БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 10, с. 1447 - 1458

УДК 541.14

СВОЙСТВА МУТАНТНЫХ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ

РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ПУРПУРНОЙ БАКТЕРИИ

Cereibacter sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ M206 Ile → Gln

ФИЦ ПНЦБИ РАН, Институт фундаментальных проблем биологии РАН,

142290 Пущино, Московская обл., Россия; электронная почта: vsyulya@mail.ru

Поступила в редакцию 09.06.2022

После доработки 14.08.2022

Принята к публикации 14.08.2022

В структуре фотосинтетического реакционного центра (РЦ) пурпурной несерной бактерии Cereibacter

sphaeroides консервативный аминокислотный остаток Ile-M206 расположен вблизи димера бактерио-

хлорофилла Р и мономерного бактериохлорофилла В_А, являющихся первичным донором и ближай-

шим акцептором электрона соответственно. Непосредственная близость Ile-M206 к С2-ацетильной

группе бактериохлорофилла Р_В, гидроксильной группе Tyr-M210, С9-кето-группе бактериохлоро-

филла В_А, а также к молекуле воды вблизи этой группы позволяет использовать данный сайт для му-

тагенеза с целью исследования механизмов первичных фотохимических процессов в РЦ. Ранее было

показано, что внесение аминокислотного замещения Ile → Glu в положении М204 (аналог положе-

ния М206 в РЦ C. sphaeroides) в РЦ близкородственной пурпурной несерной бактерии Rhodobacter

capsulatus заметно повлияло на кинетику образования состояния с разделенными зарядами Р⁺Н_–,

а замена Ile M204 на Gln привела к потере бактериохлорофилла В_А из структуры комплекса. В на-

шей работе показано, что одиночная I(M206)Q и двойная мутация I(M206)Q + F(M208)A в РЦ

C. sphaeroides не приводят к изменению пигментного состава комплекса и существенно не влияют на

редокс-потенциал первичного донора электрона. В то же время замещение Ile M206 на Gln повлияло

на положение и амплитуды полос поглощения бактериохлорофиллов РЦ, привело к увеличению вре-

мени жизни возбужденного состояния первичного донора электрона Р* c 3,1 пс до ~22 пс и снижению

квантового выхода образования состояния P⁺Q_– до ~60%, что указывает на значительные измене-

ния пигмент-белковых взаимодействий в окружении первичного донора Р и ближайшего акцептора

электрона В_А. Также было отмечено снижение устойчивости мутантных РЦ к тепловой денатурации,

более выраженное для РЦ с двойным замещением I(M206)Q + F(M208)A и обусловленное, по-види-

мому, нарушением плотной упаковки белка вблизи бактериохлорофиллов Р_В и В_А. Обсуждаются воз-

можные причины различного влияния одинаковых мутаций на свойства двух высокогомологичных

РЦ из близкородственных пурпурных несерных бактерий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: реакционный центр фотосинтеза, Rhodobacter capsulatus, Cereibacter sphaeroides, бак-

териохлорофилл, пурпурные несерные бактерии, фотохимическое разделение зарядов, квантовый выход

разделения зарядов, пигментный состав, редокс-потенциал, первичный донор электрона, термостабиль-

ность мембранных белков.

DOI: 10.31857/S0320972522100104, EDN: BCUNMI

ВВЕДЕНИЕ

удобной моделью для изучения механизмов

преобразования световой энергии в хими-

Фотосинтетические реакционные центры

ческую энергию разделенных зарядов. К на-

пурпурных бактерий (пб-РЦ), относительно

стоящему времени наиболее изучены РЦ из

более просто организованные структурные

Blastochloris viridis, Rhodobacter sphaeroides (далее

аналоги фотосистемы-2 высших растений, циа-

будет использовано новое название Cereibacter

нобактерий и водорослей, многие годы служат sphaeroides [1]) и Rhodobacter capsulatus. Про-

Принятые сокращения: БФео - бактериофеофитин; БХл - бактериохлорофилл; ДТ - дикий тип; ЛДАО - детергент

лаурилдиметиламиноксид; пб-РЦ - реакционные центры пурпурных бактерий; ВА и ВB - мономерные бактериохлоро-

филлы; НА и НВ - мономерные бактериофеофитины; P - димер бактериохлорофилла; РА и РВ - бактериохлорофиллы

димера P; QA и QВ - убихиноны.

* Адресат для корреспонденции.

1447

1448

ФУФИНА и др.

странственные структуры двух первых РЦ рас-

нокислотных остатков играет важную роль в

шифрованы с высоким разрешением [2, 3], а

процессе фотохимического разделения заря-

для РЦ Rba. capsulatus детальная структура пока

дов [6]. К таким остаткам относится, в частно-

не установлена, но, как полагают, она в це-

сти, Tyr-M210, расположенный вблизи димера

лом сходна со структурой РЦ C. sphaeroides [4].

БХл Р и мономерного БХл В_А. Установлено, что

Трансмембранный пигмент-белковый ком-

при передаче электрона от Р* на БХл В_А изме-

плекс РЦ C. sphaeroides состоит из трех субъ-

нение конформации гидроксильной группы

единиц (L, M и Н) и десяти кофакторов, инте-

Tyr-M210 приводит к понижению уровня энер-

грированных в мембрану, - четырех молекул

гии состояния с разделенными зарядами Р⁺В_–

бактериохлорофилла (БХл), двух молекул бак-

и, таким образом, способствует стабилиза-

териофеофитина (БФео) Н_А и Н_В, двух хино-

ции этого короткоживущего состояния [7, 8].

нов Q_A и Q_В, молекулы каротиноида и атома

К существенным компонентам структуры РЦ

негемового железа. Кофакторы организованы

относятся также молекулы воды в гидрофоб-

в две трансмембранные цепи переноса элек-

ной части комплекса. Так, было показано, что

трона (А и В), расположенные симметрично

кристаллографически определяемая молеку-

относительно оси симметрии 2-го порядка [4]

ла воды вблизи С9-кето-группы БХл В_А (в ли-

(рис. 1, а). Известно, что в РЦ пурпурных бак-

тературе нередко обозначаемая как «вода-А»)

терий только одна из цепей переноса электро-

необходима для эффективного переноса элек-

на, А-цепь, является функционально актив-

трона с Р* на В_А. При ее отсутствии время жизни

ной. Два БХл, Р_А и Р_В, на периплазматической

состояния Р* в РЦ C. sphaeroides повышалось в

стороне мембраны образуют димер Р, выпол-

8 раз [9]. Показано, что в процессе образования

няющий роль первичного донора электрона.

состояния Р⁺В_– формируется водородная связь

Под воздействием света в РЦ инициируется

между водой-А и С9-кето-группой БХл В_А [9,

серия быстрых трансмембранных реакций пе-

10]. Предполагается, что вода-А входит в це-

реноса электрона, сопровождающихся образо-

почку полярных атомов, участвующих в пере-

ванием состояний с разделенными зарядами.

