БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 11, с. 1625 - 1633

УДК 612.821.6

КАТИОННЫЙ КАНАЛЬНЫЙ РОДОПСИН

ИЗ ВОДОРОСЛИ Platymonas subcordiformis

КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ИНСТРУМЕНТ

М.А. Островский², А.Ю. Малышев¹*

¹ Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН,

117485 Москва, Россия; электронная почта: malyshev@ihna.ru

² Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, Россия

³ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 27.09.2022

После доработки 10.10.2022

Принята к публикации 10.10.2022

Развитие оптогенетики в значительной степени зависит от разработки новых молекулярных инстру-

ментов - светоактивируемых белков. Используя культивируемые нейроны гиппокампа, мы прове-

ли сравнение двух светоактивируемых катионных каналов: классического канального родопсина-2

из Chlamydomonas reinhardtii (CrChR2) и недавно описанного канального родопсина, выделенного

из водоросли Platymonas subcordiformis (PsChR2). Мы показали, что PsChR2 способен обеспечить ге-

нерацию потенциалов действия при импульсной световой стимуляции нейронов вплоть до частот

в 40-50 Гц, в то время как верхний предел для CrChR2 составляет 20-30 Гц. Важным преимуществом

PsChR2 по сравнению с классическим CrChR2 является сдвиг спектра его возбуждения в синюю об-

ласть. Это открывает возможность для эффективного использования PsChR2 в экспериментах, по-

строенных по принципу «all-optical electrophysiology», для которых необходимо разнести максимумы

спектров канальных родопсинов, используемых для стимуляции нейрона, и спектров возбуждения

различных красных флуоресцентных зондов. Мы провели сравнение ответов нейронов (генерации

потенциалов действия), экспрессирующих CrChR2 и PsChR2, на световые стимулы с длиной вол-

ны 530 и 550 нм - наиболее часто используемые для возбуждения красных флуоресцентных зондов.

Было показано, что свет с длиной волны 530 нм для нейронов, экспрессирующих PsChR2, гораздо

(в 3,7 раза) менее эффективен, чем для экспрессирующих классический CrChR2. Свет же с длиной

волны 550 нм даже при использованной нами максимальной интенсивности вообще не стимулирует

нейроны, экспрессирующие любой из изученных опсинов. Это означает, что канальный родопсин

PsChR2, выделенный из водоросли P. subcordiformis, и по своим частотным характеристикам, и по

возможности его использования для стимуляции нейрона коротковолновым (синим, 470 нм) светом

и одновременной регистрации различных физиологических процессов с помощью флуоресцентных

зондов может рассматриваться как весьма перспективный оптогенетический инструмент.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оптогенетика, нейрон, бактериальный опсин, канальный родопсин, светоиндуци-

рованный ток, пэтч-кламп, внутриклеточная регистрация, Platymonas subcordiformis.

DOI: 10.31857/S0320972522110082, EDN: LVZUMG

ВВЕДЕНИЕ

ментами [1]. При их экзогенной экспрессии в

клетках млекопитающих они сохраняют свою

Микробные родопсины - светочувстви-

функциональную активность и могут служить

тельные ретиналь-содержащие белки

- яв-

в качестве светоуправляемых ионных кана-

ляются наиболее универсальными и широко

лов или насосов [2]. Благодаря использованию

применяемыми оптогенетическими инстру- микробных родопсинов, в частности, стала

Принятые сокращения: ПД - потенциал действия; CrChR2 - канальный родопсин из Chlamydomonas reinhardtii;

HEK 293 - human embryonic kidney cells, иммортализованная модельная линия клеток эмбриональной почки человека;

PsChR2 - канальный родопсин из Platymonas subcordiformis.

* Адресат для корреспонденции.

1625

1626

ИДЖИЛОВА и др.

возможной малоинвазивная регуляция актив-

что обычно применяемый для возбуждения

ности нейронов с высоким временным и про-

флуоресцентных зондов свет с длиной волны

странственным разрешением как in vitro [3, 4],

530 нм способен стимулировать нейроны, экс-

так и in vivo [5].

прессирующие оба опсина - как CrChR2, так

Канальный родопсин-2, клонированный

и PsChR2. В то же время более длинноволно-

из одноклеточной водоросли Chlamydomonas

вый свет - 550 нм - не вызывал практически

reinhardtii (CrChR2) [2], наиболее широко ис-

никакого ответа в нейронах, несущих оба из-

пользуется в оптогенетике. Он не нуждает-

ученных опсина. Это обстоятельство следует

ся для функционирования в дополнительных

учитывать при планировании оптогенетиче-

компонентах, обладает относительно быстрой

ских экспериментов.

