БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 8, с. 1207 - 1216

УДК 577.322.63

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ФРАГМЕНТОВ,

СОДЕРЖАЩИХ Cys2 Cys2 МОТИВЫ,

В АРХЕЙНЫХ ФАКТОРАХ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2

О.С. Никонов*, Н.А. Невская, М.Б. Гарбер, С.В. Никонов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук,

142290 Пущино Московской обл., Россия; электронная почта: alik@vega.protres.ru

Поступила в редакцию 23.04.2021

После доработки 21.05.2021

Принята к публикации 25.05.2021

Гетеротримерный (αβγ) фактор инициации трансляции 2 архей и эукариот (a/eIF2) снабжает P сайт рибо

сомы инициаторной тРНК. Две его субъединицы (β и γ) содержат Cys2 Cys2 мотив, который при наличии

ионов цинка способен формировать стабильную структуру цинкового пальца. В представленной работе мы

провели сравнительный анализ структур фрагментов, содержащих Cys2 Cys2 мотивы, в β и γ субъедини

цах из разных организмов и проанализировали окружение этих фрагментов в кристаллах. На основании по

лученных данных нами был сделан вывод о том, что в γ и β субъединицах aIF2 конформация и роль этих

фрагментов различны.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фактор инициации трансляции 2, Sulfolobus solfataricus, кристаллическая структура,

цинковый палец, Cys2 Cys2 мотив.

DOI: 10.31857/S032097252108011X

ВВЕДЕНИЕ

ции фактор в его активной GTP связанной фор

ме участвует в транслокации метионилирован

Классический домен, содержащий цинко

ной инициаторной тРНК (Met tRNA_i) на малую

вый палец, состоит из двух β шпилек и одной

рибосомную частицу [10]. После кодон антико

α спирали. Атом цинка, который координирует

донового связывания GTP гидролизуется до

Сys2 His2 мотив [1] располагается внутри струк

GDP, и фактор в неактивной GDP связанной

туры и стабилизирует ее. Неклассические типы

форме покидает рибосому, оставляя тРНК в ее

цинковых пальцев могут иметь иные комбина

Р сайте.

ции координируемых атомов, в частности

Аминокислотные последовательности β и

Cys2 CysHis или Cys2 Cys2 [2]. Роль подобных

γ субъединиц a/eIF2 содержат Cys2 Cys2 мо

структурных доменов в клетке многогранна.

тив, в некоторых случаях координируемый ио

Они задействованы в процессе узнавания по

ном цинка. Так, для γ субъединицы фактора

следовательности нуклеотидов ДНК [3], могут

инициации трансляции 2 из Pyrococcus abyssi

связываться с РНК [4], а также способствовать

(PabIF2γ) было показано, что в области между

белок белковому взаимодействию [5].

переключателями 1 и 2 имеется структура, со

Фактор инициации трансляции 2 архей и эу

держащая четыре близко расположенных цис

кариот (a/eIF2) состоит из трех отдельных субъ

теина и соответствующая цинковому пальцу.

единиц (α, β, γ) и содержит по одному Cys2 Cys2

Наличие атома цинка в этой структуре было

мотиву в β и γ субъединицах [6, 7]. Наибольшая

подтверждено методом атомно абсорбционной

γ субъединица функционально является

спектроскопии [7]. Подобные структуры были

GTPазой. Она связана с α и β субъединицами,

также найдены в γ субъединицах Methanococcus

тогда как две последние не имеют контакта друг

jannaschii (MjaIF2γ) [11] и Pyrococcus furiosus

с другом [8, 9]. В процессе инициации трансля

(PfuIF2γ) [12].

Структура цинкового пальца, содержащая

Cys2 Cys2 мотив и координированный атом

Принятые сокращения: ЯМР- ядерный магнитный цинка, была также описана в составе С конце

резонанс; a/eIF2 - фактор инициации трансляции 2 архей

вых доменов β субъединиц архей M. jannaschii

и эукариот; aIF2β - β субъединица фактора инициации

трансляции 2 архей; aIF2γ - γ субъединица фактора ини

(MjaIF2β) [6] и Methanobacterium thermoautotrophi*

циации трансляции 2 архей.

cum (MbtIF2β) [13], определенных с помощью

* Адресат для корреспонденции.

ядерного магнитного резонанса (ЯМР), и

1207

1208

НИКОНОВ и др.

P. furiosus (PfuIF2β) [12] и Sulfolobus solfataricus

кового пальца этой субъединицы без координи

(SsoIF2β) [8], определенных методом рентгено

рующего иона цинка невозможно;

структурного анализа. По классификации, при

2) в γ субъединице Cys2 Cys2 мотив является

веденной в работе [14], цинковые пальцы a/eIF2

частью субдомена, формирующего сайт связы

относятся к типу RanBP ZnFs, поскольку по

вания β субъединицы. В известных структурах

строены из двух β шпилек, содержащих четыре

aIF2γ архей субдомен либо имеет конформацию

цистеина. Подобные структуры были описаны в

цинкового пальца, либо, как в γ субъединице

целом ряде эукариотических белков, но об их

SsoIF2, формирует две стабилизирующие S S

функции известно очень мало, соответственно

связи между соседними шпильками и не спосо

роль цинковых пальцев в функционировании

бен связывать ион цинка. В последнем случае

a/eIF2 также изучена слабо. В настоящее время

определяющую роль в конформации субдомена

известно, что замена второго цистеина на серин

играют аминокислотные последовательности

в γ субъединице [15] или нарушение целостнос

после второго и четвертого цистеинов;

ти цистеинового кластера в β субъединице кри

3) наличие Cys2 Cys2 мотива в аминокислот

тичны для роста клеток и активности IF2 в

ной последовательности не является достаточ

дрожжевых системах [16]. Некоторые мутации в

ным условием для формирования конформации

β субъединице увеличивают скорость гидролиза

цинкового пальца.

