БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 11, с. 1604 - 1613

УДК 577.112.7

СВОЙСТВА СЕРДЕЧНОГО МИОЗИНА

С КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИМИ МУТАЦИЯМИ

В СУЩЕСТВЕННЫХ ЛЁГКИХ ЦЕПЯХ

А.М. Матюшенко¹, Д.И. Левицкий¹*

¹ ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха,

119071 Москва, Россия; электронная почта: levitsky@inbi.ras.ru

² Инcтитут иммунологии и физиологии УpО PАН, 620049 Екатеpинбуpг, Россия

Поступила в редакцию 22.09.2022

После доработки 05.10.2022

Принята к публикации 05.10.2022

Исследовано влияние кардиомиопатических мутаций E56G, M149V и E177G в гене MYL3, кодирую-

щем существенные лёгкие цепи миозина желудочков сердца человека (ELCv), на функциональные

свойства сердечного миозина и его изолированной головки (субфрагмент 1 миозина, S1). Показа-

но, что только одна мутация, M149V, заметно повышает активируемую актином АТРазную актив-

ность S1. Все мутации существенно повышали Ca²⁺-чувствительность скорости скольжения тонких

филаментов по поверхности с иммобилизованным миозином в искусственной системе подвижности

(in vitro motility assay). При этом мутации E56G и M149V почти в 2 раза снижали скорость скольже-

ния нитей актина и регулируемых тонких филаментов, тогда как мутация E177G не меняла скорость

скольжения. Таким образом, несмотря на то что все исследованные мутации в ELCv участвуют в раз-

витии гипертрофической кардиомиопатии, механизмы их влияния на актин-миозиновое взаимодей-

ствие различны.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: миозин, существенные лёгкие цепи миозина, кардиомиопатические мутации, сер-

дечная мышца, молекулярный механизм мышечного сокращения.

DOI: 10.31857/S0320972522110069, EDN: LVOCEK

ВВЕДЕНИЕ

отвечает за гидролиз АТР и связывание актина,

тогда как регуляторный домен представляет

В основе молекулярного механизма мы-

собой длинную α-спираль, стабилизируемую

шечного сокращения лежит циклическое взаи-

нековалентными взаимодействиями с двумя

модействие головок миозина с актиновыми

лёгкими цепями

- существенной (Essential

филаментами, сопряжённое с гидролизом АТР.

Light Chain, ELC) и регуляторной (Regulatory

Молекула мышечного миозина состоит из двух

Light Chain, RLC) [2]. Функционирование мио-

тяжёлых и четырёх лёгких цепей; N-концевые

зиновой головки в качестве молекулярного

области тяжёлых цепей образуют глобулярные

мотора включает поворот регуляторного до-

головки, каждая из которых содержит актив-

мена относительно моторного домена, вызы-

ный центр АТРазы и участки связывания ак-

ваемый глобальными конформационными

тина [1]. Изолированная миозиновая головка,

перестройками, происходящими в моторном

называемая субфрагментом 1 миозина (S1),

домене в процессе АТРазного цикла, при ко-

состоит из двух главных структурных доменов,

тором регуляторный домен действует как ры-

известных как моторный (или каталитический)

чаг («lever arm») [1, 3]. Важную роль при этом

домен и регуляторный домен. Моторный домен играет ELC, стабилизирующая α-спираль регу-

ляторного домена головки, с которой она ассо-

Принятые сокращения: ELC - существенные лёгкие

циирована своей C-концевой частью. Имеются

цепи миозина; ELCv - ELC желудочков сердца; HCM -

данные о том, что при повороте регуляторного

гипертрофическая кардиомиопатия; RLC - регуляторные

лёгкие цепи миозина; S1 - субфрагмент 1 миозина; Tn -

домена в процессе АТРазного цикла C-конце-

тропонин; Tpm - тропомиозин.

вая часть ELC способна взаимодействовать с

* Адресат для корреспонденции.

моторным доменом головки [4-7], а её уни-

1604

КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В ELC МИОЗИНА

1605

кальная N-концевая часть - как с моторным

переходах головки из состояния слабого связы-

доменом [8], так и с актином [9].

вания с актином в состояние сильного связы-

ELC играют важную роль в функциони-

вания и наоборот. Было показано, что при на-

ровании сердечного миозина. Изменение

сыщающей концентрации АТР мутация E56G

экспрессии изоформ ELC влияет на сократи-

в ELCv заметно сдвигает равновесие между

тельную функцию миокарда [10]. Нарушения

состояниями слабого и сильного связывания в

в первичной структуре ELC миозина желудоч-

процессе АТРазного цикла в сторону сильного

ков сердца человека (ventricular ELC, ELCv),

связывания, не оказывая при этом влияния на

вызываемые мутациями в гене MYL3, кодирую-

активируемую актином АТРазу сердечного S1 и

щем ELCv, связаны с развитием такого тя-

на его сродство к актину. Авторы предположи-

жёлого наследственного заболевания сердца

ли, что именно такой сдвиг в равновесии может

человека, как гипертрофическая кардиомио-

приводить к развитию фенотипа с повышенной

патия (HCM), которая характеризуется утол-

сократимостью сердца у людей с кардиомиопа-

щением стенок левого желудочка, фиброзом

тической мутацией E56G в гене MYL3 [14].

и диастолической дисфункцией миокарда, что

Интересные данные были также получе-

может приводить к нарушениям сердечного

ны при сравнении эффектов, вызываемых

ритма вплоть до внезапной остановки сердца.

