БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 12, с. 2065 - 2077

УДК 57.013

ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА В МОЛОКЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ОДНОДОМЕННЫХ АНТИТЕЛ

Т.И. Иванова², С.В. Тиллиб²*

¹ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет,

119234 Москва, Россия; электронная почта: liliya106@mail.ru

² Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, Россия; электронная почта: tillib@genebiology.ru

Поступила в редакцию 24.06.2022

После доработки 27.10.2022

Принята к публикации 27.10.2022

Благодаря уникальной структуре и свойствам лактоферрин в молоке человека (hLF) обладает мно-

жеством необходимых для младенцев питательных и укрепляющих здоровье функций, например,

обеспечивает защиту от бактериальных инфекций и воспаления. Недостаток лактоферрина в жен-

ском молоке или в молочных смесях может приводить к нежелательному ослаблению иммуните-

та детей. Определение уровня hLF необходимо для контроля качества молока с целью возможной

терапевтической коррекции. Перспективным методом количественного определения и контроля

концентрации hLF в молоке и молочных продуктах может стать неконкурентный формат поля-

ризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPIA), не требующий обязательного разделения

связанных и свободных форм белков и длительной пробоподготовки образцов. Применение в ка-

честве распознающих реагентов флуоресцентно меченных однодоменных антител верблюда («на-

нотел») позволяет количественно определять молекулы (антигены) относительно большего разме-

ра, в частности лактоферрин человека, методом FPIA. В данной работе использованы конъюгаты

с флуоресцеин изотиоцианнатом (FITC) двух ранее полученных однодоменных антител anti-hLf5 и

anti-hLf16, специфически узнающих различные эпитопы лактоферрина человека, но не узнающих

лактоферрин козы. Изучена кинетика взаимодействия FITC-меченных нанотел с hLF. Определены

в растворе константы диссоциации (K_D) для антител FITC-anti-Lf5 и FITC-anti-Lf16 с hLF, которые

составили 3,2 ± 0,3 нМ и 4,9 ± 0,4 нМ соответственно, что свидетельствует об их высокоаффин-

ном связывании с лактоферрином человека. Разработан протокол FPIA, подобраны концентрации

FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16, которые дают оптимальный флуоресцентный сигнал и стабиль-

ное значение поляризации. Получена зависимость поляризации флуоресценции от концентрации

hLF для неконкурентного FPIA c антителами FITC-anti-hLf5 и определены аналитические харак-

теристики: предел обнаружения 2,1 ± 0,2 мкг/мл и линейный диапазон для определения концен-

траций - 3-10 мкг/мл. Метод FPIA обычно применяется для определения низкомолекулярных

веществ. Однако в данной работе продемонстрирована принципиальная возможность распро-

странения этого метода и для определения высокомолекулярных белков (лактоферрина человека)

в биологической жидкости (молоке), если использовать в качестве распознающего реагента флуо-

ресцентно меченные малые однодоменные антитела.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: однодоменное антитело, нанотело, лактоферрин, поляризация флуоресценции,

иммуноанализ.

DOI: 10.31857/S0320972522120211, EDN: NIWPGN

ВВЕДЕНИЕ

60% идентичности аминокислотной последо-

вательности с трансферрином сыворотки кро-

Лактоферрин (LF) - гликопротеин массой

ви [1, 2]. Впервые LF был выделен из коровьего

примерно 80 кДа, содержащий 690 а.о., явля-

молока в 1939 г. Соренсеном, а в 1960 г. Йохан-

ется членом семейства трансферринов и имеет соном был выделен лактоферрин из молока

Принятые сокращения: anti-hLf - нанотела против лактоферрина человека; FITC - флуоресцеин-5-изотиоцианнат

изомер 1; FP - поляризация флуоресценции; FPIA - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ; hLF - лакто-

феррин человека; LF - белок лактоферрин.

* Адресат для корреспонденции.

2065

2066

МУХАМЕТОВА и др.

человека (hLF) [1]. В настоящее время извест-

резонанс на основе иммуносенсоров [12], ка-

но, что LF присутствует не только в молоке

пиллярный электрофорез

[13], ультра-высо-

млекопитающих, но также является компо-

коэффективная жидкостная хроматография в

нентом многих физиологических жидкостей,

сочетании с тандемной масс-спектрометри-

таких как слюна, слезы, сперма и секреты сли-

ей (UHPLC-MS/MS) [14], высокоэффективная

зистых оболочек, а также является важным

жидкостная хроматографии с обращенной фа-

компонентом нейтрофильных гранул лейко-

зой (RP-HPLC) [15, 16]. Показана возможность

цитов [1, 3]. В организме человека hLF уча-

определения лактоферрина человека гомоген-

ствует во многих биологических процессах,

ным иммунохимическим методом с использо-

таких как защита организма, ингибирование

ванием переноса возбуждения и флуориметрии

роста опухоли, он обладает антимикробной,

с фазовым разрешением [17]. Для определения

антибактериальной, противовирусной и про-

лактоферрина человека сегодня чаще всего ис-

тивопаразитарной активностями и регулирует

пользуют иммуноферментный анализ (ELISA),

ферментативную активность рибонуклеазы А,

и на рынке присутствуют коммерческие набо-

клеточную пролиферацию и дифференциров-

ры, например, https://www.hycultbiotech.com/

ку [4-6]. LF эффективно связывает ионы Fe³⁺

hk329-02. Указанный набор, базирующийся

(с K_D около 10^-20 М) [7] и играет важную роль

на «sandwich-ELISA», позволяет примерно за

в регулировании уровня свободного железа в

3,5 ч. определить концентрацию hLF в раз-

жидкостях организма [8].

ных биологических жидкостях человека (по-

Концентрация лактоферрина в грудном

сле соответствующих разведений до нужно-

молоке человека выше, чем в коровьем моло-

го диапазона) c высокой чувствительностью

ке [9]. Кроме того, концентрация LF в молоке

(0,4-100 нг/мл). Метод UHPLC-MS/MS, об-

сильно варьируется в зависимости от стадий

ладающий особенно высокой чувствительно-

лактации и у разных видов. Человеческое моло-

стью, может быть использован для определе-

зиво содержит более 5 г/литр hLF по сравнению

ния LF в переработанном молоке и молочных

с 2-3 г/литр в зрелом грудном молоке. Содер-

продуктах. Однако количественная оценка LF

жание LF в коровьем молозиве составляет при-

была разработана с применением в качестве

близительно 0,8 г/литр, тогда как в коровьем

стандартов пептидов, полученных из гидроли-

молоке содержится всего 0,03-0,49 г/литр. Бо-

затов бычьего лактоферрина, а это означает,

лее высокое количество hLF в молозиве обе-

что UHPLC-MS/MS не может отличить на-

спечивает защиту младенцев, находящихся на

тивный лактоферрин от денатурированного.