GTP в дрожжах и делают его независимым от

eIF5 [17]. Делеция цинк связывающего мотива

в β субъединице приводит к дефектам в иници

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ации трансляции [18].

Из всех известных структур aIF2 наиболее

В работе использованы структуры свобод

полно изучена структура SsoIF2γ. Структура

ных β и γ субъединиц фактора инициации

этой субъединицы изучена во всех функцио

трансляции 2 архей, а также их комплексов, оп

нальных состояниях: GTP связанном, GDP

ределенные методами рентгеновской кристал

связанном и свободном от нуклеотида [19]. Кро

лографии и ЯМР (таблица). Все структуры взя

ме того, известны структуры гетеродимеров

ты из базы данных PDB. В β субъединицах гра

αγ [20], βγ [12] и неполного (содержащего фраг

ница домена цинкового пальца была определена

менты α и β субъединиц и полную γ субъеди

за два аминокислотных остатка (а.о.) до первого

ницу) и полного αβγ гетеротримера [8, 9]. Полу

цистеина, как это было сделано в более ранних

ченные кристаллы относятся к разным простран

работах [6]. В γ субъединицах субдомены, со

ственным группам симметрии, что позволяет

держащие Cys2 Cys2 мотивы, также начинаются

детально изучить белок белковые взаимодей

за два а.о. до первого цистеина.

ствия, характерные для Cys2 Cys2 мотива этой

Наложение последовательностей выполнено

субъединицы.

вручную с использованием структурных дан

В настоящей работе сделана попытка свести

ных. Для наложения фрагментов структур ис

воедино всю известную информацию о струк

пользовали программу О [21].

турных фрагментах β и γ субъединиц a/eIF2,

содержащих мотивы Cys2 Cys2 и имеющих

конформацию, соответствующую цинковым

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

пальцам типа RanBP. Выявлено принципиаль

ное отличие структуры мотива в γ субъединице

Ранее было показано [8, 11, 12], что структу

S. solfataricus от подобных структур в других

ры β и γ субъединиц aIF2 из различных орга

aIF2γ. На основе исследования известных

низмов обладают высокой степенью сходства,

структур и их упаковок в кристалле сделаны

особенно в части элементов вторичной структу

следующие выводы:

ры. Поэтому для удобства читателей на рис. 1

1) цинковый палец β субъединицы необхо

представлена структура βγ комплекса из P. furio*

дим для дополнительной защиты GTP в нуклео

sus (PDB код: 2d74) и показаны элементы, кото

тид связывающем кармане и уменьшения внут

рые обсуждаются в тексте статьи. Фрагменты β

ренней GTPазной активности фактора. Во всех

и γ субъединиц, содержащие Cys2 Cys2 моти

известных структурах атомы серы четырех цис

вы, выделены полупрозрачными сферами, а

теинов β субъединицы располагаются в верши

Сα атомы цистеинов помечены белыми шари

нах правильной четырехгранной пирамиды с

ками. В соответствии со сложившейся практи

координирующим ионом цинка в ее центре,

кой на рис. 1 не отображены короткие β шпиль

тогда как содержащий их С концевой домен

ки, которые присутствуют в Cys2 Cys2 фрагмен

субъединицы обладает высокой лабильностью.

тах. Эти шпильки с добавлением литеры f (на

Существование упорядоченной структуры цин

пример, fβ1) показаны при сравнении последо

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

Cys2 Cys2 МОТИВЫ В aIF2

1209

Структуры aIF2 и его субъединиц, использованные в работе

Объект

Лиганд

PDB код

Метод

Группа

Разрешение,

Ссылка

симметрии

SsoIF2γ

GDP

2pmd

X ray

P3₁

2,65

[22]

SsoIF2(αγ)

GDPNP

2aho

X ray

P2₁2₁2₁

3,00

[20]

SsoIF2(αβγ)_incomp

GDP

2qn6

X ray

C₁2₁

2,15

[8]

SsoIF2γ(Δ37 47)

GDP

3pen

X ray

I23

2,30

н/о

SsoIF2γ

GDPCP

4rjl

X ray

I23

1,64

[23]

SsoIF2γ

GDPNP

4rd4

X ray

P2₁2₁2₁

1,30

[24]

SsoIF2γ

GDP

4rd6

X ray

P2₁2₁2

1,94

[24]

SsoIF2γ+formate

GDP

4m4s

X ray

H32

2,25

[19]

SsoIF2γ

GDP

4m0l

X ray

P2₁

2,60

[19]

SsoIF2γ

4m2l

X ray

P3₁2₁

2,15

[19]

SsoIF2γ

GDPCP

4m53

X ray

I23

2,00

[19]

SsoIF2γ(-Mg²⁺)

GDPCP

6h6k

X ray

2,00

[25]

PfuIF2(βγ)

GDP

2d74

X ray

P2₁2₁2₁

2,80

[12]

PabIF2γ

GDP

1kk3

X ray

P2₁

1,90

[7]

MjaIF2γ

1s0u

X ray

P2₁

2,40

[11]

MjaIF2β

1k81

NMR

н/п

[6]

MbtIF2β

1nee

NMR

н/п

[13]

SsoIF2αβγ

3cw2

X ray

P2₁

2,80

[9]

SsoIF2αβγ+tRNA

GDPNP

3v11

X ray

P3221

5,0

[26]

Примечание. Sso - S. solfataricus, Pfu - P. furiosus, Pab - P. abyssi, Mja - M. jannaschii, Mbt - M. thermoautotrophicum; GDP -

гуанозиндифосфат; GDPCP - 5′ гуанозилметилентрифосфат; GDPNP - 5′ гуанилилимидодифосфат; incomp - непол

ный комплекс; X ray - рентгеновская кристаллография; NMR - ядерный магнитный резонанс; formate - формиат; н/о -

не опубликовано; н/п - не применимо.

вательностей фрагментов из разных организ

цинкового пальца с атомом цинка в середине че

мов.