мутациями A57G и M173V в ELCv миозина у

К настоящему времени известно уже 13 амино-

трансгенных мышей. Было показано, что му-

кислотных замен в ELCv человека, вызывае-

тация A57G в ELCv миозина повышает Ca²⁺-

мых мутациями в гене MYL3, которые ассоции-

чувствительность развития силы мышечными

рованы с развитием HCM: E56G, A57G, R63C,

волокнами намного сильнее, чем мутация

V79I, R81H, G128C, E143K, M149V, E152K,

M173V; напротив, мутация M173V заметно

R154H, H155D, M173V и E177G [11]. Важно

снижает активируемую актином АТРазную ак-

отметить, что все эти замены расположены в

тивность сердечного миозина, тогда как мута-

той области ELCv, которая взаимодействует с

ция A57G не оказывает на неё никакого влия-

α-спиралью тяжёлой цепи регуляторного доме-

ния [15]. И, наконец, нельзя не остановиться

на миозиновой головки [11]. При этом никаких

на свойствах сердечного миозина с мутацией

мутаций, ассоциированных с HCM, не было

M149V в ELCv, которая раньше всех перечис-

обнаружено в области 52 N-концевых остат-

ленных выше была идентифицирована как

ков ELCv, где расположены функционально

мутация, приводящая к развитию HCM [16].

важные участки, ответственные за взаимодей-

В изящных экспериментах, проведённых ме-

ствие с актином [9, 11]. Некоторое исключение

тодом плазмонного резонанса, было показано,

составляют, по-видимому, лишь мутации E56G

что эта мутация значительно снижает сродство

и A57G, которые расположены довольно близ-

ELCv к рекомбинантному фрагменту тяжё-

ко от N-концевого сегмента ELCv.

лой цепи сердечного миозина, содержащему

Следует отметить, что для большинства

IQ-мотив для связывания ELCv [12]. Помимо

мутаций в гене MYL3, ассоциированых с раз-

этого, было обнаружено, что мутация M149V в

витием HCM, почти ничего пока не известно

ELCv повышает скорость скольжения актино-

об их влиянии на свойства сердечного миози-

вых филаментов по поверхности с иммобили-

на. Данные таких экспериментов, хотя и в не-

зованным сердечным миозином в искусствен-

многочисленном количестве, имеются лишь

ной системе подвижности [16].

для нескольких мутаций (E56G, A57G, M149V

В настоящей работе мы сравнили свойства

и M173V). Так, например, было показано, что

сердечного миозина и его изолированной го-

мутация E56G резко снижает сродство ELCv к

ловки (S1) с кардиомиопатическими мутация-

участку её взаимодействия с тяжёлой цепью мио-

ми E56G, M149V или E177G в ELCv. Выбор

зина в регуляторном домене миозиновой го-

этих мутаций не был случайным. Во-первых,

ловки [12], а также снижает жёсткость молеку-

высококонсервативные остатки, подвергавшие-

лы миозина, изометрическую силу мышечных

ся мутациям, расположены в разных областях

волокон и скорость скольжения актиновых фи-

первичной последовательности ELCv: оста-

ламентов по миозину в искусственной системе

ток E56 локализован в N-концевой части по-

подвижности [13]. Помимо этого, интересные

следовательности поблизости от уникального

данные были получены методом FRET с высо-

N-концевого сегмента ELCv, тогда как остат-

ким временным разрешением (Time-resolved

ки M149 и E177 расположены в C-концевой

fluorescence energy transfer, TR-FRET), который

части последовательности (рис. 1, а). В про-

позволяет быстро измерять расстояния между

странстве остатки M149 и E177 локализованы

головкой миозина и актином непосредственно

далеко от остатка E56: они находятся в разных

в процессе АТРазного цикла актомиозина, при

частях ELCv, расположенных по разные сторо-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1606

ЯМПОЛЬСКАЯ и др.

Рис. 1. а - Положение кардиомиопатических мутаций E56G, M149V и E177G в аминокислотной последовательности

ELCv. б - Положение кардиомиопатических мутаций E56G, M149V и E177G на пространственной структуре ELCv (по-

казана светло-серым цветом), ассоциированной с α-спиралью тяжёлой цепи миозина (с фрагментом тяжёлой цепи,

включающим остатки 773-810, показан темно-серым цветом) в регуляторном домене миозиновой головки (PDB entry

5TBY). Остатки E56, M149 и E177 представлены в виде боковых цепей, показанных черным цветом. Гибкий N-конце-

вой сегмент ELCv, включающий 52 N-концевых остатка, на панели а заштрихован, а на панели б - не показан

ны от α-спирали тяжёлой цепи регуляторного

последовательность были добавлены после-

домена миозиновой головки (рис. 1, б). Во-вто-

довательности, кодирующие His-tag и специ-

рых, мы старались сравнить мутации, влияние

фический сайт для его последующего удале-

которых на свойства миозина было изучено ра-

ния при помощи специфической протеазы

нее в совершенно разной степени. В этом отно-

(Factor Xa). Модифицированный ген MYL3

шении мутация E56G является одной из наи-

был клонирован в вектор pET-9a

(«Merck,

более хорошо изученных [9, 11-14], несколько

Sigma-Aldrich», Германия) по сайтам рестрик-

меньше известно о функциональных эффектах

ции NdeI и BamHI. На основе кДНК этого гена

мутации M149V [11, 12, 16] и почти ничего не

методом сайт-направленного мутагенеза были

известно о мутации E177G, кроме того, что она

получены молекулярно-генетические кон-

была выявлена у 3-месячного младенца с тяжё-

струкции ELCv как дикого типа (WT), так и с

лой прогрессирующей HCM, приведшей к его

мутациями E56G, M149V и E177G. Для этого

смерти в возрасте 6 месяцев [17].

