БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 4, с. 474 - 496

УДК 543.94

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

Обзор

О.Л. Бодулев, И.Ю. Сахаров*

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет,

119991 Москва, Россия; электронная почта: sakharovivan@gmail.com

Поступила в редакцию 21.01.2022

После доработки 21.03.2022

Принята к публикации 21.03.2022

В настоящем обзоре рассмотрены современные методы количественного и полуколичественного определе

ния микроРНК - малых некодирующих РНК, влияющих на такие биологические процессы, как развитие,

дифференциация, метаболизм и формирование иммунологического ответа и рассматриваемых в качестве

перспективных биомаркёров в диагностике ряда заболеваний.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биоанализ, микроРНК, нуклеиновые кислоты, амплификация, полимеразы.

DOI: 10.31857/S0320972522040029, EDN: AQFBBE

ВВЕДЕНИЕ

трации тех же миРНК у здоровых людей [2]. Из

вестно, что концентрация миРНК в биологичес

В последнее время неуклонно возрастает не

ких образцах крайне низка, а число миРНК, чьи

обходимость в методах анализа нуклеиновых

последовательности имеют между собою высо

кислот [1]. Среди аналитов этой группы все бо

кую гомологию, велико. Все это приводит к не

лее пристальное внимание обращают на себя

обходимости разработки высокочувствительных

микроРНК (миРНК), концентрация которых в

и высокоселективных методов определения

биологических материалах человека при широ

миРНК [3].

ком спектре заболеваний отличается от концен

В настоящем обзоре будут рассмотрены ме

тоды количественного и полуколичественного

Принятые сокращения: МИА - методы изотерми

определения миРНК, среди которых будут опи

ческой амплификации нуклеиновых кислот; миРНК - саны как традиционные методы, такие как но

микроРНК; CEAM - циклический ферментативный ме

тод амплификации (Сycle Enzymatic Amplification Method);

зерн блоттинг, полимеразная цепная реакция с

CHA - метод каталитической сборки шпилек (Catalytic

обратной транскрипцией и микрочипы, так и

Hairpin Assembly); crРНК

- «направляющая» РНК; новые, разрабатываемые в последние годы ме

Crispr/Cas - метод коротких палиндромных повторов, ре

тоды определения с улучшенными аналитичес

гулярно расположенных группами, с ассоциированным

кими параметрами.

белком (Clustered Regularly Interspaced Palindromic

Repeats/CRISPR associated protein); EXPAR - экспоненци

альная реакция амплификации нуклеиновых кислот

(Exponential amplification reaction); HCR - реакция цепной

ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА

гибридизации (Hybridization Chain Reaction); HRCA - раз

И БИОХИМИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ микроРНК

ветвлённый метод катящегося кольца (Hyperbranched

Rolling Circle Amplification); ICSDP - амплификационный

метод с полимеризацией и замещением (Isothermal

МиРНК представляют собой класс малых

Circular Strand Displacement Polymerization); LAMP - пет

некодирующих РНК, обнаруженных в широком

левая изотермическая амплификация (Loop mediated спектре растений, вирусов и млекопитаю

isothermal Amplification); NB - нозерн блоттинг (Nothern

щих [1]. Гены миРНК обычно располагаются в

Blotting); PCR - полимеразная цепная реакция (Polymerase

Chain Reaction); RCA - метод катящегося кольца (Rolling

кластерах, которые транскрибируются как по

Circle Amplification); RT PCR - полимеразная цепная ре

лицистроны. Кроме того, они могут быть лока

акция с обратной транскрипцией (Reverse Transcriptase лизованы между другими генами (межгенные)

PCR); RT qPCR - количественная полимеразная цепная или в интронах, кодирующих мРНК (миртро

реакция с обратной транскрипцией (quantative RT PCR);

ны). Первичные транскрипты миРНК, извест

SEXPAR - симметричная экспоненциальная реакция ам

плификации нуклеиновых кислот (Symmetrical Exponential

ные как при миРНК (в основном длиной

Amplification Reaction).

100-1000 н.), транскрибируются РНК полиме

* Адресат для корреспонденции.

разами II и III в ядре клетки. Впоследствии при

474

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

475

миРНК расщепляются РНКазой III Drosha с об

ют в регуляции таких важных биологических

разованием

предшественников

миРНК

процессов, как развитие, дифференциация, ме

(70-100

н.) шпилечной структуры (пре

таболизм и формирование иммунологического

миРНК) [4]. В настоящее время описано более

ответа [12-13]. Проведённые исследования поз

38 000 пре миРНК из 271 организма [5]. Экс

волили установить взаимосвязь между измене

портин 5 обеспечивает транспорт пре миРНК

ниями в уровне экспрессии миРНК и развитием

из ядра в цитоплазму, где под действием фер

онкологических заболеваний человека [14]. При

мента Dicer из пре миРНК формируются корот

этом было найдено, что уровень экспрессии не

кие зрелые миРНК. Длина зрелых миРНК сос

которых миРНК в образцах злокачественных

тавляет примерно 18-24 н. В настоящее время

тканей был повышен, в то время как для других

около 49 000 последовательностей миРНК пред

миРНК зарегистрировано подавление их

ставлены в реестре миРНК (miRBase), в том

экспрессии. Результирующий эффект зависел от

числе 2600 миРНК человека [6].

типа и стадии заболевания. Изменение концен

Из одной молекулы пре миРНК могут быть

трации миРНК отмечено и в процессе лечения

получены несколько различных миРНК, при

заболеваний. Показано, что уровни экспрессии

этом часть миРНК генерируются из 3′ последо

миРНК влияют на скорость роста опухоли и по

вательностей пре миРНК, другие - из 5′ после

могают выбрать эффективную стратегию тера

довательностей [7]. Исследования секвенирова

певтического лечения пациентов [15].

ния показали, что в биологических образцах

Кроме онкологических заболеваний высо

зрелые миРНК представляют собой не молекулу

кая роль экспрессии миРНК была также отме

со строго определённой последовательностью

чена при аутоиммунных [16], неврологичес

нуклеотидов, а набор гомологичных молекул

ких [17] и сердечно сосудистых заболевани

различной длины. Причинами этого являются

ях [18]. По этой причине в последние годы зна

гетерогенность процессинга предшественника

чительные усилия исследователей были направ

нуклеазами, а также посттранскрипционные

лены на разработку новых высокочувствитель

модификации 3′ или 5′ концов полноразмер

ных и специфичных методов анализа экспрес

ных миРНК. Показано, что такая модификация

сии миРНК.

может оказывать влияние на стабильность и ак

тивность миРНК [8].

Уровень экспрессии зрелых миРНК пред

МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ микроРНК

ставляет наибольший интерес для исследовате

лей, изучающих их биологические функции.

Нозерн)блоттинг (Nothern blotting, NB) яв

Первая публикация с описанием миРНК появи

ляется хорошо стандартизированным методом

лась в 1993 г. [9], однако по прошествии уже бо

детекции миРНК. В этом методе анализируе

лее 25 лет интерес к изучению роли миРНК в ре

мый образец миРНК подвергается электрофо

гуляции генов и функционировании клеточных

ретическому разделению с последующим его

процессов не только не угасает, а лишь постоян

переносом на нитроцеллюлозную мембрану.

но возрастает. Зрелые миРНК могут регулиро

Детекция миРНК осуществляется после её ре

вать экспрессию генов после их включения в ак

акции с комплементарными радио /флуоресцен

тивный РНК индуцированный комплекс сай

тно мечеными зондами [19]. NB, с помощью

ленсинга, где они взаимодействуют со специфи

которого идентифицировались самые пер

ческими сайтами матричной РНК, вызывая

вые миРНК, применяется для профилирования

репрессию трансляции, а иногда и деградацию

экспрессии миРНК [9, 20]. К сожалению, дан

целевой мРНК [10].

ный метод имеет низкую чувствительность и

Как было оценено, среднее количество ко

времязатратен.

пий отдельных видов миРНК на клетку рав

Этот факт стимулировал исследования по

но 500, и их экспрессия может превышать сред

усовершенствованию NB [21-23]. Для этого бы

нюю экспрессию мРНК. Однако содержание

ло предложено использовать олигонуклеотид

различных миРНК в клетках сильно различает

ные зонды с применением запертых нуклеино

ся, и такое различие в концентрации может сос

вых кислот (LNA) [22], а также заменить УФ

тавлять более четырёх порядков. Так, миРНК 1

фиксацию зондов на нитроцеллюлозной мемб

присутствует в скелетных мышцах в количестве,

ране на их химическую иммобилизацию с по

превышающем 80 000 копий на клетку, тогда как

мощью

1 этил 3 (3′ диметиламинопропил)

в одной клетке мозга находится лишь 1 копия

карбодиимида [23]. Более того, использовалась

миРНК 381 [11].

хемилюминесцентная детекция продуктов гиб

Исследования, проведённые на лаборатор

ридизации с применением щелочной фосфата

ных организмах, показали, что миРНК участву

зы вместо детекции радиоизотопа P32 [24].

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

476

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

Kim et al. [25] объединили в одной методике все

за формирует новую ковалентную связь между

вышеобозначенные подходы, что позволило им

сближенными друг с другом концами иммоби

с помощью NB проводить определение миРНК

лизованного на чипе зонда и детектирующего

с пределом обнаружения 1 пМ, т.е понизить

зонда с флуоресцентной меткой. Сближение

предел обнаружения на 3 порядка. Кроме того,

указанных последовательностей происходит

эти изменения позволили сократить время ана

при формировании специфического сэндвич

лиза NB.

комплекса с участием миРНК. Такой метод по

Несмотря на сделанные улучшения, в срав

казал высокую чувствительность с пределом об

нении с другими методами NB остаётся методом

наружения миРНК 143, равным 30 фМ [31].

с низкой чувствительностью (в нано/пикомо

Для повышения селективности метода в от

лярном диапазоне) [26]. Кроме того, к недостат

ношении пре и при миРНК используются им

кам NB также следует отнести сложность его ис

мобилизованные зонды шпилечной структу

полнения, низкую производительность и требо

ры [32]. Следует отметить, что селективность от

вание значительного количества исходного об

носительно прекурсоров миРНК может быть

разца (5-50 мкг РНК) [25].

значимой лишь при прямом проведении опре

Микрочипы. Технология микрочипов осно

деления миРНК в образцах. Выделение же на

вывается на регистрации взаимодействия ана

предварительном этапе анализа фракции корот

лизируемых миРНК со специфичными зонда

ких РНК из исследуемых образцов позволяет

ми, зонально иммобилизованными на чипе.

избежать влияния пре и при миРНК на полу

С использованием такой технологии, позволяю

чаемые результаты.

щей в одном образце одновременно проводить

Чувствительность микрочипов для детекции

детекцию большого числа различных аналитов,

миРНК повышается при использовании в каче

были определены миРНК в биологических жид

стве захватывающих зондов LNA олигонуклео

костях (цельной крови, плазме, сыворотке, моче

тидов [33]. Чувствительность анализа также мо

и слезах), гомогенатах ткани и экзосомах, а так

жет быть повышена добавлением в схему анали

же проведена оценка изменения уровня их

за стадии амплификации, например полимераз

экспрессии на разных стадиях развития онколо

ной цепной реакции [30].