тырехгранной правильной пирамиды, в верши

Цинковые пальцы в β субъединицах aIF2. Как

нах которой располагаются атомы серы. Длина

отмечалось ранее, структуры С концевых доме

ребра пирамиды в структурах, определенных ме

нов aIF2β, содержащих Cys2 Cys2 мотивы, извест

тодом ЯМР, равна 3,81 ± 0,02 Å, тогда как ребра в

ны для четырех организмов: M. jannaschii [6],

структурах, определенных рентгеноструктурным

M. thermoautotrophicum [13], P. furiosus [12] и S. sol*

методом, демонстрируют несколько меньшую

fataricus [8]. Последовательности этих доменов

усредненную длину и значительно больший разб

содержат по 35 а.о. и описываются одной общей

рос (3,43 ± 0,25 Å), возможно, вследствие доста

формулой: 2x, C, 2x, C, 17x, C, 2x, C, 8x, где x -

точно низкого разрешения. Положение атома

любой а.о. Наибольшим числом замен обладает

цинка в этих структурах также отличается от его

последовательность S. solfataricus (33,3% иден

идеальной координации, наблюдаемой в ЯМР

тичности с другими последовательностями), тог

структурах. Однако следует заметить, что незна

да как последовательности M. jannaschii, P. furio*

чительные развороты атомов серы цистеинов

sus и M. thermoautotrophicum имеют идентичность

вокруг связи Сα Сβ позволяют разместить их в

54,5%, а для последовательностей С концевых

вершинах правильной четырехгранной пирами

доменов MjaIF2β и PfuIF2β она достигает 70%.

ды, не выходя за пределы электронной плотности.

Все С концевые домены β субъединиц ука

Ранее было показано, что цинк необходим для

занных выше структур имеют конформацию стабилизации С концевого домена aIF2β [27].

8 БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

1210

НИКОНОВ и др.

Структура полного фактора [9] подтверждает,

ходятся на концах искаженной спирали, содер

что отсутствие иона цинка в кристаллизацион

жащей один виток, ось которой параллельна по

ном растворе ведет к разупорядочению этого до

верхности β листа. В отличие от ЯМР структур

мена. Наиболее четкое представление о вторич

кристаллические структуры содержат две

ной структуре цинкового пальца можно полу

β шпильки (h1 h2, h3 h4), в каждой из которых

чить из анализа ЯМР структуры фрагмента

размещено по два цистеина. Шпильки лежат в

MjaIF2β (PDB код: 1k81) [6], поскольку этот

двух приблизительно параллельных плоскостях;

фрагмент лишен искажений, вызванных упа

ион цинка расположен между ними. Поверх

ковкой молекул в кристалле. Основу структуры

ность пальца в основном гидрофобна, однако в

цинкового пальца составляет антипараллель

области цистеинового кластера значительное

ный β лист, состоящий из трех β тяжей (рис. 2).

число атомов кислорода главной цепи оказыва

Образованная двумя последними тяжами

ется доступно растворителю.

β шпилька содержит два цистеина. Другие два

Несмотря на высокую степень идентичности

цистеина, формирующие цинковый палец, на

(67%) аминокислотных последовательностей и

Рис. 1. Структура комплекса aIF2βγ из P. furiosus (PDB код: 2d74); стереопары. Показаны элементы вторичной структуры

и функционально важные участки, обсуждаемые в тексте статьи. Структуры β и γ субъединиц выделены белым и серым

цветами соответственно. Цинк связывающие мотивы выделены полупрозрачными сферами. Сα атомы цистеинов пока

заны белыми сферами, ионы цинка - черными сферами, ход полипептидной цепи, формирующей цинк связывающие

мотивы - черным цветом

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей цинковых пальцев β субъединиц M. jannaschii (PDB код: 1k81),

M. thermoautotrophicum (PDB код: 1nee), P. furiosus (PDB код: 2d74) и S. solfataricus (PDB код: 2qn6). Белым цветом на чер

ном фоне показаны а.о., общие для всех четырех последовательностей, на сером фоне - только для трех, исключая по

следовательность SsoIF2β. α Спираль и три длинных β тяжа соответствуют цинковому пальцу MjaIF2β, β шпильки (h1

h2 и h3 h4) - цинковым пальцам P. furiosus и S. solfataricus

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

Cys2 Cys2 МОТИВЫ В aIF2

1211

Рис. 3. Наложение кристаллических структур цинковых пальцев β субъединиц SsoIF2 (показана белым цветом, PDB код:

2qmu) и PfuIF2 (показана черным цветом, PDB код: 2d74); стереопары. Наложение выполнено по 17 ти Сα атомам

(103-113 (104-114) и 127-132 (128-133)) для SsoIF2 и PfuIF2 соответственно; Сα атомы показаны белыми и черными

сферами соответственно) с σ = 0,534 Å. Все четыре цистеина занимают приблизительно одинаковое положение в обеих

структурах (максимальное отклонение Сα атомов в паре Cys106-Cys107 равно 0,64 Å), тогда как положения β шпильки

h2 h3 и С концевой части пальца сильно разнятся и полностью определяются кристаллической упаковкой. Ионы цинка

показаны светло серой (2qmu) и тёмно серой (2d74) сферами

одинаковое расположение атомов серы друг от

областями симметричной молекулы γ субъеди

носительно друга наложение ЯМР структур

ницы. В кристаллах неполного SsoIF2βγ3Dα ге

(MjaIF2β и MbtIF2β) сопряжено со значитель

теротримера [8] цинковый палец β субъедини

ными трудностями, т.к. взаимодействие N кон

цы сдвинут в сторону домена III γ субъединицы

цевого домена β субъединицы с ее центральным

и в большей степени прикрывает нуклеотид

доменом в одной из них [27] приводит к драма

связывающий карман. Различие кристалличес

тическим искажениям как β листа, так и N кон

ких упаковок двух этих структур является, по

цевой части цинкового пальца. Кристалличес

видимому, основной причиной изменений в

кие структуры цинковых пальцев β субъединиц

конформации их цинковых пальцев.