грудном вскармливании, от бактериальной

RP-HPLC можно использовать для определе-

инфекции и воспаления. В тех случаях, ког-

ния нативного лактоферрина, однако показа-

да содержание лактоферрина в молоке матери

но, что результаты, полученные данным ме-

оказывается чрезвычайно низким, считается

тодом, не сочетались с методом HPLC. Таким

целесообразным добавлять его к рациону де-

образом, RP-HPLC может быть недостаточно

тей, особенно недоношенных. Это также важ-

чувствительным для определения лактофер-

но для детей, которые находятся на искусствен-

рина в коммерческом молоке и молочных про-

ном вскармливании, в случае вынужденного

дуктах с низким содержанием лактоферри-

прекращения грудного вскармливания при бо-

на. Разработаны и апробированы колонки с

лезни матери или приеме препаратов, которые

HITRAP^TM Heparin HP [18] или аптамером [19]

могут оказать негативное действие на здоровье

для обогащения лактоферрином с последую-

грудного ребенка [10]. Пастеризация грудного

щим количественным определением на HPLC.

молока для кормления недоношенных и боль-

Однако к недостаткам данных методов можно

ных детей, процессы переработки молока и мо-

отнести длительную пробоподготовку, исполь-

лочных продуктов могут нарушать структуру и,

зование дорогостоящего оборудования и высо-

как следствие, функцию LF, что может повли-

коквалифицированного персонала.

ять на стабильность его свойств [5]. В связи с

На основе проведенного анализа литератур-

вышесказанным очевидна востребованность

ных данных и нашего предшествующего опыта

разработки быстрых, эффективных и эконо-

мы предположили, что для определения натив-

мичных методов количественного определения

ного лактоферрина в женском молоке весьма

hLF в молоке и молочных продуктах.

перспективным может оказаться использова-

К настоящему времени продемонстри-

ние метода поляризационного флуоресцент-

ровано множество различных подходов для

ного иммуноанализа (FPIA), в котором флуо-

определения LF (в основном на моделях LF

ресцентно меченные однодоменные антитела

из молока коровы): иммуноферментный ана-

(«нанотела») используются в качестве распоз-

лиз (ELISA) [11], поверхностный плазмонный

нающих реагентов. FPIA не требует сложных

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2067

операций, например, таких как разделение

Использование миниатюрных верблюжьих

связанных и свободных форм белков, длитель-

однодоменных антител («нанотел») размером

ной пробоподготовки образцов и трудоемких

12-15 кДа (2 × 4 нм) может быть перспектив-

процедур, которые обычно используют в ана-

ным для разработки FPIA-определения бел-

лизе пищевых продуктов, клинических и био-

ков. Нанотело (наноантитело, VHH) пред-

медицинских анализах [20]. Важно отметить,

ставляет собой рекомбинантный белок,

что длительность анализа составляет не более

соответствующий вариабельному антигенсвя-

5 мин и калибровочная зависимость стабильна

зывающему домену особых антител, состоя-

и не требует повторения при каждом анализе.

щих из гомодимера укороченной тяжелой цепи

Методика FPIA для определения лактоферрина

при отсутствии легких цепей. Такие антитела

в женском молоке позволила бы быстро и точно

были обнаружены у представителей семейства

определять данный белок. Большинство мето-

Верблюдовые и у хрящевых рыб [26, 27]. Нано-

дик FPIA являются конкурентными анализами,

тела очень стабильны в широком диапазоне

в которых анализируемый и меченный флуорес-

температур и рН, способны быстро ренатури-

центной меткой аналит (трейсер) конкурент-

ровать с полным восстановлением активности,

но связываются с антителом. Первоначально

они способны узнавать особые эпитопы анти-

данный метод был разработан для определения

генов (активные центры ферментов, неболь-

низкомолекулярных аналитов (антибиотиков,

шие углубления), которые не узнаются класси-

микотоксинов, пестицидов) [20, 21]. Величина

ческими антителами. В лаборатории соавторов

сигнала поляризации флуоресценции (FP) тео-

этой статьи уже на протяжении 20 лет ведется

ретически может изменяться от 0 до 0,5; в рас-

работа по получению и использованию нано-

четах обычно используют величину миллипо-

тел для широкого спектра приложений [28-31],

ляризации флуоресценции (mР). FP зависит от

в том числе при их участии были получены

гидродинамического радиуса (относительного

высокоспецифические нанотела против лак-

размера) флуоресцирующего соединения, и при

тоферрина человека [29]. Нанотела все актив-

связывании низкомолекулярного трейсера (с

нее используются в последние годы для многих

молекулярной массой меньше 5 кДа) с белками

иммунобиотехнологических исследований, и

или антителами существенно большего размера

их можно рассматривать как перспективный

гидродинамический радиус заметно увеличива-

дополнительный инструмент наряду с тради-

ется и наблюдается большее изменение степе-

ционными антителами и их производными.

ни поляризации (ΔmP). В случае же крупного

Благодаря своей небольшой молекулярной

анализируемого вещества, такого, например,

массе флуоресцентно меченное нанотело мо-

как белок среднего размера (примерно 60 кДа),

жет быть перспективным в качестве распозна-

ΔmP будет небольшим и применение FPIA за-

ющего реагента для целевого белка-мишени,

труднительно, поскольку разница в гидродина-

имеющего существенно больший размер, чем

мическом радиусе между свободным аналитом и

нанотело в методе неконкурентного FPIA.

аналитом, связанным с белком близкого размера

Цель настоящей работы - демонстрация

или антителом, в этом случае крайне невелика.

принципиальной возможности использования

Применение неконкурентного формата

однодоменных антител для разработки мето-

FPIA позволяет разработать методы анализа

дов определения в биологической жидкости

для определения крупных молекул. С помощью

целевого антигена на основе неконкурентно-

флуоресцентно меченных Fab-фрагментов ан-

го FPIA. Полученные нами ранее нанотела

тител был разработан неконкурентный FPIA

против лактоферрина человека были исполь-

для количественного определения С-реактивно-

зованы в качестве распознающего реагента для

го белка [22]. Метод FPIA был продемонстриро-

определения лактоферрина человека в молоке.

ван для обнаружения вирусных частиц [23-25].

Однако применение таких вариантов некон-

курентного FPIA ограничено высоким фоном

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

или низкой чувствительностью. Кроме про-

блемы малого изменения сигнала поляризации

FITC (флуоресцеин-5-изотиоцианнат изо-

флуоресценции при взаимодействии молекул с

мер 1, «Sigma» США), клоны-продуценты на-

высокой молекулярной массой часто возника-

нотел верблюда против лактоферрина человека

ет неспецифическая адсорбция, которая также

anti-hLf5 (20,1 кДа) и anti-hLf16 (20 кДа) [29],

может быть серьезной проблемой в FPIA. Таким

лактоферрин человека (hLF, 80 кДа) и четы-

образом, выбор антигенсвязывающих молекул

ре образца женского молока (№№ 1-4) были

с более низкой молекулярной массой является

любезно предоставлены Садчиковой Е.Р. (Ин-

перспективным для развития метода FPIA.