кинетикой, высоким сродством с мембраной и

практически не вызывает побочных эффектов.

Однако во многих случаях всего этого оказы-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

вается недостаточно. За годы развития опто-

генетики были созданы мутантные варианты

Аденоассоциированные вирусы серотипа 2

канальных родопсинов, специализированные

(pAAV-CAG-PsChR2-Venus и pAAV-CAG-CrChR2-

под конкретные задачи [6, 7]. Например, были

Venus) были синтезированы в ФГБУ Феде-

созданы опсины с ускоренной кинетикой,

ральном центре мозга и нейротехнологий

сниженной десенситизацией или модифици-

ФМБА России. Титры вирусов составляли

рованным спектром возбуждения. Особенно

5,5 × 10⁹ геномов/мкл и 7,2 × 10⁹ геномов/мкл

большой интерес представляют сообщения об

соответственно.

открытии новых микробных опсинов, которые

Приготовление первичных нейронных куль-

зачастую представляют собой практически го-

тур выполнялось по стандартной методике [10]

товые инструменты для эффективного реше-

из гиппокампа новорождённых мышат ли-

ния тех или иных методических научных задач.

нии ICR на 0-2 постнатальный день. Выделе-

Сравнительно недавно был описан но-

ние гиппокампа производили в холодном рас-

вый канальный родопсин, выделенный из

творе модифицированной базовой среды для

другой хлорофитовой водоросли, Platymonas

культивации клеток млекопитающих (DMEM,

subcordiformis [8], который далее будем обозна-

«ThermoFisher Scientific» США) с 15 мМ Hepes

чать как PsChR2. Он отличается от CrChR2 по

(«Sigma-Aldrich», США). Гиппокампы были

двум существенным для нас параметрам: более

механически измельчены и перенесены в

быстрое восстановлениие пиковой амплиту-

0,08%-ный (w/v) раствор трипсина в DMEM,

ды фототока и смещённый в коротковолновую

после чего в течение 15 мин при 37 °C проис-

область относительно CrChR2 спектр погло-

ходила ферментативная дезагрегация ткани.

щения [8]. Это делает PsChR2 потенциальным

После её окончания и центрифугирования

кандидатом на роль оптогенетического инстру-

раствор заменяли на инкубационную сре-

мента в экспериментах, построенных по прин-

ду (см. ниже), клетки несколько раз ресуспен-

ципу «all-optical electrophysiology», в которых с

дировали. Полученную суспензию одиночных

помощью света осуществляется не только сти-

клеток распределяли по лункам культуральных

муляция нейронов, но одновременно и опти-

планшетов на 12-мм покровные стекла, покры-

ческая регистрация с применением флуорес-

тые поли-D-лизином («Sigma-Aldrich»). Куль-

центных зондов [9]. Существенным условием в

туры содержались в стерильном инкубаторе в

таких экспериментах является то, что спектры

нейробазальной среде Neurobasal™-A medium

возбуждения опсина и флуоресцентного зонда

с добавлением B27™ и GlutaMAX™, согласно

или вовсе не должны перекрываться, или мо-

рекомендациям производителя («ThermoFisher

гут перекрываться в самой небольшой степени.

Scientific»). В инкубаторе поддерживалась тем-

В таком случае свет, активирующий зонд, не

пература 37 °C, содержание углекислого газа -

будет влиять на стимуляцию физиологической

5% и относительная влажность - 95%.

активности нейрона.

Вирусную трансдукцию культур клеток про-

В данной работе мы исследовали функ-

изводили на 5-6 сутки in vitro. Культуру инку-

циональные свойства PsChR2, экспресси-

бировали в течение суток в 0,1%-ном раство-

рованного в первичных культурах нейронов

ре (v/v) вируса в инкубационной среде. После

гиппокампа, в сравнении с CrChR2 в качестве

окончания инкубации среда была полностью

контроля. Мы выяснили, что PsChR2 в нейро-

обновлена.

нах обеспечивает существенно лучшие частот-

Электрофизиологическая регистрация актив-

ные характеристики стимуляции по сравнению

ности нейронов производилась на 14-20 сутки

с CrChR2 в диапазоне 20-50 Гц. Мы показали,

методом пэтч-кламп в конфигурации «целая

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАНАЛЬНЫЙ РОДОПСИН ИЗ Platymonas subcordiformis

1627

клетка» при комнатной температуре в режи-

Для статистического анализа данных ис-

ме фиксации тока или фиксации потенциала.

