БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 11, с. 1709 - 1719

УДК 577.21

Spata2L ПОДАВЛЯЕТ TLR4-ОПОСРЕДОВАННЫЙ

СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ, СПОСОБСТВУЯ ДЕУБИКВИТИНИРОВАНИЮ

TRAF6 И TAK1 ПРИ УЧАСТИИ CYLD

¹Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China; e-mail: xdyang@shsmu.edu.cn

²Department of Immunology and Microbiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China

³Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China

⁴The Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanghai Institute of Infectious Diseases and Biosecurity,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 201203 Shanghai, China

⁵Center for Traditional Chinese Medicine and Immunology Research, School of Basic Medical Sciences,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 201203 Shanghai, China

Поступила в редакцию 02.02.2022

После доработки 13.07.2022

Принята к публикации 15.08.2022

Toll-подобный рецептор 4 (TLR4, Toll-like receptor) представляет собой ключевой рецептор рас-

познавания паттерна (key pattern recognition), который может быть активирован бактериальным

липополисахаридом (LPS) и вызвать воспалительный ответ. Для защиты организма от микробных

инфекций необходима активация TLR4. Однако в связи с тем, что гиперактивация TLR4 также

приводит к отрицательным последствиям и воспалительным процессам, процесс его активации

должен контролироваться механизмами отрицательной регуляции, среди которых наиболее важ-

ным может быть деубиквитинирование ключевых сигнальных молекул, происходящее при участии

деубиквитинирующих ферментов (DUB, deubiquitinating enzymes). Белок CYLD является членом

семейства убиквитин-специфичных процессирующих протеаз (USP, ubiquitin-specific-processing

protease) этих деубиквитинирующих ферментов и действует как ключевой негативный регулятор

TLR4-зависимых воспалительных ответов, вызывая отщепление полиубиквитиновых цепей от сиг-

нальных молекул, таких как белки TRAF6 и TAK1. Нарушение регуляции активности CYLD вносит

существенный вклад в возникновение состояний, ассоциированных с воспалительными процес-

сами. Однако остаются открытыми вопросы, касающиеся регуляции активности CYLD в процессе

воспалительного ответа. Недавно нами и другими авторами было показано, что белок Spata2 функ-

ционирует как важный партнёр CYLD в регуляции его ферментативной активности и связывания

субстратов. В настоящей работе нами было показано, что Spata2-подобный белок Spata2L может

также образовывать комплекс с белком CYLD и ингибировать TLR4-зависимый воспалительный

ответ. Нами было показано, что белок Spata2L конститутивно взаимодействует с CYLD, и что де-

фицит белка Spata2L усиливает индуцированную LPS активацию NF-κB и экспрессию генов про-

воспалительных цитокинов. Конкретно, белок Spata2L усиливал CYLD-опосредованное деубик-

витинирование белков TRAF6 и TAK1, вероятно, путём повышения ферментативной активности

CYLD. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что белок Spata2L является впервые

выявленным регулятором активности CYLD, дают новые представления о регуляторных механиз-

мах, лежащих в основе роли CYLD в TLR4-зависимой передаче сигнала, и предполагают возмож-

ные мишени для модуляции воспалительных процессов, индуцируемых TLR-4.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: воспаление, TLR4, деубиквитинирование, CYLD, Spata2L, Spata2.

DOI: 10.31857/S032097252211015X, EDN: LXAZUK

Принятые сокращения: BMDM - bone-marrow-derived macrophages, макрофаги из костного мозга; KO - нокаут;

LPS - липополисахарид; TLR4 - Toll-like receptor 4, Toll-подобный рецептор 4; USP - ubiquitin-specific-processing

protease, убиквитин-специфичная процессирующая протеаза; WT - wild type, дикий тип.

# Авторы внесли равный вклад в работу.

* Адресат для корреспонденции.

1709

1710

ZHANG и др.

ВВЕДЕНИЕ

воспалительных процессах, включая колит,

экспериментальный аутоиммунный энце-

Воспалительные реакции, опосредован-

фаломиелит (EAE, experimental autoimmune

ные Toll-подобными рецепторами (TLR,

encephalomyelitis) и полиартрит [15, 24, 25].

Toll-like receptors), необходимы для борьбы

До сих пор остаётся открытым вопрос о том,

с различными инфекциями и поддержания

как регулируется ферментативная актив-

гомеостаза тканей. Их нарушение может вы-

ность CYLD, и как CYLD определяет различ-

зывать тяжёлые и даже летальные послед-

ные белковые мишени в TLR4-зависимом

ствия, такие как септический шок, воспале-

сигнальном пути.

ние кишечника, аутоиммунные заболевания и

Недавно, чтобы выяснить механизм регу-

рак [1-5]. Патогены или продукты их жизнеде-

ляции активности CYLD, нами был исполь-

ятельности, такие как липополисахарид (LPS,

зован метод BioID (идентификация биотина,

lipopolysaccharide), вызывают ряд воспали-

зависимая от близости, proximity-dependent

тельных ответов путём активации различных

biotin identification) для проведения скрининга

TLR [1, 5]. Активация TLR4 приводит к запуску

CYLD-связывающих белков. В результате был

процесса образования сигнального комплекса

идентифицирован белок Spata2 как партнёр

и последующего рекрутирования E3-убикви-

CYLD, контролирующий внутриклеточную

тин-лигазы TRAF6, которая катализирует по-

локализацию CYLD и его взаимодействие с

лиубиквитинирование соответствующих суб-

субстратами в процессе активации инфламмо-

стратных белков и самого белка TRAF6 [6-8].