гических заболеваний различного типа [27-29].

Модификация конструкции микрочипов до

Следует отметить, что метод является полуколи

полнительно повышает стоимость и без того до

чественным и применим лишь для регистрации

рогостоящего метода анализа. Хотя такой под

изменений в уровне экспрессии миРНК. Мето

ход приводит к улучшению чувствительности и

ды на основе микрочипов характеризуются уз

специфичности анализа, все же проблема узких

кими рабочими диапазонами по сравнению с

рабочих диапазонов микрочипов остаётся пока

другими методами, в связи с чем существенные

неразрешённой. Несмотря на указанные недос

отклонения в уровне экспрессии при исследова

татки, микрочипы остаются очень востребован

нии данным методом могут оставаться незаре

ными при проведении профилирования

гистрированными [30]. Кроме того, в класси

миРНК, так как позволяют проводить одновре

ческих вариантах метод характеризуется низкой

менно скрининг большого числа разных

чувствительностью и специфичностью.

миРНК [34].

При использовании микрочипов осущест

Кроме указанных выше гибридизационных

вляется ферментативное удлинение последова

методов, в литературе описаны также и другие

тельности выделенных миРНК, за счёт чего они

безамплификационные методы анализа миРНК

приобретают способность прочно взаимодей

[35-40]. В первую очередь здесь следует упомя

ствовать с комплементарным ДНК линкером,

нуть многочисленные разработки электрохими

иммобилизованным на чипе [2]. Методы такого

ческих биосенсоров. В таких сенсорах детекция

типа характеризуются пределом обнаружения в

комплексов анализируемой миРНК с компле

нано/пикомолярном диапазоне, и для проведе

ментарным ей зондом может проводиться как с

ния такого анализа требуется от десятков до со

использованием зондов с ковалентно связанны

тен нг РНК. Дополнительное затруднение свя

ми электроактивными метками, так и зондов,

зано с различной специфичностью полиадени

меченных ферментами или интеркалирующими

лаз к различным анализируемым миРНК, что

метками. Большинство электрохимических био

понижает точность такого мультиплексного

сенсоров без проведения амплификации сиг

анализа [30].

нала демонстрируют пределы обнаружения

Альтернативный вариант конструирования

миРНК в нано/пикомолярном диапазоне и вы

микрочипов основан на постгибридизационном

ше [35-37].

введении аналитической метки в образуемый

Описаны также оптические безамплифика

дуплекс аналита и зонда. В этом случае Т4 лига

ционные биосенсоры. Среди них благодаря

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

477

простоте и скорости проведения вызывают ин

полученный продукт подвергается qPCR

терес гомогенные методы с применением пе

(рис. 1), при этом используемый праймер может

роксидаза подобных ДНКзимов [38]. Наиболь

иметь как линейную (рис. 1, а), так и шпилеч

шая чувствительность безамплификационных

ную структуру (рис. 1, б), в которой свободный

биосенсоров обнаружена при использовании

«хвост» комплементарен анализируемой

детектирующей системы на основе поверхност

миРНК. Ранее в группе Guegler проводилось

ного плазмонного резонанса. Пределы обнару

сравнительное исследование qPCR с использо

жения таких биосенсоров достигают пикомо

ванием указанных типов праймеров [41]. Полу

лярных значений [39]. Более того, в некоторых

ченные результаты показали, что при примене

случаях удалось развить методы анализа с преде

нии праймера шпилечной структуры эффек

лами обнаружения в фемто и субфемтомоляр

тивность амплификации более чем в 100 раз вы

ных диапазонах [40]. К недостаткам такого ме

ше (в сравнении с линейным аналогом). Следу

тода следует отнести его высокую стоимость, а

ет также отметить, что использование шпилеч

также сложность приготовления сенсорной

ного праймера повысило способность метода

подложки.

различать зрелые миРНК от их прекурсоров.

Как указано выше, концентрация миРНК в

Повышение эффективности амплификации

биологических объектах достаточно низкая, по

при использовании шпилечного праймера мо

этому невысокая чувствительность безампли

жет быть связано с увеличением термостабиль

фикационных методов затрудняет их примене

ности его комплекса с миРНК благодаря стэ

ние для определения миРНК в реальных образ

кинг взаимодействиям нуклеотидов в стебле

цах. В тех же случаях, когда удаётся получить

шпильки, тогда как специфичность метода, по

высокую чувствительность, протоколы таких

видимому, увеличивается за счёт нахождения

методов становятся чрезвычайно сложными,

большей части некомплементарного миРНК

что, в свою очередь, приводит к резкому повы

фрагмента праймера не в свободном, а в связан

шению стоимости анализа. В связи с этим в

ном состоянии. Метод с применением такого

большинстве случаев гибридизационные мето

праймера получил название «стебель петлевая

ды определения миРНК дополняются методами

полимеразная цепная реакция в реальном вре

амплификации нуклеиновых кислот.

мени с обратной транскрипцией» (stem loop

RT qPCR) и успешно применяется для оценки

уровней экспрессии опухолевых миРНК в об

АМПЛИФИКАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ

разцах биоптатов [42], экзосом [43], сыворотки

АНАЛИЗА микроРНК

крови [44] и мочи [45].

Для повышения специфичности определе

Полимеразная цепная реакция. На настоя

ния миРНК был разработан метод, названный

щий момент наиболее популярным методом

двухвостовой PCR (2 tailed RT qPCR) [46].

амплификации нуклеиновых кислот является

В данном подходе используется праймер шпи

полимеразная цепная реакция (Polymerase

лечной структуры, хвосты которого комплемен

Chain Reaction, PCR), которая в случае миРНК

тарны двум концевым последовательностям

дополняется реакцией обратной транскрипции

анализируемой миРНК (рис. 1, в). Благодаря об

(Reverse Transcriptase PCR, RT PCR) [1]. Для

разованию такого комплекса становится воз

количественного определения миРНК нашёл

можным различать изомиры (термин введён для

широкое применение PCR в реальном времени

миРНК, чьи последовательности различаются

(quantitative PCR, qPCR). Малый размер моле

между собой только на один нуклеотид в край

кул миРНК существенно усложняет их опреде

них положениях молекулы). Данный метод спо

ление методом RT qPCR, так как требуются

собен детектировать миРНК с концентрацией

праймеры меньшего, чем миРНК, размера. Это

до 2 аМ и рабочим диапазоном в 7 порядков.

существенно уменьшает температуру плавле

С его применением был исследован уровень

ния образующихся дуплексов и оказывает серь

экспрессии трёх миРНК (миРНК let 7a,

ёзное влияние на эффективность и специфич

миРНК 21 и миРНК 193a) в ткани мозжечка

ность метода. Для решения этой задачи приме

мыши. Полученные результаты совпали с ре

няется стратегия превращения миРНК в более

зультатами анализа, проведённого с применени

длинную одноцепочечную ДНК, которая далее

ем коммерческого набора TaqMan.

используется для проведения qPCR. Для этого

Известно, что методы, использующие в сво

последовательность анализируемой миРНК

их схемах обратную транскриптазу, активность

комплементарно взаимодействует с удлинён

которой довольно чувствительна к компонентам

ным с 5′ конца праймером, после чего осущест

реакционной среды, часто имеют пониженную

вляется элонгация последнего. В дальнейшем

точность [47]. Этот негативный факт привёл к

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

478

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

Рис. 1. Схемы модификаций полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR) для определения миРНК: а - по

лимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией и использованием линейного праймера

(RT qPCR); б - стебель петлевая полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (stem

loop RT qPCR); в - двухвостовая полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (2 tailed

RT qPCR); г - лигирующая полимеразная цепная реакция в реальном времени (ligation qPCR)

конструированию метода анализа, получившего

миРНК лигируются T4 РНК лигазой 2, и полу

в литературе название «лигирующая PCR в ре

ченная в результате этого ДНК амплифицирует

альном времени» (ligation qPCR), в котором от

ся в qPCR (рис. 1, г). Основываясь на данной

сутствует этап обратной транскрипции миРНК.

схеме анализа, был разработан флуоресцентный

В данном методе концевые последовательности

метод определения миРНК let 7а [48]. Предел

двух зондов в присутствии анализируемой

обнаружения и линейный диапазон составили

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

479

0,2 фМ и 0,2 фМ-2 нМ соответственно. Кросс

МЕТОДЫ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ

реактивность метода в отношении миРНК let 7c

АМПЛИФИКАЦИИ, ПРИВОДЯЩИЕ

и миРНК let 7a 3 составила 22 и 0,17% соответ

К ПОВЫШЕНИЮ АНАЛИТИЧЕСКОГО

ственно. Когда же в этом методе для измерения

СИГНАЛА ЗА СЧЁТ ПОВЫШЕНИЯ

флуоресценции использовалась технология

КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИТА

цифровой детекции сигнала, предел обнаруже

ния миРНК let 7a и его линейный диапазон со

Все известные МИА можно разделить на:

ставили 20 аМ и 20 аМ-200 фМ, т.е. все величи

(а) методы амплификации, приводящие к повы

ны сместились в область более низких концент

шению аналитического сигнала за счёт повыше

раций [49]. Более того, одновременно повыси

ния концентрации аналита, и (б) методы ампли

лась и точность определения аналита. Следует

фикации, приводящие к повышению аналити

отметить, что PCR с цифровой детекцией сигна

ческого сигнала за счёт многократного реагиро

ла становится все более популярной в исследо

вания одних и тех же молекул аналита [1].

ваниях миРНК [50, 51].

Метод амплификации катящегося кольца

Секвенирование следующего поколения (next

(Rolling Circle Amplification, RCA) является од

generation sequencing, NGS). В настоящее время

ним из наиболее часто применяемых в анализе

данный метод активно применяется в анализе

миРНК МИА первой группы. Этот метод осно

миРНК. На первом этапе NGS к анализируе

вывается на использовании «замочного» зонда,

мым молекулам миРНК присоединяют с обоих

линейного ДНК олигонуклеотида, концы кото

концов дополнительные олигонуклеотидные

рого смыкаются при комплементарном взаимо

последовательности, после чего проводится RT

действии с анализируемой миРНК (рис. 2, а).

PCR. Продукты амплификации секвенируются,

Формирование такого комплекса позволяет

что позволяет определить как последователь

ферментативно лигировать концы зонда. Впос

ность миРНК, так и их концентрацию в образце.

ледствии с использованием кольцевого зонда

В отличие от других методов, NGS может ис

осуществляется элонгация миРНК ДНК поли

пользоваться для определения как известных,

меразой, обладающей способностью к замеще

так и неизвестных миРНК, в связи с чем в нас

нию цепи. Обычно в RCA используются phi 29

тоящее время этот метод широко используется

или Bst полимеразы. В результате проведения

для создания библиотек миРНК, присутствую

амплификации осуществляется синтез одноце

щих в разных организмах [52]. Вместе с тем про

почечной ДНК последовательности с образова

ведение метода и обработка полученных данных

нием множества копий комплемента зонда в ви

требует значительного времени, дорогостояще

де конкатемеров. Обычно RCA проводится при

го оборудования, а также высококвалифициро

температуре 30-37 °С [58-61].