носе электрона от возбужденного донора элек-

Квантовый выход фотоиндуцированного раз-

трона Р* на ближайший акцептор БХл В_А [11].

деления зарядов в пб-РЦ близок к 100% [5].

Несмотря на значительный объем инфор-

К настоящему времени установлено, что

мации, накопленной к настоящему време-

белок пб-РЦ не только удерживает кофакторы

ни в отношении влияния белкового окру-

внутри мембраны, но также участвует в регу-

жения на свойства кофакторов и процессы

ляции их спектральных и окислительно-вос-

переноса электрона и протонов в пб-РЦ,

становительных свойств. Кроме того, ряд ами-

вопрос о механизмах наиболее быстрых

Рис. 1. Структура реакционного центра C. sphaeroides (PDB ID 3v3y) (а). L - L-субъединица; М - М-субъединица;

Н - Н-субъединица; P - димер БХл; ВА и ВB - мономерные БХл; НА и НВ - мономерные БФео; QA и QВ - убихиноны;

car - каротиноид. б - Белковое окружение бактериохлорофиллов РВ и ВА в структуре РЦ дикого типа (PDB ID 3v3y).

Показано расположение Ile-M206, Phe-M208, Tyr-M210, воды-А, фрагментов α-спиралей D и Е M-субъединицы

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР C. sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ I(M206)Q

1449

начальных этапов разделения зарядов остается

олигонуклеотидные праймеры, как описа-

предметом дискуссий.

но ранее [18]. Путем определения последова-

Внесение направленных аминокислотных

тельности ДНК ПЦР-фрагмента было под-

замещений в окружение кофакторов с целью

тверждено присутствие мутаций в гене pufM,

изменения пигмент-белковых и белок-белко-

кодирующем М-субъединицу РЦ. Модифици-

вых взаимодействий служит одним из подходов

рованный puf-оперон был клонирован в шаттл-

к исследованию механизмов фотосинтетиче-

вектор pRK-415

[19], полученная плазмида

ского переноса электрона в пб-РЦ [6]. В част-

с помощью конъюгации была перенесена в

ности, в ряде работ внимание было акцен-

штамм С. sphaeroides DD13 [20]. Клетки полу-

тировано на высококонсервативном остатке

ченных рекомбинантных штаммов синтезиро-

Ile-M206, расположенном в непосредственной

вали РЦ с заданными мутациями и не содержали

близости от БХл Р_В, С9-кето-группы моно-

светособирающих комплексов [18]. В качестве

мерного БХл В_А, Tyr-M210 и воды-А (рис. 1, б).

контрольного реакционного центра псевдо-ди-

Было показано, что в РЦ C. sphaeroides замены

кого типа (ДТ) использовали РЦ, выделенные

Ile-M206 на His и Tyr существенно повлияли

из штамма С. sphaeroides DD13, который со-

на оптические характеристики комплекса в

держал производную pRK-415, несущую немо-

области поглощения димера Р и мономерных

дифицированные копии генов puf-LMX [18].

БХл [12, 13]. Кроме того, было отмечено значи-

С. sphaeroides выращивали на среде Хатнера [21]

тельное падение квантового выхода образова-

в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл) и кана-

ния состояния Р⁺Q_– и снижение количества РЦ

мицина (5 мкг/мл). Реакционные центры вы-

I(M206)H после его выделения из мембран и

деляли методом ионообменной и аффинной

очистки с использованием детергента лаурил-

хроматографии, как описано ранее [22, 23].

диметиламиноксида (ЛДАО) [12, 14]. Было вы-

Для солюбилизации комплексов из мембран

сказано предположение, что внесение поляр-

использовали детергент ЛДАО. Смену детер-

ного остатка гистидина в сайт М206 в область

гента после очистки РЦ осуществляли, как

контакта L- и М-субъединиц могло повлиять

описано ранее [24]. Очищенные РЦ растворяли

на связывание кристаллографически опреде-

в 20 мМ Tris-HCl-буфере (pH 8,0), содержащем

ляемого гликолипида [15] и, таким образом,

0,2% холата натрия (ТХ) или 0,6% н-октил-глю-

отразиться на стабильности структуры РЦ [14].

козида. Термостабильность РЦ исследовали

В РЦ Rba. capsulatus положение М204 соответ-

при 48 и 55 °С в течение 60 мин путем регистра-

ствует положению М206 в РЦ С. sphaeroides.

ции термозависимых изменений амплитуды по-

В работе Saggu et al. [16] показано, что мутация

лосы Q_Y В, как описано ранее [24]. Измерение

I(М204)E повлияла на подвижность ОН-груп-

спектров поглощения производили на спек-

пы Tyr-М210, а замена I(M204)Q привела к по-

трофотометре Shimadzu UV-1800 («Shimadzu»,

тере БХл В_А из структуры комплекса [17]. Полу-

Япония) при комнатной температуре. К образ-

чение стабильных мутантных РЦ C. sphaeroides

цам добавляли аскорбат натрия в концентра-

с аналогичными свойствами представляет ин-

ции 1 мМ для поддержания первичного донора

терес для изучения механизмов начальных эта-

электрона в восстановленном состоянии. Экс-

пов фотохимического процесса в этом РЦ.

тракцию и анализ пигментов проводили мето-

В представленной работе были получены му-

дом, описанным ранее [25], ошибку измерений

тантные РЦ C. sphaeroides с одиночным I(M206)Q

определяли методом стандартного отклонения.

и двойным I(M206)Q + F(M208)A замещениями,

Величину среднеточечного потенциала Р/Р⁺

исследованы их спектральные и фотохимические

определяли с помощью электрохимическо-

свойства, пигментный состав и термостабиль-

го титрования изолированных РЦ, используя

ность. Мутация М208 Phe → Ala была внесена

феррицианид калия в качестве окислителя и

для повышения гомологии белкового окружения

аскорбат натрия в качестве восстановителя,

Р и В_А в РЦ C. sphaeroides и Rba. capsulatus. Также

как описано ранее [25]. Кинетики изменений

авторами обсуждаются возможные причины раз-

поглощения с фемтосекундным разрешением

личного влияния одинаковых мутаций на свой-

в РЦ измеряли на установке, описанной ра-

ства и пигментный состав гомологичных РЦ из

нее [26]. Импульсы света длительностью ~35 фс

пурпурных несерных бактерий.

и частотой повторения 20 Гц получали с по-

мощью титан-сапфирового лазера MaiTai SP

(«Spectra-Physics», США) и регенеративного

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

усилителя Spitfire Ace («Spectra-Physics»). Энер-

гию выходных импульсов Spitfire Ace ослабляли

Направленные аминокислотные заме-

и использовали для накачки параметрического

щения в РЦ вносили методом ПЦР через

усилителя OPA800 CF («Spectra-Physics») с це-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

1450

ФУФИНА и др.