сомы NLRP3 [26]. В ряде работ других авторов

В свою очередь, это полиубиквитинирование

было показано, что белок Spata2 взаимодей-

служит в качестве платформы для рекрутиро-

ствует с CYLD, стимулируя его ферментатив-

вания белка TAK1 и его активации через бел-

ную активность и рекрутируя CYLD на сиг-

ки TAB2 (TAK1-связывающий белок 2, TAK1-

нальный комплекс TNF-RSC рецептора TNFα

binding protein 2) и TAB3, каждый из которых

(TNFR, TNFα receptor) после стимуляции

связывает цепи убиквитина [6, 9]. Кроме того,

TNFα. В этом плане комплекс Spata2 и CYLD

прямая коньюгация цепей убиквитина с бел-

служит в качестве важного регулятора гибе-

ком TAK1 вносит вклад в активацию его ка-

ли клеток, индуцированной TNFα [27-31].

талитической активности

[10-14], приводя

Однако остаётся не выясненным, как регуля-

к активации нижележащих IκB-киназ (IKK,

торная функция белка CYLD модулируется в

IκB kinases) и митоген-активируемых белко-

TLR4-зависимом сигнальном пути.

вых киназ (MAPK, mitogen-activated protein

Кроме белка Spata2, нами также был иден-

kinases), таких как p38 и JNK [15-17]. Активи-

тифицирован Spata2-подобный белок, Spata2L,

рованные белки IKK фосфорилируют IκBα и

который сильно взаимодействовал с CYLD

вызывают его деградацию в протеасомах , тем

при проведении скрининга белков с помощью

самым высвобождая фактор транскрипции

метода BioID [26]. В настоящей работе нами

NF-κB в ядро, где он индуцирует экспрессию

было показано, что белок Spata2L, так же как

генов провоспалительных цитокинов, таких

и Spata2, взаимодействует с белком CYLD. Од-

как IL-1β, IL-6 и TNFα [18, 19]. Активирован-

нако, в отличие от белка Spata2, Spata2L играет

ные белки MAPK индуцируют фактор транс-

ключевую роль в регуляции TLR4-опосредо-

крипции AP-1, который принимает участие в

ванной передачи сигнала путём CYLD-опосре-

транскрипции провоспалительных цитоки-

дованного деубиквитинирования белков TAK1

нов [13, 20, 21].

и TRAF6. В целом наши данные указывают

Процессу активации TLR4 путём поли-

на белок Spata2L как на ранее не охарактери-

убиквитинирования противодействует про-

зованный регулятор воспалительного ответа

цесс деубиквитинирования, опосредован-

с участием CYLD и TLR4 и дают новые пред-

ный деубиквитинирующими белками (DUB,

ставления о механизмах регуляции активности

deubiquitinating enzymes), что необходимо для

CYLD.

поддержания баланса силы и продолжитель-

ности воспалительного ответа. Ключевым

представителем белков DUB является CYLD.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Он высвобождает активирующие цепи по-

лиубиквитина из ключевых сигнальных мо-

Мыши. Мыши с нокаутированным (KO)

лекул, таких как TRAF6 и TAK1 [22, 23], тем

геном Spata2L были получены в Шанхайском

самым ослабляя TLR4-зависимую передачу

центре модельных организмов (Shanghai Model

сигнала. Хорошо известно, что нарушение

Organisms Center, Inc.) с использованием ме-

регуляции CYLD имеет место при различных

тода CRISPR-Cas9. Вкратце, мРНК Cas9 и

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

Spata2L И TLR4-ОПОСРЕДОВАННЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ

1711

направляющие РНК (gRNA), нацеленные на

подвергнуты дифференцировке, как описа-

экзон 2 гена Spata2L, были интродуцированы с

но ранее [26]. Хорошо дифференцированные

использованием метода электропорации в опло-

клетки BMDM были размещены в 12-ячеечной

дотворённые яйцеклетки мышей C57BL/6J.

микропланшете в плотности 5×10⁵ клеток на

Полученные эмбрионы были имплантированы

ячейку для последующей стимуляции LPS. При

самкам мышей с ложной беременностью. По-

проведении экспериментов по экспрессии ге-

лученные химеры были подвергнуты обратно-

нов клетки в течение 4 ч были стимулирова-

му скрещиванию с мышами линии C57BL/6J,

ны добавлением 20 нг/мл LPS (L4391, «Sigma-

и гетерозиготное потомство было генотипи-

Aldrich», США) и затем немедленно отобраны

ровано с помощью геномной ПЦР с исполь-

для получения препарата РНК. Для экспери-

зованием пары праймеров, окружающих це-

ментов по определению активации сигнальных

левой участок в направляющей РНК (прямой:

путей с помощью иммуноблоттинга клетки

GCTAAGCTGCCAAGGTCCCTAT, обратный:

подвергались стимулированию в течение раз-

GTGAGACTACTTTGAGGACAGCCAT) с по-

личных периодов времени путём добавления

следующим секвенированием полученных

50 нг/мл LPS и немедленно после отбора были

в результате проведения ПЦР фрагментов.

лизированы во льду для получения препаратов

Мыши содержались в стерильных условиях на

клеточного лизата.

медицинском факультете университета име-

Выделение РНК и количественная ПЦР в

ни Джяо Тона в Шанхае (Shanghai Jiao Tong

реальном времени (RT-qPCR). Препарат об-

University School of Medicine), и гетерозиготы

щей РНК получали с использованием набора

были использованы для получения однопо-

RNeasy Mini Kit («Qiagen», США). Препарат

мётников дикого типа (WT, wild-type) и мышей

кДНК из РНК получали с использованием

Spata2L KO. Все протоколы экспериментов на

набора PrimeScript RT Reagent Kit (RR037A,

мышах были одобрены комитетом по содержа-

«TaKaRa», Япония). RT-qPCR выполнялась

нию и использованию лабораторных живот-

трижды с использованием набора SYBR Green

ных медицинского факультета университета

Master Mix (A25918,

«Applied Biosystems»,

имени Джяо Тона в Шанхае.