ванных специалистов [53]. По этой причине ме

В работе Kumara et al. [61] описан метод оп

тод не целесообразно использовать для количе

ределения миРНК 24 с использованием RCA.

ственного определения известных миРНК.

В этом методе на стадии элонгации к последова

Среди методов определения миРНК RT

тельности миРНК добавлялcя, кроме традици

qPCR считается «золотым стандартом», в связи

онной смеси dNTP, меченный нафталиними

с чем он часто используется для подтверждения

дом dUNTP, что приводило к синтезу флуорес

данных, полученных другими методами [54].

цирующего продукта. Предел обнаружения та

Однако при этом важно учитывать, что на регис

кого флуоресцентного метода составил

трацию аналитического сигнала в RT qPCR мо

3,6 фМ миРНК.

жет оказывать влияние неспецифичная гибри

Известны также другие варианты RCA. Так,

дизация праймеров, образование неспецифи

кроме кольцевого зонда, описано применение и

ческих продуктов, как результат катализа поли

гантелеобразного зонда шпилечной структу

меразы, и ингибирование Taq полимеразы ком

ры [62]. В последнем случае за счёт наличия

понентами анализируемой пробы, что в конеч

шпильки в структуре зонда увеличивается спе

ном счёте может привести к ложноположитель

цифичность амплификации и соответственно

ным и ложноотрицательным сигналам [55-57].

определения миРНК. В другом варианте RCA

Помимо вышеобозначенного, за счёт необходи

Li et al. [63] предложили «замочные» зонды с од

мости проведения циклического изменения

нонуклеотидными заменами в комплементар

температуры, данный метод анализа требует до

ном аналиту фрагменте. В этом случае повыша

рогостоящего оборудования. В связи с этим в

лась специфичность определения миРНК let 7a

последние годы активно развиваются методы

по отношению к близкородственным миРНК.

детекции миРНК с применением методов изо

В отличие от указанных выше, в некоторых

термической амплификации нуклеиновых кис

работах высокомолекулярный продукт ампли

лот (МИА).

фикации RCA подвергали ферментативной

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

480

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

Рис. 2. Схемы методов амплификации катящегося кольца (RCA, а) и гиперразветвлённой амплификации катящегося

кольца (HRCA, б) при определении миРНК

рестрикции. На данном принципе Liu et al. [64]

Данная модификация получила название «ги

сконструировали метод RCA с экспоненциаль

перразветвлённая RCA» (Hyperbranched RCA,

ной амплификацией, где фрагмент зонда, комп

HRCA) (рис. 2, б). При определении миРНК 21

лементарный анализируемой миРНК, обособ

с помощью HRCA был достигнут предел обна

лен сайтами рестрикции. Это приводило к тому,

ружения, равный 10 аМ. Рабочий диапазон дан

что синтезированный конкатемер после его

ного метода не был широк (до 100 фМ), однако

комплементарного комплексообразования с ис

при этом величина сигнала в пределах рабочего

ходным «замочным» зондом подвергался специ

диапазона повышалась более чем в 90 раз [66].

фическому расщеплению рестриктазой, образуя

Последний факт указывает на высокое значение

большое число молекул ДНК олигонуклеотида,

коэффициента чувствительности, определяемо

последовательность которого аналогична пос

го как значение первой производной градуиро

ледовательности анализируемой миРНК. Вслед

вочной функции при определённой концентра

ствие этого такие молекулы синтезированного

ции аналита, что позволило оценить концентра

олигонуклеотида инициировали RCA, так как,

цию аналита с высокой точностью [67]. Разрабо

по сути, они являются дополнительными прай

танный метод применялся для анализа уровня

мерами. В данном исследовании рабочий диапа

экспрессии миРНК 21 в ткани печени пациен

зон при определении миРНК флуоресцентным

тов с гепатоцеллюлярной карциномой. Таким

методом составил 30 аМ-30 фМ. Метод был

образом, методы, основанные на экспоненци

применён для количественной оценки содержа

альных модификациях RCA, обладают экстре

ния миРНК let 7a в клетках A549 (карцинома

мально высокой чувствительностью.

лёгких человека).

Выше отмечалось, что рабочий диапазон ме

Высокочувствительные методы определения

тода c применением HRCA недостаточно широк

миРНК также могут быть сконструированы со

по сравнению с большинством описанных ме

четанием RCA с микрофлюидным электрофоре

тодов для миРНК. Однако этот факт ни в коем

зом. Chen et al. [65] сконструировали микро

случае не следует относить к недостаткам мето

флюидный чип для определения миРНК 21,

да. Методы анализа миРНК с широким рабочим

чувствительность которого позволила количест

диапазоном предпочтительно использовать при

венно оценить содержание этой миРНК, ис

оценке их экспрессии в неописанных образцах

пользуя как образец всего лишь 20 клеток. С по

или при количественном определении опреде

мощью данного метода найдено, что концентра

лённых миРНК, концентрация которых в норме

ция миРНК 21 в клетках линий HepG2 и HL

и патологии сильно отличается. Однако если

7702 равна 49,8 и 11,4 пМ соответственно.

различие в концентрации миРНК в образцах

Более распространённая модификация RCA,

здоровых людей и пациентов не велико [68-69],

позволяющая осуществлять экспоненциальную

то предпочтительно использование методов с

амплификацию, основывается на использова

более узким рабочим диапазоном, но макси

нии дополнительных праймеров, комплемен

мально возможным коэффициентом чувстви

тарных высокомолекулярному продукту RCA.

тельности. Таким образом, методы анализа

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

481

миРНК как с широким, так и с узким рабочими

Для повышения специфичности EXPAR бы

диапазонами представляют интерес для диаг

ли применены «арочные» зонды. Как видно на

ностической медицины.

рис. 3, б, в этом методе используется комплекс

В научной литературе отмечены и недостат

основного зонда и дополнительного зонда бло

ки RCA, связанные с протеканием фоновой

катора, при этом концы последовательности

амплификации (в отсутствие аналита), что в ко

блокатора комплементарны концам основного

нечном счёте ухудшает аналитические парамет

зонда. Так как фрагмент основного зонда, всту

ры метода определения миРНК. Аналогичный

пающий в реакцию с аналитом, частично нахо

вопрос в равной степени относится и к другим

дится в дуплексе, метод характеризуется повы

методам амплификации. В случае методов ам

шенной специфичностью. Данная стратегия

плификации с применением полимераз (в част

была успешно применена Wu et al. [73] для опре

ности, RCA) данный процесс связывают с меж

деления миРНК 141. Кросс реактивность

молекулярными взаимодействиями молекул

миРНК 200а, наиболее структурно близкой к

зонда и их дальнейшей элонгацией, взаимодей

анализируемой миРНК 141, составила все

ствием их с дополнительно используемыми

го 3%. При флуоресцентной детекции образуе

праймерами, присутствием в анализируемых

мых на подложке продуктов амплификации на

образцах дополнительных нуклеиновых кислот,

нокластеров серебра был получен предел обна

а также побочными активностями используе

ружения 1 фМ при довольно узком рабочем диа

мых полимераз [70]. Для элиминирования влия

пазоне (до 500 фМ).

ния фоновых реакций на определение миРНК

Серьёзной проблемой, ограничивающей

следует применять методы детекции, специфич

чувствительность методов с применением

ные к продуктам основной (аналит зависимой)

EXPAR, является интенсивная неспецифичес

реакции.

кая реакция, протекающая при отсутствии ана

Экспоненциальная реакция амплификации

лита. В случае EXPAR данная проблема усугуб

(EXPonential Amplification Reaction, EXPAR) яв

ляется использованием зондов (превышающих

ляется ещё одним широко используемым при

как минимум в 2 раза последовательность ана

определении миРНК методом из группы МИА,

лита по длине) в высокой концентрации. Для

приводящим к повышению аналитического сиг

уменьшения димеризации зондов и снижения

нала за счёт повышения концентрации аналита.

эффекта побочных активностей используемых

В EXPAR применяется зонд, представляющий

полимераз рекомендуется проводить EXPAR

из себя две полностью комплементарные анали

при повышенной температуре (55 °С) с исполь

ту ДНК последовательности, связанные друг с

зованием термофильных ферментов [74]. Следу

другом одной из цепей сайта рестрикции ника

ет заметить, что данный подход полностью ука

зы (рис. 3, а). При взаимодействии аналита с 3′

занную проблему не решает.

и 5′ концами зонда образуются дуплексы. Тот

Интересная модификация метода, позволя

дуплекс, в котором аналит гибридизован c 3′

ющая элиминировать развитие фоновой реак

концом зонда, удлиняется ДНК полимеразой с

ции вследствие образования димеров зондов и

отсутствием (3′→5′) экзонуклеазной активнос

их дальнейшей элонгации и названная «симмет

ти (полимераза phi 29, фрагмент Кленова, поли

ричная EXPAR» (Symmetric EXPAR, SEXPAR),

меразы Vent и Bst). В результате этого наблюда

была предложена Chen et al. [75]. Зонд в данном

ется формирование сайта рестрикции никазы и

методе представляет из себя гантелеобразную

ферментативный гидролиз комплементарной

замкнутую последовательность, содержащую

зонду последовательности, после чего образуе

два комплементарных аналиту домена. При

мая последовательность аналита элонгируется

этом часть каждого из доменов находится в

вновь [71].

стебле шпильки, а домены связаны между собой

В пионерской работе по применению метода

сайтом рестрикции никазы (рис. 3, в). При свя

EXPAR при анализе миРНК с использованием

зывании миРНК с зондом в присутствии поли

флуоресцентной детекции предел обнаружения

меразы осуществляется его элонгация, при

миРНК let 7a составил 0,1 фМ. Его рабочий диа

этом, как только происходит формирование

пазон покрывал 10 порядков концентрации ана

сайта рестрикции, элонгируемая последователь

лита. В то же время следует отметить, что анали

ность подвергается ферментативному гидролизу

тический сигнал при этом изменялся лишь в

и впоследствии вытесняется. Именно благодаря

6 раз, что указывает на низкое значение коэф

замкнутой геометрии зонда предотвращается

фициента чувствительности метода. Для наибо

протекание фоновой реакции, вызванной взаи

лее структурно близких аналиту миРНК let 7e и

модействием зондов. Шпилечная структура до

миРНК let 7f кросс реактивность состави

менов зонда, связывающих аналит, призвана

ла 17,6 и 0,6% соответственно [72].

повысить специфичность формирования комп

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

483

Петлевая изотермическая амплификация

дает способностью к замещению цепи, одновре

(Loop isothermal AMPlification, LAMP) извест

менно происходит вытеснение первого прайме

на как один из наиболее эффективных и быст

ра. Впоследствии на 3′ конце первичного про

рых методов изотермической амплификации

дукта осуществляется связывание и элонгация

нуклеиновых кислот. Несмотря на то что ориги

другой пары праймеров, а именно обратных

нальная схема LAMP разработана для амплифи

внутреннего и внешнего праймеров. Это приво

кации высокомолекулярной ДНК, в настоящее

дит к формированию гантелеобразных структур

время описаны варианты данного метода, ис

на обоих концах образованной последователь

пользуемые для анализа миРНК [76]. В этом

ности, после чего запускается каскад дальней

случае анализируемая миРНК играет роль одно

ших циклов амплификации. Температура прове

го из праймеров. С заменой прямого внешнего

дения амплификации - 60 °С. Детекция сигнала

праймера в классической LAMP на миРНК и

не специфична к последовательности аналита и

двухцепочечной ДНК матрицы на одноцепо

проводится при помощи флуоресцентных ин

чечную ранее разработан метод определения

теркалирующих красителей.