лью получения импульсов возбуждения на дли-

поглощению молекул БФео. В коротковолно-

не волны 865 нм (вторая гармоника холостого

вой области спектра полоса при 599 нм отра-

пучка). Небольшую часть энергии импульсов из

жаeт Q_Х-переходы в молекулах БХл. При 532 нм

регенеративного усилителя использовали для

расположен максимум полосы поглощения мо-

генерации континуума в кювете с водой толщи-

лекул БФео активной и неактивной цепей пе-

ной 5 мм в качестве импульсов зондирования.

реноса электрона, Q_Х H. Плечо в районе 500 нм

После кюветы с образцом спектры зонди-

принадлежит молекуле каротиноида. В корот-

рующих импульсов измеряли с помощью

коволновой области спектра поглощения изо-

CCD-камеры Pixis

400BR и спектрографа

лированных РЦ ДТ расположена полоса Соре с

SpectraPro 2300i («Princeton Instruments», США)

максимумом при 363 нм и плечом на длинновол-

в области длин волн 750-1100 нм. Разностные

новом склоне полосы при 390 нм, отражающая

спектры получали путем усреднения 500 спек-

поглощение всех бактериохлоринов РЦ (рис. 2).

тров для каждой задержки времени. Возбужда-

В спектре поглощения мутантных РЦ с оди-

ющий луч с энергией ~1-5 мкДж фокусировали

ночным и двойным замещениями наблюдаются

на образец так, чтобы выцветание первичного

сходные изменения - заметное снижение ам-

донора электрона составляло ~10%. Измере-

плитуды полосы Q_Y Р и коротковолновый сдвиг

ния проводили при комнатной температуре.

этой полосы на 7 нм. Кроме того, отмечается

Относительную поляризацию импульсов воз-

снижение амплитуды и длинноволновый сдвиг

буждения устанавливали параллельно измери-

на 4 нм полосы Q_Y В вблизи 800 нм (рис. 2).

тельному импульсу. Визуализацию структуры

Сходство спектров поглощения РЦ I(M206)Q

реакционного центра и моделирование амино-

и РЦ I(M206)Q + F(M208)A свидетельствует

кислотных замещений проводили с помощью

о том, что наблюдаемые изменения связаны с

программы PyMol [27].

одиночной мутацией I(M206)Q, а замещение

F(M208)A не оказало существенного влияния

на спектральные свойства РЦ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пигментный анализ показал, что в му-

тантных РЦ соотношение БХл/БФео такое

В спектре поглощения изолированных

же, как и в РЦ ДТ (таблица). Эти результаты

РЦ ДТ, представленном на рис. 2, длинноволно-

свидетельствуют о том, что аминокислотное

вая полоса Q_Y Р с максимумом при 865 нм при-

замещение M206 Ile → Gln в РЦ C. sphaeroides

надлежит поглощению димера БХл Р, полоса

не приводит к удалению мономерного БХл В_А

поглощения с максимумом при 804 нм припи-

из структуры комплекса, как это наблюдалось

сывается поглощению мономерных БХл (Q_Y В),

ранее в РЦ Rba. capsulatus с аналогичной мута-

а также высокоэнергетическому переходу в мо-

цией I(M204)Q [17].

лекуле первичного донора электрона. Полоса

Значение среднеточечного потенциа-

Q_Y H с максимумом при 760 нм соответствует

ла Р/Р⁺ для РЦ ДТ составило 490 ± 8 мВ,

Рис. 2. Спектры поглощения изолированных РЦ C. sphaeroides дикого типа (^__), I(M206)Q (⋅⋅⋅) и I(M206)Q + F(M208)A (---),

измеренные при комнатной температуре. Спектры нормированы по полосе QY H при 760 нм

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР C. sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ I(M206)Q

1451

Величина среднеточечного потенциала Р/Р⁺ и пигмент-

На рис. 3 и 4 показаны результаты исследо-

ный анализ РЦ C. sphaeroides

вания динамики разделения зарядов в РЦ ДТ и

I(M206)Q, полученные методом накачки-зон-

РЦ

Em P/P⁺, мВ

БХл/БФео

дирования. Целью данного исследования было

выяснение влияния замещения изолейцина

ДТ

490 ± 8

2,00 ± 0,1

на глютамин в позиции M206 на время жизни

возбужденного состояния первичного доно-

I(M206)Q

470 ± 5

1,98 ± 0,1

ра электрона и квантовый выход образования

состояния с разделенными зарядами P⁺Q_–

I(M206)Q + F(M208)A

475 ± 5

1,98 ± 0,1

в РЦ I(M206)Q.

На рис. 3 приведена кинетика затухания

стимулированного излучения из возбужденно-

для РЦ I(M206)Q - 470 ± 5 мВ, для РЦ

го состояния при 930 нм в РЦ ДТ (рис. 3, от-

I(M206)Q + F(M208)A - 475 ± 5 мВ (таблица).

крытые символы (○)) и РЦ I(M206)Q (рис. 3,

Близкие, в пределах ошибки измерения, зна-

закрытые символы (●)). В РЦ ДТ кинетика

чения окислительного потенциала Р в двух му-

стимулированного излучения состояния Р*

тантных РЦ указывают на то, что обнаруженное

удовлетворительно описывается экспонентой с

небольшое понижение величины E_m P/P⁺ яв-

временем жизни 3,1 ± 0,03 пс. В РЦ I(M206)Q

ляется результатом внесения замещения M206

кинетика стимулированного излучения со-

Ile → Gln. Изменение величины E_m P/P⁺ в сторо-

хранила экспоненциальный характер, но вре-

ну понижения позволяет также сделать заклю-

мя жизни увеличилось до 22 ± 1,4 пс. В реак-

чение, что мутация I(M206)Q не привела к об-

ционных центрах дикого типа время жизни

разованию водородной связи между Gln-M206

возбужденного первичного донора электро-

и С2-ацетильной группой БХл Р_В, входящей в

на с заблокированным переносом электрона,

π-электронную систему макроцикла. На осно-

вании того, что величины E_m P/P⁺ в РЦ ДТ и му-

тантных РЦ близки, можно предположить, что

снижается до

движущая сила фотохимической реакции ΔG в

генетически модифицированных комплексах

также существенно не изменилась. Учитывая,

когда канал переноса электрона открыт. Это по-

что замещение F(M208)A не оказало влияния

зволяет оценить как константу скорости переноса

на спектральные свойства и окислительный

электрона от возбужденного первичного донора

потенциал Р, определение времени жизни Р* и

в активную цепь кофакторов, k_p ≈ 3,3 · 10^-13 (1/с),

квантового выхода образования состояния P⁺Q_–

так и квантовый выход разделения зарядов,

были проведены только для РЦ с одиночным за-

мещением I(M206)Q.