предварительно был сделан дизайн перекрываю-

щихся праймеров (прямого и обратного), ко-

торые были затем синтезированы («Евроген»,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Россия). Использованные в работе праймеры

для получения молекулярно-генетических кон-

Получение белков. Все препараты ELCv

струкций мутантных форм ELCv (мутантные

(ELC желудочков сердца человека), использо-

кодоны подчёркнуты) представлены в табл. 1.

ванные в данной работе, были рекомбинант-

Все эти конструкции были использова-

ными белками, продуктами гена MYL3 чело-

ны для бактериальной экспрессии реком-

века (UniProtKB P08590; MYL3_HUMAN),

бинантных белков (ELCv WT, ELCv E56G,

содержащими на N-конце 6-членный His-tag,

ELCv M149V и ELCv E177G) в клетках

необходимый для последующей очистки бел-

Escherichia coli BL21 (DE3). Рекомбинантные

ков методом аффинной хроматографии. Для

белки были выделены и очищены с помо-

этого предварительно был проведён дизайн

щью аффинной хроматографии на колонке

гена MYL3; в частности, в его нуклеотидную

HisTrap HP 5 мл («GE Healthcare», США). Кон-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В ELC МИОЗИНА

1607

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе

Последовательности праймеров (5′→3′)

Мутантные формы ELCv

прямой

обратный

ELCv E56G

TCTTAAGTTTCCTCGCAAGTA

TACTTGCGAGGAAACTTAAGA

ELCv M149V

ATGGCAACACCCACGCCTT

AAGGCGTGGGTGTTGCCAT

ELCv E177G

CCAGTCCCTCTGAGATTGC

GCAATCTCAGAGGGACTGG

центрацию препаратов ELCv определяли спек-

дечного миозина, нерастворимого при низкой

трофотометрически, используя коэффициент

ионной силе, нам пришлось существенно мо-

экстинкции A^1% при 280 нм, равный 0,2 см^-1.

дифицировать эту методику. Сердечный мио-

Сердечные миозин и тропонин (Tn) по-

зин (2 мг/мл, 4 мкМ) смешивали с 10-крат-

лучали по стандартным методикам [18, 19] из

ным молярным избытком рекомбинантных

левых желудочков сердца свиньи. Тропомио-

ELCv (40 мкМ) в 50 мМ буфере имидазол-HCl

зин (Tpm, сердечная изоформа Tpm1.1) пред-

(pH 7,0), содержащем 5 мM DTT, 10 мM MgATP

ставлял собой рекомбинатный белок, получе-

и 0,7 М KCl, и инкубировали в течение 1 часа

ние которого было подробно описано ранее [20,

при 37 °С. Далее смесь миозина с ELC диали-

21]. Актин получали стандартным методом

зовали против буфера 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0)

из скелетных мышц кролика [22]. Актиновые

для агрегации миозина и центрифугировали

филаменты (F-актин) полимеризовали, до-

при 8000 g в течение 10 мин при 4 °С, после

бавляя 4 мМ MgCl₂ и 100 мМ KCl к раствору

чего осадок миозина ресуспендировали и диа-

мономерного G-актина. Для экспериментов

лизовали против того же буфера, содержаще-

в искусственной подвижной системе F-ак-

го 1 М NaCl.

тин флуоресцентно метили, добавляя к нему

На последней стадии очистки миозина

двукратный молярный избыток TRITC-фал-

или S1 мы использовали металл-аффинную

лоидина

(«Sigma Chemical Co.», США).

хроматографию на колонке His-Trap HP 1 мл

Изолированные миозиновые головки (S1) по-

(«GE Healthcare»), на которой удержива-

лучали, переваривая филаменты сердечного

ются лишь головки миозина, содержащие

миозина α-химотрипсином, обработанным

His-tag на ELCv. Хроматографию проводили в

TLCK («Sigma Chemical Co.») [23]. Концентра-

50 мМ буфере Tris-HCl (рН 8,0), содержащем

цию S1 определяли спектрофотометрически,

300 мМ NaCl (в случае S1) или 1 М NaCl (для

используя коэффициент экстинкции A^1% при

целого миозина), используя линейный гради-

280 нм, равный 7,5 см^-1.

ент имидазола 15-500 мМ. Важно отметить,

Замена собственных ELC в сердечных миози-

что при такой хроматографии молекулы мио-

не и S1 на рекомбинантные ELCv. Методика ре-

зина с заменами собственных ELC на рекомби-

ассоциации, т.е. замены одних ELC на другие в

нантные ELCv в обеих головках освобождались

изолированной головке миозина (S1), неодно-

с колонки при более высоких концентрациях

кратно использовалась нами ранее в исследо-

имидазола, чем молекулы, содержащие реком-

ваниях на S1, полученном из миозина скелет-

бинантные ELCv лишь в одной из двух головок.

ных мышц кролика [7, 8]. Эту же методику мы

Мы собирали с колонки лишь те фракции мио-

использовали и для замены собственных ELC

зина, в которых собственные ELC были пол-

на рекомбинантные ELCv в S1, полученном из

ностью заменены на рекомбинантные ELCv,

сердечного миозина. Вкратце, замену проводи-

содержащие N-концевой His-tag, электрофо-

ли, инкубируя S1 30 мин при 37 °C с 8-кратным

ретическая подвижность которых была ниже,

молярным избытком рекомбинантных ELCv в

чем у ELC, не содержащих His-tag. Именно эти

50 мМ буфере имидазол-HCl (pH 7,0), содержа-

фракции миозина с рекомбинантными ELCv в

щем 5 мM DTT, 10 мM MgATP и 100 мM NaCl.