миРНК паразитов Fasciola hepatica и Fasciola

Использование вышеизложенного метода

gigantica [77]. Как видно на рис. 4, а, с 3′ конце

позволило провести определение миРНК novel

вой последовательностью ДНК зонда последо

shared 03 в диапазоне концентраций 0,1 фМ-

вательно взаимодействуют прямой внутренний

0,1 нМ [77]. Описанный метод показал хорошую

праймер и миРНК. Bst Полимераза элонгирует

специфичность, так как гомологичные миРНК с

оба праймера, а так как данный фермент обла

однонуклеотидными заменами не определялись

Рис. 4. Схемы метода петлевой изотермической амплификации (LAMP, а) и метода «лигирующей» петлевой изотермичес

кой амплификации (ligation LAMP, б), используемых при определении миРНК. A_n - Полиаденилиновая последователь

ность, T₁₀ - последовательность из десяти тиминовых нуклеотидов

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

484

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

даже в концентрации, равной 100 фМ. Для об

ется ферментативному расщеплению. Для этого

наружения инфицированных животных был ус

могут быть применены различные ферменты:

пешно проведён анализ паразитических миРНК

дуплекс специфическая нуклеаза [79-81], экзо

в образцах сыворотки быков.

нуклеазы [82-89] и эндонуклеазы [90-92]. В ре

В другом варианте LAMP, названном «лиги

зультате гидролиза зонда происходит диссоциа

рующей» LAMP (ligation LAMP), предваритель

ция модифицированного дуплекса, а освобо

но полученный транскрипт миРНК взаимодей

дившаяся последовательность миРНК взаимо

ствовал с хвостовыми последовательностями

действует со следующей молекулой зон

двух шпилечных зондов, соединяя их, что в при

да (рис. 5, а).

сутствие лигазы приводило к формированию

Опубликован ряд работ, описывающих мето

ковалентной связи между шпилечными зондами

ды определения миРНК на основе CEAM с ис

с образованием гантелеобразной последова

пользованием эндонуклеазы. В большинстве та

тельности (ГП1, рис. 4, б) [78]. Далее с 3′ конца

ких методов формируются олигонуклеотидные

ГП1 осуществлялась её элонгация полимеразой

структуры Y формы

[90,

91]. В работе

со способностью к замещению цепи и одновре

Miao et al. [90] на поверхности углеродного

менное взаимодействие с прямым праймером,

электрода через золотые наночастицы иммоби

его элонгация и вытеснение продукта удлине

лизован ДНК олигонуклеотид, связанный с

ния (второй гантелеобразной последователь

электроактивной меткой (зонд 1). При специ

ности (ГП2)) растущей цепью ГП1. Замыкание

фическом взаимодействии миРНК, зонда 1 и

цикла амплификации происходило благодаря

дополнительного зонда (зонда 2) происходило

удлинению 3′ конца ГП2 и её взаимодействию с

формирование Y комплекса, причём на одной

обратным праймером, в результате чего при

из ветвей Y комплекса, образованной зондами 1

дальнейших актах элонгации и замещения вы

и 2, формируется сайт рестрикции эндонуклеа

теснялась ГП1.

зы Nb.BbvCl. После расщепления эндонуклеа

При исследовании специфичности данного

зой Y комплекс распадался, благодаря чему

метода показано, что кросс реактивность в отно

электрохимическая метка диффундировала в

шении миРНК 21 с одной нуклеотидной заменой

раствор, что приводило к понижению регистри

равна 22%. Предел обнаружения миРНК 21 и ра

руемого сигнала, а освободившаяся миРНК

бочий диапазон составили 0,2 фМ и 1 фМ-1 нМ

инициировала следующий цикл амплификации.

соответственно. Метод был успешно применён

Базируясь на данной схеме, при определении

для количественного определения миРНК 21 в

миРНК был достигнут низкий предел обнару

клетках раковых линий MCF 10A, HT 1080, HeLa

жения (30 аМ) и широкий рабочий диапа

и MCF 7. Относительно ранее рассмотренной

зон (100 аМ-1 нМ). Кросс реактивность мето

модификации LAMP данный метод более сложен

да, оценённая в отношении изомиров, состави

и требует больше времени за счёт проведения ре

ла 4%. Высокая чувствительность метода позво

акции обратной транскрипции.

лила провести анализ миРНК 21 в образцах сы

В заключение отметим, что несмотря на эф

воротки пациентов с раком груди.

фективность и скорость амплификации LAMP,

Гораздо реже в методе CEAM используется

число публикаций, описывающих её примене

Т7 экзонуклеаза. В этом случае после взаимо

ние при определении миРНК, невелико.

действия миРНК с распознающим зондом пос

ледовательность зонда в образовавшемся комп

лексе подвергается ферментативному гидролизу

МИА, ПРИВОДЯЩИЕ К ПОВЫШЕНИЮ

(5′→3′) направлении, в результате чего

АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА БЕЗ

миРНК высвобождается и формирует дуплекс с

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ микроРНК

другой молекулой зондом. Чувствительность

таких методов сильно зависит от используемых

Циклический ферментативный метод ампли)

методов детекции. Так, при использовании

фикации (Circle Enzymatic Amplification, CEAM)

электрохимической детекции предел обнаруже

стал одним из первых методов изотермической

ния часто лежит в фемтомолярном диапазо

амплификации, приводящих к повышению ана

не [84-86]. В случае применения оптических

литического сигнала без изменения концентра

методов детектируемость миРНК ниже; их пре

ции аналита и нашедших применение в анализе

делы обнаружения находятся в пикомолярном

миРНК. Известно большое число публикаций с

диапазоне [82, 83]. Описаны единичные работы

описанием методов определения миРНК, осно

по применению в данном методе экзонуклеа

ванных на CEAM. В этом методе амплификации

зы III, гидролизующей последовательность зон

последовательность распознающего зонда после

да в дуплексе с аналитом в (3′→5′) направле

его комплексообразования с миРНК подверга

нии [87-89]. Малое число таких работ может

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

486

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

миРНК с использованием системы CRISPR/

миРНК 17 составили 1,3 фМ и 6,2-500 фМ со

Cas13а.

ответственно. Авторами отмечается, что достиг

Данная система включает в себя «направля

нутая в методе чувствительность на 3 порядка

ющую» РНК (crРНК) и РНК мишень (аналит).

выше, чем в случае применения одноэтапного

crРНК находится в положительно заряженном

метода с применением CRISPR/Cas13a. Кроме

канале, образующемся в результате конформа

того, показано, что при использовании crРНК с

ционных изменений при её включении в

введённым некомплементарным аналиту нуклео

CRISPR/Cas13а. Присутствие в реакционном

тидом метод демонстрирует особенно высокую

растворе, кроме CRISPR/Cas13а, также РНК

селективность относительно близкородствен

мишени, например миРНК, приводит к тому,

ных миРНК. Разработанный каскадный

что белки Cas13а приобретают способность ка

CRISPR/Cas метод был использован при опре

талитически гидролизовать РНК, т.е. проявляют

делении миРНК 17 в экстрактах из сыворотки

активность РНКазы. Расщепление последова

крови больных аденокарциномой груди.

тельности РНК мишени происходит за предела

Системы CRISPR/Cas также применялись в

ми её комплементарности с crРНК, при этом

сочетании и с другими методами изотермичес

места рестрикции детерминируются первичной

кой амплификации, такими как RCA [101] и

и вторичной структурами РНК мишени [95].

EXPAR [102], что в конечном счёте позволило

После активации РНК мишенью CRISPR/

сконструировать высокочувствительные кас

Cas13а проявляет также РНКазную активность

кадные методы определения миРНК.

по отношению к неспецифическим одноцепо

Амплификационный метод с полимеризацией и

чечным РНК. Такая активность CRISPR/Cas13а

замещением (Isothermal Circular Strand Displace

называется коллатеральной или транс актив

ment Polymerization, ICSDP) является ещё од

ностью. Проявление данной способности

ним относительно редко используемым в анали

CRISPR/Cas13а легло в основу ряда методов оп

зе миРНК МИА, приводящим к повышению

ределения миРНК.

аналитического сигнала без изменения концен

В присутствии анализируемой миРНК бла

трации аналита. В этом методе анализируемая

годаря её взаимодействию с crРНК и активации

миРНК специфически взаимодействует с зон

транс активности Cas13a происходит расщеп

дом шпилечной структуры, в результате чего

ление меченых РНК зондов, что приводит к

последний раскрывается, что приводит к высво

амплификации сигнала (рис. 5, б). На основе

бождению из стебля шпильки фрагмента, комп

описанного принципа разработаны флуоресцент

лементарного праймеру (рис. 5, в). Это позволя

ные, колориметрические и электрохимические

ет праймеру гибридизоваться с зондом, после

методы детекции миРНК [96-98].

чего праймер элонгируется полимеразой. Чаще

Следует отметить, что чувствительность ме

других для этих целей используется фрагмент

тодов определения миРНК с помощью системы

Кленова, а элонгация проводится при низких

CRISPR/Cas13a невысока и находится в пико

температурах. В процессе удлинения праймера

молярном интервале [99]. Другим недостатком

одновременно происходит замещение последо

данного подхода является необходимость про

вательности миРНК. Высвобожденный из

ведения анализа миРНК в особо чистых поме

комплекса аналит вступает в реакцию с другой

щениях, предназначенных для работы с РНК.

молекулой зонда. Концентрация миРНК соот

Недавно Sha et al. [100] описали каскадный

ветствует количеству образовавшегося дуплек

метод с применением CRISPR/Cas для опреде

са, который определяется такими методами, как

ления миРНК 17. На первом амплификацион

флуоресценция [103, 104], электрохимия [105],

ном этапе была задействована система

хемилюминесценция [106, 107]. Таким образом,

CRISPR/Cas13а, а на втором - CRISPR/Cas14а.

в ICSDP молекула миРНК выполняет роль ката

Анализируемая миРНК активировала проявле

лизатора реакции раскрытия шпилечного зонда.

ние транс активности Cas13a, которая гидроли

Недавно описан гетерогенный метод опреде

зовала связь между двумя урацилами, включён

ления миРНК 39, в котором для амплификации

ными в петлю шпилечного ДНК зонда. После

сигнала применён ICSDP [107]. В этом методе

гидролиза шпилька трансформировалась в дуп

использовался биотинилированный праймер, в

лекс, одна из цепей которого вступала в реак

связи с чем образованный в процессе гетероген

цию замещения цепи с crРНК в составе

ной амплификации продукт также содержал био

CRISPR/Cas14a, что, в свою очередь, активиро

тин, который впоследствии эффективно взаи

вало проявление транс активности Cas14a, гид

модействовал с конъюгатом стрептавидина и

ролизующей линейные ДНК зонды с флуорес

полипероксидазы. Сигнал детектировался мето

центной меткой и тушителем на концах. Предел

дом усиленной хемилюминесценции с исполь

обнаружения и рабочий диапазон определения

зованием фенотиазиновых усилителей. Предел

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

487

обнаружения составил 400 фМ, при этом полу

Методы определения миРНК, основанные

чено высокое значение коэффициента чувстви

на ICSDP, в целом характеризуются низкими

тельности метода (в пределах рабочего диапазо

значениями предела обнаружения, а за счёт

на сигнал возрастал более чем в 500 раз). При

применения шпилечного зонда являются высо

определении миРНК 39 в образцах коротких

коспецифичными.