ститут биологии гена РАН, Москва). Так же в

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

20*

2068

МУХАМЕТОВА и др.

работе использовали смесь апо- и холо-транс-

бумина, сывороточного альбумина человека,

ферринов человека (hTF), бычий сывороточ-

трансферрина человека и др. Концентрации

ный альбумин (BSA), сывороточный альбумин

стандартных растворов реагентов составляли

человека (HSA), лизоцим человека (LYZ) и ка-

(0, 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл).

зеин (Cas) фирмы «Sigma-Aldrich» США.

Анализ образцов молока. Для оценки опре-

Получение FITC-меченных нанотел про-

деления лактоферрина человека в натураль-

тив hLF. Используя ранее полученные бактери-

ное козье молоко был добавлен стандартный

альные клоны-продуценты [29], нанотела LF5

раствор hLF до конечных концентраций 0,5

и LF16, специфически узнающие лактоферрин

и 1 мг/мл. Молоко центрифугировали 15 мин

человека (анти-hLf), но не узнающие лактофер-

(4000 g) для удаления жира, разбавляли в 20, 40

рин козы, были наработаны в периплазме бак-

и 80 раз 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,4),

терий, выделены из периплазматического экс-

содержавшим 150 мМ NaCl, и использовали для

тракта с помощью металл-хелатной аффинной

неконкурентного FPIA. Для валидации мето-

хроматографии, охарактеризованы с помощью

да FPIA все образцы молока были проанализи-

хроматографического, электрофоретического и

рованы методом иммуноферментного анализа с

иммуноферментного анализа, как описано ра-

использованием набора hLF ELISA («XEMA»),

нее [29]. Полученные нанотела конъюгировали

который в настоящее время проходит регистра-

с FITC и очищали, как описано ранее [32], и

цию и выпускается как опытная партия.

характеризовали как по содержанию белка, так

и по степени модификации аминогрупп белка

спектрофотометрически. Концентрации анти-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

тел были определены, используя расчетные ко-

эффициенты экстинкции ε₂₈₀ = 29780 M^-1 cм^-1

В данной работе были использованы од-

(anti-hLf-5 0,68 мг/мл) и ε₂₈₀ = 28260 M^-1 cм^-1

нодоменные нанотела верблюда, anti-hLf5 и

(anti-hLf-16 0,71 мг/мл) [33]. Молярный коэф-

anti-hLf16, ранее полученные к различным

фициент экстинкции FITC - 73,000 M^-1 cм^-1.

эпитопам лактоферрина человека [29]. Было

Иммуноферментный метод

определе-

показано, что каждое нанотело связывает прак-

ния (ELISA) лактоферрина человека был про-

тически весь hLF в молоке [29], из чего можно

веден, используя набор LF ELISA («ХЕМА»,

предположить, что узнаваемые этими наноте-

Россия), согласно инструкции производите-

лами эпитопы hLF остаются доступными для

ля. Поглощение для LF ELISA было измерено

связывания как в случае мономерных, так и в

при длине волны 450 нм, используя микро-

случае олигомерных форм hLF. По предвари-

планшетный фотометр Bio-Rad 680 («Bio-Rad

тельным данным относительно связывания на-

Laboratories Inc.», США).

нотелами пептидов, полученных при частичном

Неконкурентный FPIA был выполнен на

переваре hLF пепсином, при использовании

портативном флуориметре Sentry-200 («Ellie»,

нанотела anti-hLf5 связывания не наблюдали,

США), при λ_ex/λ_em - 495/530 нм. Готовили ра-

тогда как нанотело anti-hLf16 сохраняло спо-

бочий раствор (TWS) FITC-anti-hLf, чтобы

собность связывать в переваре наибольший

интенсивность флуоресценции раствора со-

пептид размером 35 кДа. Таким образом, мож-

ставляла около 200 000. Готовили стандартные

но предполагать, что по крайней мере одно

растворы hLF, проверяя в нескольких разведе-

(anti-hLf16) из двух используемых в работе на-

ниях концентрацию спектрофотометрически,

нотел способно связывать не только целый бе-

используя ε₂₈₀ = 8,85 10⁴ M^-1 см^-1 [34]. Затем

лок, но и отдельный пептид этого белка (или

к 950 мкл TWS добавляли 50 мкл стандартно-

денатурированный белок, содержащий этот

го раствора hLF различных концентраций (0,

пептид). Мы не наблюдали заметных различий

0,01; 0,1; 1; 3; 10; 20; 40; 100 и 1000 мкг/мл) и

в результатах при использовании по отдель-

измеряли изменение сигнала поляризации

ности каждого из этих двух нанотел в качестве

флуоресценции (mP) и интенсивность ис-

трейсеров. Можно предполагать, что эффекты

следуемого раствора после 5 мин инкубации

возможной частичной денатурации hLF не яв-

при комнатной температуре. Каждый экспе-

ляются существенными при детекции hLF с по-

римент был выполнен в двух повторах и трех

мощью используемых нанотел. Данные антите-

аппаратных измерениях. Перекрестные реак-

ла высокоспецифичны к hLF и не связываются

ции данных нанотел были изучены, измеряя

с лактоферрином козы [29].

изменение поляризации флуоресценции при

В данной работе использовали адапти-

добавлении к 950 мкл рабочему раствору трей-

рованные нанотела, содержащие на С-конце

сера (FITC-anti-hLf) 50 мкл стандартных рас-

длинную линкерную последовательность (из

творов казеина, бычьего сывороточного аль-

28 а.о. длинного варианта шарнирного участ-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2069

ка неканонического верблюжьего антитела),

титела FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 де-

после которой расположены два пептидных

монстрировали значение поляризации флуо-

фрагмента: фрагмент из 9 а.о. YPYDVPDYA

ресценции 125 ± 1 mP.

(HA-tag) и последовательность из 6 остатков

Изучение кинетики связывания нанотел

гистидина (His-tag). Линкерный линейный

FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 с лактофер-

участок содержит 4 удобно расположенные

рином человека изучали в широком диапазоне

и хорошо доступные а.о. лизина, по которым

концентраций белка. Были приготовлены стан-

удобно проводить конъюгирование с другими

дартные растворы hLF (0,125 Нм - 12 мкМ) в

молекулами.

10 мМ фосфатном буфере рН 7,4, содержавшем

В работе были получены и охарактеризо-

150 мМ NaCl (PBS). Для измерения сигнала FP

ваны FITC-меченные производные данных

в пробирке смешивали 50 мкл стандартно-

антител: FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 со-

го раствора hLF с 950 мкл рабочих растворов

ответственно.

антител FITC-anti-hLf5 или FITC-anti-hLf16.