обеих головках молекулы использовались в по-

Реакцию останавливали охлаждением во льду,

следующих экспериментах. N-Концевой His-tag

после чего препарат S1 очищали с помощью

был впоследствии удалён из ELCv путём об-

хроматографии на колонке с SP-трисакрилом

работки специфической протеазой (Factor Xa

для отделения S1 от избытка свободных ELCv.

protease, «NewEngland Biolabs», Великобрита-

Однако для замещения собственных ELC на

ния) при 4 °С, которую проводили в течение

рекомбинантные ELCv в целой молекуле сер-

ночи и останавливали добавлением PMSF.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1608

ЯМПОЛЬСКАЯ и др.

В результате нам удалось получить препараты

количества выделяемого неорганического фос-

сердечного миозина и S1, в которых собствен-

фата, требующей значительно более высоких

ные ELC были полностью заменены на реком-

концентраций белка. Поэтому для определения

бинантные ELCv (как ELCv WT, так и ELCv с

ATPазной активности нам пришлось восполь-

мутациями E56G, M149V или E177G).

зоваться значительно более чувствительной

Эксперименты в искусственной системе под-

методикой, позволяющей с высокой точностью

вижности (in vitro motility assay). Использование

измерять снижение количества ATP в пробе не-

этого метода позволяет исследовать скорость

посредственно в процессе ATPазной реакции

скольжения F-актина или реконструирован-

по снижению интенсивности люминесценции,

ных тонких филаментов (т.е. актиновых фила-

измеряемой при помощи люциферин-люци-

ментов, содержащих Tpm и Tn) по стеклянной

феразной системы. В наших экспериментах

поверхности с иммобилизованным на ней мио-

мы использовали специальный коммерческий

зином, а в случае реконструированных тонких

набор - смесь люциферина и люциферазы

филаментов - определять зависимость скоро-

(«Sigma-Aldrich», США), который позволяет

сти такого скольжения от концентрации ионов

детектировать пикомолярные концентрации

кальция. Ранее мы неоднократно применяли

ATP в исследуемом образце. Однако даже этого

этот подход для изучения функциональных

оказалось недостаточно для измерения ATPаз-

свойств Tpm с кардиомиопатическими мута-

ной активности целого миозина, содержащего

циями в различных областях молекулы [20, 21].

рекомбинантные ELCv, концентрация кото-

В настоящей работе мы использовали его для

рого была слишком уж мала для таких измере-

исследования свойств миозина, несущего в

ний. Поэтому все эксперименты по изучению

обеих головках рекомбинантные ELCv, в т.ч.

актин-активируемой Mg²⁺-зависимой ATPазы

с кардиомиопатическими мутациями E56G,

проводились на препаратах изолированных

M149V или E177G. Измерения проводили при

головок сердечного миозина (S1), содержащих

30 °С, как описано ранее [20, 21]. Вкратце, сер-

рекомбинантные ELCv. Образцы содержали

дечный миозин (300 мкг/мл) с рекомбинант-

5 мМ имидазол (рН 7,0), 10 мМ MgCl₂, 87 нМ S1

ными ELCv загружали в экспериментальную

и 4,7 мкМ F-актин. ATPазную реакцию иниции-

проточную ячейку с внутренней поверхностью,

ровали добавлением 10 мМ ATP. Поскольку

покрытой нитроцеллюлозой. Регулируемые

люцифераза способна сама расщеплять ATP

тонкие филаменты получали, добавляя сер-

(хотя и с невысокой скоростью) и вносить та-

дечные Tpm и Tn до конечных концентраций

ким образом некоторые изменения в кинетику

100 нМ к раствору 10 нМ F-актина, меченного

реакции, в качестве главного параметра скоро-

TRITC-фаллоидином, и помещали их в проточ-

сти реакции мы использовали время полного

ную ячейку с иммобилизованным миозином.

тушения люминесценции. Измерения сниже-

Скорость скольжения филаментов измеряли в

ния интенсивности люминесценции проводи-

присутствии 2 мМ ATP с помощью программы

ли при 560 нм и 20 °C на планшетном ридере

GMimPro [24] при различных концентраци-

фирмы PerkinElmer (Multimode Plate Reader,

ях ионов Са²⁺. Скорость скольжения F-актина

«PerkinElmer», США).

измеряли в тех же условиях, но при отсутствии

Tpm, Tn и ионов Са²⁺. Эксперименты с каждым

миозином, содержащим в обеих головках ре-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

комбинантные ELCv (как WT ELCv, так и ELCv

с мутациями E56G, M149V или E177G), повто-

Функциональные свойства миозина, со-

ряли 3 раза (каждый раз - с заново приготов-

держащего в обеих головках рекомбинант-

ленным миозином) и полученные значения

ные ELCv, изучали, используя метод искус-

скоростей скольжения тонких филаментов или

ственной системы подвижности. В первую

F-актина выражали как среднее ± SD. Кальцие-

очередь исследовали скорость скольжения ак-

вую зависимость скорости скольжения тонких

тиновых филаментов (F-актина, не содержа-

филаментов аппроксимировали уравнением

щего Tpm и Tn) по поверхности, на которой

Хилла, как описано ранее [20, 25].