РНК, полученных из лизатов клеточных линий,

Реакция цепной гибридизации. В отличие от

показано отсутствие матричного эффекта, что

вышеописанных МИА для проведения реакции

позволило использовать буферные растворы

цепной гибридизации (hybridization chain reac

миРНК в качестве калибраторов. Так как

tion, HCR) не требуется участия какого либо

миРНК 39 обнаруживается в нематоде Caeno(

фермента. Понятно, что такие методы менеe до

rhabditis elegans и отсутствует в организме чело

рогостоящие и им не присущи недостатки, свя

века, данный метод предложено использовать

занные с применением ферментов (см. выше).

для оценки эффективности выделения миРНК

HCR основана на комплементарном взаимодей

из биоматериала человека [90, 105].

ствии двух зондов шпилечной структуры, ката

В методах определения миРНК с ICSDP ис

лизируемом последовательностью олигонуклео

пользуются и другие детектирующие системы.

тида, в частности миРНК (рис. 6). При взаимо

Так, в работе Wang et al. [104] шпилечный зонд

действии миРНК с первым зондом происходит

был мечен флуоресцентной меткой, в то время

высвобождение домена, способного раскрыть

как праймер предварительно иммобилизовался

шпилечную структуру второго. В свою очередь,

на поверхности наночастиц золота. При образо

при раскрытии второго зонда в нём из дуплекса

вании в процессе амплификации дуплексов

освобождается фрагмент последовательности,

флуоресцентные метки сближались с поверх

способный раскрыть шпилечную структуру пер

ностью наночастиц, что приводило к тушению

вого зонда. Таким образом, в присутствии ана

флуоресценции. Предел обнаружения метода,

лита формируется цепная дуплексная структура,

разработанного для определения миРНК 21, и

состоящая из используемых зондов. Правила

его линейный диапазон составили 1,5 фМ и

моделирования используемых в HCR шпилек

10 фМ-10 нМ соответственно. Кроме того, про

сформулированы в работе Ang и Yung [108]. Ес

демонстрирована способность метода к выявле

ли один или оба зонда содержат в своей структу

нию однонуклеотидных замен. Метод был ис

ре аналитическую метку, то полимеризация зон

пользован для определения миРНК 21 в экзосо

дов приводит к амплификации регистрируемого

мах, секретируемых клетками HeLa.

сигнала.

Рис. 6. Схема реакции цепной гибридизации (HCR), используемой при определении миРНК

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

488

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

С использованием HCR разработано боль

ких либо преимуществ одного метода амплифи

шое количество методов определения миРНК,

кации перед другим. Справедливости ради оста

многие из которых являются высокочувстви

ётся отметить, что данное заключение сделано

тельными и способны детектировать аналиты в

при сравнении данных, полученных в различ

фемто и аттомолярных концентрационных диа

ных лабораториях при определении различных

пазонах [109-112]. Недавно Zhang et al. [109] ис

миРНК, а не на основании прямого сравнения

пользовали HCR для амплификации сигнала

указанных методов амплификации в одной и

микрочипов. В данной работе ДНК зонд 1 с од

той же работе.

ного из концов был связан с тетраэдрической

Метод каталитической сборки шпилек. Наря

ДНК структурой, ковалентно иммобилизован

ду с HCR при разработке методов определения

ной на поверхность чипа. При взаимодействии

миРНК не менее широко используется метод

аналита с иммобилизованным ДНК зондом 1 в

каталитической сборки шпилек (Catalytic

систему вносился зонд шпилечной структуры 2,

Hairpin Assembly, CHA). Для проведения данной

который раскрывался аналитом. Освобождён

амплифицирующей реакции так же, как и в слу

ный благодаря этому домен зонда 2 служил ини

чае HCR, не требуется присутствия каких либо

циатором взаимодействия пары HCR зондов,

ферментов. CHA основывается на аналит зави

которые полимеризовались с образованием

симом взаимодействии двух комплементарных

двухцепочечной ДНК. Для данного метода наб

друг другу шпилечных зондов (рис. 7). Так как

людался очень низкий предел обнаружения

используемые зонды находятся в шпилеч

(10 аМ), при этом линейное нарастание сигнала

ной (закрытой) форме, их спонтанная гибриди

регистрировалось вплоть до 100 фМ. Высокая

зация затруднена. На первом этапе аналит гиб

специфичность данного метода позволила раз

ридизуется с первым зондом (зонд 1). Появле

личить однонуклеотидные замены в структуре

ние одноцепочечного фрагмента в образован

миРНК [109].

ном дуплексе является инициирующим центром

Как и для большинства других методов ам

для взаимодействия с зондом 2. По завершении

плификации, в случае применения HCR наблю

амплификационного цикла формируется комп

дается повышенный фоновый сигнал, обуслов

лекс зондов 1 и 2 и молекула миРНК в свобод

ленный спонтанной (при отсутствии аналита)

ном состоянии, что позволяет ей вступать в ре

полимеризацией зондов. Недавно описан под

акцию со следующей молекулой зонда 1. Таким

ход понижения фонового сигнала, основанный

образом, одна молекула аналита способна ката

на обработке экзонуклеазой I захватывающего

лизировать образование большего числа дуп

зонда шпильки, предварительно иммобилизо

лексов зондов 1 и 2.

ванного на поверхности электрода. В результате

На настоящий момент среди МИА, исполь

действия фермента удалялись шпилечные пос

зуемых в методах анализа миРНК, СНА являет

ледовательности, имеющие дефекты в их вто

ся наиболее популярным. В данных методах

ричной структуре [113]. После такой обработки

CHA успешно сочетается с различными мето

предел обнаружения миРНК 122 составил

дами детекции. Хотя для таких методов наблю

100 аМ с рабочим диапазоном до 100 нМ. Разра

дается большой разброс значений предела об

ботанный метод показал свою эффективность

наружения (от пикомолярных до субфемтомо

при определении миРНК 122 в экзосомах рако

лярных концентраций) [118-120], что требует

вых клеток HepG2 и SCF 7.

отдельного исследования, способность с по

Для дополнительного повышения эффек

мощью данного типа изотермической ампли

тивности данного метода амплификации разра

фикации конструирования ультрачувствитель

ботана разветвлённая HCR, где образуемый

ных методов анализа указывает на перспектив

дуплекс содержит фрагмент одного из зондов,

ность СНА. Недавно Jin и Xu [121] описали

свободный от какого либо взаимодействия, ко

микрочип на стекле, функционирующий с

торый, в свою очередь, является инициатором

применением CHA. Для данного чипа с флуо

полимеризации другой пары зондов (зондов 3

ресцентной детекцией предел обнаружения

и 4). В конечном счёте происходит образование

миРНК 21 и миРНК 155 был одинаков и сос

разветвлённой структуры, состоящей из после

тавил 1,3 фМ. Полученные значения были

довательностей четырёх зондов.

очень низкими по сравнению с аналогичными

С применением разветвлённой HCR разра

величинами, обычно характерными для микро

ботан ряд методов определения миРНК

чипов. Разработанный чип также был высоко

[114-117]. Следует отметить, что сравнение ана

специфичен в отношении исследуемых

литических параметров методов определения

миРНК. Следует отметить, что высокая специ

миРНК, созданных на основе базовой и развет

фичность в целом характерна для методов, ос

влённой HCR, не выявило в явной форме ка

нованных на CHA [119, 122-124].

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

489

Рис. 7. Схема реакции каталитической сборки шпилек (CHA, а) и схема реакции CHA с образованием Y структур (б), ис

пользуемых при определении миРНК

Кроме базового варианта CHA с участием

С помощью разработанного метода успешно

двух зондов, описаны методы анализа миРНК с

проведены определения миРНК 181 в экзосо

применением трёх шпилечных зондов, из кото

мах сывороток крови больных с ишемической

рых в конечном счёте образуются Y структуры.

болезнью сердца и здоровых людей.

В электрохимическом методе анализа миРНК

Существенным фактором, ограничивающим

181

[124] итоговые биотинилированные Y

чувствительность методов с использованием

структуры формировались вблизи поверхности

CHA, является фоновая реакция зондов в отсут

электрода и впоследствии реагировали с конъю

ствие аналита. Для понижения степени протека

гатом стрептавидина и щелочной фосфата

ния данной реакции были предложены различ

зы (рис. 7, а). Определение ферментативной ак

ные стратегии. Одной из первых была предло

тивности фосфатазы вольтамперометрическим

жена стратегия использования одного из зондов

методом позволило получить предел обнаруже

с одним или двумя нуклеотидами не компле

ния миРНК 181, равный 7 фМ. Рабочий диапа

ментарными другому зонду. Это понизило веро

зон данного метода лежал в интервале

ятность гибридизации шпилек, находящихся в

10 фМ-100 нМ, т.е. был достаточно широким.

динамическом равновесии между открытой и

3 БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

490

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

закрытой формами [125]. Jiang et al. [125] назва

миРНК, основанные на сочетании RCA с CEAM

ли данный метод СНА с некомплементарным

или CHA. В одних методах CEAM [128] и

противостоянием нуклеотидов (Mismatched

СHA [129] используются на втором этапе после

Catalytic Hairpin Assembly, mСНА). Примене

RCA, в других - RCA используется для повыше

ние mСНА позволяет значительно понизить ин

ния эффективности CEAM [130] и CHA [131].

тенсивность фоновой реакции, однако пол

Объединение RCA с CRISPR/Cas13a позволило

ностью её подавить не способно.

разработать метод с субфемтомолярными пре

Другой причиной, приводящей к протека

делами обнаружения миРНК [132].

нию фоновой реакции, является наличие в раст

Ранее отмечалось, что при использова

ворах шпилечных зондов молекул с дефектной

нии EXPAR образуется большое количество

вторичной структурой. Так как шпилечная

неспецифических продуктов, что, в свою оче

структура зондов формируется на этапе их от

редь, приводит к ложноположительным сигна

жига, недавно проведено детальное исследова

лам. Для устранения этого недостатка

ние влияния условий отжига олигонуклеотид

Liu et al. [133] предложили метод с каскадной

ных зондов на интенсивность фоновой реакции

амплификацией, в котором вместо неспецифи

в mСНА [126]. Понижение концентрации оли

ческой детекции продуктов с помощью интер

гонуклеотидов, а также оптимизация концент

калирующих красителей использовался CHA,

рации солей (таких как NaCl и MgCl₂) в буфере

позволяющий специфически детектировать

отжига зондов привело к снижению интенсив

миРНК зависимый продукт EXPAR. Предел об

ности фоновой реакции и позволило в 20 раз по

наружения миРНК 21, достигнутый при помо

низить предел обнаружения миРНК 141. Не

щи данного метода, составил 3 фМ.