США). Относительные показатели экспрес-

Плазмиды и трансфекция. Плазмиды, коди-

сии каждого гена были нормализованы отно-

рующие белки Spata2 и CYLD человека, были

сительно экспрессии гена глицеральдегидфос-

описаны ранее [26]. Плазмида, кодирующая

фатдегидрогеназы (ГАФД) и представлены в

белок Spata2L человека с прикреплённым V5,

виде кратной индукции. Праймеры, использо-

поступила от «GE Dharmacon» (США). Кон-

ванные для проведения RT-qPCR, были опи-

струкция, экспрессирующая белок Spata2L

саны в нашей предыдущей работе [26].

человека с прикрёпленным тэгом Flag, была

Иммуноблоттинг и иммунопреципитация.

получена в результате клонирования с исполь-

Были приготовлены лизаты клеток, которые

зованием метода ПЦР. Плазмиды, кодирую-

далее были фракционированы с помощью ме-

щие белки HOIP (#50015), HOIL-1 (#50016) и

тода электрофореза в ПААГ в присутствии SDS

Sharpin (#50014) человека с тэгом Flag, были

(SDS-PAGE) и иммуноблоттинга, как было

получены от «Addgene» (США). Плазмиды, со-

описано ранее [26], с использованием следу-

держащие белки TRAF6 и TAK1 человека, были

ющих антител: CYLD (sc-74435, «Santa Cruz

любезно предоставлены доктором Шао-Конг

Biotechnology», США), тубулин (изготовлены

Сунь (Shao-Cong Sun) из онкологического цен-

в лаборатории), V5 (MA5-15253-HRP, «Thermo

тра Андерсена, штат Мериленд (MD Anderson

Fisher Scientific», США), HA

(12013819001,

Cancer Center, США). При проведении транс-

«Roche», Швейцария), FLAG (F1804 или

фекции плазмид клетки HEK293 рассевали

F7425, «Sigma-Aldrich»), IκBα (sc-371, «Santa

в 6-ячеечные микропланшеты при плотности

Cruz Biotechnology»), фосфо-IκBα (2859S, «Cell

8×10⁵ клеток/ячейка. Трансфекцию проводили

Signaling», США), p38 (9212S, «Cell Signaling»),

с использованием реагента для трансфекции

фосфо-p38 (9215S, «Cell Signaling»), JNK (sc-474,

Neofect transfection reagent («Neofect Biotech»,

«Santa Cruz Biotechnology») и фосфо-JNK

Китай) в соответствии с инструкциями произ-

(9251, «Cell Signaling»). Для проведения имму-

водителя, и через 36-48 ч после трансфекции

нопреципитации лизаты трансфицированных

клетки собирали для проведения последующих

клеток инкубировали с агарозными шарика-

анализов.

ми с прикреплённым Flag (M2, A2220, «Sigma-

Выделение макрофагов из костного мозга

Aldrich») при 4 °C в течение 2 ч. Шарики про-

(BMDM, bone-marrow-derived macrophages) и их

мывали 3 раза буфером для лизиса клеток и

стимуляция. Клетки костного мозга были полу-

кипятили в двукратном буфере для образцов,

чены от мышей одного пола и возраста и далее

содержащем SDS и используемом для прове-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1712

ZHANG и др.

дения SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Им-

лок Spata2L имеет большое сходство с белком

мунопреципитацию белков для определения

Spata2 в N-концевом домене PUB и немного

степени их убиквитинирования проводили как

меньшее сходство в C-концевом домене B-box

было описано ранее [26]. Показаны результаты

(рис. S1 Приложения). В то же время, в средней

всех экспериментов (по крайней мере двух не-

части белок Spata2L отличается от белка Spata2,

зависимых повторов) с использованием имму-

поскольку у него отсутствует ранее идентифи-

нопреципитации и иммуноблоттинга. Количе-

цированный мотив PIM следующего состава:

ственную обработку полученных изображений

Asp-Leu-Tyr-Thr [29] (рис. S1 Приложения), ко-

результатов иммуноблоттинга проводили с ис-

торый ответственен за взаимодействие с доме-

пользованием программы ImageJ 1.8.0.

ном PUB белка HOIP.

Spata2L конститутивно взаимодейству-

ет с белками CYLD и HOIP (аналогично белку

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Spata2). С использованием совместной им-

мунопреципитации нами было подтверждено

Spata2L обладает аминокислотной последо-

взаимодействие белков Spata2L и CYLD. На-

вательностью, сходной со Spata2. Ранее, в ре-

блюдалось сильное взаимодействие Spata2L с

зультате проведения скрининга белков, взаи-

CYLD, как и в случае Spata2 (рис. 1, a), что со-

модействующих с CYLD, с помощью мето-

гласуется со сходством их N-концевых PUB-до-

да BioID нами был идентифицирован белок

менов. Интересно, что, хотя средняя часть

Spata2 как новый регулятор активности CYLD.

Spata2L отличается от мотива PIM, обнару-

Мы также обнаружили, что Spata2L являет-

женного в Spata2, тем не менее Spata2L также

ся одним из высокодостоверных совпадений в

может связываться с белком HOIP (рис. 1, b).