Рис. 3. Кинетика стимулированного излучения при 930 нм для РЦ ДТ С. sphaeroides дикого типа (○) и РЦ I(M206)Q (●).

Сплошными линиями показана экспоненциальная аппроксимация кинетики изменений поглощения

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

1452

ФУФИНА и др.

В реакционных центрах мутанта I(M206)Q

в частности, рекомбинации зарядов состояний

увеличение времени жизни возбужденного пер-

P⁺B_– и P⁺H_–.

вичного донора электрона до

В литературе неоднократно отмечалась

относительно высокая стабильность РЦ пур-

пурных бактерий [28]. Также известно, что

должно приводить к уменьшению константы

некоторые аминокислотные замены могут

скорости переноса электрона от возбужденного

способствовать как ослаблению, так и укреп-

первичного донора в активную цепь кофакто-

лению структуры этого комплекса

[13,

29].

ров до k_p ≈ 4,2 · 10^-14 (1/с) и снижению кванто-

Влияние мутаций в положении М206, внесен-

вого выхода разделения зарядов до

ных в данной работе или описанных ранее для

РЦ I(M206)H [12] и РЦ I(M206)Y [13], на ста-

бильность структуры РЦ было исследовано ме-

Для оценки квантового выхода разделения

тодом регистрации термозависимых измене-

зарядов в РЦ мутанта РЦ I(M206)Q на рис. 4

ний амплитуды полосы Q_Y В при температуре

приведены разностные спектры поглощения,

48 °С [24]. В составе буфера для растворения РЦ

измеренные на отдельных задержках времени.

был использован детергент холат натрия, спо-

В РЦ ДТ (рис. 4, а) при импульсном возбужде-

собствующий стабилизации комплекса

[24].

нии первичный донор электрона переходит в

Сравнительное исследование показало, что

возбужденное состояние (кривая 1). К задержке

после 60 мин инкубирования в данных усло-

времени ~20 пс происходит переход возбужден-

виях амплитуда Q_Y-полосы мономерных БХл

ного Р^* в состояние P⁺H_– с квантовым выходом

при 804 нм в РЦ I(M206)Y уменьшалась ме-

0,99 (кривая 2). На задержке времени 1600 пс

нее, чем на 5%, как и в РЦ ДТ, в то время как

можно наблюдать состояние P⁺Q_– (кривая 3).

в РЦ I(M206)Q она уменьшалась на ~10%. Наи-

В РЦ мутанта I(M206)Q (рис. 4, б) при той же

меньшей устойчивостью к температурной де-

концентрации возбужденного первичного до-

натурации обладали РЦ I(M206)Q + F(M208)A

нора (кривая 1) состояние P⁺H_– образуется на

и I(M206)Н, их инкубирование при 48 °С в те-

задержке времени 260 пс с квантовым выходом

чение 60 мин приводило к 20%-ному сниже-

~0,6 (кривая 2). К задержке времени 1600 пс

нию амплитуды полосы Q_Y В (рис. 5). Эти ре-

в РЦ I(M206)Q разностный спектр поглощения

зультаты согласуются с ранее полученными

отражает состояние P⁺Q_– (кривая 3).

данными о дестабилизирующем влиянии заме-

Разница в ожидаемой величине квантового

щения I(M206)Н на структуру РЦ C. sphaeroides,

выхода (92%) и фактической величине кван-

более выраженном в присутствии детерген-

тового выхода (60%) образования состояния

та ЛДАО [14]. Таким образом, показано, что

P⁺Q_– в РЦ I(M206)Q может быть обусловлена

двойная мутация I(M206)Q + F(M208)A, целью

изменением констант скорости как прямых,

которой было повышение гомологии белкового

так и обратных реакций переноса электрона,

окружения молекул Р и В_А в РЦ C. sphaeroides

Рис. 4. Разностные «свет-минус-темнота» спектры поглощения, измеренные на задержках времени 0,3 пс (1), 20 пс (2)

и 1600 пс (3) для РЦ ДТ С. sphaeroides (а) и на задержках времени 0,3 пс (1), 260 пс (2) и 1600 пс (3) для РЦ I(M206)Q (б)

при возбуждении в QY полосу Р

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР C. sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ I(M206)Q

1453

Рис. 5. Изменение поглощения в QY B области в спектре РЦ дикого типа (

), I(M206)Q (▲), I(M206)Q + F(M208)A (■),

I(M206)Y (Δ) и I(M206)H (□) пурпурной бактерии C. sphaeroides, измеренные в течение 60 мин инкубации при 48 °С

в TХ-буфере

и Rba. capsulatus, оказала большее дестабили-

разделения зарядов в мутантных РЦ. Так, пока-

зирующее влияние на структуру комплекса, по

зано, что мутация I(M204)E в РЦ Rba. capsulatus

сравнению с одиночной мутацией I(M206)Q.

привела к образованию водородной связи меж-

Результаты, приведенные на рис. 5 позволяют

ду внесенным остатком Glu и гидроксильной

предположить, что замещение M206 Ile → Tyr не

группой Tyr-M210, что повлияло на кинетики

повлияло на термостабильность РЦ или даже

образования состояния Р⁺Н_– [16].

привело к небольшой стабилизации структуры

В данной работе показано, что аминокис-

комплекса, например, как было ранее показа-

лотное замещение I(M206)Q заметно повлияло

но для РЦ с замещением M197 Phe → His [29].

на спектральные свойства димера Р и моно-

Однако при нагревании в буфере с детергентом

мерных БХл. Имеющиеся в литературе данные

н-октил-глюкозидом при 48 и 55 °С РЦ I(M206)Y

свидетельствуют о том, что различные факторы

проявляли значительно меньшую устойчи-

могут влиять на положение и амплитуду поло-

вость к термальной денатурации по сравнению

сы Q_Y Р. Среди них ориентация С2-ацетильной

с РЦ дикого типа (данные не приведены). Та-

группы БХл, расстояние между макроцикла-

ким образом, относительно высокая термоста-

ми в димере, электростатическое окружение

бильность структуры мутантных РЦ I(M206)Y,

и другие [30, 31]. Согласно полученным дан-

очевидно, объясняется стабилизирующим дей-

ным, окислительный потенциал Р, и, очевид-

ствием детергента холата натрия, показанным

но, ориентация С2-ацетильной группы БХл Р_В

ранее [24].

в мутантных РЦ не претерпели значительных

изменений. Gln, как и Ile, является нейтраль-

ной аминокислотой, поэтому в результате мута-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ции I(M206)Q изменения электростатического

окружения Р также не ожидается. Таким обра-

Как упоминалось во введении, Ile-М206

зом, причина спектральных изменений в обла-

расположен в непосредственной близости от

сти поглощения димера БХл остается неясной.