смотря на достигнутые значительные успехи

Описано также применение каскадных бес

при решении данной задачи, на сегодняшний

ферментных методов амплификации. Fu et al.

день окончательного решения данной пробле

[134] применили стратегию каскадной ампли

мы пока не предложено.

фикации, основанной на сочетании CHA и

Таким образом, в настоящее время с исполь

HCR. В этом методе HCR зонды содержали ин

зованием разнообразных методов амплифика

вертазу как метку, что позволило регистрировать

ции нуклеиновых кислот разработано большое

аналитический сигнал, образующийся при оп

число методов определения миРНК. Однако так

ределении миРНК 155, с помощью мобильного

как концентрация некоторых миРНК в биоло

глюкометра. Предел обнаружения данного ме

гических образцах крайне низкая, а в некоторых

тода составил 0,36 фM. Следует отметить, что

случаях при патологических состояниях она до

при отсутствии второй амплификации в каскаде

полнительно понижается [14], требуются мето

чувствительность детекции миРНК понижалась

ды анализа с повышенной чувствительностью.

на

порядка. Благодаря взаимодействию

Кроме того, как было уже отмечено выше, для

миРНК с зондом шпилечной структуры на пер

более точной оценки концентрации миРНК

вом этапе метод также показал высокую специ

требуются методы с высокими значениями ко

фичность.

эффициента чувствительности.

Таким образом, с использованием каскад

Каскадные методы амплификации. Для улуч

ных методов амплификации разработаны мето

шения данных аналитических параметров, ха

ды определения миРНК с чрезвычайно высокой

рактеризующих методы определения миРНК,

чувствительностью, вплоть до аттомолярных

могут быть использованы каскадные методы

концентраций [135-136]. В то же время следует

амплификации, в которых используется сочета

отметить, что не во всех описанных случаях

ние различных типов амплификации. В таких

применение каскадной амплификации было ус

методах анализа миРНК запускает первый тип

пешным. Хотя на настоящий момент число пуб

амплификации, а образующийся продукт явля

ликаций, посвящённых разработке новых мето

ется инициатором для последующей амплифи

дов определения микРНК с применением кас

кации.

кадной амплификации невелико, наблюдается

Используя данный подход, недавно был

тенденция повышения интереса к данному под

сконструирован метод определения миРНК let

ходу улучшения чувствительности анали

7a, в котором последовательно использовались

за миРНК.

RCA и LAMP [127]. При детекции продукта

LAMP флуоресцентным методом миРНК let 7a

детектировалось вплоть до 10 аМ. Кросс реак

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

тивность метода в отношении других миРНК се

мейства let 7 не превышала 19%. Описаны так

Детальный анализ литературы показывает,

же высокочувствительные методы анализа

что с каждым годом разрабатывается всё больше

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

491

новых высокоэффективных методов определе

ности за счёт применения методов амплифика

ния миРНК. Многие из них позволяют успешно

ции, улучшается и специфичность методов оп

оценивать уровень миРНК маркёров в клетках,

ределения миРНК, что чрезвычайно важно,

экзосомах и биологических жидкостях, таких

учитывая высокое разнообразие миРНК в био

как сыворотка/плазма крови, моча, слезы, что

логических объектах. Применение каскадных

является хорошим заделом для развития мало

методов амплификации и высокочувствитель

инвазивной диагностики. Полученные при этом

ных методов детекции [137-138] создаёт плат

новыми методами данные согласуются с резуль

форму для дальнейшего повышения чувстви

татами, демонстрируемыми RT qPCR [64, 78,

тельности методов анализа миРНК.

124]. Разрабатываемые методы обладают высо

Большое внимание специалистов привлека

кой чувствительностью и специфичностью.

ют не только аналитические параметры методов

Вместе с тем пока внимание большинства ис

анализа миРНК, но также их технологичность,

следователей акцентировано на оценках преде

стоимость производства и лёгкость автоматиза

ла обнаружения, рабочего диапазона и специ

ции. Не последнее место среди этих требований

фичности разрабатываемых методов, оставляя

занимает и производительность метода анализа.

за скобками такой важный аналитический пара

С учётом сказанного, в первую очередь проявля

метр, как коэффициент чувствительности, часто

ется интерес к оптическим методам анализа

являющийся ключевым при регистрации откло

миРНК, основанным на применении МИА.

нений в уровне экспрессии миРНК в образцах

Все вышесказанное показывает актуальность

пациентов с различными патологиями. Данная

дальнейших интенсивных исследований в об

проблема заслуживает более пристального рас

ласти разработки методов определения миРНК и

смотрения [67].

их внедрения в аналитическую практику.

Для повышения чувствительности анализа

миРНК используются разнообразные методы

Финансирование. Работа выполнена при фи

амплификации. В последние годы из за просто

нансовой поддержке Российского фонда фунда

ты проведения большой интерес исследователей

ментальных исследований (грант № 21 54

привлекают МИА. Особенно заманчиво выгля

53007).

дит перспектива создания методов анализа на

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

основе бесферментных МИА, что позволит, с

сутствии конфликта интересов.

одной стороны, преодолеть проблему синтеза

Соблюдение этических норм. Настоящая

неспецифических продуктов полимеразами, а с

статья не содержит описания каких либо иссле

другой стороны, понизить стоимость определе

дований с участием людей или использованием

ния миРНК. Кроме повышения чувствитель

животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bodulev, O. L., and Sakharov, I. Y. (2020) Isothermal

decay, Nat. Rev. Genet., 11, 597610, doi: 10.1038/

nucleic acid amplification techniques and their use in bio

nrg2843.

analysis,

Biochemistry (Moscow),

85,

147166,

8. Katoh, T., Sakaguchi, Y., Miyauchi, K., Suzuki, T.,

doi: 10.1134/S0006297920020030.

Kashiwabara, S. I., et al. (2009) Selective stabilization of

Pritchard, C. C., Cheng, H. H., and Tewari, M. (2012)

mammalian microRNAs by 3′ adenylation mediated by the

MicroRNA profiling: Approaches and considerations, Nat.

cytoplasmic poly (A) polymerase GLD 2, Genes Dev., 23,

Rev. Genet., 13, 358 369, doi: 10.1038/nrg3198.

433 438, doi: 10.1101/gad.1761509.

De Planell Saguer, M., and Rodicio, M. C.

(2011)

9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., and Ambros, V. (1993)

Analytical aspects of microRNA in diagnostics: A review,

The C. elegans heterochronic gene lin 4 encodes small

Anal. Chim. Acta, 699, 134 152, doi: 10.1016/j.aca.2011.

RNAs with antisense complementarity to lin(14, Cell, 75,

05.025.

843 854, doi: 10.1016/0092 8674(93)90529 Y.

Ragan, C., Zuker, M., and Ragan, M. A.

(2011)

10. Bartel, D. P. (2009) MicroRNAs: target recognition and

Quantitative prediction of miRNA mRNA interaction

regulatory functions, Cell, 136, 215 233, doi: 10.1016/

based on equilibrium concentrations, PLoS Comput. Biol.,

j.cell.2009.01.002.

7, e1001090, doi: 10.1371/journal.pcbi.1001090.

11. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., and Chen, C. (2007)

Kozomara, A., Birgaoanu, M., and Griffiths Jones, S.

Characterization of microRNA expression profiles in nor

(2019) miRBase: From microRNA sequences to function,

mal human tissues, BMC Genom., 8, 1 20, doi: 10.1186/

Nucleic Acids Res., 47, D155 D162, doi: 10.1093/nar/

1471 2164 8 166.

gky1141.

12. Wienholds, E., Kloosterman, W. P., Miska, E., Alvarez

Plotnikova, O., Baranova, A., and Skoblov, M. (2019)

Saavedra, E., Berezikov, E., et al. (2005) MicroRNA

Comprehensive analysis of human microRNA-mRNA

expression in zebrafish embryonic development, Science,

interactome, Front. Genet., 10, 933, doi: 10.3389/fgene.

309, 310 311, doi: 10.1126/science.1114519.

2019.00933.

13. Alvarez Garcia, I., and Miska, E. A. (2005) MicroRNA

Krol, J., Loedige, I., and Filipowicz, W. (2010) The wide

functions in animal development and human disease,

spread regulation of microRNA biogenesis, function and

Development, 132, 4653 4662, doi: 10.1242/dev.02073.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

492

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

14.

Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez Saavedra, E.,

30.

Li, W., and Ruan, K. (2009) MicroRNA detection by

Lamb, J., et al. (2005) MicroRNA expression profiles clas

microarray, Anal. Bioanal. Chem.,

394,

11171124,

sify human cancers, Nature, 435, 834 838, doi: 10.1038/

doi: 10.1007/s00216 008 2570 2.

nature03702.

31.

Ueno, T., and Funatsu, T. (2014) Label free quantification

15.

Lee, J. S., Ahn, Y. H., Won, H. S., Sun, D. S., Kim, Y. H.,

of microRNAs using ligase assisted sandwich hybridiza

et al. (2017) Prognostic role of the microRNA 200 family

tion on a DNA microarray, PLoS One, 9, e90920,

in various carcinomas: a systematic review and meta

doi: 10.1371/journal.pone.0090920.

analysis, BioMed Res. Int., 2017, doi: 10.1155/2017/

32.

Wang, H., Ach, R. A., and Curry, B. O. (2007) Direct and

1928021.

sensitive miRNA profiling from low input total RNA,

16.

Zhang, L., Wu, H., Zhao, M., and Lu, Q. (2020)

RNA, 13, 151 159, doi: 10.1261/rna.234507.

Identifying the differentially expressed microRNAs in

33.

Castoldi, M., Schmidt, S., Benes, V., Noerholm, M.,

autoimmunity: a systemic review and meta analysis,

Kulozik, A. E., et al. (2006) A sensitive array for

Autoimmunity, 53, 122 136, doi: 10.1080/08916934.2019.

microRNA expression profiling (miChip) based on locked

1710135.

nucleic acids (LNA), RNA, 12, 913 920, doi: 10.1261/

17.

He, M., Zhang, H. N., Tang, Z. C., Gao, S. G. (2021)

rna.2332406.

Diagnostic and therapeutic potential of exosomal

34.

Liu, C. G., Calin, G. A., Volinia, S., and Croce, C. M.

microRNAs for neurodegenerative diseases, J. Neural

(2008) MicroRNA expression profiling using microarrays,

Transplant. Plast., 2021, doi: 10.1155/2021/8884642.

Nat. Protoc., 3, 563 578, doi: 10.1038/nprot.2008.14.

18.

Ono, K., Kuwabara, Y., and Han, J. (2011) MicroRNAs

35.

Tian, R., Ning, W., Chen, M., Zhang, C., Li, Q., et al.

and cardiovascular diseases, FEBS J., 278, 1619 1633,

(2019) High performance electrochemical biosensor based

doi: 10.1111/j.1742 4658.2011.08090.x.

on 3D nitrogen doped reduced graphene oxide electrode

19.

Sempere, L. F., Freemantle, S., Pitha Rowe, I., Moss, E.,

and tetrahedral DNA nanostructure, Talanta, 194, 273

Dmitrovsky, E., et al. (2004) Expression profiling of mam

281, doi: 10.1016/j.talanta.2018.09.110.

malian microRNAs uncovers a subset of brain expressed

36.