пользовали критерий Манна-Уитни и t-крите-

Сигнал регистрировался с помощью усили-

рии Уэлча и Стьюдента (для нормально распре-

теля Multiclamp™ 700B с преобразовательной

делённых данных); для оценки нормальности

головкой CV-7B («Molecular Devices»), оциф-

распределения использовался критерий Шапи-

ровывался с помощью АЦП (аналогово-цифро-

ро-Уилка. В качестве статистических оценок

вого преобразователя) Axon™ Digidata® 1550A

везде приведены средние значения ± стандарт-

(«Molecular Devices») с частотой дискретизации

ные ошибки среднего, если не указано иное.

10 кГц и после фильтрации (фильтр низких ча-

стот Бесселя, частота среза - 10 кГц) записы-

вался на компьютер при помощи программного

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

обеспечения pCLAMP™ 10 («Molecular Devices»).

Ванночка с культурой была закрепле-

В культурах, трансдуцированных обои-

на на предметном столике эпифлуоресцент-

ми вирусами, наблюдался высокий уровень

ного микроскопа Olympus BX51WI («Olympus

экспрессии флуоресцентного продукта как в

Corporation», Япония) и заполнена стандарт-

нейронах, так и в небольшом количестве гли-

ным буфером Хэнкса с глюкозой и Hepes:

альных клеток. Все зарегистрированные све-

10 мМ Glc; 10 мМ Hepes; 139 мМ NaCl; 5,3 мМ

тящиеся нейронные клетки отвечали деполя-

KCl; 1,26 мМ CaCl₂*(2H₂O); 0,5 мМ MgCl₂*(6H₂O);

ризацией на стимуляцию световым стимулом с

4,16 мМ NaHCO₃; 0,34 мМ Na₂HPO₄; 0,44 мМ

длиной волны 470 нм. Максимум поглощения

KH₂PO₄; 0,4 мМ MgSO₄*(7H₂O) (pH 7,4). Пэтч-

PsChR2 составляет 445 нм [8], однако нам по-

пипетка из боросиликатного стекла была запол-

казалось интересным сравнить ответы обоих

нена раствором, имитирующим внутриклеточ-

опсинов на стимуляцию светом с длиной вол-

ный, следующего состава: 140 мМ глюконата

ны 470 нм, поскольку таким источником света

калия; 10 мМ Hepes; 5 мМ KCl; 10 мМ фосфо-

по умолчанию оснащаются эпифлуоресцент-

креатина; 4 мМ Mg-ATP и 0,3 мМ Na2-GTP

ные микроскопы, на базе которых, как правило,

(pH 7,31). Сопротивление регистрирующего

создаются электрофизиологические установки

электрода при этом составляло 4-7 МОм.

для проведения оптогенетических экспери-

Присутствие в пирамидном нейроне про-

ментов in vitro. Интенсивность светового сти-

дукта экспрессии определялось по сигналу флуо-

мула в первой серии экспериментов подбира-

ресценции белка Venus. Световая стимуляция

лась индивидуально для каждого нейрона как

производилась с помощью трёх светодиодов:

максимально возможная интенсивность, при

M470L2 (максимум

470 нм), M530L3 (мак-

которой стимул не приводил к генерации ПД.

симум

530 нм)

(«Thorlabs Inc.», США) и

Таким образом, мы компенсировали возмож-

pE-100 (максимум 550 нм) («CoolLED Ltd.»,

ную разницу в уровне экспрессии опсинов в

Великобритания), через объектив микроскопа.

разных клетках. В этой серии регистрировал-

Интенсивность освещения под объекти-

ся входящий светоиндуцированный ток, вы-

вом при различных токах питания диодов была

званный активацией канального родопсина, в

предварительно измерена с помощью PM16-130

режиме фиксации потенциала (voltage clamp).

(«Thorlabs Inc.»), и были построены калибро-

Средняя интенсивность таких стимулов соста-

вочные кривые, которые затем использовали

вила для PsChR2 0,20 ± 0,16 мкВт/мм² (n = 19)

для установки тока питания диода для достиже-

и для CrChR2 - 0,25 ± 0,13 мкВт/мм² (n = 16)

ния требуемой мощности светового стимула.

(p = 0,34; t-критерий Стьюдента). Типичная

Во всех экспериментах поперечный размер

форма фототока, вызываемого световой сти-

светового пучка был максимально ограничен

муляцией нейронов, экспрессирующих каналь-

(примерно до 100 мкм в диаметре) при закры-

ный родопсин, представлена на рис. 1, а и б.

той полевой диафрагме микроскопа, а пятно

Ответ включает в себя быстрый пиковый

отцентрировано на сому клетки, чтобы мини-

компонент и медленный стационарный. Мак-

мизировать нецелевую стимуляцию соседних

симальные амплитуды стационарного компо-

трансфицированных нейронов в культуре.