SsoIF2 и PfuIF2 также демонстрируют высокую

Следует отметить значительное конформа

лабильность, однако в этих структурах

ционное различие между структурами цинково

β шпильки (h1 h2 и h3 h4) сохраняют свою

го пальца β субъединицы в кристалле и раство

конформацию (рис. 3). В пределах ошибки из

ре. Ранее уже говорилось о невозможности срав

мерений сохраняется также и взаимное распо

нения двух структур, полученных методом ЯМР.

ложение Сα атомов и атомов серы всех четырех

Попытка наложить β шпильки кристалличес

цистеинов. В то же время конформация цент

ких структур на соответствующие по аминокис

ральной части пальца претерпевает значитель

лотной последовательности участки структур в

ные изменения в зависимости от положения

растворе в лучшем случае позволяет получить

С концевой части β субъединицы относительно

среднее квадратичное отклонение ≈ 3 Å при зна

γ субъединицы. Участок последней, содержа

чительных смещениях Сα атомов всех четырех

щий нуклеотид связывающий карман, закрыва

цистеинов. Таким образом, даже в присутствии

ется цинковым пальцем β субъединицы

координирующего иона цинка цинковый палец

(SsoIF2) или ее центральным доменом (PfuIF2),

β субъединицы представляет собой высоко ла

в обоих случаях обеспечивая защиту связанного

бильную структуру и способен принимать раз

нуклеотида.

ные конформации.

В кристаллах βγ гетеродимера PfuIF2 [12] и

Цинковые пальцы в структурах аIF2γ. В

неполного гетеротримерного комплекса SsoIF2

структурах γ субъединиц из P. abyssi [7], P. furio*

[8] цинковый палец β субъединицы имеет раз

sus [12] и M. jannaschii [11] атом цинка коорди

ное окружение и взаимодействует с различными

нирует четыре атома серы подобно тому, как это

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

1212

НИКОНОВ и др.

шпильки. Тем не менее все 24 Сα атома, состав

ляющие цинковый палец указанных структур,

могут быть наложены друг на друга со средней

квадратичной ошибкой, не превышающей

0,57 Å.

В базе данных PDB содержится несколько

структур PabIF2γ, определенных с разрешением

выше 1,9 Å. Эти структуры позволяют оценить

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей

среднее расстояние между координируемыми

Cys2 Cys2 субдоменов архейных IF2γ S. solfataricus (PDB

цинком атомами серы в 3,69 ± 0,25 Å, что близ

код: 4rd4), P. abyssi (PDB код: 1kk3), P. furiosus (PDB

код: 2d74), M. jannaschii (PDB код: 1s0u). Одновитковые

ко к оценке этой величины в структурах aIF2β,

спирали в структуре SsoIF2γ показаны как fα1 и fα2,

полученных методом ЯМР. Следует отметить,

β шпильки - как h1 h2 и h3 h4. Остатки, совпадающие во

что изменение конформации боковых цепей

всех 4 х случаях, выделены белым шрифтом на черном фо

цистеинов этих структур в пределах электрон

не, в трех случаях - серым фоном, только в двух случаях -

серой рамкой

ной плотности легко позволяет расположить

атомы серы в вершинах правильной четырех

гранной пирамиды.

наблюдается в β субъединицах. Фрагмент

Cys2 Cys2 мотив в структуре SsoIF2γ. Цисте

структуры, содержащий Cys2 Cys2 мотив,

иновый кластер SsoIF2γ содержит аминокислот

представляет собой субдомен, связанный с те

ные остатки в положениях 57-85 и, подобно

лом молекулы двумя β тяжами, и описывается

Cys2 Cys2 мотивам рассмотренных ранее

общей формулой: 2x, C, 2x, C, 8x, C, 2x, C, 6x.

γ субъединиц архейных факторов инициации 2,

Цинковые пальцы PabIF2γ и PfuIF2γ идентичны

представляет собой отдельный субдомен, содер

за исключением одного остатка. Идентичность

жащий две β шпильки. Однако структурно суб

последовательностей цинковых пальцев PabIF2γ

домен SsoIF2γ существенно отличается от цин

и MjaIF2γ составляет 67%.

ковых пальцев других aIF2γ. Он содержит до

Подобно цинковым пальцам кристалличес

полнительно 3 а.о. между вторым и третьим цис

ких структур β субъединиц цинковые пальцы

теинами и 2 а.о. после четвертого цистеина и

рассматриваемых трех γ субъединиц также

описывается формулой 2x, C, 2x, C, 11x, C, 2x,

сформированы двумя β шпильками (рис. 4).

C, 8x. Удлинение Cys2 Cys2 субдомена SsoIF2γ

Шпильки связаны осью симметрии второго по

на 5 а.о. по отношению к цинковым пальцам

рядка, которая проходит через атом цинка и

других aIF2γ привело к значительному измене

примерно параллельна оси пальца. На плоской

нию его конформации по сравнению с ними.

поверхности каждой шпильки находятся четыре

Наложение структур субдоменов SsoIF2γ и

экспонированных в растворитель атома кисло

PabIF2γ показано на рис. 5. Вставка 3 х а.о. в

рода главной цепи. Содержащие цистеины

N концевой β шпильке SsoIF2γ привела к обра

участки цинковых пальцев β и γ субъединиц

зованию одновитковой спирали с участием а.о.

кристаллических структур имеют близкую кон

в положениях 64-68, стабилизированной двумя

формацию. Так, в структуре PfuIF2βγ они могут

водородными связями Lys63 O - Ala67 N и

быть наложены друг на друга со средней квадра

Pro65 O - Tyr68 N, тогда как конформация ос

тичной ошибкой 1,05 Å для 18 ти Сα атомов,

тальной части шпильки существенно не поме

тогда как для 9 ти N концевых Сα атомов эта

нялась. При этом положение Сα атомов цисте

величина уменьшается до 0,47 Å. Участок между

инов практически идентично в обоих белках. В

N концевой и С концевой парами цистеинов в

С концевой β шпильке вставка двух аминокис

γ субъединицах в два раза короче, чем в β субъ

лотных остатков после последнего цистеина в

единицах, что, по видимому, оказывает сущест

последовательность SsoIF2γ изменила конфор

венное влияние на стабильность структуры цин

мацию участка последовательности в положе

кового пальца.