Kutluk, H., Bruch, R., Urban, G. A., and Dincer, C.

microRNAs with possible roles in murine and human neu

(2020) Impact of assay format on miRNA sensing:

ronal differentiation, Genome Biol.,

1 11,

Electrochemical microfluidic biosensor for miRNA 197

doi: 10.1186/gb 2004 5 3 r13.

detection, Biosens. Bioelectron., 148, 111824, doi: 10.1016/

20.

Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. (1993) Posttranscrip

j.bios.2019.111824.

tional regulation of the heterochronic gene lin(14 by lin(4

37.

Smith, D. A., Simpson, K., Cicero, M. L., Newbury, L. J.,

mediates temporal pattern formation in C. elegans, Cell, 75,

Nicholas, P., et al. (2021) Detection of urinary microRNA

855 862, doi: 10.1016/0092 8674(93)90530 4.

biomarkers using diazo sulfonamide modified screen

21.

Válóczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyán, J.,

printed carbon electrodes, RSC Adv., 11, 18832 18839,

Kauppinen, S., et al. (2004) Sensitive and specific detec

doi: 10.1039/D0RA09874D.

tion of microRNAs by northern blot analysis using LNA

38.

Bodulev, O. L., and Sakharov, I. Y. (2019) Chemilumines

modified oligonucleotide probes, Nucleic Acids Res., 32,

cent determination of microRNA 141 using target depen

e175 e175, doi: 10.1093/nar/gnh171.

dent activation of the peroxidase mimicking DNAzyme,

22.

Várallyay, E., Burgyán, J., and Havelda, Z.

(2008)

Anal. Lett., 52, 813 824, doi: 10.1080/00032719.2018.

MicroRNA detection by northern blotting using locked

1498506.

nucleic acid probes, Nat. Protoc., 3, 190 196, doi: 10.1038/

39.

Lai, M., and Slaughter, G. (2019) Label free MicroRNA

nprot.2007.528.

optical biosensors, Nanomaterials, 9, 1573, doi: 10.3390/

23.

Pall, G. S., Codony Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., and

nano9111573.

Hamilton, A. (2007) Carbodiimide mediated cross linking

40.

Xue, T., Liang, W., Li, Y., Sun, Y., Xiang, Y., et al. (2019)

of RNA to nylon membranes improves the detection of

Ultrasensitive detection of miRNA with an antimonene

siRNA, miRNA and piRNA by northern blot, Nucleic

based surface plasmon resonance sensor, Nat. Commun.,

Acids Res., 35, e60, doi: 10.1093/nar/gkm112.

10, 1 9, doi: 10.1038/s41467 018 07947 8.

24.

Ramkissoon, S. H., Mainwaring, L. A., Sloand, E. M.,

41.

Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee,

Young, N. S., and Kajigaya, S. (2006) Nonisotopic detec

D. H., et al.

(2005) Real time quantification of

tion of microRNA using digoxigenin labeled RNA probes,

microRNAs by stem loop RT PCR, Nucleic Acids Res.,

Mol. Cell. Probes, 20, 1 4, doi: 10.1016/j.mcp.2005.07.

33, e179, doi: 10.1093/nar/gni178.

004.

42.

Lao, T. D., and Le, T. A. H. (2020) Development of stem

25.

Kim, S. W., Li, Z., Moore, P. S., Monaghan, A. P.,

loop real time PCR technique for miRNA 141 expression

Chang, Y., et al. (2010) A sensitive non radioactive north

analysis in nasopharyngeal carcinoma, Asian J. Pharm. Res.

ern blot method to detect small RNAs, Nucleic Acids Res.,

Health Care, 11, 30 36, doi: 10.18311/ajprhc/2019/24990.

38, e98 e98, doi: 10.1093/nar/gkp1235.

43.

Xu, Y. F., Hannafon, B. N., Khatri, U., Gin, A., and Ding,

26.

Johnson, B. N., and Mutharasan, R. (2014) Biosensor

W. Q. (2019) The origin of exosomal miR 1246 in human

based microRNA detection: techniques, design, perfor

cancer cells, RNA Biol., 16, 770784, doi: 10.1080/

mance, and challenges, Analyst,

139,

15761588,

15476286.2019.1585738.

doi: 10.1039/C3AN01677C.

44.

Zhang, L., Lin, J., Ye, Y., Oba, T., Gentile, E., et al. (2018)

27.

Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., et al. (2013)

Serum microRNA 150 predicts prognosis for early stage

MicroRNA: function, detection, and bioanalysis, Chem.

non small cell lung cancer and promotes tumor cell prolif

Rev., 113, 6207 6233, doi: 10.1021/cr300362f.

eration by targeting tumor suppressor gene SRCIN1, Clin.

28.

Shimomura, A., Shiino, S., Kawauchi, J., Takizawa, S.,

Pharmacol. Ther., 103, 1061 1073, doi: 10.1002/cpt.870.

Sakamoto, H., et al. (2016) Novel combination of serum

45.

Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Bryzgunova, O. E.,

microRNA for detecting breast cancer in the early stage,

Zaporozhchenko, I. A., Yarmoschuk, S. V., et al. (2020)

Cancer Sci., 107, 326 334, doi: 10.1111/cas.12880.

The panel of 12 cell free microRNAs as potential biomark

29.

Gungormez, C., Aktas, H. G., Dilsiz, N., and Borazan, E.

ers in prostate neoplasms, Diagnostics,

10,

38,

(2019) Novel miRNAs as potential biomarkers in stage II

doi: 10.3390/diagnostics10010038.

colon cancer: microarray analysis, Mol. Biol. Rep., 46,

46.

Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R., and

4175 4183, doi: 10.1007/s11033 019 04868 7.

Kubista, M. (2017) Two tailed RT qPCR: A novel method

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

493

for highly accurate miRNA quantification, Nucleic Acids

rolling circle amplification, Analyst, 145, 47774781,

Res., 45, e144 e144, doi: 10.1093/nar/gkx588.

doi: 10.1039/D0AN00723D.

47.

Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., and Rozhdestvensky,

62.

Zhou, Y., Huang, Q., Gao, J., Lu, J., Shen, X., et al. (2010)

T. S. (2014) Biases in small RNA deep sequencing data,

A dumbbell probe mediated rolling circle amplification

Nucleic Acids Res., 42, 14141426, doi: 10.1093/nar/

strategy for highly sensitive microRNA detection, Nucleic

gkt1021.

Acids Res., 38, e156, doi: 10.1093/nar/gkq556.

48.

Zhang, J., Li, Z., Wang, H., Wang, Y., Jia, H., and Yan, J.

63.

Li, R., Wang, Y., Wang, P., and Lu, J. (2017) A dual dis

(2011) Ultrasensitive quantification of mature microRNAs

crimination mode for improved specificity towards let 7a

by real time PCR based on ligation of a ribonucleotide

detection via a single base mutated padlock probe based

modified DNA probe, Chem. Commun., 47, 9465 9467,

exponential rolling circle amplification, Luminescence, 32,

doi: 10.1039/C1CC13466C.

1574 1581, doi: 10.1002/bio.3362.

49.

Tian, H., Sun, Y., Liu, C., Duan, X., Tang, W., et al. (2016)

64.

Liu, H., Li, L., Duan, L., Wang, X., Xie, Y., Tong, L., et al.

Precise quantitation of microRNA in a single cell with

(2013) High specific and ultrasensitive isothermal detec

droplet digital PCR based on ligation reaction, Anal.

tion of microRNA by padlock probe based exponential

Chem., 88, 1138411389, doi: 10.1021/acs.analchem.

rolling circle amplification, Anal. Chem., 85, 7941 7947,

6b01225.

doi: 10.1021/ac401715k.

50.

Zhao, G., Jiang, T., Liu, Y., Huai, G., Lan, C., et al. (2018)

65.

Chen, S., Zhao, J., Xu, C., Sakharov, I. Y., and Zhao, S.

Droplet digital PCR based circulating microRNA detec

(2021) Absolute quantification of microRNAs in a single

tion serve as a promising diagnostic method for gastric can

cell with chemiluminescence detection based on rolling

cer, BMC Cancer, 18, 1 10, doi: 10.1186/s12885 018

circle amplification on a microchip platform, Anal. Chem.,

4601 5.

93, 9218 9225, doi: 10.1021/acs.analchem.1c01463.

51.

Cirillo, P. D., Margiotti, K., Mesoraca, A., and

66.

Zhang, X., Liu, Y., Yang, Y., Huang, J., Wang, H., et al.

Giorlandino, C. (2020) Quantification of circulating

(2018) Ligation promoted hyperbranched rolling circle

microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection,

amplification enables ultrasensitive detection of

BMC Res. Notes, 13, 1 6, doi: 10.1186/s13104 020 05190 3.

microRNA in clinical specimens, Sens. Actuators B Chem.,

52.

Friedländer, M. R., Chen, W., Adamidi, C., Maaskola, J.,

277, 634 639, doi: 10.1016/j.snb.2018.09.058.

Einspanier, R., et al. (2008) Discovering microRNAs from

67.

Бодулев О. Л., Сахаров И. Ю. (2022) Планшетный хе

deep sequencing data using miRDeep, Nat. Biotechnol., 26,

милюминесцентный метод определения микроРНК

407 415, doi: 10.1038/nbt1394.

141, основанный на применении каталитической

53.

Dave, V. P., Ngo, T. A., Pernestig, A. K., Tilevik, D.,

сборки шпилек и конъюгата стрептавидина и полипе

Kant, K., et al. (2019) MicroRNA amplification and

роксидазы, Журн. Анал. Химии,

77,

366374,

detection technologies: opportunities and challenges for

doi: 10.31857/S0044450222040053.

point of care diagnostics, Lab. Invest., 99, 452469,

68.

Eslamizadeh, S., Heidari, M., Agah, S., Faghihloo, E.,

doi: 10.1038/s41374 018 0143 3.

Ghazi, H., et al. (2018) The role of microRNA signature as

54.

Castoldi, M., Collier, P., Nolan, T., and Benes, V. (2013)

diagnostic biomarkers in different clinical stages of col

Expression profiling of microRNAs by quantitative real

orectal cancer, Cell J., 20, 220, doi: 10.22074/cellj.

time PCR: the good, the bad, and the ugly, PCR

2018.5366.

Technology: Current Innovations, 307 319, Boca Raton, FL:

69.

Zhang, S., Liu, C., Zou, X., Geng, X., Zhou, X., et al.

CRC Press.

(2021) MicroRNA panel in serum reveals novel diagnostic

55.

Borst, A., Box, A. T. A., and Fluit, A. C. (2004) False pos

biomarkers for prostate cancer, PeerJ,

9, e11441,

itive results and contamination in nucleic acid amplifica

doi: 10.7717/peerj.11441.

tion assays: suggestions for a prevent and destroy strategy,

70.

Zyrina, N. V., and Antipova, V. N. (2021) Nonspecific syn

Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.,

23,

289299,

thesis in the reactions of isothermal nucleic acid amplifica

doi: 10.1007/s10096 004 1100 1.

tion, Biochemistry (Moscow), 86, 887 897, doi: 10.1134/

56.