нента фототока, измеренные во время непре-

Анализ данных был выполнен с исполь-

рывной стимуляции, в двух экспериментальных

зованием пакета программ pCLAMP™ 10 и

группах нейронов были близки и достоверно не

Python [11]. Нейроны, мембранный потенциал

различались: 320 ± 30 пА - для PsChR2 (n = 19)

которых превышал -40 мВ, а также клетки, не

и 300 ± 40 пА - для CrChR2 (n = 16) (p = 0,73;

способные стабильно генерировать потенциа-

t-критерий Стьюдента). В то время как пико-

лы действия (ПД) при инъекции тока, были ис-

вые значения ответа были достоверно выше в

ключены из анализа.

нейронах, экспрессирующих CrChR2, по срав-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАНАЛЬНЫЙ РОДОПСИН ИЗ Platymonas subcordiformis

1629

нению с ответами клеток с PsChR2 (620 ± 80 пА

и CrChR2. Интенсивность светового стиму-

и 420 ± 40 пА соответственно, p < 0,05; t-кри-

ла в данных экспериментах подбиралась как

терий Стьюдента). Такая разница обуслов-

пороговое для генерации ПД значение, ум-

лена в том числе различным соотношением

ноженное на 2 (две реобазы). Нейроны обеих

пиковой и стационарной компоненты отве-

экспериментальных групп стабильно генери-

та у двух исследованных нами канальных ро-

ровали ПД в ответ на импульсную стимуляцию

допсинов (рис. 1, а и б). Вклад стационарной

короткими световыми стимулами (3 мс) на ча-

компоненты в общий ответ был значитель-

стоте 5-20 Гц (рис. 2). При повышении часто-

но и достоверно выше у нейронов с PsChR2

ты импульсов в ответах возникало всё больше

по сравнению с клетками с CrChR2 (75 ± 3%

и больше пропущенных ПД, причём в ней-

и 47 ± 3% соответственно, p < 0,001; t-крите-

ронах, экспрессирующих PsChR2, пропуски

рий Стьюдента) (рис. 1, в). Следует отметить,

возникали при бо льших частотах следования

что средние значения мембранных потенциа-

световых стимулов (рис. 2). Частотные харак-

лов покоя для этих групп клеток не различа-

теристики усреднённых ответов имели S-об-

лись (-59 ± 7 мВ - для PsChR2 и -62 ± 8 мВ -

разную форму (рис. 3). В среднем частотном

для CrChR2, p = 0,34; t-критерий Стьюдента).

диапазоне (20-40 Гц) у нейронов, экспрес-

Импульсная стимуляция. Ранее было по-

сирующих PsChR2, доля успешных ПД была

казано, что при стимуляции клеток HEK 293

статистически значимо выше, чем у нейронов,

(иммортализованная модельная линия клеток

экспрессирующих CrChR2 (p < 0,05; критерий

эмбриональной почки человека), экспресси-

Манна-Уитни).

рующих PsChR2, следующими друг за другом

Ответы на световые стимулы зелёной области

парными световыми стимулами ответ, вы-

спектра. Существенной особенностью PsChR2

званный вторым стимулом, восстанавлива-

является то, что спектр его возбуждения сдви-

ется гораздо лучше, чем при стимуляции кле-

нут в коротковолновую область по отношению

ток, экспрессирующих CrChR2, в широком

к CrChR2, что делает его более подходящим

диапазоне частот стимуляции [8]. В этой свя-

кандидатом для проведения экспериментов, в

зи мы решили охарактеризовать максималь-

которых стимуляция и регистрация активности

ные частоты генерации потенциалов действия,

нейронов на препарате происходит при помо-

которые можно индуцировать импульсной

щи света с разной длиной волны. Поэтому мы

световой стимуляцией культивируемых ней-

задались целью проверить, насколько у нейро-

ронов гиппокампа, экспрессирующих PsChR2

нов, экспрессирующих PsChR2 и CrChR2, раз-

Рис. 3. Доля потенциалов действия, сгенерированных в ответ на импульсную стимуляцию, относительно общего ко-

личества поданных световых стимулов. Цветом закрашена область межквартильного размаха (ящик без усов), попе-

речные линии - медианы. Звёздочками отмечено наличие статистически значимого различия между распределениями

по критерию Манна-Уитни (p < 0,05). При стимуляции на частотах 5 и 10 Гц все нейроны в обеих группах достигли

100%-ного количества «успешных» ответов

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1630

ИДЖИЛОВА и др.

Рис. 4. Трансмембранные токи, индуцированные в культивируемых нейронах гиппокампа, экспрессирующих ро-

допсины CrChR2 и PsChR2, световыми стимулами с длиной волны 470, 530 и 550 нм одинаковой интенсивности.