Соотношение anti-hLf/FITC определяли

Пробирку помещали в портативный флуори-

по спектрам поглощения меченных антител в

метр Sentry-200 и изучали кинетику связы-

10 мМ PBS (pH 7,4) по уравнению (1):

вания лактоферрина (конечные концентра-

ции hLF составили 6 пМ - 625 нМ с рабочими

FITC

A₄₉₂ * ε_anti-hLf

(1)

растворами FITC-anti-hLf5 или FITC-anti-hLf16

anti-hLf

(A₂₈₀ - C * A₄₉₂) * ε_FITC

в течении 1 ч). На рис. 1 в качестве примера

где A₄₉₂ - поглощение конъюгата на длине вол-

представлена зависимость сигнала FP от вре-

ны максимума поглощения FITC (492 нм),

мени при конечной концентрации hLF 10 нМ.

A₂₈₀ - поглощение образца на длине волны мак-

Быстрое увеличение сигнала и достижение

симума поглощения антител (280 нм), ε_anti-hLf -

равновесия за 1-2 мин при комнатной темпе-

молярный коэффициент экстинкции антитела

ратуре свидетельствовало о высокоаффинном

на длине волны 280 нм, ε_FITC - мольный ко-

связывании белок/нанотело (рис. 1). В даль-

эффициент экстинкции FITC на длине вол-

нейшем при изучении связывания флуорес-

ны максимума поглощения (73 000 М^-1 cм^-1),

центно меченных нанотел с лактоферрином

C - фактор коррекции для FITC на длине вол-

сигнал FP мы измеряли после 5 мин инкуба-

ны 280 нм (С = 0,35). Соотношение FITC/anti-

ции. В настоящее время известно, что лакто-

hLf составило приблизительно 1 : 1, данное со-

феррин способен образовывать ассоциаты, а

отношение является оптимальным, поскольку

уровень олигомеризации зависит от концен-

дальнейшее увеличение соотношения белок/

траций hLF, KCl, NaCl, а также от продол-

краситель не приводит к увеличению флуорес-

жительности хранения белка в растворе [36].

центного сигнала.

Для того, чтобы исключить влияние олиго-

Необходимым условием для разработки

меризации hLF мы изучили стабильность

эффективных диагностических систем явля-

сигнала FP в широком диапазоне концентра-

ется полная характеристика специфичности и

ций hLF (6 пМ - 625 нМ). Нами показано, что

аффинности применяемых антител [35]. Для

для всего изученного диапазона концентраций

аналитического метода на основе FPIA важ-

сигнал FP после достижения максимального

ным является определение константы связыва-

значения в течение 2 мин инкубации сохра-

ния антигена с антителом в растворе, которая

нялся в течение часа. Эти данные могут сви-

может существенно отличаться от константы

детельствовать о том, что за время инкубации

связывания с антителами, иммобилизованны-

не происходит агрегации лактоферрина в ис-

ми на поверхности. Мы определили аффинно-

следуемом растворе, которая приводила бы

сти антител FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16

к увеличению сигнала FP. Кроме того, кине-

в отношении hLF и оценили возможность их

тика связывания лактоферрина с нанотелами

использования для количественного определе-

FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 была также

ния лактоферрина в молоке методом поляри-

изучена при различном времени прединку-

зационного флуоресцентного иммуноанализа.

бации стандартных растворов лактоферри-

Для разработки протокола FPIA были вы-

на (125 пМ - 12 мкМ) перед измерением FP.

браны рабочие растворы FITC-anti-hLf5 и

Однако даже при прединкубации стандарт-

FITC-anti-hLf16 с концентрациями, которые

ных растворов при комнатной температуре в

дают оптимальный флуоресцентный сигнал

течение 8 ч перед проведением анализа сиг-

и, следовательно, стабильное значение по-

нал FP оставался на том же уровне (данные

ляризации. При концентрациях в интерва-

не приведены), что свидетельствует об от-

ле 2,5-5 нМ соотношение сигнал/шум было

сутствии влияния возможной олигомериза-

оптимальным. Флуоресцентно меченные ан-

ции hLF на анализ.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

2070

МУХАМЕТОВА и др.

Рис. 1. Кинетика связывания FITC-anti-hLf5 (1) и FITC-anti-hLf16 (2) (оба в концентрации 5 нМ) с hLF (10 нМ)

в 10 мМ PBS (рН 7,4) при 25 °С. Измерения проводили трижды, результаты представлены как среднее значение ± SD

Известно, что метод FPIA удобен для харак-

Флуоресцентно меченные нанотела FITC-anti-

теристики взаимодействий белок/лиганд [34,

Lf5 и FITC-anti-Lf16 были получены нами в

36]. Уравнение (2) описывает реакцию связы-

трех независимых экспериментах, и вариация

вания между трейсером (FITC-anti-Lf) и бел-

сигнала FP в данном эксперименте не превы-

ком hLF:

шала 10%.

Константу диссоциации (K_D) для пар

hLF + anti-Lf-FITC ⇄ (hLF* FITC-anti-Lf). (2)

FITC-anti-Lf5 и hLF определяли с использо-

ванием постоянной концентрации трейсера

Если концентрация [FITC-anti-Lf] мно-

2,5 нМ, при которой получались устойчивые

го меньше концентрации [hLF], поляризация

значения FP, оптимальное соотношение сиг-

флуоресценции может быть выражена уравне-

нал/шум и, кроме того, они были ниже ожи-

нием (3) [37]:

даемой величины K_D и увеличивающихся кон-

центраций hLF, превосходящих ожидаемую

[hLF]

mP = (mP_max - mP_min) ·

+ mP_min,

(3)

величину K_D. Концентрации hLF варьировали

K_D-[hLF]

от 0 до 50 нМ. Величины сигнала поляризации

где mP_min - это поляризация флуоресценции

флуоресценции (mP) были аппроксимирова-

свободного флуорофора FITC-anti-Lf5, mP_max -

ны по уравнению (2) и вычислены K_D. Равно-

FP для комплекса hLF*FITC-anti-Lf5; [hLF] -

весные константы диссоциации для антител

концентрация лактоферрина, а K_D - константа

FITC-anti-Lf5- и FITC-anti-Lf16- составили

диссоциации комплекса hLF*FITC-anti-Lf.

3,2 ± 0,3 нМ и 4,9 ± 0,4 нМ соответственно.

На рис. 2 представлена кривая связыва-

Как видно, оба антитела имеют достаточно

ния трейсеров FITC-anti-Lf5 и FITC-anti-Lf16

низкие константы диссоциации, что свиде-

(2,5 нМ) и различных концентраций hLF. Как

тельствует о высокоаффинном связывании с

видно, с увеличением концентрации белка hLF

лактоферрином.