молекул предполагаемых участников первого

В связи с перекрыванием полос Q_Y B и Q_Y P

этапа разделения зарядов (рис. 1, б). Моделиро-

уменьшение поглощения в области Q_Y B вблизи

вание аминокислотного замещения I(M206)Q с

800 нм в мутантных РЦ, по-видимому, связано

помощью программы PyMol показывает 16 воз-

со снижением амплитуды полосы Q_Y P. Учиты-

можных положений боковой группы Gln в по-

вая расположение сайта мутации, длинновол-

ложении М206. В зависимости от положения

новый сдвиг и снижение амплитуды полосы

этой группы замещение М206 Ile → Gln потен-

поглощения Q_Y В может свидетельствовать об

циально может изменить взаимодействия лю-

образовании новых взаимодействий БХл В_А с

бой из перечисленных молекул с их окружени-

белком. Как одно из предположений, в мутант-

ем, что должно повлиять на квантовый выход

ных РЦ боковая группа Gln-М206 могла обра-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

1454

ФУФИНА и др.

зовать водородную связь с близкой к месту му-

других пурпурных бактерий [33], закристал-

тации С9-кето-группой БХл В_А. В этом случае

лизовать этот комплекс и расшифровать его

перенос электрона от Р* на В_А через цепочку

структуру до настоящего времени не удалось.

полярных связей, о котором говорилось выше,

В работе Foloppe et al. [34] была сделана по-

окажется затруднен. Как показано в данной ра-

пытка гомологического моделирования струк-

боте, в мутантных РЦ I(M206)Q время жизни

туры РЦ Rba. capsulatus на основе известных

возбужденного состояния первичного донора

к тому времени структур пурпурных бактерий

электрона Р* составляет ~22 пс, что свидетель-

B. viridis и C. sphaeroides с разрешениями 2,3 Å

ствуют о значительном замедлении переноса

и 2,8 Å соответственно. Относительно невы-

электрона с Р* на БХл В_А и согласуется с этим

сокое разрешение структуры РЦ C. sphaeroides,

предположением.

используемой для гомологического моделиро-

Ранее аналогичное

8-кратное замедле-

вания, значительно ограничивало возможно-

ние затухания состояния Р* наблюдали в РЦ

сти этого подхода. Тем не менее были обнару-

C. sphaeroides с замещением G(M203)L

[9].

жены небольшие, но достоверные различия

Структура этого РЦ показала, что в результате

во взаимной ориентации мономерных БХл и

мутации вода-А оказалась стерически вытес-

БФео В-цепи между РЦ C. sphaeroides и моде-

нена боковой группой лейцина М203. В спек-

лью РЦ Rba. capsulatus [34]. Значимых различий

трах поглощения РЦ G(M203)L наблюдали не-

в белковом окружении кофакторов активной

большой коротковолновый сдвиг полосы Q_Y P

цепи А, выходящих за пределы ошибки разре-

без уменьшения дипольной силы этой полосы,

шения структуры РЦ C. sphaeroides, найдено

а также коротковолновый сдвиг полосы Q_Y B

не было.

без снижения ее амплитуды [9]. Поскольку

До недавнего времени пурпурные несерные

спектры поглощения РЦ I(M206)Q, описан-

бактерии C. sphaeroides и Rba. capsulatus отно-

ные в данной работе, и РЦ G(M203)L, опи-

сились к одному роду Rhodobacter [1], а их РЦ

санного ранее [9], существенно отличаются в

считались высокогомологичными комплекса-

области полосы Q_Y B (рис. 2), можно предполо-

ми [35]. В нашей работе показано, что свойства

жить, что характер изменений межмолекуляр-

РЦ C. sphaeroides с замещением I(M206)Q суще-

ных взаимодействий, вызванный внесением

ственно отличаются от свойств мутантных РЦ

Gln-М206, отличается от изменений, вызван-

близкородственной бактерии Rba. capsulatus с

ных замещением Gly-M203 на Leu. Для уточ-

аналогичной заменой I(M204)Q, в которых эта

нения деталей этих взаимодействий необходи-

мутация приводила к утере БХл В_А из структу-

ма информация о пространственной структуре

ры РЦ [17]. Эти результаты являются достаточ-

РЦ I(M206)Q.

но неожиданными, если учитывать высокую

Для РЦ I(M206)Q было отмечено умень-

консервативность Ile-M206 в РЦ пурпурных

шение квантового выхода образования состоя-

бактерий, значительное сходство общей архи-

ния с разделенными зарядами P⁺Q_– до ~60% от

тектуры двух пигмент-белковых комплексов,

величины квантового выхода в РЦ ДТ (рис. 4).

одинаковый состав кофакторов, особенности

Наряду с предположением о том, что дан-

взаимодействия хромофоров с их белковым

ная мутация могла повлиять на скорости как

окружением [36], а также высокую (77%) общую

прямых, так и обратных реакций переноса

степень гомологии белковых последовательно-

электрона (см. раздел «Результаты исследо-

стей этих РЦ [35]. Особенно высока гомоло-

вания»), также можно ожидать, что внесе-

гия белкового окружения бактериохлорофил-

ние аминокислотного замещения в участок

лов функционально активных цепей переноса

D-спирали М-субъединицы вблизи кофакто-

электрона, достигающая 96% для α-спирали D

ров активной цепи фотопереноса электрона

М-субъединиц РЦ.

могло привести к изменению динамики белка.

Предположение о возможных причинах

В недавней работе Dods et al. [32] были пока-

различного влияния замещения Ile → Gln в

заны заметные изменения конформаций E

аналогичных позициях М206 и М204 в РЦ

α-спирали L-субъединицы и D α-спирали

C. sphaeroides и Rba. capsulatus может быть сде-

М-субъединицы, происходящие в процес-

лано на основе экспериментальных данных,

се фотохимической реакции, и, по-видимо-

полученных ранее Wang et al. [37]. В этой ра-

му, связанные с эффективным протеканием

боте было проведено сравнение свойств изо-

этого процесса.

лированных РЦ четырех пурпурных бактерий,

Несмотря на то что генетическая систе-

включая C. sphaeroides и Rba. capsulatus. Были

ма для направленного мутагенеза и струк-

отмечены разные положения максимумов по-

турно-функциональных исследований РЦ

лос Q_Y P в спектре поглощения этих РЦ, раз-

Rba. capsulatus была получена раньше, чем для

ные положения максимумов полосы окислен-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР C. sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ I(M206)Q

1455

ного донора электрона Р⁺ при 1250 нм, а также

ной упаковки трансмембранного участка белка

отличия в дипольной силе этих полос. Кроме

вблизи бактериохлорофиллов Р и В_А, ослабле-

того, было показано различное влияние ион-

нию Ван-дер-Ваальсовых и гидрофобных взаи-

ных детергентов на положения максимумов

модействий в этой области и, как следствие,

полос Q_Y P в РЦ этих двух бактерий [37]. Од-

к снижению стабильности мутантных РЦ.