а и б - Примеры внутриклеточной записи фототоков в нейронах, экспрессирующих канальные родопсины, в ответ

на световой стимул длительностью 200 мс с длинами волн 470 нм (1), 530 нм (2) и 550 нм (3) (в скобках указана цифра

возле соответствующей кривой). Время светового стимула обозначено черной скобкой. в - Отношение амплитуд ста-

ционарного ответа на световые стимулы с длиной волны 530 нм и 550 нм к амплитуде ответа на стимул 470 нм. Статис-

тически значимое различие, * p < 0,01; t-критерий Уэлча

личаются характеристики ответа на зелёный

Уэлча). Оба результата согласуются с измерения-

свет (530 нм и 550 нм), используемый обычно

ми спектров поглощения CrChR2 и PsChR2,

для имаджинга красных флуоресцентных бел-

проведёнными ранее на клетках линии

ков, который для проведения вышеописан-

HEK 293 [8]. Важно отметить, что при доста-

ных экспериментов должен вызывать мини-

точно высокой интенсивности световой стиму-

мальную (или, в идеале, нулевую) активацию

ляции (порядка 4-5 мкВт/мм²) удавалось ин-

канального родопсина. Как и в предыдущей

дуцировать потенциалы действия в нейронах,

серии экспериментов, интенсивность свето-

экспрессирующих как CrChR2, так и PsChR2, в

вого стимула подбиралась индивидуально для

то время как свет с длиной волны 550 нм даже

каждого нейрона при длине волны 470 нм (как

при максимальной интенсивности не приводил

максимальная интенсивность, не вызываю-

к надпороговой активации нейронов.

щая ПД), и затем стимул с той же абсолютной

Аппликация полностью-транс ретиналя не

интенсивностью использовался при длине вол-

влияет на активность канальных родопсинов.

ны 530 и 550 нм. Фототоки регистрировались в

В оригинальной статье, впервые описывающей

режиме фиксации потенциала в ответ на свето-

свойства PsChR2, сообщалось, что культиви-

вой стимул длительностью 200 мс.

рование нейронов, экспрессирующих данный

Оказалось, что соотношение амплитуд

канальный родопсин, в среде с повышенным

530/470 в группе PsChR2 в 3,7 раза ниже, чем в

содержанием полностью-транс ретиналя при-

группе CrChR2 (PsChR2: 0,10 ± 0,08; CrChR2:

водит к значительному увеличению амплитуды

0,37 ± 0,04; p < 0,01; t-критерий Уэлча) (рис. 4).

светоиндуцированного тока. В данной работе

В данной серии экспериментов измерение ам-

авторы, помимо 0,5 мкМ ацетата ретинола, ко-

плитуды пикового ответа не проводилось, вви-

торый по умолчанию содержится в стандарт-

ду его практически полного отсутствия при

ной культуральной среде и служит для клеток

стимуляции зелёным светом. При этом на сти-

источником полностью-транс ретиналя, допол-

муляцию светом с длиной волны 550 нм такой

нительно вносили в чашку ретиналь в полно-

же интенсивности ответ клеток в обеих груп-

стью-транс форме до достижения его финаль-

пах был минимальным (PsChR2: 0,006 ± 0,005;

ной концентрации 0,4 мкМ [8]. В этой связи

CrChR2: 0,014 ± 0,009; p = 0,076; t-критерий

мы решили проверить, не усиливает ли ответ

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАНАЛЬНЫЙ РОДОПСИН ИЗ Platymonas subcordiformis

1631

на свет нейронов, экспрессирующих канальные

продуктивным рабочим диапазоном, и именно

родопсины, добавление ретиналя непосред-

в этом диапазоне PsChR2 обладает ощутимым

ственно в культуральную чашку во время прове-

преимуществом над CrChR2. Возможность све-

дения электрофизиологического эксперимента,

товой стимуляции нейронов на этих частотах

поскольку известно, что микробные родопси-

является ключевой для экспериментов с индук-

ны способны быстро захватывать и ковалентно

цией долговременной синаптической пластич-

связывать ретиналь из окружающей среды [12].

ности, а также для экспериментов по изучению

Ответы нейронов на световой стимул с длиной

особенностей и механизмов кодирования и пе-

волны 470 нм и длительностью 200 мс реги-

редачи информации между нейронами.