этом скрининге [26]. Белок Spata2 состоит из

Было убедительно продемонстрировано, что

N-концевого домена PUB и C-концевого доме-

HOIP взаимодействует с HOIL-1 и Sharpin с

на B-box, разделённых участком (a.о. 212-356),

образованием активной E3-лигазы, обозна-

взаимодействующим с белком HOIP [29]. Бе-

чаемой как LUBAC [32-34]. Однако белок

Рис. 1. Идентификация Spata2L как нового белка, взаимодействующего с CYLD. a и b) Клетки HEK293 были трансфи-

цированы вышеупомянутыми плазмидами, и было проведено осаждение шариками с антителами против Flag (IP - им-

мунопреципитация). Также был проведён с использованием метода иммуноблоттинга (IB) анализ взаимодействий

белка CYLD (a) или HOIP (b) с белками Spata2L и Spata2. c, d) IP-Анализ взаимодействий Spata2L (c) или Spata2 (d)

с CYLD и субъединицами белка LUBAC, HOIP, HOIL-1 и Sharpin в трансфицированных клетках HEK293.e) IP-Анализ

взаимодействий трансфицированных белков Spata2L или Spata2 с эндогенными белками CYLD или HOIP в клетках

HEK293, стимулированных TNFα или не подвергшихся стимуляции. Представлены результаты экспериментов, про-

ведённых независимо друг от друга, по крайней мере дважды. Представлены репрезентативные результаты

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

Spata2L И TLR4-ОПОСРЕДОВАННЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ

1713

Spata2L не связывается с HOIL-1 или Sharpin

системы редактирования генома CRISPR/

(рис. 1, c), что указывает на высокую специ-

Cas9 была получена линия мышей Spata2L KO,

фичность связывания с субъединицей HOIP

у которой делеция размером в 71 нуклеотид в

из комплекса LUBAC, хотя и намного более

экзоне 2 приводила к образованию прежде-

слабого, чем с белком CYLD (рис. 1, c). Вели-

временного стоп-кодона, вызывающего терми-

чины сродства связывания Spata2L с этими

нацию трансляции на самом N-конце белка

субъединицами LUBAC и белком CYLD были

Spata2L (рис. 2, a-c). Мыши с дефицитом бел-

сходными с параметрами связывания белка

ка Spata2L рождались в ожидаемом менделев-

Spata2 (рис. 1, d).

ском соотношении, и их развитие до взрослого

При проведении оценки взаимодействий

состояния протекало нормально. Это указыва-

белка Spata2L с эндогенными белками CYLD и

ет на то, что белок Spata2L может быть необя-

HOIP при их стимуляции белком TNFα или в

зательным для развития и роста в нормальных

отсутствие такой стимуляции нами было уста-

условиях.

новлено, что Spata2L взаимодействует сход-

Так как CYLD- и LUBAC-опосредованное

ным образом с эндогенными белками CYLD и

убиквитинирование играет важную роль в ре-

HOIP как в нестимулированных клетках, так

гуляции TLR-зависимого воспалительного

и в клетках, стимулированных белком TNFα

ответа, мы в первую очередь провели оценку

(рис. 1, e, дорожки 2 и 5). Были выявлены кон-

LPS-индуцированной транскрипции провос-

ститутивные взаимодействия в парах Spata2L-

палительных цитокинов в первичных клетках

CYLD и Spata2L-HOIP, напоминающие взаи-

BMDM, выделенных из мышей линии Spata2L

модействия Spata2 с CYLD и HOIP (рис. 1, e,

KO и контрольных мышей WT из одного помё-

дорожки 3 и 6) [26, 29]. В целом данные по свя-

та. После стимуляции LPS в клетках WT про-

зыванию белков предполагают, что Spata2L и

исходило значительное повышение уровня

Spata2 могут иметь сходные и, вероятно, избы-

мРНК провоспалительных цитокинов, вклю-

точные функции в регуляции процесса убикви-

чая IL-1β, IL-6, IL-12 и TNFα. Интересно,

тинирования белков с участием белков CYLD

что дефицит Spata2L в значительной степени

и LUBAC.

усиливал индукцию этих цитокиновых генов

Дефицит белка Spata2L усиливал индуциро-

(рис. 2, d).

ванную LPS экспрессию генов провоспалитель-

Дефицит белка Spata2L усиливал LPS-ин-

ных цитокинов в первичных макрофагах. Чтобы

дуцированную активацию NF-κB в первичных

изучить функции Spata2L in vivo, с помощью

макрофагах. Чтобы оценить влияние дефицита

Рис. 2. Дефицит белка Spata2L усиливал экспрессию генов провоспалительных цитокинов, индуцированную LPS.

а - Схематичное представление стратегии получения линии мышей Spata2L KO с использованием метода CRISPR/

Cas9. b, c - Анализ мутантных мышей Spata2L KO. Выравнивание последовательностей продуктов ПЦР, амплифи-

цированных из геномной ДНК, выделенной из мышей WT и гомозиготных мутантных мышей, показывает делецию

71 нуклеотида в мутантном аллеле (b). c - Результаты секвенирования и предсказанной трансляции мутантного алле-

ля; красный треугольник указывает положение делеции. d - BMDM-клетки WT и Spata2L KO либо не обрабатывались

LPS, либо были стимулированы LPS в течение 4 ч, и транскрипция провоспалительных цитокинов была проанализи-

рована с помощью метода RT-qPCR. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение;

* p < 0,05, ** p < 0,01 при непарном двухвыборочном t-критерии Стьюдента

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1714

ZHANG и др.

Рис. 3. Белок Spata2L имеет решающее значение для LPS-индуцированной активации NF-κB. Клетки BMDM, выде-

ленные из мышей WT и линии Spata2L KO, были стимулированы LPS или не были им обработаны. Далее, эти клетки

были использованы для приготовления клеточных лизатов для проведения анализа с помощью иммуноблоттинга фос-

форилированной (p - phosphorylated ) формы и общего белка в случае IκBα, JNK и p38. Представлены репрезентатив-

ные результаты двух независимых повторных экспериментов. Внизу показаны относительные уровни сигнала p-IκBα