ниях 73-83, сместив оба цистеина на концы од

В кристалле PfuIF2γ β шпилька, содержащая

новитковой спирали 74-78. Для Сys77 Сα это

С концевую пару цистеинов, имеет плотный

смещение составило 3,91 Å по отношению к со

контакт с центральным доменом β субъедини

ответствующему Cys75 PabIF2γ.

цы, а вершина шпильки, содержащей N конце

Сближение цистеинов N и C концевой

вую пару цистеинов, контактирует со спи

шпилек в Cys2 Cys2 субдомене SsoIF2γ и изме

ралью α1 β субъединицы. В кристаллах PabIF2γ

нение ориентации их Сα Сβ связей привели к

и MjaIF2γ с окружающими молекулами контак

образованию двух S S мостиков: Сys59-Сys74 и

тирует, соответственно, либо вершина С конце

Сys62-Cys77, стабилизирующих структуру суб

вой шпильки, либо вершина N концевой

домена. Сравнение структур SsoIF2γ высокого

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

Cys2 Cys2 МОТИВЫ В aIF2

1213

Рис. 5. Наложение структур субдоменов SsoIF2γ (показана белым цветом, PDB код: 4rd4) и PabIF2γ (показана черным

цветом, PDB код: 1kk3); стереопары. Наложены а.о. в положениях 57-62, 67-70 и 82-85 структуры 4rd4 и а.о. 58-63,

65-68 и 78-81 структуры 1kk3 (σ = 0,516). Сα атомы цистеинов показаны сферами соответствующих цветов, ион цинка

PabIF2γ показан сферой серого цвета. Вставка 3 а.о. в N концевой β шпильке SsoIF2γ и 2 а.о. в С концевой β шпильке

привела к образованию двух одновитковых спиралей: 64-68 и 74-78, двух S S связей и значительному смещению шпилек

относительно друг друга. Для Сys77 Сα это смещение составило 3,91 Å по отношению к соответствующему Cys75 PabIF2γ

разрешения показывает, что атомы серы распо

найден в структуре 4rjl, кристаллы которой при

лагаются в вершинах неправильной четырех

надлежат к кубической пространственной груп

гранной пирамиды со сторонами S59-S74 и

пе симметрии I23, и в структурах 2pmd и 4m2l,

S62-S77, равными 2,05 ± 0,01 Å, и сторонами

кристаллы которых принадлежат к простран

S59-S62, S59-S77, S62-S74 и S74-S77, равными

ственным группам P3₁ и P3₁21 соответственно. В

4,80 ± 0,08, 3,92 ± 0,09, 5,42 ± 0,14 и 4,77 ± 0,07 Å

остальных кристаллах SsoIF2γ и SsoIF2αγ гете

соответственно. Очевидно, что в этом случае ко

родимера сайт связывания β субъединицы так

ординация атомов серы ионом цинка невозмож

же занят различными частями симметричных

на, что подтверждается отсутствием соответ

молекул, а именно шпилькой β12-β13, N кон

ствующего иона во всех структурах SsoIF2γ.

цевой частью переключателя 2, переключате

Анализ кристаллических упаковок SsoIF2γ

лем 1 или доменом 1 α субъединицы. Только в

подтверждает высокую стабильность Cys2 Cys2

кристаллах комплекса γ субъединицы с принад

субдомена этого белка, содержащего два S S

лежащей β субъединице спиралью α1 (PDB

мостика. Известные в настоящее время структу

код: 2qn6) межмолекулярные контакты в этой

ры SsoIF2γ закристаллизованы в девяти про

области отсутствуют. Отсюда следует, что

странственных группах (таблица). Среди рас

Cys2 Cys2 субдомен ограничивает «липкую»

смотренных структур имеются соответствую

впадину на поверхности γ субъединицы, кото

щие всем трем состояниям белка (GTP связан

рая используется для связывания спирали α1

ному, GDP связанному и свободному от нукле

β субъединицы. Более того, сродство этой спи

отида), в том числе содержащие αγ гетеродимер

рали к γ субъединице выше, чем сродство дру

и комплекс γ субъединицы со спиралью α1,

гих участков SsoIF2, принимающих участие в

принадлежащей β субъединице. Наиболее

кристаллических контактах.

плотное окружение цистеинового субдомена

Сравнение структур SsoIF2γ, относящихся к

обнаружено в кристалле, относящемся к прост

различным группам симметрии, показало, что

ранственной группе Р1. В этой структуре субдо

несмотря на различное окружение, существен

мен контактирует с двумя соседними молекула

ных изменений в конформации главной цепи

ми: со шпилькой β19-β20 домена III одной мо

Cys2 Cys2 субдомена при изменении упаковки

лекулы и междоменной перетяжкой доменов II

молекул в кристалле не наблюдается (среднее

и III другой. Домен III соседней молекулы пе

квадратичное отклонение не превышает 0,85 Å

рекрывает ограниченную субдоменом впадину

даже для пары структур низкого разрешения).

на поверхности SsoIF2γ, в которой расположен

Наибольшему смещению подвергаются Сα ато

сайт связывания β субъединицы. Аналогичный

мы Сys77, расстояния между которыми в паре

контакт с доменом III симметричной молекулы

структур низкого или среднего разрешения мо

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

1214

НИКОНОВ и др.