был иммобилизован миозин. Оказалось, что

Измерения АТРазной активности. Концен-

мутация E177G в ELCv не оказывает влияния

трация миозина, содержащего рекомбинант-

на скорость скольжения F-актина, тогда как

ные ELCv, как и его количество, были слиш-

мутации E56G и M149V снижают её почти в

ком малы после всех стадий реассоциации и

2 раза (табл. 2). В случае мутации E56G полу-

очистки белка, что не позволяло нам восполь-

ченные нами данные коррелируют с данными,

зоваться стандартной методикой определения

известными из литературы и указывающими

ATPазной активности миозина по измерению

на то, что эта мутация в ELCv может заметно

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В ELC МИОЗИНА

1609

Таблица 2. Влияние кардиомиопатических мутаций E56G, M149V и E177G в ELCv миозина на скорость скольжения

F-актина и на характеристики кальциевой зависимости скорости скольжения регулируемых тонких филаментов,

содержащих Tpm и Tn, в искусственной системе подвижности

Характеристики кальциевой зависимости

Скорость скольжения

скорости скольжения тонких филаментов

ELCv

F-актина, мкм/с

pCa50

Vmax, мкм/с

WT ELCv

1,9 ± 0,07

6,00 ± 0,01

1,8 ± 0,1

E177G ELCv

1,9 ± 0,1

6,40 ± 0,01*

2,0 ± 0,1

E56G ELCv

1,0 ± 0,05*

6,21 ± 0,01*

1,1 ± 0,1*

M149V ELCv

1,1 ± 0,1*

6,33 ± 0,01*

1,0 ± 0,1*

Примечание. Знаком * обозначены статистически значимые отличия характеристик миозина с ELCv, несущими кардио-

миопатические мутации, от характеристик миозина с WT ELCv (р < 0,05).

(~ на 25%) снижать скорость скольжения F-ак-

в ELCv, так и без неё. Препараты миозина, ис-

тина по поверхности с иммобилизованным мио-

пользованные в наших экспериментах и в ра-

зином [13]. Напротив, в случае мутации M149V

боте Poetter et al. [16], различались не только

в ELCv в литературе имеются данные о том,

по составу тяжёлых цепей сердечного миозина,

что она не снижает, а повышает почти на 40%

но могли различаться и по иным параметрам

скорость скольжения F-актина по поверхно-

(таким, например, как степень фосфорилиро-

сти с иммобилизованным миозином [16]. Та-

вания ELCv в миозине, полученном из биопта-

кие различия в результатах можно объяснить

тов, но не в полностью дефосфорилированных

получением препаратов миозина: в наших экс-

рекомбинантных ELCv).

периментах мы использовали препараты мио-

Важно отметить, что мы исследовали в ис-

зина из сердца свиньи, которые различались

кусственной системе подвижности влияние му-

лишь замещённой рекомбинантной ELCv, тог-

таций в ELCv сердечного миозина не только на

да как в экспериментах, описанных в работе

скорость скольжения F-актина, что делалось и

Poetter et al. [16], сердечный миозин выделяли

ранее [13, 16], но впервые исследовали в этой си-

из биоптатов пациентов как с мутацией M149V

стеме влияние таких мутаций на скольжение ре-

Рис. 2. Влияние кардиомиопатических мутаций E56G, M149V и E177G в ELCv миозина на кальциевую зависимость

скорости скольжения регулируемых тонких филаментов по сердечному миозину в искусственной системе подвижности

(in vitro motility assay). Экспериментальные значения скоростей (среднее ± SD) аппроксимированы уравнением Хилла.

Значения параметров уравнения Хилла представлены в табл. 2

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1610

ЯМПОЛЬСКАЯ и др.

конструированных тонких филаментов (т.е. ак-

чае мутации E56G эти результаты хорошо соот-

тиновых филаментов, содержащих Tpm и Tn),

ветствуют известным из литературы данным,

определяя при этом зависимость скорости та-

указывающим на то, что мутация E56G в ELCv

кого скольжения от концентрации ионов каль-

не оказывает влияния на актин-активируемую

ция, т.е. выявляя влияние исследуемых мутаций

ATPазу S1 [14].

на кальциевую регуляцию актин-миозинового

При сравнении эффектов, вызываемых

взаимодействия, как возможного механизма

мутациями E56G и M149V в ELCv, можно от-

развития HCM. Результаты этих исследований

метить их различие в зависимости от используе-

представлены на рис. 2 и в табл. 2. Сразу отме-

мого метода исследования. Так, при экспери-

тим, что максимальная скорость скольжения

ментах в искусственной системе подвижности

тонких филаментов (V_max), измеренная при вы-

обе мутации сходным образом снижали ско-

соких концентрациях Са²⁺ (при pCa 4,5), почти

рость скольжения F-актина и тонких фила-

не отличалась от скорости скольжения F-актина

ментов (рис. 2, табл. 2), тогда как лишь одна

при отсутствии регуляторных белков (табл. 2).