стрировались до добавления 0,4 мкМ полно-

Световые стимулы в нашей работе генери-

стью-транс ретиналя, а также через 20 мин по-

ровались с помощью стандартного светодиода

сле добавления. Было найдено, что аппликация

с максимумом излучения 470 нм и шириной

ретиналя значимо не повлияла на ответы кле-

спектра 40 нм, рутинно применяемого для ак-

ток. Если принять амплитуду ответа, вызван-

тивации CrChR2 в оптогенетических экспери-

ного стимулом 470 нм, за единицу, то спустя

ментах, в то время как максимум спектра акти-

20 мин после аппликации полностью-транс

вации PsChR2, измеренный в клетках HEK 293,

ретиналя доля быстрого компонента ответа в

находится в области 445 нм [8]. Этим можно

нейронах, экспрессирующих CrChR2, состави-

объяснить тот факт, что амплитуда светоинду-

ла 0,93 ± 0,05, тогда как в клетках с PsChR2 -

цированных токов в нейронах, экспрессирую-

0,87

± 0,05. Доля постоянного медленного

щих PsChR2, была практически такой же, как и

компонента ответа - 0,86 ± 0,06 и 0,82 ± 0,06

в клетках с CrChR2. В то же время было показа-

соответственно (все различия были статистиче-

но, что при использовании светового стимула

ски недостоверны, t-критерий Стьюдента).

440 нм PsChR2 генерирует больший фототок,

чем CrChR2 при стимуляции светом с длиной

волны 470 нм. Тем не менее мы показали, что,

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

применяя стандартный диод 470 нм, всё равно

можно успешно активировать PsChR2, дости-

PsChR2, предположительно, является од-

гая высоких частот генерации ПД.

ним из по крайней мере трёх типов рецепто-

Ранее на ооцитах Xenopus laevis было по-

ров фототаксиса водоросли P. subcordiformis, и,

казано, что экзогенный канальный опсин

как было показано ранее, по своей первичной

C. reinhardtii более устойчив к деградации в

структуре и свойствам этот белок схож с дру-

присутствии связанного с ним хромофора пол-

гими канальными родопсинами зелёных во-

ностью-транс ретиналя [13]. Длительное инку-

дорослей [8]. Тем не менее описанные здесь

бирование клеток в среде с повышенной кон-

электрофизиологические свойства делают его

центрацией ретиналя приводило к повышению

особенным в этом ряду. Поэтому PsChR2 и

уровня флуоресценции, связанной с опсином

был выбран нами для изучения в целях даль-

метки, а также к увеличению амплитуды фо-

нейшего применения в оптогенетических

тотока. Однако оставалось неизвестным, про-

экспериментах. Мы показали, что, несмотря

является ли этот или сходный эффект другого

на сходство с «классическим» канальным ро-

механизма на более коротких временных мас-

допсином CrChR2, PsChR2 способен стабильно

штабах инкубации, порядка десятков минут.

обеспечивать более высокую частоту потенциа-

Нам не удалось зафиксировать сколько-нибудь

лов действия при импульсной световой стиму-

существенного влияния аппликации ретиналя

ляции. По всей видимости, одним из объясне-

на активность как PsChR2, так и CrChR2, экс-

ний этой особенности может являться ранее

прессируемых в культурированных нейронах

показанная в работе Govorunova et al. [8] по-

гиппокампа.

ниженная десенситизация PsChR2 в процессе

Одной из важных особенностей нового

освещения, что проявляется как меньшая доля

канального родопсина PsChR2 является сдвиг

быстрой компоненты в общем ответе на свет в

спектра его возбуждения влево (в синюю об-

наших экспериментах. При этом необходимо

ласть) по сравнению с классическим CrChR2.

учитывать, что нейроны в культуре не являют-

Это открывает возможности для использова-

ся зрелыми, поскольку их источником являет-

ния PsChR2 в экспериментах, построенных по

ся мозг новорождённых животных, и по ряду

принципу «all-optical electrophysiology», когда

причин они не могут развиться полноценно.

стимуляция и регистрация активности нейро-

Как следствие, частоты генерации ПД свыше

нов на препарате происходят при помощи света

50 Гц являются для них труднодостижимыми.

с разной длиной волны. В частности, в нейрон-

Поэтому диапазон 20-50 Гц можно считать их

ной культуре можно стимулировать нейроны,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1632

ИДЖИЛОВА и др.