жет достигать 2,2 Å. Следует, однако, заметить,

дет к смещению цинкового пальца относитель

что это смещение практически не влияет на вза

но нуклеотид связывающего кармана γ субъ

имное расположение атомов серы всех четырех

единицы и снижает степень защиты нуклеотида

цистеинов, расстояния между которыми оста

от столкновения с другими молекулами в про

ются почти неизменными. Область субдомена,

цессе броуновского движения, хотя и не ликви

обращенная к телу молекулы (а.о. в положениях

дирует ее полностью. По видимому, отсутствие

57-69), представляет собой его наиболее кон

ионов цинка столь же критично для функцио

сервативный участок.

нирования цинкового пальца IF2β, как и заме

Структура Cys2 Cys2 субдомена SsoIF2γ де

ны одного из цистеинов на другой аминокис

монстрирует, что наличие четырех близко рас

лотный остаток [18]. Защитная роль цинкового

положенных цистеинов не обязательно ведет к

пальца β субъединицы подтверждается также

формированию цинкового пальца. В отличие от

тем, что мутации в этой области увеличивают

других aIF2γ в структуре SsoIF2γ цистеины двух

собственную скорость гидролиза GTP в IF2 из

соседних шпилек формируют две S S связи, что

S. cerevisiae даже в отсутствие eIF5 [17]. Кроме

обеспечивает ее высокую стабильность и иск

того, крио ЭМ структура полного инициатор

лючает перестройки в положениях атомов серы,

ного комплекса архейной рибосомы [28] также

которые необходимы для посадки иона цинка.

демонстрирует, что в случае, когда антикодон

Отсюда можно сделать вывод, что часть молеку

тРНК удален от Р сайта рибосомы, цинковый

лы aIF2γ, которая в структурах PfuIF2γ, PabIF2γ

палец β субъединицы расположен напротив

и MjaIF2γ имеет форму цинкового пальца, не

нуклеотид связывающего кармана γ субъеди

предназначена для выполнения известных из

ницы и отходит в сторону при кодон антикодо

литературы функций этого пальца, а использу

новом спаривании, снимая дополнительную за

ется исключительно для формирования места

щиту нуклеотида.

связывания β субъединицы. Для этих целей

Мотив Cys2 Cys2 сохраняется также в после

субдомен SsoIF2γ, не требующий для своей ста

довательностях β субъединиц эукариот, что го

билизации связывания иона цинка, более пред

ворит в пользу схожести функции этих мотивов

почтителен, чем цинковый палец, используе

в обоих доменах жизни. Предполагается, что в

мый другими археями. Анализ соответствующих

эукариотах цинковый палец β субъединицы

участков аминокислотных последовательностей

вместе с лизиновыми повторами участвует в

факторов инициации 2 дрожжей и человека поз

связывании мРНК [29]. Тем не менее анализ

воляет сделать вывод, что вставка 5 а.о. в после

структуры архейной рибосомы в состоянии,

довательность Cys2 Cys2 субдомена, характер

предшествующем кодон антикодоновому свя

ная для SsoIF2γ, является эволюционным при

зыванию, и в состоянии кодон антикодонового

обретением, которое используют и эукариоты.

взаимодействия [28] не обнаруживает каких

либо контактов между β субъединицей и мРНК.

В γ субъединице субдомен, содержащий

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Cys2 Cys2 мотив, ограничивает с одной из сто

рон глубокую выемку, образующую сайт связы

Цинковый палец архейных IF2β необходим,

вания β субъединицы, другая сторона которой

по видимому, для дополнительной защиты нук

образована спиралью α4. В факторах, содержа

леотида в нуклеотид связывающем кармане и

щих одну субъединицу, таких как EF Tu [30],

не несет структурной функции. В присутствии

подобная выемка отсутствует. Формирование

координирующего иона цинка атомы серы всех

выемки в гетеротримерных факторах инициа

четырех цистеинов сохраняют свое взаимное

ции трансляции 2 обеспечивает нужную ориен

положение, чего нельзя сказать о конформации

тацию узнающей спирали β субъединицы, ко

пальца в целом. Анализ структур С концевых

торая может быть направлена только параллель

доменов β субъединиц из различных организ

но тяжу β7 (рис. 1). Использование в качестве

мов позволяет сделать вывод о высокой лабиль

ограничителя небольшой, но стабильной струк

ности этого фрагмента. Наложение всех Сα ато

туры цинкового пальца является, по видимому,

мов для кристаллических структур PfuIF2β и

эволюционным приобретением некоторых

SsoIF2β дает σ = 1,6 Å, а для структур, получен

aIF2, ускоряющим формирование гетеротриме

ных методом ЯМР, наложение выполнить прак

ра. Тем не менее структура цинкового пальца,

тически невозможно. В отсутствие иона цинка

содержащего Cys2 Cys2 мотив, стабильна толь

палец не в состоянии сохранять упорядоченную

ко в присутствии иона цинка [9, 27]. В археях,

структуру, и его β лист разрушается. Тяж β3

которые используют цинковый палец в качестве

вступает в непосредственный контакт с N кон

одной из стенок сайта связывания β субъедини

цевой частью переключателя 1 aIF2γ [9], что ве

цы, в случае недостатка цинка в клетке образо

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

Cys2 Cys2 МОТИВЫ В aIF2

1215

вание βγ гетеродимера может быть заблокиро

ствует также высокая стабильность цинкового

вано или сильно затруднено, что ведет к нару

пальца γ субъединицы архей, что кардинально

шению функции aIF2. Видимо поэтому в про

отличает его от цинкового пальца β субъеди

цессе эволюции стабилизация субдомена с по

ниц, который, вероятно, не выполняет струк

мощью иона цинка в S. solfataricus была замене

турной функции.