из них, M149V, повышала ATPазную актив-

При этом все мутации в ELCv заметно повы-

ность акто-S1, а другая, E56G, не оказывала на

шали Ca²⁺-чувствительность скорости сколь-

неё особого влияния. Это противоречие мож-

жения тонких филаментов, смещая кривые

но объяснить тем, что эксперименты в искус-

зависимости скорости от pCa в сторону более

ственной системе подвижности проводились

низких концентраций Ca²⁺ (рис. 2) и снижая та-

на целом миозине с мутациями в ELCv, ассо-

ким образом концентрацию Ca²⁺, при которой

циированных с обеими головками молекулы,

достигается полумаксимальная скорость сколь-

а измерения АТРазной активности - на изоли-

жения (pCa₅₀). Наиболее существенное повы-

рованных головках миозина (S1). В то же время

шение Ca²⁺-чувствительности наблюдалось в

имеются данные о том, что свойства целого мио-

случае ELCv с мутацией E177G (табл. 2). Важно

зина и S1 могут довольно сильно различать-

отметить, что повышение Ca²⁺-чувствительно-

ся. Это связано, во-первых, с кооперативным

сти взаимодействия миозина с актином являет-

взаимодействием между двумя головками в мо-

ся одним из характерных признаков HCM.

лекуле миозина [26-28], а во-вторых - с воз-

Мы также исследовали влияние кардиомио-

можным взаимодействием между ELC и RLC в

патических мутаций E56G, M149V и E177G в

головках целого миозина [29], но не в S1, кото-

ELCv миозина на активность ATPазы акто-

рый не содержит RLC.

миозина. По ряду описанных выше причин

Анализируя полученные данные, следу-

(см. «Материалы и методы») мы не смогли ис-

ет особо отметить эффект, оказываемый му-

пользовать для этих целей ни традиционные

тациями E56G и M149V в ELCv на скорость

методы измерения ATPазной активности, ни

скольжения F-актина и тонких филаментов в

целый миозин с мутациями в ELCv обеих го-

искусственной системе подвижности, который

ловок его молекулы. Поэтому мы использова-

выражается в двукратном снижении скоро-

ли методику, позволяющую измерять сниже-

сти (рис. 2, табл. 2). Этот эффект обусловлен,

ние количества ATP в пробе непосредственно

скорее всего, тем, что обе эти мутации сни-

в процессе ATPазной реакции S1 по снижению

жают сродство ELCv к тяжёлой цепи миозина

интенсивности люминесценции, измеряемой

в регуляторном домене миозиновой голов-

при помощи люциферин-люциферазной си-

ки [12], нарушая таким образом нормальное

стемы. Результаты проведённых экспериментов

функционирование этого домена, важное для

свидетельствуют о том, что среди исследован-

работы головки в качестве молекулярного мо-

ных мутаций в ELCv S1 лишь одна, M149V, за-

тора. Интересно также отметить, что такого

метно повышала ATPазную активность акто-S1,

эффекта не было обнаружено в случае мута-

почти в 2 раза снижая время, необходимое для

ции E177G (рис. 2, табл. 2), влияние которой

полного тушения люминесценции, которое

на свойства сердечного миозина ранее вооб-

составляло 26,0 ± 1,2 мин для S1 с ELCv WT и

ще ещё не исследовалось. Не исключено, что

15,3 ± 1,9 мин для S1 с мутацией M149V в ELCv

влияние этой мутации на развитие HCM об-

(представлены данные 7 независимых измере-

условлено не снижением скорости взаимодей-

ний, среднее значение ± SD). Две другие му-

ствия миозина с актином в сердечной мышце, а

тации в ELCv, E56G и E177G, не оказывали су-

значительным повышением Ca²⁺-чувствитель-

щественного влияния на ATPазную активность

ности этого взаимодействия (табл. 2). Стоит

акто-S1; по времени, необходимому для полно-

также отметить, что аминокислотный остаток

го тушения люминесценции (26,5 ± 2,3 мин),

в положении 177 с мутацией E177G в структу-

препараты S1 с этими мутациями в ELCv прак-

ре ELCv находится в неупорядоченной подвиж-

тически не отличались от S1 с ELCv WT. В слу-

ной петле, тогда как аминокислотные остатки в

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В ELC МИОЗИНА

1611

положениях 56 и 149 (мутации E56G и M149V)

жали её почти в 2 раза. С другой стороны, му-

расположены либо в α-спирали (E56), либо в

тация E177G повышала Ca²⁺-чувствительность

короткой петле, соединяющей участки β-склад-

скорости скольжения тонких филаментов силь-

ки и α-спирали (M149) [11] (см. рис. 1, б). Этим

нее, чем другие исследованные мутации. Всё

можно объяснить, хотя бы отчасти, тот факт,

это позволяет предположить, что механизм раз-

что мутация E177G не оказывает влияния на

вития гипертрофической кардиомиопатии, вы-

скорость взаимодействия миозина с актином,

зываемой кардиомиопатическими мутациями

повышая при этом её Ca²⁺-чувствительность,

в ELCv, в случае мутации E177G отличается от

которая определяется наличием регуляторных

такового для мутаций E56G и M149V.

белков, Tpm и Tn, в реконструированных тон-

ких филаментах.

Вклад авторов. Д.С. Ямпольская, А.М. Ма-

тюшенко и Д.И. Левицкий - концепция и руко-

водство работой; Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

и С.Ю. Бершицкий - проведение эксперимен-

тов в искусственной системе подвижности;

Подводя итоги, следует сказать, что на ос-

Д.С. Ямпольская - проведение экспериментов

новании проведённых экспериментов нам уда-

по измерению АТРазной активности; Д.С. Ям-

лось получить новую информацию о влиянии

польская и Д.И. Левицкий - написание пер-

кардиомиопатических мутаций E56G, M149V

воначального текста статьи. Все авторы при-

и E177G в гене MYL3, кодирующем ELCv, на

нимали участие в обсуждении результатов

функциональные свойства сердечного миозина

исследования и редактировании окончатель-

и его изолированной головки (S1). В частности,

ной версии статьи.