величина FP увеличивается и достигает мак-

Белки, входящие в состав матрицы физи-

симальных значений при полном связывании

ологических жидкостей, как и белки, которые

трейсера с антителом. Как видно из представ-

часто используются в приготовлении буферов

ленного рисунка, изменение поляризации флуо-

или структурно подобные лактоферрину, по-

ресценции (ΔmP) составило 30-35 ед. Данная

тенциально могут влиять на значение сигна-

величина была достигнута благодаря приме-

ла FP и на точность анализа. Мы исследовали

нению однодоменных нанотел, которые име-

на этот предмет ряд нецелевых белков (сыво-

ют низкий молекулярный вес (около 20 кДа).

роточный альбумин быка и человека, казеин,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2071

Рис. 2. Изменение сигнала FP в зависимости от концентрации hLF в присутствии 2,5 нМ FITC-anti-Lf5 (1) и FITC-

anti-Lf16 (2) (рН 7,4) при 25 °С. Измерения проводили трижды, результаты представлены как среднее значение ± SD

Рис. 3. Специфичность основных белков на связывание с FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 (рН (7,4) при 25 °С). Кон-

центрация стандартного раствора hLF составила 40 мкг/мл, других реагентов - 1000 мкг/мл. Измерения проводили

трижды, результаты представлены как среднее значение ± SD

лизоцим, трансферрин человека) в неконку-

далось, что свидетельствует о высокой аффин-

рентном FPIA, используя FITC-anti-hLf5 и

ности используемых антител только к hLF.

FITC-anti-hLf16 (рис. 3). К рабочему раствору

На рис. 3 представлено изменение сигнала FP

антител добавляли различные концентрации

при высоких концентрациях этих белков, и,

вышеперечисленных белков (1-1000 мкг/мл)

как видно из данного рисунка, они не вызы-

и измеряли сигнал поляризации флуоресцен-

вали изменения сигнала, что свидетельству-

ции через 5 мин инкубации. При данных кон-

ет о высокоспецифичном связывании FITC-

центрациях потенциальных кросс-реагентов

anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 с лактоферрином

изменение сигнала FP практически не наблю-

человека.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

2072

МУХАМЕТОВА и др.

Для определения лактоферрина челове-

определять содержания данного белка при раз-

ка в молоке был использован метод введено/

ведении более чем в 200 раз методом FPIA.

найдено. Антитела anti-hLf5 и anti-hLf16 не

Так как FITC-anti-hLf5 связывалось с hLF

связываются с лактоферрином козы, поэтому

с большим сродством, то в качестве распоз-

в экспериментах использовали натуральное

нающего реагента было выбрано данное на-

козье молоко, в которое добавляли точное ко-

нотело. На рис. 4, а представлена стандартная

личество hLF.

зависимость поляризации флуоресценции от

Известно, что молоко является довольно

концентрации hLF, полученная при некон-

сложной матрицей для проведения анализа,

курентном анализе FPIA c антителами FITC-

поскольку в молоке присутствует большое ко-

anti-hLf5, и ее линейный участок (б). Предел

личество компонентов, которые могут влиять

обнаружения определен как (mP₀ + 3 SD), ко-

на аналитический сигнал. Наиболее распро-

торый составил 2,1 ± 0,2 мкг/мл и линейный

страненным способом уменьшения матрично-

диапазон для определения концентраций со-

го эффекта в молоке является его разбавление

ставил 3-50 мкг/мл.

для снижения концентрации веществ, которые

Для проверки воспроизводимости метода

могут мешать анализу. Молоко первоначально

получения флуоресцентно меченный конъюгат

центрифугировали для обезжиривания и го-

FITC-anti-hLf5 был синтезирован и очищен,

товили образцы с последовательным двукрат-

как описано в работе [32], в трех независимых

ным разбавлением 10 мМ фосфатным буфером

экспериментах и обнаружено, что калибровоч-

(рН 7,4), содержавшим 150 мМ NaCl. После чего

ные зависимости и их аналитические характе-

определяли оптимальный коэффициент раз-

ристики во всех трех случаях различались меж-

бавления молока для проведения анализа сле-

ду собой не более чем на 10%.

дующим образом: к рабочим растворам FITC-

Поскольку нанотело anti-hLf5 высокоспеци-

anti-hLf5 и FITC-anti-hLf16 добавляли 50 мкл

фично к лактоферрину человека и не связыва-

молока в различных разведениях и через 5 мин

ется с лактоферрином козы [29], натуральное

инкубации измеряли сигнал FP. Было обнару-

козье молоко с добавленным hLF было ис-

жено, что уже при предварительном разведении

пользовано для подтверждения возможности

в 8-10 раз (конечное разведение в анализируе-

определения данного белка в молоке. В образ-

мом растворе составило 160-200 раз) образцы

цы козьего молока был добавлен лактофер-

показали значение FP, аналогичное сигналу

рин человека до конечных концентраций 0,5

рабочих растворов FITC-anti-hLf5 и FITC-anti-

и 1 мг/мл. Затем образцы молока разбавили в

hLf16 c 50 мкл буфера (данные не представле-

20, 40 и 80 раз; как уже упоминалось выше, при

ны). Таким образом, даже при разведении мо-

разведении образцов в 10 раз полностью устра-

лока в анализируемом растворе в 160 раз нам

няется матричный эффект. При каждом разве-

полностью удалось снять влияние матричного

дении измеряли значение FP и определяли со-

эффекта, однако высокое содержание лакто-

держание лактоферрина в образце, результаты

феррина в молоке (0,5-1 мг/мл) позволяет нам

представлены в табл. 1.

Рис. 4. Нормированная кривая зависимости поляризации флуоресценции от концентрации hLF (а) и ее линейный уча-

сток (б), полученные при неконкурентном анализе FPIA c антителом FITC-anti-hLf5 (рН 7,4 и 25 °С). Измерения про-

водили трижды, результаты представлены как среднее значение ± SD

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2073

Рис. 5. Калибровочная зависимость определения hLF методом иммуноферментного анализа. Измерения дублировали,

результаты представлены как среднее значение ± SD

Таблица 1. Результаты обнаружения hLF в молоке методом введено/найдено с помощью FPIA и LF ELISA

FPIA

hLF ELISA

Введено,

мг/мл

разведение

найдено,

разведение

найдено,

мкг/мл

образца

мг/мл

открытия

образца

мг/мл

открытия

1 : 20

24,0 ± 0,5

1 : 200

2,55 ± 0,02

0,5

1 : 40

13,2 ± 0,3

0,52 ± 0,02

104

1 : 400

1,35 ± 0,04

0,54 ± 0,02

108

1 : 80

7,0 ± 0,2

1 : 800

0,70 ± 0,05

1 : 20

53,5 ± 0,3

1 : 200

5,10 ± 0,05

1 : 40

26,4 ± 0,2

1,12 ± 0,03

111

1 : 400

2,72 ± 0,06

1,10 ± 0,05

110

1 : 80

15,5 ± 0,4

1 : 800

1,51 ± 0,4

Примечание. % - Соответствие (в процентах) полученного результата с ожидаемым, исходя из предварительных данных.