новременно в работе Rautter et al. [38] было

Следует также заметить, что 28 аминокислот-

показано, что электронная структура Р в

ных остатков D-спиралей М-субъединиц РЦ

мембраносвязанных и изолированных РЦ

C. sphaeroides и Rba. capsulatus отличаются толь-

C. sphaeroides была одинакова, тогда как в РЦ

ко одним остатком в положении М208 [35], и

Rba. capsulatus она менялась после выделения

этот сайт в РЦ C. sphaeroides является местом

этих пигмент-белковых комплексов из мем-

связывания гликолипида [15]. Можно предпо-

бран. Wang et al. [37] предположили, что РЦ

ложить существование различий во взаимо-

С. sphaeroides и Rba. capsulatus отличаются друг

действии двух РЦ с этим липидом, что также

от друга характером связывания и электроста-

могло послужить причиной дестабилизации

тического взаимодействия фосфолипидов мем-

РЦ C. sphaeroides после внесения замещения

браны с димером БХл и его окружением. По-

M208 Phe → Ala.

скольку сайт внесенной мутации М206/M204

Таким образом, в данной работе полу-

расположен непосредственно в белковом окру-

чен и охарактеризован новый мутантный РЦ

жении Р, мы предполагаем, что эти отличия

C. sphaeroides с аминокислотным замещени-

могли послужить причиной различного влия-

ем Ile → Gln в положении M206 вблизи моле-

ния аминокислотного замещения Ile → Gln на

кул БХл Р_В и В_А в активной цепи кофакторов.

свойства РЦ C. sphaeroides и Rba. capsulatus.

Показано, что данная мутация не приводит к

Также нельзя исключать существование от-

изменению пигментного состава комплекса,

личий в расстояниях между аминокислотным

но заметно влияет на спектральные свойства

остатком в положении М206/M204 и ближай-

кофакторов, близких к месту мутации, на вре-

шими кофакторами, которые могли послужить

мя жизни Р* и на квантовый выход разделения

причиной разных последствий аналогичного

зарядов, что, возможно, связано с образовани-

аминокислотного замещения и для выявления

ем новых межмолекулярных взаимодействий

которых требуется расшифровка структуры

в активной цепи кофакторов. Свойства РЦ

Rba. capsulatus.

C. sphaeroides и Rba. capsulatus с одинаковым

В данной работе также показано, что амино-

замещением Ile → Gln в аналогичных позициях

кислотные замещения I(M206)Q и I(M206)Q +

отличаются значительно, что, возможно, объ-

+ F(M208)A повлияли на устойчивость струк-

ясняется различиями во взаимодействиях этих

туры РЦ к повышенным температурам. Для

комплексов с липидами фотосинтетической

РЦ двойного мутанта снижение термоста-

мембраны.

бильности было более выражено, чем для РЦ

I(M206)Q. Одной из возможных причин изме-

нения стабильности мутантных РЦ может быть

Вклад авторов. Л.Г. Васильева - концеп-

повышение подвижности трансмембранной

ция и руководство работой; Т.Ю. Фуфина,

α-спирали D М-субъединицы РЦ (рис. 1, б) за

О.А. Третчикова, А.М. Христин, Р.А. Хаты-

счет уменьшения парциального молекулярного

пов - проведение экспериментов; Л.Г. Василье-

объема аминокислотных остатков в положени-

ва, Т.Ю. Фуфина, О.А. Третчикова, А.М. Хри-

ях М206 и М208 в результате внесения мутаций.

стин, Р.А. Хатыпов - обсуждение результатов

Так, замещение гидрофобного остатка Ile на

исследования; Л.Г. Васильева, Т.Ю. Фуфина,

полярный Gln приводит к локальному умень-

А.М. Христин, Р.А. Хатыпов - написание и ре-

шению объема остатка в положении M206

дактирование текста статьи.

на 11,7 см³/моль, а замещение гидрофобных

Финансирование. Работа выполнена в рам-

остатков Phe → Ala в положении M208 умень-

ках госзадания № 122041100204-3.

шает парциальный объем в данном участке

Благодарности. Авторы выражают благо-

на 38,6 см³/моль [39]. Таким образом, суммар-

дарность М.М. Леоновой за ее вклад в началь-

ное уменьшение парциального молекулярно-

ный этап работы.

го объема остатков М206 и М208 в D-спира-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

ли М-субъединицы за счет двойной мутации

отсутствии конфликта интересов.

I(M206)Q + F(M208)A составляет 50,3 см³/моль,

Соблюдение этических норм. Статья не со-

что сопоставимо с объемом небольшого ами-

держит описания каких-либо исследований с

нокислотного остатка. Можно ожидать, что

использованием людей и животных в качестве

такое изменение приводит к нарушению плот-

объектов.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

1456

ФУФИНА и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Hordt, A., Lopez, M. G., Meier-Kolthoff, J. P.,

sphaeroides reaction center, J. Biol. Chem.,

280,

Schleuning, M., Weinhold, L. M., et al.

(2020)

27155-27164, doi: 10.1074/jbc.M501961200.

Analysis of

1,000+ type-strain genomes sub-

10.

Robert, B., and Lutz, M.

(1988) Proteic events

stantially improves taxonomic classification of

following charge separation in the bacterial reaction

Alphaproteobacteria, Front. Microbiol.,

11,

468,

center: resonance Raman spectroscopy, Biochemistry,

doi: 10.3389/fmicb.2020.00468.

27, 5108-5114, doi: 10.1021/bi00414a024.

Wöhri, A. B., Wahlgren, W. Y., Malmerberg, E.,

11.

Yakovlev, A. G., Jones, M. R., Potter, J. A., Fyfe,

Johansson, L. C., Neutze, R., K et al. (2009) Lipidic

P. K., Vasilieva, L. G., et al. (2005) Primary charge

sponge phase crystal structure of a photosynthetic

separation between P* and B_A: electron-transfer

reaction center reveals lipids on the protein surface,

pathways in native and mutant GM203L bacterial

Biochemistry, 48, 9831-9838, doi: 10.1021/bi900545e.

reaction centers, Chem. Phys.,

319,

297-307,

Selikhanov, G., Fufina, T., Vasilieva, L., Betzel,

doi: 10.1016/j.chemphys.2005.08.018.

C., and Gabdulkhakov, A. (2020) Novel approaches

12.

Болгарина Т. И., Хатыпов Р. А., Васильева Л. Г.,

for the lipid sponge phase crystallization of the

Шкуропатов А. В., Шувалов В. А. (2004) Заме-

Rhodobacter sphaeroides photosynthetic reaction

щение изолейцина М206 на гистидин в

center, IUCrJ,

1084-1091, doi:

10.1107/

реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides

S2052252520012142.