Spata2L на TLR4-зависимую передачу сигна-

с помощью которого Spata2L осуществля-

ла, проводили стимуляцию клеток BMDM и

ет негативную регуляцию TLR4-зависимо-

изучали передачу сигнала, следующую после

го воспалительного ответа, нами была про-

TLR4. Утрата белка Spata2L оказывала неболь-

анализирована роль Spata2L в процессе

шой эффект или совсем не влияла на актива-

CYLD-опосредованного деубиквитинирова-

цию фосфорилирования белков p38 и JNK, а

ния TRAF6 и TAK1. Прикреплённый к эпи-

фосфорилирование IκBα (ингибитор NF-κB),

топному участку (epitope-tagged) убиквитин и

которое является этапом индукции в процес-

белки TRAF6 или TAK1 были совместно экс-

се активации NF-κB, немного повышалось в

прессированы в клетках HEK293. Далее, белки

клетках Spata2L KO в сравнении с клетками

TRAF6 или TAK1 были иммунопреципитиро-

WT (рис. 3). Эти результаты свидетельствуют

ваны для проведения анализа убиквитиниро-

о том, что белок Spata2L подавляет актива-

вания. Эктопическая экспрессия убиквитина

цию NF-κB в TLR4-зависимом воспалитель-

приводила к сильному полиубиквитинирова-

ном ответе. В то же время ранее нами было

нию молекул TRAF6 и TAK1 (рис. 4, дорожки 1

показано, что дефицит белка Spata2 оказывает

и 5). Как и ожидалось, при совместной экс-

небольшое влияние или вообще не влияет на

прессии белок CYLD взаимодействовал с бел-

TLR4-зависимую передачу сигнала и экспрес-

ками TRAF6 и TAK1 и понижал уровни их по-

сию провоспалительных цитокинов [26]. В це-

лиубиквитинирования (рис. 4, дорожки 3 и 7).

лом можно предположить, что белки Spata2L и

Вызывает особый интерес то, что дальнейшая

Spata2, несмотря на их сходство в структуре и

совместная экспрессия Spata2L не влияла на

сродстве связывания с ферментами, участву-

взаимодействия CYLD с TRAF6 и TAK1, но

ющими в убиквитинировании белков, игра-

отчётливо усиливала CYLD-опосредованное

ют разные роли в регуляции TLR4-зависи-

деубиквитинирование этих белков (рис. 4, до-

мого сигнального пути (рис. S1 Приложения

рожки 4 и 8). Эти результаты позволяют пред-

и рис. 1).

положить важную роль белка Spata2L в моду-

Spata2L способствовал CYLD-опосредо-

ляции деубиквитинирующей активности белка

ванному деубиквитинированию белков TRAF6

CYLD в отношении полиубиквитинирован-

иTAK1. Хорошо известно, что белок CYLD

ных белков TRAF6 и TAK1. Неудивительно,

необходим для удаления полиубиквитиновых

что экспрессия Spata2L в отсутствие CYLD

цепей из молекул TRAF6 и TAK, чтобы пре-

также вызывала снижение уровня полиубик-

дотвратить гиперактивацию сигнальных пу-

витинирования TRAF6 и TAK1 (рис. 4, дорож-

тей, опосредованных этими белками [22, 23].

ки 2 и 6), вероятно, стимулируя деубиквити-

Чтобы выяснить молекулярный механизм,

назную активность эндогенного белка CYLD.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

Spata2L И TLR4-ОПОСРЕДОВАННЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ

1715

Рис.

4. Spata2L способствовал CYLD-опосредованному деубиквитинированию белков TRAF6 и TAK1. Клетки

HEK293 трансфицировали вышеупомянутыми плазмидами с белками TRAF6 и TAK1 с прикреплённым Flag и затем

осаждали с помощью шариков с антителами против Flag для проведения анализа степени убиквитинирования с помо-

щью иммуноблоттинга (IB: HA) и определения их взаимодействий с белками CYLD (IB: CYLD) или Spata2L (IB: V5).

Представлены результаты трёх экспериментов, выполненных независимо друг от друга. Внизу представлены относи-

тельные величины уровня сигнала убиквитинирования

Важно, что Spata2L-опосредованное повыше-

идентифицирован как белок, взаимодейству-

ние активности CYLD оказалось специфич-

ющий с CYLD [26, 29, 38]. Однако функции

ным, поскольку Spata2L оказывал незначи-

белка Spata2L до сих пор оставались невыяс-

тельное воздействие на процесс стабилизации

ненными. В настоящей работе нами впервые

репрессора транскрипции Snail белком USP37,

были получены свидетельства о взаимодей-

одной из деубиквитинaз, которые мы ранее

ствии этого белка с CYLD и субъединицами

идентифицировали в качестве стабилизаторов

LUBAC и изучена его ключевая роль в моду-

белка Snail (рис. S2 Приложения) [35].

ляции TLR4-зависимого сигнального пути

и воспалительных ответов через регуляцию

CYLD-опосредованного деубиквитинирования

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

белков TRAF6 и TAK1.

Как основной негативный регулятор вос-

Белки CYLD с деубиквитиназной актив-

палительных ответов, белок CYLD сам должен

ностью широко признаны в качестве основ-

регулироваться соответствующим образом.

ных регуляторов иммунных и воспалительных

Было показано, что активность CYLD регули-

ответов и возможных мишеней для действия

руется путем посттрансляционных модифи-

лекарств при лечении расстройств иммунной

каций, таких как фосфорилирование и убик-

системы и рака [36, 37]. Понимание механизма

витинирование [22]. Появляется все больше

функционирования и регуляции активности

свидетельств о том, что белок CYLD распоз-

белка CYLD было бы полезно для разработ-

нает некоторые из своих субстратов не напря-

ки лекарств для лечения заболеваний челове-

мую, а через адапторные белки, из которых

ка. В ряде работ, включая наши, Spata2L был

лучше всех изучен белок Spata2 [26-30]. Spata2

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1716

ZHANG и др.