В тех же образцах было определено содер-

определения ниже предела обнаружения для

жание лактоферрина методом иммунофер-

FPIA 0,3 и 2,1 мкг/мл соответственно. Однако

ментного анализа на лактоферрин hLF ELISA.

содержание лактоферрина в молоке составляет

На рис. 5 представлена калибровочная зависи-

1 мг/мл или больше и разбавление испытуе-

мость поглощения (А) от концентрации стан-

мых образцов до определяемых концентраций

дартных растворов hLF. Образцы молока пред-

позволяет полностью избавиться от матрично-

варительно разбавляли в 200, 400 и 800 раз.

го эффекта, влияющего на точность анализа.

Результаты представлены в табл. 1. В образце

Но метод FPIA благодаря своим преимуще-

козьего молока без добавления лактоферрина

ствам позволяет избежать длительного и тру-

методами FPIA и ELISA не было обнаружено

доемкого иммуноферментного анализа, суще-

увеличение аналитического сигнала, что сви-

ственно снизив время его проведения с 3,5 ч

детельствует о высокоспецифичном связыва-

до 5 мин. Кроме того, калибровочная зависи-

нии антител с лактоферрином человека.

мость для полученных нами иммунореагентов

Как видно из рис. 4, б и рис. 5, предел об-

была стабильна и не было необходимости при

наружения для иммуноферментного метода тестировании образцов ее повторять.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

2074

МУХАМЕТОВА и др.

Таблица 2. Сравнение результатов обнаружения hLF в реальных образцах женского молока при их различном разведе-

нии с помощью FPIA и hLF ELISA

FPIA

hLF ELISA

Образец

содержание hLF

содержание

молока

разведение

в разведенных

hLF в образцах,

образца

образцах,

образцах, мкг/мл

мг/мл

мкг/мл

1 : 100

24,0 ± 0,5

1 : 1500

1,56 ± 0,08

№ 1

2,19 ± 0,02

2,34 ± 0,12

1 : 150

13,2 ± 0,3

1 : 2000

1,17 ± 0,15

1 : 100

25,2 ± 0,3

1 : 1500

1,69 ± 0,11

№ 2

2,26 ± 0,14

2,24 ± 0,11

1 : 150

13,5 ± 0,2

1 : 2000

0,98 ± 0,10

1 : 100

20,0 ± 0,4

1 : 1500

1,41 ± 0,12

№ 3

1,95 ± 0,05

1,95 ± 0,12

1 : 150

12,8 ± 0,2

1 : 2000

0,90 ± 0,12

1 : 100

18,1 ± 0,2

1 : 1500

1,13 ± 0,20

№ 4

1,85 ± 0,05

1,79 ± 0,18

1 : 150

12,1 ± 0,3

1 : 2000

0,95 ± 0,15

Для проверки адекватности разработан-

Таким образом, в данной работе проде-

ного метода FPIA на образцах женского моло-

монстрирована принципиальная возможность

ка мы воспользовались четырьмя образцами

использования однодоменных антител в каче-

женского молока (№№ 1-4). В этих образцах

стве распознающего реагента для определения

мы параллельно определяли содержание лак-

в биологической жидкости (молоке) целевого

тоферрина с помощью традиционного метода

антигена (лактоферрина) методом неконку-

иммуноферментного анализа (с помощью на-

рентного FPIA. По сравнению с традицион-

бора фирмы «ХЕМА»).

ным иммуноферментным анализом FPIA зани-

Как видно из представленной табл. 2, при

мает всего 5 мин, связывание антиген/антитело

разбавлении образца молока в 100 и 150 раз

происходит в гомогенной среде и не требует

удается определить близкое к ожидаемому со-

сложных операций. Данный метод показал вы-

держание лактоферрина методом FPIA.

сокую чувствительность и специфичность для

При проверке этих же образцов женского

определения лактоферрина человека в моло-

молока методом иммуноферментного анализа

ке, как в образцах козьего молока с добавлен-

показано, что для получения достоверных ре-

ным hLF, так и в реальных образцах женско-

зультатов необходимо было разбавить образцы

го молока, и показал хорошую корреляцию с

молока более, чем в 1000 раз, поскольку метод

традиционным методом hLF ELISA. Флуорес-

hLF ELISA имеет более низкий предел обнару-

центно меченные однодоменные антитела anti-

жения; однако он является более длительным и

LF5 и anti-LF16 являются перспективными для

трудоемким.

создания тест-системы определения лактофер-

Как видно из приведенных в табл. 2 ре-

рина человека в молоке и физиологических

зультатов, количество лактоферрина в образ-

жидкостях методом FPIA.

цах женского молока, определенное методом

FPIA, находится в хорошей корреляции с дан-

Вклад авторов. Еремин С.А., Тиллиб С.В.,

ными, полученными с помощью более тради-

Мухаметова Л.И. - концепция и руководство

ционного метода ELISA.

работой; Мухаметова Л.И., Арутюнян Д.А. - про-

Для верификации метода в данной статье

ведение FPIA-экспериментов; Горяйнова О.С.,

мы смогли получить и использовать только че-

Иванова Т.И., Тиллиб С.В. - наработка и ме-

тыре образца женского молока, которые были

чение нанотел; Еремин С.А., Тиллиб С.В., Му-

ранее в работе у наших коллег и хранились

хаметова Л.И. - обсуждение результатов иссле-

уже в серии разведений в замороженном виде.

дования; Мухаметова Л.И. - написание текста;

В статье мы показали, что переход к реальным

Еремин С.А., Тиллиб С.В. - редактирование тек-

биологическим образцам молока не вызывает

ста статьи.

возникновения новых проблем с определени-

Финансирование. Работа выполнена при

ем лактоферрина, требующих радикально ме-

финансовой поддержке Российского научного

нять используемую нами методику.

фонда (грант № 20-14-00305).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2075

Благодарности. Мы выражаем благо-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

дарность Садчиковой Е.Р. (Институт био-

отсутствии конфликта интересов.

логии гена РАН, Москва) за предостав-

Соблюдение этических норм. Настоящая

ление для данной работы очищенного

статья не содержит описания каких-либо ис-

лактоферрина человека и образцов женского

следований с участием людей или животных

молока.

в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

González-Chávez, S. A., Arévalo-Gallegos, S., and

mon resonance: Comparison with amperometric and

Rascón-Cruz, Q.

(2009) Lactoferrin: Structure,

screen-printed immunosensor methods, Sens. Actuat.

function and applications, Int J. Antimicrob. Agents, 33,

B Chem., 179, 215-225, doi: 10.1016/j.snb.2012.09.096.

301.e1-301.e8, doi: 10.1016/j.ijantimicag.2008.07.020.

13.