приводит к изменению структуры молекулы

Komiya, H., Yeates, T. O., Rees, D. C., Allen,

бактериохлорофилла

специальной

пары,

J. P., and Feher, G. (1988) Structure of the reaction

Доклады Академии наук, 394, 265-268, doi: 10.1023/

center from Rhodobacter sphaeroides R-26 and 2.4.1:

b:dobi.0000017147.33235.b4.

symmetry relations and sequence comparisons

13.

Фуфина Т. Ю., Селиханов Г. К., Проскуряков И. И.,

between different species, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

Шувалов В. А., Васильева Л. Г. (2019) Свойства

85, 9012-9016, doi: 10.1073/pnas.85.23.9012.

реакционных центров Rhodobacter sphaeroides

Wraight, C. A., and Clayton, R. K.

(1974)

с аминокислотными замещениями Ile на Tyr в

The absolute quantum efficiency of bacteriochloro-

позициях L177 и М206, Биохимия, 5, 739-744,

phyll photooxidation in reaction centres of Rhodo-

doi: 10.1134/S0006297919050110.

pseudomonas sphaeroides, Biochim. Biophys. Acta, 333,

14.

Васильева Л. Г., Фуфина, Т. Ю., Габдулхаков, А. Г.,

246-260, doi: 10.1016/0005-2728(74)90009-7.

Шувалов, В. А.

(2015) Разные последствия

Леонова М. М., Фуфина Т. Ю., Шувалов В. А.,

одинаковых симметричных мутаций вблизи ди-

Васильева Л. Г. (2014) Исследование пигмент-

мера бактериохлорофилла в реакционном центре

белковых взаимодействий в фотосинтетическом

Rhodobacter sphaeroides. Биохимия,

80,

767-774,

реакционном центре пурпурных бактерий. Глава

doi: 10.1134/S0006297915060012.

в кн. Современные проблемы фотосинтеза, том 1

15.

Camara-Artigas, A., Brune, D., and Allen J. P. (2002)

(под ред. Аллахвердиева С. И., Рубина А. Б.,

Interactions between lipids and bacterial reaction

Шувалова В. А.), Ижевский Институт компьютер-

centers determined by protein crystallography, Proc.

ных исследований, Москва-Ижевск, с. 157-196.

Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11055-11060, doi: 10.1073/

Alden, R. G., Parson, W. W., Chu, Z. T., and

pnas.162368399.

Warshel, A. (1996) Orientation of the OH dipole

16.

Saggu, M., Carter, B., Zhou, X., Faries, K., Cegelski, L.,

of tyrosine (M)210 and its effect on electrostatic

et al. (2014) Putative hydrogen bond to tyrosine

energies in photosynthetic bacterial reaction centers,

M208 in photosynthetic reaction centers from

J. Phys. Chem.,

100,

16761-16770, doi:

10.1021/

Rhodobacter capsulatus significantly slows primary

jp961271s.

charge separation, J. Phys. Chem. B, 118, 6721-6732,

Yakovlev, A. G., Vasilieva, L. G., Shkuropatov, A. Ya.,

doi: 10.1021/jp503422c.

Bolgarina, T. I., Shkuropatova, V. A., et al. (2003)

17.

Carter, B., Boxer, S. G., Holten, D., and

Mechanism of charge separation and stabilization of

Kirmaier, C. (2012) Photochemistry of a bacterial

separated charges in reaction centers of Chloroflexus

photosynthetic reaction center missing the

aurantiacus and of YM210W(L) mutants of

initial

bacteriochlorophyll

electron

acceptor,

Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at

J. Phys. Chem. B, 116, 9971-9982, doi: 10.1021/

90 K, J. Phys. Chem. A, 107, 8330-8338, doi: 10.1021/

jp305276m.

jp0300647.

18.

Хатыпов Р. А., Васильева Л. Г., Фуфина Т. Ю.,

Potter, J. A., Fyfe, P. K., Frolov, D., Wakeham,

Болгарина Т. И., Шувалов В. А. (2005) Влияние

M. C., van Grondelle, R. B. R., et al. (2005) Strong

замещения изолейцина L177 гистидином на

effects of an individual water molecule on the rate

пигментный состав и свойства реакционных

of light-driven charge separation in the Rhodobacter

центров пурпурной бактерии Rhodobacter

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР C. sphaeroides С ЗАМЕЩЕНИЕМ I(M206)Q

1457

sphaeroides, Биохимия, 70, 1527-1533, doi: 10.1007/

bring about opposing changes to the thermal stability

s10541-005-0256-3.

of a complex integral membrane protein, Arch.

19.

Keen, N. T., Tamaki, S., Kobayashi, D., and

Biochem. Biophys.,

505,

160-170, doi:

10.1016/

Trollinger, D.

(1988) Improved broad-host-range

j.abb.2010.09.029.

plasmids for DNA cloning in gram-negative bacteria,

30.

Spiedel, D., Roszak, A. W., McKendrick, R.,

Gene, 70, 191-197, doi: 10.1016/0378-1119(88)90117-5.

McAuley, K. E., Fyfe, P. K., et al. (2002) Tuning of

20.

Jones, M. R., Visschers, R. W., van Grondelle, R.,

the optical and electrochemical properties of the

and Hunter, C. N.

(1992) Construction and

primary donor bacteriochlorophylls in the reaction

characterization of a mutant strain of Rhodobacter

centre from Rhodobacter sphaeroides: spectroscopy

sphaeroides with the reaction center as the sole

and structure, Biochim. Biophys. Acta, 1554, 75-93,

pigment-protein complex, Biochemistry, 31, 4458-

doi: 10.1016/S0005-2728(02)00215-3.

4465, doi: 0.1021/bi00133a011.

31.

Haffa, A. L. M., Lin, S., Katilius, E., Williams, J. C.,

21.

Cohen-Basire, G., Sistrom, W. R., and Stanier, R. Y.

Taguchi, A. K. W., et al. (2002) The dependence of

(1957) Kinetic studies of pigment synthesis by non-

the initial electron-transfer rate on driving force in

sulfur purple bacteria, J. Cell Comp. Physiol., 49, 25-

Rhodobacter sphaeroides reaction centers, J. Phys.

68, doi: 10.1002/jcp.1030490104.

Chem. B, 106, 7376-7384, doi: 10.1021/jp0257552.

22.

Goldsmith, J. O., and Boxer, S. G. (1996) Rapid

32.

Dods, R., Bath, P., Morozov, D., Gagner, V. A.,

isolation of bacterial photosynthetic reaction

Arnlund, D., et al. (2021) Ultrafast structural changes

centers with an engineered poly-histidine tag,

within a photosynthetic reaction centre, Nature, 589,

Biochim. Biophys. Acta, 1276, 171-175, doi: 10.1016/

310-314, doi: 10.1038/s41586-020-3000-7.

0005-2728(96)00091-6.

33.

Youvan, D. C., Ismail, S., and Bylina, E. J. (1985)

23.