взаимодействует с белками CYLD и HOIP, ре-

Кроме того, сильное взаимодействие Spata2L

крутирует CYLD на комплекс TNF-RSC и

с белком HOIP приводит к предположению о

NOD2-SC в HOIP-зависимой манере и наце-

том, что Spata2L может играть роль в регуляции

лен на полиубиквитинированные белки, при-

активности HOIP в контексте вовлечения этой

сутствующие в этих комплексах (например,

E3-лигазы. Требуются дополнительные иссле-

RIPK1 и RIPK2) [27-30]. Кроме того, Spata2

дования физиологической и патологической

может выступать в качестве аллостерического

значимости взаимодействия этих двух белков.

активатора деубиквитинирующей активности

Дефицит белка Spata2L способствовал

белка CYLD [29, 30].

TLR4-зависимой передаче сигнала in vitro.

В настоящей работе нами было показано,

Представляет интерес изучение in vivo функ-

что подобно Spata2, белок Spata2L связывается

ции белка Spata2L в TLR4-индуцированном

и с CYLD, и с HOIP. Это позволяет предполо-

воспалении с использованием мышиных мо-

жить, что Spata2L также может рекрутировать

делей. Также, поскольку CYLD играет важную

CYLD на белковые комплексы TNF-RSC и

роль в регуляции гибели клеток, активации

NOD2-SC путём взаимодействия с белком

T- и B-клеток и противовирусном врождённом

HOIP, и, следовательно, он может быть во-

иммунитете, остаётся прояснить, вовлечён ли

влечён в TNFR- и NOD2-опосредованные пути

и Spata2L в регуляцию этих процессов [22, 24].

передачи сигнала. Иными словами, белки

В заключение, наша работа открывает

Spata2 и Spata2L могут быть избыточными в ре-

дверь к пониманию роли белка Spata2L в вос-

гуляции этих сигнальных путей. Однако было

палительном ответе и может привлечь внима-

обнаружено, что утрата только белка Spata2

ние к этой области исследований. Получен-

полностью предотвращала рекрутирование

ные нами результаты показывают, что белок

белка CYLD на комплекс TNF-RSC в клетках

Spata2L является ранее не охарактеризован-

U2OS, что указывает на то, что Spata2L может

ным регулятором TLR4-зависимой передачи

быть необязательным для этого процесса [29].

сигнала, предлагают новое механистическое

Кроме того, в нашей недавней работе было по-

понимание регуляции активности и функций

казано, что, в отличие от недостатка Spata2L,

белка CYLD и могут предложить новые потен-

дефицит белка Spata2 не влияет на процесс

циальные терапевтические мишени для лече-

активации NF-κB и экспрессию провоспали-

ния воспалительных заболеваний.

тельных цитокинов в первичных BMDM. В

целом эти результаты свидетельствуют против

Вклад авторов. X.-D. Yang - разработка

идеи о функциональной избыточности белков

проекта; Z. Zhang и S. Zhang - проведение экс-

Spata2 и Spata2L и благоприятствуют возмож-

периментов; X. Jiang, D. Wu и Y. Du - участие

ности того, что эти белки выполняют различ-

в проведении экспериментов; Z. Zhang, X. Jiang

ные функции в зависимости от типа клеток

и X.-D. Yang - анализ полученных результатов

или соответствующего контекста. Для провер-

и подготовка текста статьи; X.-D. Yang - руко-

ки этих предположений нужны дополнитель-

водство проектом.

ные исследования.

Финансирование. Эта работа была выпол-

В структурных исследованиях было пока-

нена при грантовой поддержке Национальной

зано, что Spata2 и OTULIN связываются с до-

программы ключевых исследований и разра-

меном PUB белка HOIP через консервативный

боток Китая

(2021YFA1301400), Основного

мотив PIM, а замена в этом мотиве консерва-

проекта поддержки науки и технологий му-

тивных аминокислотных остатков приводит к

ниципалитета г. Шанхай (ZD2021CY001), На-

значительному снижению степени связывания

ционального фонда естественных наук Китая

Spata2 с HOIP, но не сказывается на его взаи-

(31770818) и Шанхайской комиссии по науке и

модействии с CYLD [29], что предполагает

технологиям (21ZR1456300).

высокий уровень консервативности амино-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

кислотной последовательности мотива PIM.

отсутствии конфликта интересов в финансовой

Фрагмент белка в Spata2L отличается от соот-

или какой-либо иной сфере.

ветствующего мотива PIM в Spata2, и в нём от-

Соблюдение этических норм. Были соблю-

сутствуют предположительно имеющие боль-

дены все международные, национальные и ин-

шое значение аминокислотные остатки. Тем

ституциональные рекомендации по уходу и ис-

не менее белок Spata2L связывается с HOIP

пользованию животных.

так же сильно, как и Spata2. Это очевидное не-

Дополнительные материалы. Приложение к

соответствие указывает на то, что может по-

статье опубликовано на английском языке на сай-

требоваться пересмотр роли консервативной

те издательства Springer (https://link.springer.com/

последовательности PIM в различных белках.

article/10.1134/S0006297922090085).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

Spata2L И TLR4-ОПОСРЕДОВАННЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ

1717

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Hennessy, E. J., Parker, A. E., and O’Neill, L. A. (2010)

14.

Li, Q., Yan, J., Mao, A. P., Li, C., Ran, Y., et al.

Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics,

(2011) Tripartite motif 8 (TRIM8) modulates TNFα-

Nat. Rev. Drug Discov., 9, 293-307, doi: 10.1038/nrd3203.

and IL-1β-triggered NF-κB activation by targeting

Netea, M. G., Wijmenga, C., and O’Neill, L. A.

TAK1 for K63-linked polyubiquitination, Proc. Natl.

(2012) Genetic variation in Toll-like receptors and

Acad. Sci. USA, 108, 19341-19346, doi: 10.1073/

disease susceptibility, Nat. Immunol., 13, 535-542, doi:

pnas.1110946108.

10.1038/ni.2284.

15.

Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M.,

Murray, P. J., and Smale, S. T. (2012) Restraint of

and Karin, M. (1997) The IkappaB kinase complex

inflammatory signaling by interdependent strata of

(IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and

negative regulatory pathways, Nat. Immunol., 13, 916-

IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation

924, doi: 10.1038/ni.2391.

and NF-kappaB activation, Cell, 91, 243-252, doi:

Caballero, S., and Pamer, E. G. (2015) Microbiota-

10.1016/s0092-8674(00)80406-7.

mediated inflammation and antimicrobial defense

16.

Wang, C., Deng, L., Hong, M., Akkaraju, G. R.,

in the intestine, Annu. Rev. Immunol., 33, 227-256,

Inoue, J., et al. (2001) TAK1 is a ubiquitin-dependent

doi: 10.1146/annurev-immunol-032713-120238.

kinase of MKK and IKK, Nature, 412, 346-351, doi:

Fitzgerald, K. A., and Kagan, J. C. (2020) Toll-like

10.1038/35085597.

receptors and the control of immunity, Cell, 180,

17.

Israël, A. (2010) The IKK complex, a central regulator

1044-1066, doi: 10.1016/j.cell.2020.02.041.

of NF-kappaB activation, Cold Spring Harb Perspect.

Chen, Z. J. (2012) Ubiquitination in signaling to

Biol., 2, a000158, doi: 10.1101/cshperspect.a000158.

and activation of IKK, Immunol. Rev., 246, 95-106,

18.

Silverman, N., and Maniatis, T. (2001) NF-kappaB sig-

doi: 10.1111/j.1600-065X.2012.01108.x.

naling pathways in mammalian and insect innate immu-

Adhikari, A., Xu, M., and Chen, Z. J.

(2007)

nity, Genes Dev., 15, 2321-42, doi: 10.1101/gad.909001.

Ubiquitin-mediated activation of TAK1 and IKK,

19.

Kawai, T., and Akira, S. (2007) Signaling to NF-kappaB

Oncogene, 26, 3214-3226, doi: 10.1038/sj.onc.1210413.

by Toll-like receptors, Trends Mol. Med., 13, 460-469,

Carpenter, S., and O’Neill, L. A. (2009) Recent in-

doi: 10.1016/j.molmed.2007.09.002.

sights into the structure of Toll-like receptors and

20.

Yu, Y., Ge, N., Xie, M., Sun, W., Burlingame, S.,

post-translational modifications of their associated sig-

et al. (2008) Phosphorylation of Thr-178 and Thr-184

nalling proteins, Biochem. J., 422, 1-10, doi: 10.1042/

in the TAK1 T-loop is required for interleukin (IL)-1-

bj20090616.

mediated optimal NFkappaB and AP-1 activation

Xia, Z. P., Sun, L., Chen, X., Pineda, G., Jiang, X.,

as well as IL-6 gene expression, J. Biol. Chem., 283,

et al. (2009) Direct activation of protein kinases

24497-24505, doi: 10.1074/jbc.M802825200.

by unanchored polyubiquitin chains, Nature, 461,

21.

Mao, R., Fan, Y., Mou, Y., Zhang, H., Fu, S., et al.

114-119, doi: 10.1038/nature08247.

(2011) TAK1 lysine 158 is required for TGF-β-induced

10.

Reiley, W. W., Jin, W., Lee, A. J., Wright, A., Wu, X.,

TRAF6-mediated Smad-independent IKK/NF-κB

et al.

(2007) Deubiquitinating enzyme CYLD

and JNK/AP-1 activation, Cell. Signal., 23, 222-227,

negatively regulates the ubiquitin-dependent kinase

doi: 10.1016/j.cellsig.2010.09.006.

Tak1 and prevents abnormal T cell responses, J. Exp.

22.

Sun, S. C. (2010) CYLD: a tumor suppressor deubiq-

Med., 204, 1475-1485, doi: 10.1084/jem.20062694.

uitinase regulating NF-kappaB activation and diverse

11.

Thiefes, A., Wolf, A., Doerrie, A., Grassl, G. A.,

biological processes, Cell Death Differ., 17, 25-34, doi:

Matsumoto, K., et al. (2006) The Yersinia enterocolit-

10.1038/cdd.2009.43.

ica effector YopP inhibits host cell signalling by inac-

23.

Rothschild, D. E., McDaniel, D. K., Ringel-Scaia, V.

tivating the protein kinase TAK1 in the IL-1 signal-

M., and Allen, I. C. (2018) Modulating inflammation

ling pathway, EMBO Rep., 7, 838-44, doi: 10.1038/

through the negative regulation of NF-κB signaling,

sj.embor.7400754.

J. Leukoc. Biol., doi: 10.1002/jlb.3mir0817-346rrr.

12.

Lamb, A., Yang, X. D., Tsang, Y. H., Li, J. D.,

24.

Lork, M., Verhelst, K., and Beyaert, R. (2017) CYLD,

Higashi, H., et al. (2009) Helicobacter pylori CagA

A20 and OTULIN deubiquitinases in NF-κB signaling

activates NF-kappaB by targeting TAK1 for TRAF6-

and cell death: so similar, yet so different, Cell Death

mediated Lys 63 ubiquitination, EMBO Rep., 10, 1242-

Differ., 24, 1172-1183, doi: 10.1038/cdd.2017.46.

1249, doi: 10.1038/embor.2009.210.

25.

Mathis, B. J., Lai, Y., Qu, C., Janicki, J. S., and

13.

Fan, Y., Yu, Y., Shi, Y., Sun, W., Xie, M., et al. (2010)

Cui, T. (2015) CYLD-mediated signaling and diseases,

Lysine 63-linked polyubiquitination of TAK1 at lysine

Curr. Drug Target, 16, 284-294, doi: 10.2174/13894501

158 is required for tumor necrosis factor alpha- and

15666141024152421.

interleukin-1beta-induced IKK/NF-kappaB and

26.