Chen, H., Wang, Z., Fan, F., Shi, P., Xu, X., Du, M.,

Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., and

and Wang, C. (2021) Analysis method of lactoferrin

Barile, D. (2017) Studying lactoferrin N-glycosylation,

based on uncoated capillary electrophoresis, eFood, 2,

Int. J. Mol. Sci., 18, 870, doi: 10.3390/ijms18040870.

147-153, doi: 10.2991/efood.k.210720.001.

Rosa, L., Cutone, A., Lepanto, M. S., Paesano, R.,

14.

Zhang, J., Lai, S., Cai, Z., Chen, Q., Huang, B., and

and Valenti, P. (2017) Lactoferrin: a natural glycopro-

Ren, Y. (2014) Determination of bovine lactoferrin

tein involved in iron and inflammatory homeostasis,

in dairy products by ultra-high performance liquid

J. Mol. Sci., 18, 1985, doi: 10.3390/ijms18091985.

chromatography-tandem mass spectrometry based on

Adlerova, L., Bartoskova, A., and Faldyna, M.

tryptic signature peptides employing an isotope-labeled

(2008) Lactoferrin: a review, Vet. Med., 53, 457-468,

winged peptide as internal standard, Anal. Chim. Acta,

doi: 10.17221/1978-VETMED.

829, 33-39, doi: 10.1016/j.aca.2014.04.025.

Murphy, M. E., Kariwa, H., Mizutani, T., Tanabe, H.,

15.

Palmano, K. P., and Elgar, D. F. (2002) Detection and

Yoshimatsu, K., Arikawa, J., and Takashima, I. (2001)

quantitation of lactoferrin in bovine whey samples by

Characterization of in vitro and in vivo antiviral activity

reversed-phase high-performance liquid chromatogra-

of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus, J. Vet.

phy on polystyrene-divinylbenzene, J. Chromatogr. A,

Med. Sci., 63, 637-645, doi: 10.1292/jvms.63.637.

947, 307-311, doi: 10.1016/s0021-9673(01)01563-1.

Legrand, D., and Mazurier, J. (2010) A critical review

16.

Tsakali, E., Chatzilazarou, A., Houhoula, D.,

of the roles of host lactoferrin in immunity, Biometals,

Koulouris, S., Tsaknis, J., and Van Impe, J. (2019)

23, 365-376, doi: 10.1007/s10534-010-9297-1.

A rapid HPLC method for the determination of

Baker, E. N. (2004) Lactoferrin and iron: structural

lactoferrin in milk of various species, J. Dairy Res., 86,

and dynamic aspects of binding and release, BioMetals,

238-241, doi: 10.1017/s0022029919000189.

17, 209-216, doi: 10.1023/B:BIOM.0000027694.

17.

Nithipatikom, K., and McGown, L. B. (1987) Homo-

Nagasako, Y., Saito, H., Tamura, Y., Shimamura, S.,

geneous immunochemical technique for determina-

and Tomita, M. (1993) Iron-binding properties of bo-

tion of human lactoferrin using excitation transfer and

vine lactoferrin in iron-rich solution, J. Dairy Sci., 76,

phase-resolved fluorometry, Anal. Chem., 59, 423-427,

1876-1881, doi: 10.3168/jds.S0022-0302(93)77520-7.

doi: 10.1021/ac00130a010.

Fox, P. F., Uniacke-Lowe, T., McSweeney, P., and

18.

Chen, M. X., Wen, F., Zhang, Y. D., Li, P., Zheng,

O’Mahony, J. (2015) Biologically Active Compounds

N., and Wang, J. Q. (2019) Determination of native

in Milk, in: Dairy Chemistry and Biochemistry,

lactoferrin in milk by HPLC on HiTrap Heparin

Springer. Cham, doi: 10.1007/978-3-319-14892-2_11.

HP column, Food Anal. Method., 12, 2518-2526,

10.

Садчиков П. Е., Гольдман И. Л., Намазова-Барано-

doi: 10.1007/s12161-019-01572-x.

ва Л. С., Яцык Г. В., Боровик Т. Э., Черноусов А. Д.,

19.

Wang, N., Jiang, X., Xu, X., Liu, Y., Liu, L., Lu, A.,

Романченко А. И., Садчикова Е. Р., Лукоянова О. Л.,

Lu, J., and Luan, Y. (2021) An aptamer affinity column

Звонкова Н. Г., Беляева И. А. (2016) Лактоферрин

for purification and enrichment of lactoferrin in milk,

в проблеме противоинфекционной защиты детей

J. Chromatography B, 1178, 122724, doi: 10.1016/j.

первого года жизни, Педиатрическая фармакология,

jchromb.2021.122724.

13, 607-613, doi: 10.15690/pf.v13i6.1677.

20.

Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A.V.,

11.

Chen, P.-W., and Mao, F.C. (2004) Detection of

Dzantiev, B. B., and Eremin, S. A. (2020) Fluorescence

lactoferrin in bovine and goat milk by enzyme-linked

polarization-based bioassays: new horizons, Sensors,

immunosorbent assay, J. Food Drug Anal.,

12,

20, 7132, doi: 10.3390/s20247132.

doi: 10.38212/2224-6614.2653.

21.

Zhang, H., Yang, S., De Ruyck, K., Beloglazova, N.,

12.

Tomassetti, M., Martini, E., Campanella, L., Favero, G.,

Eremin, S. A., De Saeger, S., Zhang, S., Shen, Ji., and

Sanzò, G., and Mazzei, F. (2013) Lactoferrin determi-

Wang, Z. (2019) Fluorescence polarization assays for

nation using flow or batch immunosensor surface plas-

chemical contaminants in food and environmental

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

2076

МУХАМЕТОВА и др.

analyses, Trends Anal. Chem.,

114,

293-313,

giev, G. P., Goldman, I. L., and Sadchikova, E. R.

doi: 10.1016/j.trac.2019.03.013.

(2014) Single-domain antibody-based ligands for im-

22.

Nishiyama, K., Fukuyama, M., Maeki, M., Ishida, A.,

munoaffinity separation of recombinant human lac-

Tani, H., Hibara, A., Tokeshi, M. (2021) One-step

toferrin from the goat lactoferrin of transgenic goat

non-competitive fluorescence polarization immu-

milk, J. Chromatogr. B, 949-950, 48-57, doi: 10.1016/

noassay based on a Fab fragment for C-reactive pro-

j.jchromb.2013.12.034.

tein quantification, Sensors Actuators B Chem., 326,

30.

Горяйнова О. С., Иванова Т. И., Рутовская М. В.,

128160, doi: 10.1016/j.snb.2020.128982.

Тиллиб С. В. (2017) Метод параллельного и после-

23.

Nishiyama, K., Takeda, Y., Takahash, K., Fukuyama, M.,

довательного генерирования однодоменных анти-

Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Shigemura, K.,

тел для протеомного анализа плазмы крови чело-

Hibara, A., Ogawa, H., and Tokeshi, M. (2021) Non-

века, Мол. биол., 51, 985-996.

competitive fluorescence polarization immunoassay

31.

