. V., Afanasyeva, M. A., Gubernatorova, E. O.,

Fridman, W. H. (2019) Tertiary lymphoid structures in the

Bogolyubova, A. V., Uvarova, A. N., et al. (2019) Multi&

era of cancer immunotherapy, Nat. Rev. Cancer, 19, 307&

dimensional immunoproteomics coupled with in vitro

325, doi: 10.1038/s41568&019&0144&6.

recapitulation of oncogenic NRASQ61R identifies diag&

116. Hansen, M., Nielsen, H., and Ditzel, H. (2001) The

nostically relevant autoantibody biomarkers in thyroid

tumor&infiltrating B cell response in medullary breast can&

neoplasia, Cancer Lett., 467, 96&106, doi: 10.1016/j.canlet.

cer is oligoclonal and directed against the autoantigen actin

2019.07.013.

exposed on the surface of apoptotic cancer cells, Proc.

103. Radbruch, A., Muehlinghaus, G., Luger, E. O.,

Natl. Acad. Sci. USA, 98, 12659&12664, doi: 10.1073/pnas.

Inamine, A., Smith, K. G. C., et al. (2006) Competence

171460798.

and competition: the challenge of becoming a long&lived

117. Kotlan, B., Simsa, P., Teillaud, J.&L., Fridman, W. H.,

plasma cell, Nat. Rev. Immunol., 6, 741&750, doi: 10.1038/

Toth, J., et al. (2005) Novel ganglioside antigen identified

nri1886.

by B cells in human medullary breast carcinomas: the proof

104. Wang, S., He, Z., Wang, X., Li, H., and Liu, X. S. (2019)

of principle concerning the tumor&infiltrating B lympho&

Antigen presentation and tumor immunogenicity in cancer

cytes, J. Immunol.,

175,

2278&2285, doi:

10.4049/

immunotherapy response prediction, eLife,

jimmunol.175.4.2278.

doi: 10.7554/eLife.49020.

118. Pavoni, E., Monteriù, G., Santapaola, D., Petronzelli, F.,

105. Tetsuka, S., Tominaga, K., Ohta, E., Kuroiwa, K.,

Anastasi, A., et al. (2007) Tumor&infiltrating B lympho&

Sakashita, E., et al. (2013) Paraneoplastic cerebellar

cytes as an efficient source of highly specific immunoglob&

degeneration associated with an onconeural antibody

ulins recognizing tumor cells, BMC Biotechnol., 7, 70,

against creatine kinase, brain&type, J. Neurol. Sci., 335, 48&

doi: 10.1186/1472&6750&7&70.

57, doi: 10.1016/j.jns.2013.08.022.

119. Garaud, S., Zayakin, P., Buisseret, L., Rulle, U.,

106. Darnell, J. C., Albert, M. L., and Darnell, R. B. (2000)

Silina, K., et al. (2018) Antigen specificity and clinical sig&

Cdr2, a target antigen of naturally occurring human tumor

nificance of IgG and IgA autoantibodies produced in situ

immunity, is widely expressed in gynecological tumors,

by tumor&Infiltrating B cells in breast cancer, Front.

Cancer Res., 60, 2136&2139.

Immunol., 9, 2660, doi: 10.3389/fimmu.2018.02660.

107. Wang, M., Weiss, M., Simonovic, M., Haertinger, G.,

120. Wang, D., Yang, L., Zhang, P., LaBaer, J., Hermjakob, H.,

Schrimpf, S. P., et al. (2012) PaxDb, a database of protein

et al. (2017) AAgAtlas 1.0: a human autoantigen database,

abundance averages across all three domains of life, Mol. Cell.

Nucleic Acids Res., 45, D769&D776, doi: 10.1093/nar/

Proteomics, 11, 492&500, doi: 10.1074/mcp.O111. 014704.

gkw946.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021

710

БЕЛОУСОВ

THE ANALYSIS OF THE REPERTOIRES OF THE CIRCULATING

AUTOANTIBODIES’ ANTIGENIC SPECIFICITIES AS A SEARCH TOOL

FOR THE IDENTIFICATION OF THE TUMOR6ASSOCIATED ANTIGENS:

CURRENT PROBLEMS AND SOLUTIONS

Review

P. V. Belousov^1,2

¹ Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine,

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences,

119991 Moscow, Russia; E4mail: belousp@gmail.com

² National Center for Personalized Medicine of Endocrine Diseases,

National Medical Research Center for Endocrinology,

Ministry of Health of the Russian Federation, 117036 Moscow, Russia

Circulating autoantibodies against tumor&associated autoantigens (TAA) may serve as valuable biomarkers for a wide

range of diagnostic purposes. Modern immunology offers a large variety of methods for in&depth comparative analy&

sis of the repertoires of circulating antibodies’ antigenic specificities in health and disease. Nevertheless, this research

field meets somewhat limited clinical success, while numerous data on the repertoires of the circulating autoanti&

bodies’ specificities in cancer patients are poorly integrated into the contemporary picture of the immunological and

molecular “landscapes” of human tumors. This review is an attempt to identify and systematize the key and essen&

tially universal conceptual and methodological limitations in the field of the analysis of the repertoires of circulating

antibodies’ antigenic specificities in cancer (expression bias, TAA repertoires’ redundancy, identification of natural

IgG, the absence of pathogenetically relevant context in experimental systems used to detect TAA), as well as to dis&

cuss potential and already known methodological improvements that may significantly increase the detectability of

pathogenetically relevant and diagnostically significant bona fide TAA.

Keywords: tumor&associated antigens, autoantibodies, cancer biomarkers, immunoproteomics

БИОХИМИЯ том 86 вып. 5 2021