при сравнительном анализе эффектов, вызывае-

Финансирование. Работа выполнена при

мых этими мутациями, нам удалось показать,

финансовой поддержке Российского научного

что мутация E177G, эффекты которой на свой-

фонда (грант № 22-14-00059).

ства миозина ранее не исследовались, заметно

Благодарности. Авторы выражают глубо-

отличается от других исследованных мутаций,

кую благодарность Валентине Юрьевне Берг за

E56G и M149V, по её влиянию на скорость

помощь в проведении экспериментов в искус-

скольжения F-актина или реконструированных

ственной системе подвижности.

тонких филаментов в искусственной системе

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

подвижности. Так, эта мутация не оказывала

отсутствии конфликта интересов.

влияния на скорость скольжения F-актина и

Соблюдение этических норм. Настоящая

на максимальную скорость скольжения тонких

статья не содержит описания каких-либо ис-

филаментов при высокой концентрации ионов

следований с участием людей или животных в

кальция, тогда как мутации E56G и M149V сни-

качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Levitsky, D. I. (2004) Actomyosin systems of biological

with the essential light chain: visualization of the pre-

motility, Biochemistry (Moscow),

69,

1177-1189,

power stroke state, Cell, 94, 559-571, doi: 10.1016/

doi: 10.1007/s10541-005-0063-x.

s0092-8674(00)81598-6.

2. Rayment, I., Rypniewski, W., Schmidt-Base, K.,

6. Borejdo, J., Ushakov, D. S., Moreland, R., Akopova, I.,

Smith, R., Tomchick, D., et al.

(1993) Three-

Reshetnyak, Y., et al. (2001) The power stroke causes

dimentional structure of myosin subfragment

changes in the orientation and mobility of the termini

a molecular motor, Science, 261, 50-58, doi: 10.1126/

of essential light chain 1 of myosin, Biochemistry, 40,

science.8316857.

3796-3803, doi: 10.1021/bi002527u.

3. Rayment, I. (1996) The structural basis of the myosin

7. Logvinova, D. S., Markov, D. I., Nikolaeva, O. P.,

ATPase activity, J. Biol. Chem., 271, 15850-15853,

Sluchanko, N. N., Ushakov, D. S., et al. (2015) Does

doi: 10.1074/jbc.271.27.15850.

interaction between the motor and regulatory domains

4. Milligan, R. A. (1996) Protein-protein interactions in

of the myosin head occur during ATPase cycle?

the rigor actomyosin complex, Proc. Natl. Acad. Sci.

Evidence from thermal unfolding studies on myosin

USA, 93, 21-26, doi: 10.1073/pnas.93.1.21.

subfragment 1, PLoS One, 10, e0137517, doi: 10.1371/

5. Dominguez, R., Freyzon, Y., Trybus, K. M., and

journal.pone.0137517.

Cohen, C. (1998) Crystal structure of a vertebrate

8. Logvinova, D. S., Matyushenko, A. M., Nikolaeva, O. P.,

smooth muscle myosin motor domain and its complex

and Levitsky, D. I.

(2018) Transient interaction

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1612

ЯМПОЛЬСКАЯ и др.

between the N-terminal extension of the essential light

muscle, Methods Enzymol., 85, 55-71, doi: 10.1016/

chain-1 and motor domain of the myosin head during

0076-6879(82)85009-x.

the ATPase cycle, Biochem. Biophys. Res.Commun.,

19.

Potter, J. D. (1982) Preparation of troponin and its

495, 163-167, doi: 10.1016/j.bbrc.2017.10.172.

subunits, Methods Enzymol., 85 (Part B), 241-263,

Logvinova, D. S., and Levitsky, D. I. (2018) Essential

doi: 10.1016/0076-6879(82)85024-6.

light chains of myosin and their role in functioning of

20.

Matyushenko, A. M., Shchepkin, D. V., Kopylova, G. V.,

the myosin motor, Biochemistry (Moscow), 83, 944-

Popruga, K. E., Artemova, N. V., et al.

(2017)

960, doi: 10.1134/S0006297918080060.

Structural and functional effects of cardiomyopathy-

10.

Schaub, M.C., Hefti, M. A., Zuellig, R. A., and

causing mutations in the troponin T-binding region

Morano, I. (1998) Modulation of contractility in

of cardiac tropomyosin, Biochemistry, 56, 250-259,

human cardiac hypertrophy by myosin essential light

doi: 10.1021/acs.biochem.6b00994.

chain isoforms, Cardiovasc. Res., 37, 381-404, doi:

21.

Matyushenko, A. M., Koubassova, N. A., Shchepkin,

10.1016/s0008-6363(97)00258-7.

D. V., Kopylova, G. V., Nabiev, S. R., et al. (2019)

11.

Yadav, S., Sitbon, Y. H., Kazmierczak, K., and

The effects of cardiomyopathy-associated mutations

Szczesna-Cordary, D. (2019) Hereditary heart disease:

in the head-to-tail overlap junction of α-tropomyosin

pathophysiology, clinical presentation, and animal

on its properties and interaction with actin, Int. J.

models of HCM, RCM, and DCM associated with

Biol. Macromol.,

125,

1266-1274, doi:

10.1016/

mutations in cardiac myosin light chains, Pflügers

j.ijbiomac.2018.09.105.

Arch. Eur. J. Physiol., 471, 683-699, doi: 10.1007/

22.

Pardee, J. D., and Spudich, J. A. (1982) Purification

s00424-019-02257-4.

of muscle actin, Methods Enzymol., 85, 164-181, doi:

12.