Fufina, T. Yu., Vasilieva, L. G., Khatypov, R. A.,

Chromosomal deletion and plasmid complementation

Shkuropatov, A. Ya., and Shuvalov, V. A.

(2007)

of the photosynthetic reaction center and light-

Substitution of isoleucine L177 by histidine in

harvesting genes from Rhodopseudomonas capsulate,

Rhodobacter sphaeroides reaction center results in the

Gene, 38, 19-30, doi: 10.1016/0378-1119(85)90199-4.

covalent binding of P_A bacteriochlorophyll to the L

34.

Foloppe, N., Ferrand, M., Breton, J., and Smith,

subunit, FEBS Lett, 581, 5769-5773, doi: 10.1016/

J. C. (1995) Structural model of the photosynthetic

j.febslet.2007.11.032.

reaction center of Rhodobacter capsulatus, Proteins,

24.

Фуфина Т. Ю., Васильева Л. Г. (2021) Влияние

22, 226-244, doi: 10.1002/prot.340220304.

детергентов и осмолитов на термостабильность

35.

Michel, H., Epp, O., and Deisenhofer, J.

(1986)

нативных и мутантных реакционных центров

Pigment-protein interactions in the photosynthetic

Rhodobacter sphaeroides, Биохимия,

86,

607-614,

reaction centre from Rhodopseudomonas viridis,

doi: 10.1134/S000629792104012X.

EMBO J.,

2445-2451, doi:

10.1002/j.1460-

25.

Vasilieva, L. G., Fufina, T. Yu., Gabdulkhakov, A.

2075.1986.tb04520.x.

G., Leonova, M. M., Khatypov, R. A., et al. (2012)

36.

Lancaster, C. R. D., Ermler, U., and Michel, H.

The site-directed mutation I(L177)H in Rhodobacter

(1995) The structures of photosynthetic reaction

sphaeroides reaction center affects coordination of P_A

centers from purple bacteria as revealed by X-ray

and B_B bacteriochlorophylls, Biochim. Biophys. Acta,

crystallography. Anoxygenic Photosynthetic Bacteria,

1817, 1407-1417, doi: 10.1016/j.bbabio.2012.02.008.

Advances in Photosynthesis and Respiration v.

26.

Хатыпов Р. А., Христин А. М., Фуфина Т. Ю.,

(Blankenship, R. E., Madigan, M. T., Bauer, C. E.,

Шувалов В. А. (2017) Альтернативный путь инду-

eds) Kluwer Academic Publishers, Netherlands,

цированного светом трансмембранного переноса

pp. 503-526, doi: 10.1007/0-306-47954-0_23.

электрона в фотосинтетических реакционных

37.

Wang, S., Lin, S., Lin, X., Woodbury, N. W., and

центрах Rhodobacter sphaeroids, Биохимия, 82, 916-

Allen, J. P. (1994) Comparative study of reaction

922, doi: 10.1134/S0006297917060050.

centers from purple photosynthetic bacteria: Isolation

27.

DeLano, W. L.

(2002) The PyMOL molecular

and optical spectroscopy, Photosynth. Res., 42, 203-

graphics system, URL: http://www.Pymol.Org.

215, doi: 10.1007/BF00018263.

28.

Jones, M. R.

(2008) Structural plasticity of

38.

Rautter, J., Lendzian, F., Lubitz, W., Wang, S., and

reaction centers from purple bacteria, in The Purple

Allen, J. P. (1994) Comparative study of reaction

Phototrophic Bacteria (Hunter, C. N., Daldal, F.,

centers from photosynthetic purple bacteria: electron

Thurnauer, M. C., and Beatty, N., eds) Springer,

paramagnetic resonance and electron nuclear double

pp. 295-321.

resonance spectroscopy, Biochemistry,

33,

12079,

29.

Holden-Dye, K., Crouch, L. I., Williams, C. M.,

doi: 10.1021/bi00206a010.

Bone, R. A., Cheng, J., et al. (2011) Opposing

39.

Нолдинг Б. (2005) Новейшие методы исследования

structural changes in two symmetrical polypeptides

биосистем, Техносфера, Москва.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022

1458

ФУФИНА и др.

PROPERTIES OF MUTANT PHOTOSYNTHETIC

REACTION CENTERS OF PURPLE NON-SULFUR BACTERIA

Cereibacter sphaeroides WITH SUBSTITUTION M206 Ile → Gln

T. Yu. Fufina, O. A. Tretchikova, A. M. Khristin, R. A. Khatypov, and L. G. Vasilieva*

Institute of Basic Biological Problems Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research,

Russian Academy of Sciences, 142290 Pushchino, Moscow Region, Russia; E-mail: vsyulya@mail.ru

In the structure of the photosynthetic reaction center (RC) of the purple bacterium Cereibacter sphaeroides the

highly conserved amino acid residue Ile-M206 is located near the primary electron donor P and the accessory

bacteriochlorophyll molecule B_A, which is the nearest electron acceptor. Since Ile-M206 is close to the

C2-acetyl carbonyl group of bacteriochlorophyll P_B, the hydroxyl group of Tyr-M210, the C9-keto group of

bacteriochlorophyll B_A, and a water molecule near the latter group, this site is useful for introducing mutations in

order to study mechanisms of primary photochemical processes in the RC. Previously it was shown, that in the

RC of the closely related purple bacterium Rhodobacter capsulatus, the Ile → Glu substitution at M204 position

(analog of M206 in the RC of C. sphaeroides) significantly affected the kinetics of the P⁺H_– state formation

whereas M204 Ile → Gln replacement led to the loss of BChl B_A molecule from the complex structure. In the

present work, it is shown that introduction of the single I(M206)Q or double I(M206)Q + F(M208)A amino

acid substitutions in the RC of C. sphaeroides do not change the pigment composition or redox properties of

primary electron donor. However, substitution of Ile M206 by Gln affected positions and amplitudes of the

absorption bands of bacteriochlorophylls, increased lifetime of the primary electron donor P* excited state from

3.1 ps to 22 ps, and decreased quantum yield of the P⁺Q_– state to 60%. These data suggest significant changes

in pigment-protein interactions near the primary electron donor P and the nearest electron acceptor B_A.

A considerable decrease in thermal stability of the RC I(M206)Q + F(M208)A was also noticed that apparently

associated with disturbance of the dense packing of the membrane protein environment of bacteriochlorophylls

P_B and B_A. Possible reasons for different effects of identical mutations on the properties of the two highly

homologous RCs from closely related purple non sulfur bacteria are discussed.

Keywords: photosynthesis reaction center, Rhodobacter capsulatus, Cereibacter sphaeroides, bacteriochlorophyll,

purple non sulfur bacteria, photochemical charge separation, quantum yield, pigment composition, redox potential,

primary electron donor, thermal stability of membrane proteins

БИОХИМИЯ том 87 вып. 10 2022