Тиллиб С. В. (2020) Перспективы использования

for detection of H5 avian influenza virus using a

однодоменных антител в биомедицине, Мол. биол.,

portable analyzer, Anal. Bioanal. Chem., 413, 4619-

54, 362-373, doi: 10.31857/S0026898420030167.

4623, doi: 10.1007/s00216-021-03193-y.

32.

Schreiber, A. B., and Yfimovich, J. (1983) Quantitative

24.

Nishiyama, K., Takahashi, K., Fukuyama, M., Kasuya, M.,

fluorometric assay for detection and characterization

Imai, A., Usukura, T., Maishi, N., Maeki, M., Ishida, A.,

of Fc receptors, Meth. Enzymol.,

93,

147-155,

Tani, H., Hida, K., Shigemura, K., Hibara, A., and

doi: 10.1016/s0076-6879(83)93039-2.

Tokeshi, M. (2021) Facile and rapid detection of

33.

Pace, C. N, Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and

SARS-CoV-2 antibody based on a noncompetitive

Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar

fluorescence polarization immunoassay in human

absorption coefficient of a protein, Protein Sci., 11,

serum samples, Biosens. Bioelectron., 190, 113414,

2411-23, doi: 10.1002/pro.5560041120.

doi: 10.1016/j.bios.2021.113414.

34.

Chung, T., and Raymond, K. (1993) Lactoferrin: the

25.

Takeda, Y., Yonezawa, Y., Asake, S., Ogawa, H., and

role of conformational changes in its iron binding

Imai, K. (2020) A fluorescence polarization immu-

and release, J. Am. Chem. Soc., 115, 6765-6768,

noassay for the rapid detection of antibody against in-

doi: 10.1021/ja00068a037

fluenza A virus in chicken and goat sera, J. Vet. Diagn.

35.

Мухаметова Л. И., Крылов В. Б., Соловьев A. C.,

Invest., 32, 887-891, doi: 10.1177/1040638720960046.

Яшунский Д. В., Матвеев A. Л., Тикунова Н. В.,

26.

Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S.,

Еремин С. А., Нифантьев Н. Э. (2021) Характери-

Robinson, G., Hamers, C., Songa, E.B, Bendahman, N.,

стика аффинности анти-β-(1→3)-d-глюканового

and Hamers, R. (1993) Naturally occurring antibodies

моноклонального антитела 3G11 методом поляри-

devoid of light chains, Nature,

363,

446-448,

зационно-флуоресцентного иммуноанализа, Из-

doi: 10.1038/363446a0.

вестия Академии наук. Сер. хим., 5, 975-980.

27.

Flajnik, M. F., and Kasahara, M. (2010) Origin and

36.

Nevinskii, A. G., Soboleva, S. E., Tuzikov, F. V.,

evolution of the adaptive immune system: genetic

Buneva, V. N., and Nevinsky, G. A. (2009) DNA, oli-

events and selective pressures, Nat. Rev. Genet., 11, 47-

gosaccharides, and mononucleotides stimulate oligo-

59, doi: 10.1038/nrg2703.

merization of human lactoferrin, J. Mol. Recognit., 22,

28.

Тиллиб, С. В., Иванова, Т. И., Васильев Л. А. (2010)

330-342, doi: 10.1002/jmr.952.

Фингерпринтный анализ селекции наноантител ме-

37.

Zhang, S., Chen, L., Kumar, S., Wu, L., Lawrence, D. S.,

тодом фагового дисплея с использованием двух ва-

and Zhang, Z.-Y.

(2007) An affinity-based flu-

риантов фагов-помощников, Acta Naturae, 2, 100-108.

orescence polarization assay for protein tyrosine

29.

Tillib, S. V., Privezentseva, M. E., Ivanova, T. I., Va-

phosphatases, Methods, 42, 261-267, doi: 10.1016/

silev L. F., Efimov, G. A., Gurskiy, Ya. G., Geor-

j.ymeth.2007.02.008.

FLUORESCENCE POLARIZATION IMMUNOASSAY

OF HUMAN LACTOFERRIN IN MILK USING

SMALL SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES

L. I. Mukhametova¹*, S. A. Eremin¹, D. A. Arutyunyan¹, O. S. Goryainova²,

T. I. Ivanova², and S. V. Tillib²*

¹ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Chemistry, 119234 Moscow, Russia; email: liliya106@mail.ru

² Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, 119334 Moscow, Russia; email: tillib@genebiology.ru

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022

НАНОТЕЛА ДЛЯ FPIA ЛАКТОФЕРРИНА

2077

Due to its unique structure and properties, lactoferrin in human milk (hLF) has many nutritional and health-

promoting functions for infants, such as protection against bacterial infections and inflammation. A lack

of lactoferrin in human milk or formula milk can lead to an undesirable weakening of the infant’s immune

system. A promising method for the quantitative determination and control of the concentration of hLF in

milk and dairy products can be a non-competitive format of polarization fluorescence immunoassay (FPIA),

which does not require mandatory separation of bound and free forms of proteins and long-term sample

preparation. The use of fluorescently labeled single-domain camel antibodies (“nanobodies”) as recognition

reagents makes it possible to quantify relatively larger molecules (antigens), in particular, human lactoferrin

by FPIA. In this work, conjugates with fluorescein isothiocyanate (FITC) of two previously obtained anti-

hLf5 and anti-hLf16 nanobodies, which specifically recognize various human lactoferrin epitopes, but do not

recognize goat lactoferrins, were used. The kinetics of the interaction of FITC labeled nanobodies with hLF

was studied. The dissociation constants (K_D) for antibodies anti-Lf5-FITC and anti-Lf16-FITC with hLF

were determined to be 3.2 ± 0.3 nM and 4.9 ± 0.4 nM, respectively, indicating their high affinity binding

to human lactoferrin. The FPIA protocol was developed, and the concentrations of FITC-anti-hLf5 and

FITC-anti-hLf16 were selected, which give the optimal fluorescent signal and a stable polarization value. The

dependence of fluorescence polarization on hLF concentration for non-competitive FPIA with FITC-anti-

hLf5 antibodies was obtained and analytical characteristics were determined: detection limit 2.1 ± 0.2 μg/ml

and linear range for determining concentrations 3-10 μg/ml. The FPIA method is usually used to determine

low molecular weight substances, but high molecular weight proteins can be determined using fluorescein-

labeled small nanobodies; in particular, this work shows the possibility of quantitative determination of human

lactoferrin in milk by the FPIA method using fluorescently labeled nanobodies as a recognition reagent.

Keywords: single-domain antibody, nanobody, lactoferrin, fluorescence polarization, immunoassay

БИОХИМИЯ том 87 вып. 12 2022