Lossie, J., Ushakov, D. S., Ferenczi, M. A.,

10.1016/0076-6879(82)85020-9.

Werner, S., Keller, S., et al. (2012) Mutations of

23.

Weeds, A. G., and Taylor, R. S. (1975) Separation

ventricular essential myosin light chain disturb myosin

of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal

binding and sarcomeric sorting, Cardiovasc. Res., 93,

muscle myosin, Nature, 257, 54-56, doi: 10.1038/

390-396, doi: 10.1093/cvr/cvr320.

257054a0.

13.

Lossie, J., Köhncke, C., Mahmoodzadeh, S.,

24.

Mashanov, G. I., and Molloy, J. E. (2007) Automatic

Steffen, W., Canepari, M., et al. (2014) Molecular

detection of single fluorophores in live cells, Biophys. J.,

mechanism regulating myosin and cardiac functions by

92, 2199-2211, doi: 10.1529/biophysj.106.081117.

ELC, Biochem. Biophys. Res. Commun., 450, 464-469,

25.

Matyushenko, A. M., Artemova, N. V., Shchepkin,

doi: 10.1016/j.bbrc.2014.05.142.

D. V., Kopylova, G. V., Bershitsky, S. Y., et al. (2014)

14.

Guhathakurta, P., Prochniewicz, E., Roopnarine, O.,

Structural and functional effects of two stabilizing

Rohde, J. A., and Thomas, D. D. (2017) A cardio-

substitutions, D137L and G126R, in the middle part

myopathy mutation in the myosin essential light chain

of α-tropomyosin molecule, FEBS J., 281, 2004-2016,

alters actomyosin structure, Biophys. J., 113, 91-100,

doi: 10.1111/febs.12756.

doi: 10.1016/j.bpj.2017.05.027.

26.

Schaub, M. C., Watterson, J. G., and Waser, P. G.

15.

Huang, W., and Szczesna-Cordary, D.

(2015)

(1977) Evidence for head-head interactions in myosin

Molecular mechanisms of cardiomyopathy pheno-

from cardiac and skeletal muscles, Basic Res. Cardiol.,

types associated with myosin light chain mutations,

72, 124-132, doi: 10.1007/BF01906350.

J. Muscle Res. Cell Motil., 36, 433-445, doi: 10.1007/

27.

Tyska, M. J., Dupuis, D. E., Guilford, W. H.,

s10974-015-9423-3.

Patlak, J. B., Waller, G. S., et al. (1999) Two heads of

16.

Poetter, K., Jiang, H., Hassanzadeh, S., Master, S. R.,

myosin are better than one for generating force and

Chang, A., et al. (1996) Mutations in either the

motion, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4402-4407,

essential or regulatory light chains of myosin are

doi: 10.1073/pnas.96.8.4402.

associated with a rare myopathy in human heart and

28.

Albet-Torres, N., Bloemink, M. J., Barman, T.,

skeletal muscle, Nat. Genet., 13, 63-69, doi: 10.1038/

Candau, R., Froölander, K., et al. (2009) Drug effect

ng0596-63.

unveils inter-head cooperativity and strain-dependent

17.

Jay, A., Chikarmane, R., Poulik, J., and Misra,

ADP release in fast skeletal actomyosin, J. Biol. Chem.,

V. K. (2013) Infantile hypertrophic cardiomyopathy

284, 22926-22937, doi: 10.1074/jbc.M109.019232.

associated with a novel MYL3 mutation, Cardiology,

29.

Houdusse, A., and Cohen, C. (1996) Structure of the

124, 248-251, doi: 10.1159/000347138.

regulatory domain of scallop myosin at 2 Å resolution:

18.

Margossian, S. S., and Lowey, S. (1982) Preparation

implications for regulation, Structure, 4, 21-32, doi:

of myosin and its subfragments from rabbit skeletal

10.1016/s0969-2126(96)00006-8.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАРДИОМИОПАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В ELC МИОЗИНА

1613

PROPERTIES OF CARDIAC MYOSIN

WITH CARDIOMYOPATHIC MUTATIONS IN ESSENTIAL LIGHT CHAINS

D. S. Yampolskaya¹, G. V. Kopylova², D. V. Shchepkin², S. Y. Bershitsky²,

A. M. Matyushenko¹, and D. I. Levitsky¹*

¹ Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences,

119071 Moscow, Russia; e-mail: Levitsky@inbi.ras.ru

² Institute of Immunology and Physiology Ural Branch of the Russian Academy of Sciences,

620049 Yekaterinburg, Russia

The effect of cardiomyopathic mutations E56G, M149V, and E177G in the MYL3 gene, which encodes

essential light chains of human ventricular myosin (ELCv), on the functional properties of cardiac myosin

and its isolated head (myosin subfragment 1, S1) was investigated. It has been shown that only one mutation,

M149V, significantly increases the actin-activated ATPase activity of S1. All mutations significantly increased

the Ca²⁺-sensitivity of the sliding velocity of thin filaments on the surface with immobilized myosin in the

in vitro motility assay. At the same time, mutations E56G and M149V reduced the sliding velocity of actin

filaments and regulated thin filaments by almost 2 times, while the mutation E177G in ELCv did not have

such an effect on the sliding velocity. Thus, despite the fact that all the studied mutations in ELCv are involved

in the development of hypertrophic cardiomyopathy, the mechanisms of their influence on actin-myosin

interaction are different.

Keywords: myosin, essential light chains, cardiomyopathic mutations, cardiac muscle, molecular mechanism of

muscle contraction

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022