на стабилизацией двумя S S cвязями. Кроме то

Наш анализ показывает, что конформации

го, N концевая спираль субдомена SsoIF2γ пер

субдоменов, содержащих Cys2 Cys2 мотивы в

пендикулярна спирали α5 и обеспечивает его

γ субъединицах aIF2 из разных организмов, мо

дополнительную привязку к телу молекулы. Об

гут существенно различаться. В трех известных

ращает на себя внимание идентичное положе

aIF2γ в присутствии ионов цинка формируется

ние по отношению к спирали α5 консерватив

конформация цинкового пальца с координиру

ного Tyr68 (положение соответственно номенк

ющим атомом цинка в центре правильной четы

латуре SsoIF2γ) во всех известных структурах

рехгранной пирамиды и четырьмя атомами серы

aIF2γ вне зависимости от конформации субдо

в ее вершинах, тогда как в структуре SsoIF2γ

мена. Этот остаток входит в состав гидрофобно

атомы серы образуют две S S связи и не требуют

го ядра между субдоменом и телом молекулы.

иона цинка для стабилизации субдомена. Таким

Усиление связи субдомена с α5 и сокращение

образом, несмотря на схожесть формул, описы

расстояния между субдоменом и α4 повышают

вающих аминокислотные последовательности

вероятность узнавания β субъединицей сайта

субдоменов, наличие Cys2 Cys2 мотива не явля

связывания на SsoIF2γ. Следует отметить, что

ется достаточным доказательством присутствия

последовательности γ субъединиц эукариот во

цинкового пальца в структуре.

обще не содержат Cys2 Cys2 мотив, однако

вполне вероятно, что аналогичный участок их

сайта связывания с β субъединицей также ста

Финансирование. Работа выполнена в рамках

билизирован S S связями. Так, последователь

государственного задания

№ АААА А19

ность дрожжевой субъединицы содержит пять

119122490038 8.

цистеинов с минимальным расстоянием в 4 а.о.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

между ними, а последовательность человечес

сутствии конфликта интересов.

кой γ субъединицы - всего три цистеина. Таким

Соблюдение этических норм. Настоящая

образом, имеются все основания полагать, что

статья не содержит описания выполненных ав

этот субдомен выполняет только структурную

торами исследований с участием людей или ис

функцию. В пользу данного вывода свидетель пользованием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Zhang, W., Xu, C., Bian, C., Tempel, W., Crombet., L.,

homologue of elongation factors, EMBO J., 21, 1821 1832,

et al. (2011) Crystal structure of the Cys2 His2 type zinc

doi: 10.1093/emboj/21.7.1821.

finger domain of human DPF2б Biochem. Biophys. Res.

8. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E.

Commun., 413, 58 61, doi: 10.1016/j.bbrc.2011.08.043.

(2007) Structure of an archaeal heterotrimeric initiation

Cassandri, M., Smirnov, A., Novelli, F., Pitolli, C.,

factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP and the

Agostini, M., et al. (2017) Zinc finger proteins in health

GDP states, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 18445 18450,

and disease, Cell Death Discov.,

1707117082,

doi: 10.1073/pnas.0706784104.

doi: 10.1038/cddiscovery.2017.71.

9. Stolboushkina, E., Nikonov, S., Nikulin, A., Blasi, U.,

Marmorstein, R., Carey, M., Ptashne, M., and Harrisont,

Manstein, D. J., et al. (2008) Crystal structure of the intact

S. C. (1992) DNA recognition by GAL4: structure of a

archaeal translation initiation factor 2 demonstrates very

protein DNA complex, Nature,

356,

408414,

high conformational flexibility in the alpha and beta sub

doi: 10.1038/356408a0.

units, J. Mol. Biol., 382, 680 691, doi: 10.1016/j.jmb.2008.

Hall, T. M. (2005) Multiple modes of RNA recognition by

07.039.

zinc finger proteins, Curr. Opin. Struct. Biol., 15, 367 373,

10. Kyrpides, N. C., and Woese, C. R. (1998) Archaeal trans

doi: 10.1016/j.sbi.2005.04.004.

lation initiation revisited: the initiation factor 2 and

Mackay, J. P., and Crossley, M. (1998) Zinc fingers are

eukaryotic initiation factor 2B α β δ subunit families,

sticking together, Trends Biochem. Sci.,

23,

1 4,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3726 3730, doi: 10.1073/

doi: 10.1016/s0968 0004(97)01168 7.

pnas.95.7.3726.

Cho, S., and Hoffman, D. W. (2002) Structure of the β

11. Roll Mecak, A., Alone, P., Cao, C., Dever, T. E., and

subunit of translation initiation factor 2 from the archaeon

Burley, S. K. (2004) X ray structure of translation initiation

Methanococcus jannaschii: a representation of the

factor eIF2gamma: implications for tRNA and eIF2alpha

eIF2β/eIF5 family of proteins, Biochemistry, 41, 5730

binding, J. Biol. Chem., 279, 10634 10642, doi: 10.1074/

5742, doi: 10.1021/bio11984n.

jbc.M310418200.

Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2002) The

12. Sokabe, M., Yao, M., Sakai, N., Toya, S., and Tanaka, I.

large subunit of initiation factor aIF2 is a close structural

(2006) Structure of archaeal translational initiation factor 2

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021

1216

НИКОНОВ и др.

betagamma GDP reveals significant conformational

22.

Nikonov, O., Stolboushkina, E., Nikulin, A.,

change of the beta subunit and switch 1 region, Proc. Natl.

Hasenöhrl, D., Bläsi, U., et al. (2007) New insights into

Acad. Sci. USA, 103, 13016 13021, doi: 10.1073/pnas.

the interactions of the translation initiation factor 2 from

0604165103.

archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA,

13.

Gutierrez, P., Osborne, M. J., Siddiqui, N., Trempe, J. F.,

J. Mol. Biol., 373, 328 336, doi: 10.1016/j.jmb.2007.07.048.

Arrowsmith, C. and Gehring, K. (2004) Structure of the

23.

Nikonov, O., Kravchenko, O., Arkhipova, V.,

archaeal translation initiation factor aIF2β from

Stolboushkina, E., Nikonov, S., and Garber, M. (2016)

Methanobacterium thermoautotrophicum: implications for

Water clusters in the nucleotide binding pocket of the pro

translation initiation, Protein Sci.,

13,

659667,

tein aIF2g from the archaeon Sulfolobus solfataricus: pro

doi: 10.1110/ps.03506604.

ton transmission, Biochimie, 121, 197 203, doi: 10.1016/

14.