Yang, X. D., Li, W., Zhang, S., Wu, D., Jiang, X.,

JNK/AP-1 activation, J. Biol. Chem., 285, 5347-5360,

et al. (2020) PLK4 deubiquitination by Spata2-CYLD

doi: 10.1074/jbc.M109.076976.

suppresses NEK7-mediated NLRP3 inflammasome

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1718

ZHANG и др.

activation at the centrosome, EMBO J., 39, e102201,

polyubiquitylation of NEMO in NF-kappaB activation,

doi: 10.15252/embj.2019102201.

Nat. Cell Biol., 11, 123-132, doi: 10.1038/ncb1821.

27. Kupka, S., De Miguel, D., Draber, P., Martino, L.,

33. Tokunaga, F., Nakagawa, T., Nakahara, M., Saeki, Y.,

Surinova, S., et al. (2016) SPATA2-mediated binding

Taniguchi, M., et al. (2011) SHARPIN is a component

of CYLD to HOIP enables CYLD recruitment to

of the NF-κB-activating linear ubiquitin chain as-

signaling complexes, Cell Rep., 16, 2271-80, doi:

sembly complex, Nature, 471, 633-636, doi: 10.1038/

10.1016/j.celrep.

nature09815.

28. Wagner, S. A., Satpathy, S., Beli, P., and

34. Emmerich, C. H., Schmukle, A. C., and Walczak, H.

Choudhary, C. (2016) SPATA2 links CYLD to the

(2011) The emerging role of linear ubiquitination

TNF-α receptor signaling complex and modulates the

in cell signaling, Sci. Signal., 4, re5, doi: 10.1126/

receptor signaling outcomes, EMBO J, 35, 1868-1884,

scisignal.2002187.

doi: 10.15252/embj.201694300.

35. Qian, W., Li, Q., Wu, X., Li, W., Li, Q., et al. (2020)

29. Elliott, P. R., Leske, D., Hrdinka, M., Bagola, K.,

Deubiquitinase USP29 promotes gastric cancer cell

Fiil, B. K., et al. (2016) SPATA2 links CYLD to

migration by cooperating with phosphatase SCP1

LUBAC, activates CYLD, and controls LUBAC

to stabilize Snail protein, Oncogene, 39, 6802-6815,

signaling, Mol. Cell,

63,

990-1005, doi:

10.1016/

doi: 10.1038/s41388-020-01471-0.

j.molcel.2016.08.001.

36. Lopez-Castejon, G., and Edelmann, M. J. (2016)

30. Schlicher, L.,Wissler,M., Preiss, F., Brauns-Schubert, P.,

Deubiquitinases: novel therapeutic targets in immune

Jakob, C., et al. (2016) SPATA2 promotes CYLD

surveillance, Mediators Inflamm.,

2016,

3481371,

activity and regulates TNF-induced NF-κB signaling

doi: 10.1155/2016/3481371.

and cell death, EMBO Rep., 17, 1485-1497, doi:

37. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., and Jack-

10.15252/embr.201642592.

son, S. P. (2018) Deubiquitylating enzymes and drug

31. Wei, R., Xu, L. W., Liu, J., Li, Y., Zhang, P., et al.

discovery: emerging opportunities, Nat. Rev. Drug

(2017) SPATA2 regulates the activation of RIPK1 by

Discov., 17, 57-78, doi: 10.1038/nrd.2017.152.

modulating linear ubiquitination, Genes Dev., 31,

38. Sowa, M. E., Bennett, E. J., Gygi, S. P., and Harper, J. W.

1162-1176, doi: 10.1101/gad.299776.117.

(2009) Defining the human deubiquitinating en-

32. Tokunaga, F., Sakata, S., Saeki, Y., Satomi, Y.,

zyme interaction landscape, Cell, 138, 389-403, doi:

Kirisako, T., et al.

(2009) Involvement of linear

10.1016/j.cell.2009.04.042.

Spata2L SUPPRESSES TLR4 SIGNALING BY PROMOTING CYLD-MEDIATED

DEUBIQUITINATION OF TRAF6 AND TAK1

Z. Zhang^1,2#, S. Zhang^1,2#, X. Jiang^1,2#, D. Wu^1,2, Y. Du³, and X.-D. Yang^1,2,4,5*

¹Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China; e-mail: xdyang@shsmu.edu.cn

²Department of Immunology and Microbiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China

³Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,

200025 Shanghai, China

⁴The Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanghai Institute of Infectious Diseases and Biosecurity,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 201203 Shanghai, China

⁵Center for Traditional Chinese Medicine and Immunology Research, School of Basic Medical Sciences,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 201203 Shanghai, China

Toll-like receptor 4 (TLR4) is a key pattern recognition receptor that can be activated by bacterial

lipopolysaccharide to elicit inflammatory response. Proper activation of TLR4 is critical for the host defense

against microbial infections. Since overactivation of TLR4 causes deleterious effects and inflammatory

diseases, its activation needs to be tightly controlled by negative regulatory mechanisms, among which the most

pivotal could be deubiquitination of key signaling molecules mediated by deubiquitinating enzymes (DUBs).

CYLD is a member of the USP family of DUBs that acts as a critical negative regulator of TLR4-depedent

inflammatory responses by deconjugating polyubiquitin chains from signaling molecules, such as TRAF6 and

TAK1. Dysregulation of CYLD is implicated in inflammatory diseases. However, how the function of CYLD

is regulated during inflammatory response remains largely unclear. Recently, we and other authors have shown

that Spata2 functions as an important CYLD partner to regulate enzymatic activity of CYLD and substrate

binding by this protein. Here, we show that a Spata2-like protein, Spata2L, can also form a complex with CYLD

to inhibit the TLR4-dependent inflammatory response. We found that Spata2L constitutively interacts with

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022