экспрессирующие канальный родопсин, при

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

помощи световых стимулов 470 нм и при этом

регистрировать высвобождение медиатора из

Таким образом, мы показали, что катион-

синаптической везикулы при помощи красных

ный канальный родопсин из одноклеточной

флуоресцентных зондов, схожих с pH-флуори-

водоросли P. subcordiformis по своим функ-

ном. pH-Флуорин встраивается в синаптическую

циональным свойствам превосходит широ-

везикулу и меняет свой уровень флуоресцен-

ко используемый в оптогенетике канальный

ции при высвобождении везикулы вследствие

родопсин-2 из C. reinhardtii. Во-первых, он

разницы pH между содержимым везикулы и

обеспечивает возможность достижения бо-

внеклеточной средой [14]. Другим вариантом

лее высоких частот стимуляции нейронов, и,

возможного эксперимента, построенного по

во-вторых, PsChR2 больше подходит для про-

принципу «all-optical electrophysiology», явля-

ведения экспериментов с одновременной све-

ется оптогенетическая стимуляция нейронов

товой стимуляцией трансфицированных ней-

и одновременная оптическая регистрация из-

ронов и оптической регистрацией их ответов

менения уровня кальция в клетке при помощи

при помощи красных флуоресцентных зондов.

таких кальций-чувствительных красных флуо-

Однако в этом случае для возбуждения флуо-

ресцентных зондов, как R-GECO.

ресценции красных зондов необходимо ис-

Для выяснения возможностей проведения

пользовать свет с длиной волны 550 нм.

подобного рода экспериментов с использова-

нием рассматриваемых здесь канальных ро-

Вклад авторов. А.Ю. Малышев, М.А. Остров-

допсинов мы сравнили ответы нейронов, экс-

ский - концепция и руководство работой;

прессирующих CrChR2 и PsChR2, на освещение

Г.Р. Смирнова, Л.Е. Петровская - проведение

при помощи светодиодов с длиной волны 530

молекулярно-биологических экспериментов;

и 550 нм - наиболее часто используемых для

О.С. Иджилова и Д.А. Колотова - проведе-

возбуждения флуоресценции красных флуо-

ние электрофизиологических экспериментов;

ресцентных белков. Оказалось, что амплитуда

А.Ю. Малышев, О.С. Иджилова и М.А. Остров-

фототока, индуцированного в нейронах, экс-

ский - написание и редактирование текста.

прессирующих PsChR2, светом 530 нм, была су-

Финансирование. Работа выполнена при

щественно меньше, чем в клетках, экспрессиру-

финансовой поддержке гранта Министерства

ющих CrChR2. Тем не менее стимуляция светом

науки и высшего образования Российской

с длиной волны 530 нм высокой интенсивности

Федерации (соглашение

№ 075-15-2020-795,

все-таки могла приводить к генерации потен-

внутренний номер 13.1902.21.0027).

циалов действия в нейронах с PsChR2, хотя ча-

Благодарности. Авторы благодарят О.Г. Щер-

стота ПД была ожидаемо ниже, чем в нейронах

бакову за предоставление плазмиды с PsChR2.

с CrChR2. В связи с этим мы изучили ответ ней-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

ронов на свет с длиной волны 550 нм. Оказалось,

отсутствии конфликта интересов.

что световые стимулы этой длины волны даже

Соблюдение этических норм. Все процеду-

при максимальной интенсивности не вызывают

ры, выполненные в исследованиях с участием

генерацию ПД в нейронах, экспрессирующих

животных, соответствовали этическим стан-

любой из изученных опсинов. Из этого следует,

дартам ФГБУН ИВНД и НФ РАН и утверж-

что свет с длиной волны 550 нм предпочтитель-

дённым правовым актам РФ и международных

ней для возбуждения флуоресценции зонда.

организаций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Montagni, E., Resta, F., Mascaro, A. L. A., and

3. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G.,

Pavone, F. S. (2019) Optogenetics in brain research:

and Deisseroth, K.

(2005) Millisecond-timescale,

from a strategy to investigate physiological function

genetically targeted optical control of neural activity,

to a therapeutic tool, Photonics, 6, 92, doi: 10.3390/

Nat. Neurosci., 8, 1263-1268, doi: 10.1038/nn1525.

photonics6030092.

4. Govorunova, E., Sineshchekov, O., Janz, R., Liu, X.,

2. Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S.,

and Spudich, J. (2015) Natural light-gated anion channels:

Adeishvili, N., et al. (2003) Channelrhodopsin-2,

a family of microbial rhodopsins for advanced optogenet-

a directly light-gated cation-selective membrane

ics, Science, 349, 647-650, doi: 10.1126/science.aaa7484.

channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 13940-

5. Arenkiel, B., Peca, J., Davison, I., Feliciano, C., Deis-

13945, doi: 10.1073/pnas.1936192100.

seroth, K., et al. (2007) In vivo light-induced activation

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КАНАЛЬНЫЙ РОДОПСИН ИЗ Platymonas subcordiformis

1633

of neural circuitry in transgenic mice expressing chan-

10. Beaudoin, G., Lee, S.-H., Singh, D., Yuan, Y., Ng,

nelrhodopsin-2, Neuron, 54, 205-218, doi: 10.1016/

Yu-G., et al. (2012) Culturing pyramidal neurons from

j.neuron.2007.03.005.

the early postnatal mouse hippocampus and cortex,

6. Duan, X., Nagel, G., and Gao, S. (2019) Mutated chan-

Nat. Protoc., 7, 1741-1754, doi: 10.1038/nprot.2012.099.

nelrhodopsins with increased sodium and calcium per-

11. Van Rossum, G., and Drake, F. (2009) Python 3

meability, Appl. Sci., 9, 664, doi: 10.3390/app9040664.