Gamsjaeger, R., Liew, C. K., Loughlin, F. E., Crossley, M.,

j.biochi.2015.11.029.

and Mackay, J. P. (2007) Sticky fingers: zinc fingers as pro

24.

Dubiez, E., Aleksandrov, A., Lazennec Schurdevin, C.,

tein recognition motifs, Trends Biochem Sci., 32, 63 70,

Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2015) Identification of a

doi: 10.1016/j.tibs.2006.12.007.

second GTP bound magnesium ion in archaeal initiation

15.

Erickso, F. L., Harding, L. D., Dorris, D. R., and

factor 2, Nucleic Acids Res., 43, 2946 2957, doi: 10.1093/

Hanning, E. M. (1997) Functional analysis of homologs of

nar/gkv053.

translation initiation factor 2 γ in yeast, Mol. Gen. Genet.,

25.

Nikonov, O., Kravchenko, O., Nevskaya, N.,

253, 711 719, doi: 10.1007/s004380050375.

Stolboushkina, E., Garber, M., and Nikonov, S. (2019)

16.

Donahue, T. F., Cigan, A. M., Pabich, E. K., and

The third structural switch in the archaeal translation initi

Valavicius, B. C. (1988) Mutations at a Zn(II) finger motif

ation factor 2 (aIF2) molecule and its possible role in the

in the yeast eIF 2 β gene alter ribosomal start site selection

initiation of GTP hydrolysis and the removal of aIF2 from

during the scanning process, Cell,

54,

621632,

the ribosome, Acta Cryst. D Biol. Crystallogr., 75, 392 399,

doi: 10.1016/s0092 8674(88)80006 0.

doi: 10.1107/S2059798319002304.

17.

Huang, H. K., Yoon, H., Hanning, E. M., Donahue, T. F.

26.

Schmitt, E., Panvert, M., Lazennec Schurdevin, C.,

(1997) GTP hydrolysis controls stringent selection of the

Coureux, P. D., Perez, J., et al. (2012) Structure of the

AUG start codon during translation initiation in

ternary initiation complex aIF2 GDPNP methionylated

Saccharomyces cerevisiae, Genes Dev., 11, 2396 2413,

initiator tRNA, Nat. Struct. Mol. Biol., 19, 450 454,

doi: 10.1101/gad.11.18.2396.

doi: 10.1038/nsmb.2259.

18.

Castilho Valavicius, B., Thompson, G. M., and Donahue,

27.

Gutierrez, P., Collet Matillon, S., Arrwsmith, C., and

T. F. (1992) Mutation analysis of the Cys X2 Cys X19

Gehring, K. (2002) Zinc is required for structural stability

Cys X2 Cys motif in the β subunit of eukaryotic transla

of the C terminus of archaeal translation initiation factor

tion initiation factor 2, Gene Expr., 2, 297 309.

aIF2β, FEBS Lett., 517, 155 158, doi: 10.1016/s0014

19.

Nikonov, O., Stolboushkina, E., Arkhipova, V.,

5793(02)02610 8.

Kravchenko, O., Nikonov, S., and Garber, M. (2014)

28.

Coureux, P. D., Lazennec Schurdevin, C., Monestier, A.,

Conformational transitions in the γ subunit of the archaeal

Larquet, E., Cladiere, L., et al. (2016) Cryo EM study of

translation initiation factor 2, Acta Crystallogr. D Biol.

start codon selection during archaeal translation initiation,

Crystallogr., 70, 658 667, doi: 10.1107/S1399004713032240.

Nat. Commun., 7, 13366 13375, doi: 10.1038/ncomms13366.

20.

Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E.

29.

Laurino, J. P., Thompson, G. M., Pacheco, E., Castilho,

(2006) Structural switch of the gamma subunit in an

B. A.(1999) The β subunit of eukaryotic translation initia

archaeal aIF2alpha gamma heterodimer, Structure, 14,

tion factor 2 binds mRNA through the lysine repeats and a

119 128, doi: 10.1016/j.str.2005.09.020.

region comprising the C2 C2 motif, Mol. Cell Biol., 19,

21.

Jones, T. A., Zou, J. Y., Cowan, S. W., and Kjeldgaard, M.

173 181, doi: 10.1128/mcb.19.1.173.

(1991) Improved methods for building protein models in

30.

Berchtold, H., Reshetnikova, L., Riser, C. O., Schirmer,

electron density maps and the location of errors in these

N. K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993) Crystal structure

models, Acta Crystallogr. A Found. Adv., 47, 110 119,

of active elongation factor Tu reveals major domain rearrange

doi: 10.1107/s0108767390010224.

ments, Nature, 365, 126 132, doi: 10.1038/365126a0.

STRUCTURE AND FUNCTION OF ARCHAEAL TRANSLATION INITIATION

FACTOR 2 FRAGMENTS CONTAINING Cys2 Cys2 MOTIVES

O. S. Nikonov*, N. A. Nevskaya, M. B. Garber, and S. V. Nikonov

Institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences,

142290 Pushchino, Moscow Region, Russia; e*mail: alik@vega.protres.ru

Heterotrimeric (αβγ) translation initiation factor 2 of archaea and eukaryotes (a/eIF2) supplies the P site of the ribo

some with the initiation tRNA. Its two subunits (β and γ) contain the Cys2 Cys2 motif, which in the presence of zinc

ions is capable of forming a stable structure of zinc finger. In this work, a comparative analysis of fragments, contain

ing Cys2 Cys2 motifs, of aIF2β and aIF2γ structures from different organisms and their environment in crystals was

carried out. Based on the data obtained, a conclusion was made about the different conformation and role of these

fragments in β and γ subunits of aIF2.

Keywords: translation initiation factor 2, Sulfolobus solfataricus, crystal structure, Zn finger, Cys2 Cys2 motif

БИОХИМИЯ том 86 вып. 8 2021