Reference Manual, Scotts Valley, CA: CreateSpace.

7. Wietek, J., and Prigge, M.

(2016) Enhancing

12. Nakanishi, K., and Crouch, R. (1995) Application

channelrhodopsins: an overview, in Methods in

of artificial pigments to structure determination and

Molecular Biology (Clifton, N. J., ed) 1408, pp. 141-

study of photoinduced transformations of retinal

165, doi: 10.1007/978-1-4939-3512-3_10.

proteins, Isr. J. Chem., 35, 253-272, doi: 10.1002/

8. Govorunova, E., Sineshchekov, O., Li, H., Janz, R.,

ijch.199500030.

and Spudich, J. (2013) Characterization of a highly

13. Ullrich, S., Gueta, R., and Nagel, G.

(2013)

efficient blue-shifted channelrhodopsin from the

Degradation of channelopsin-2 in the absence of

marine alga Platymonas subcordiformis, J. Biol. Chem.,

retinal and degradation resistance in certain mutants,

288, 29911-29922, doi: 10.1074/jbc.M113.505495.

Biol. Chem., 394, 271-280, doi: 10.1515/hsz-2012-

9. Hochbaum, D., Zhao, Y., Farhi, S., Klapoetke, N.,

0256.

Werley, C. A., et al. (2014) All-optical electrophysiology

14. Miesenböck, G., De Angelis, D., and Rothman, J.

in mammalian neurons using engineered microbial

(1998) Visualizing secretion and synaptic transmission

rhodopsins, Nat. Methods, 11, 825-833, doi: 10.1038/

with pH-sensitive green fluorescent proteins, Nature,

nmeth.3000.

394, 192-195, doi: 10.1038/28190.

CATIONIC CHANNELRHODOPSIN FROM THE ALGAE Platymonas

subcordiformis AS A PROMISING OPTOGENETIC TOOL

O. S. Idzhilova^1,2, G. R. Smirnova^1,2, L. E. Petrovskaya³, D. A. Kolotova^1,2,

M. A. Ostrovsky², and A. Y. Malyshev¹*

¹ Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences,

117485 Moscow, Russia; E-mail: malyshev@ihna.ru

² Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, 119334 Moscow, Russia

³ Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,

117997 Moscow, Russia

The progress of optogenetics largely depends on the development of new molecular tools - light-activated

proteins. Using cultured hippocampal neurons, we compared properties of two light-activated cation channels:

the classical channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii (CrChR2) and the recently described

channelrhodopsin isolated from the algae Platymonas subcordiformis (PsChR2). We have shown that PsChR2

is capable to induce generation of action potentials during pulsed light stimulation of neurons up to frequencies

of 40-50 Hz, while the upper limit for CrChR2 is 20-30 Hz. An important advantage of PsChR2 compared to

classical CrChR2 is the blue shift of its excitation spectrum. This opens up the possibility for its effective use

in experiments based on the “all-optical electrophysiology” principle, for which it is necessary to separate the

maxima of the spectra of channelrhodopsins used to stimulate a neuron and the excitation spectra of various

red fluorescent probes. We compared the responses of neurons (generation of action potentials) expressing

CrChR2 and PsChR2 to light stimuli with a wavelength of 530 and 550 nm, the most commonly used for

excitation of red fluorescent probes. It was shown that light with a wavelength of 530 nm for neurons expressing

PsChR2 is much (3.7 times) less effective than for those expressing classical CrChR2. Light with a wavelength

of 550 nm, even at its maximum used intensity, does not stimulate neurons expressing any of the studied opsins

at all. This means that the PsChR2 channelrhodopsin isolated from the algae P. subcordiformis, both in terms

of its frequency characteristics and the possibility of its use for stimulating a neuron with short-wavelength

(blue, 470 nm) light and simultaneous recording of various physiological processes using fluorescent probes,

can be considered as a very promising optogenetic tool.

Keywords: optogenetics, neuron, bacterial opsin, channelrhodopsin, light-induced current, patch clamp, intracellular

recording, Platymonas subcordiformis

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022