Garc a, P. B., Robledo, N. L., and Islas, A. L. (2004)

S0006297921070099.

Analysis of non template directed nucleotide addition and

71.

Van Ness, J., Van Ness, L. K., and Galas, D. J. (2003)

template switching by DNA polymerase, Biochemistry, 43,

Isothermal reactions for the amplification of oligonu

16515 16524, doi: 10.1021/bi0491853.

cleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 4504 4509,

57.

Lomidze, L., Williford, T. H., Musier Forsyth, K., and

doi: 10.1073/pnas.0730811100.

Kankia, B. (2018) Isothermal amplification of long DNA

72.

Jia, H., Li, Z., Liu, C., and Cheng, Y. (2010) Ultrasensitive

segments by quadruplex priming amplification, Anal.

detection of microRNAs by exponential isothermal ampli

Methods, 10, 2972 2979, doi: 10.1039/C8AY00843D.

fication, Angew. Chem. Int. Ed.,

49,

54985501,

58.

Jonstrup, S. P., Koch, J., and Kjems, J.

(2006)

doi: 10.1002/anie.201001375.

A microRNA detection system based on padlock probes

73.

Wu, H., Wu, J., Liu, Y., Wang, H., and Zou, P. (2019)

and rolling circle amplification, RNA, 12, 1747 1752,

Fluorometric determination of microRNA using arched

doi: 10.1261/rna.110706.

probe mediated isothermal exponential amplification

59.

Wu, X., Zhu, S., Huang, P., and Chen, Y. (2016) Highly

combined with DNA templated silver nanoclusters,

specific quantification of microRNA by coupling

Microchim. Acta, 186, 1 8, doi: 10.1007/s00604 019 3836 4.

probe-rolling circle amplification and Förster resonance

74.

Reid, M. S., Le, X. C., and Zhang, H. (2018) Exponential

energy transfer, Anal. Biochem., 502, 16 23, doi: 10.1016/

isothermal amplification of nucleic acids and assays for

j.ab.2016.03.001.

proteins, cells, small molecules, and enzyme activities: An

60.

Li, R., Liu, Q., Jin, Y., and Li, B. (2020) Sensitive colori

EXPAR example, Angew. Chem. Int. Ed., 57, 11856 11866,

metric determination of microRNA let 7a through rolling

doi: 10.1002/anie.201712217.

circle amplification and a peroxidase mimicking system

75.

Chen, J., An, T., Ma, Y., Situ, B., Chen, D., et al. (2018)

composed of trimeric G triplex and hemin DNAzyme,

Isothermal amplification on a structure switchable sym

Microchim. Acta, 187, 1 8, doi: 10.1007/s00604 019 4093 2.

metric toehold dumbbell template: A strategy enabling

61.

Kumara, G. S. R., Pandith, A., and Seo, Y. J. (2020)

MicroRNA analysis at the single cell level with ultrahigh

Highly fluorescent morpholine naphthalimide deoxyuri

specificity and accuracy, Anal. Chem., 90, 859865,

dine nucleotide for the detection of miRNA 24 3P through

doi: 10.1021/acs.analchem.7b03713.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

494

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

76.

Li, C., Li, Z., Jia, H., and Yan, J. (2011) One step ultra

90. Miao, P., Wang, B., Yu, Z., Zhao, J., and Tang, Y. (2015)

sensitive detection of microRNAs with loop mediated

Ultrasensitive electrochemical detection of microRNA

isothermal amplification (LAMP), Chem. Commun., 47,

with star trigon structure and endonuclease mediated signal

2595 2597, doi: 10.1039/C0CC03957H.

amplification, Biosens. Bioelectron.,

63,

365370,

77.

Tran, D. H., and Phung, H. T. T. (2020) Detecting Fasciola

doi: 10.1016/j.bios.2014.07.075.

hepatica and Fasciola gigantica microRNAs with loop

91. Huang, Y., Wang, W., Wu, T., Xu, L. P., Wen, Y., et al.

mediated isothermal amplification (LAMP), J. Parasit.

(2016) A three line lateral flow biosensor for logic detec

Dis., 44, 364 373, doi: 10.1007/s12639 019 01164 w.

tion of microRNA based on Y shaped junction DNA and

78.

Du, W., Lv, M., Li, J., Yu, R., and Jiang, J. (2016) A liga

target recycling amplification, Anal. Bioanal. Chem., 408,

tion based loop mediated isothermal amplification (liga

8195 8202, doi: 10.1007/s00216 016 9925 x.

tion LAMP) strategy for highly selective microRNA detec

92. Luo, L., Wang, L., Zeng, L., Wang, Y., Weng, Y., et al.

tion, Chem. Commun., 52, 12721 12724, doi: 10.1039/

(2020) A ratiometric electrochemical DNA biosensor for

C6CC06160E.

detection of exosomal microRNA, Talanta, 207, 120298,

79.

Liu, L., Deng, D., Wu, D., Hou, W., Wang, L., et al. (2021)

doi: 10.1016/j.talanta.2019.120298.

Duplex specific nuclease based electrochemical biosensor for

93. Gong, S., Zhang, S., Lu, F., Pan, W., Li, N., and Tang, B.

the detection of microRNAs by conversion of homogeneous

(2021) CRISPR/Cas based in vitro diagnostic platforms

assay into surface tethered electrochemical analysis, Anal.

for cancer biomarker detection, Anal. Chem., 93, 11899

Chim. Acta, 1149, 338199, doi: 10.1016/j.aca.2021.338199.

11909, doi: 10.1021/acs.analchem.1c02533.

80.

Yin, B. C., Liu, Y. Q., and Ye, B. C. (2012) One step, mul

94. Kim, S., Ji, S., and Koh, H. R. (2021) CRISPR as a diag

tiplexed fluorescence detection of microRNAs based on

nostic tool, Biomolecules,

11,

1162, doi:

10.3390/

duplex specific nuclease signal amplification, J. Am. Chem.

biom11081162.

Soc., 134, 5064 5067, doi: 10.1021/ja300721s.

95. Zhang, F. (2019) Development of CRISPR Cas systems

81.

Ma, X., Xu, H., Qian, K., Kandawa Schulz, M., Miao, W.,

for genome editing and beyond, Q. Rev. Biophys., 52, e6, 1

et al. (2020) Electrochemical detection of microRNAs

31, doi: 10.1017/S0033583519000052.

based on AuNPs/CNNS nanocomposite with Duplex spe

96. Shan, Y., Zhou, X., Huang, R., and Xing, D. (2019) High

cific nuclease assisted target recycling to improve the sensi

fidelity and rapid quantification of miRNA combining

tivity, Talanta,

208,

120441, doi:

10.1016/j.talanta.

crRNA programmability and CRISPR/Cas13a trans

2019.120441.

cleavage activity, Anal. Chem.,

91,

52785285,

82.

Sang, Y., Xu, Y., Xu, L., Cheng, W., Li, X., et al. (2017)

doi: 10.1021/acs.analchem.9b00073.

Colorimetric and visual determination of microRNA via

97. Yuan, C., Tian, T., Sun, J., Hu, M., Wang, X., et al. (2020)

cycling signal amplification using T7 exonuclease,

Universal and naked eye gene detection platform based on

Microchim. Acta, 184, 2465 2471, doi: 10.1007/s00604

the clustered regularly interspaced short palindromic

017 2238 8.

repeats/Cas12a/13a system, Anal. Chem., 92, 4029 4037,

83.

Zheng, Y., Chen, J., Li, Y., Xu, Y., Chen, L., et al. (2021)

doi: 10.1021/acs.analchem.9b05597.

Dual probe fluorescent biosensor based on T7 exonucle

98. Bruch, R., Johnston, M., Kling, A., Mattmüller, T.,

ase assisted target recycling amplification for simultaneous

Baaske, J., et al. (2021) CRISPR powered electrochemical

sensitive detection of microRNA 21 and microRNA 155,

microfluidic multiplexed biosensor for target amplifica

Anal. Bioanal. Chem., 413, 16051614, doi: 10.1007/

tion free miRNA diagnostics, Biosens. Bioelectron., 177,

s00216 020 03121 6.

112887, doi: 10.1016/j.bios.2020.112887.

84.

Wang, M., Fu, Z., Li, B., Zhou, Y., Yin, H., et al. (2014)

99. Granados Riveron, J. T., and Aquino Jarquin, G. (2021)

One step, ultrasensitive, and electrochemical assay of

CRISPR/Cas13 based approaches for ultrasensitive and

microRNAs based on T7 exonuclease assisted cyclic enzy

specific detection of microRNAs, Cells,

10,

1655,

matic amplification, Anal. Chem.,

86,

56065610,

doi: 10.3390/cells10071655.

doi: 10.1021/ac5010376.

100. Sha, Y., Huang, R., Huang, M., Yue, H., Shan, Y., et al.

85.

Zhang, P., Zhuo, Y., Chang, Y., Yuan, R., and Chai, Y.

(2021) Cascade CRISPR/Cas enables amplification free

(2015) Electrochemiluminescent graphene quantum dots

microRNA sensing with fM sensitivity and single base

as a sensing platform: A dual amplification for microRNA

specificity, Chem. Commun., 57, 247 250, doi: 10.1039/

assay, Anal. Chem., 87, 10385 10391, doi: 10.1021/acs.

D0CC06412B.

analchem.5b02495.

101. Zhang, G., Zhang, L., Tong, J., Zhao, X., and Ren, J.

86.

Chen, Z., Xie, Y., Huang, W., Qin, C., Yu, A., et al. (2019)

(2020) CRISPR Cas12a enhanced rolling circle amplifica

Exonuclease assisted target recycling for ultrasensitive

tion method for ultrasensitive miRNA detection,

electrochemical detection of microRNA at vertically

Microchem. J., 158, 105239, doi: 10.1016/j.microc.2020.

aligned carbon nanotubes, Nanoscale, 11, 11262 11269,

105239.

doi: 10.1039/c9nr02543j.

102. Zhou, T., Huang, R., Huang, M., Shen, J., Shan, Y., et al.

87.

Liu, M. X., Liang, S., Tang, Y., Tian, J., Zhao, Y., et al.

(2020) CRISPR/Cas13a powered portable electrochemilu

(2018) Rapid and label free fluorescence bioassay for

minescence chip for ultrasensitive and specific MiRNA

microRNA based on exonuclease III assisted cycle ampli

detection, Adv. Sci., 7, 1903661, doi: 10.1002/advs.

fication, RSC Adv.,

1596715972, doi:

10.1039/

201903661.

c8ra01605d.

103. Giuffrida, M. C., Zanoli, L. M., D’Agata, R., Finotti, A.,

88.

Tang, Y., Liu, M., Zhao, Z., Li, Q., Liang, X., et al. (2019)

Gambari, R., et al. (2015) Isothermal circular strand dis

Fluorometric determination of microRNA 122 by using

placement polymerization of DNA and microRNA in dig

ExoIII aided recycling amplification and polythymine

ital microfluidic devices, Anal. Bioanal. Chem., 407, 1533

induced formation of copper nanoparticles, Microchim.

1543, doi: 10.1007/s00216 014 8405 4.

Acta, 186, 133, doi: 10.1007/s00604 019 3237 8.

104. Wang, B., You, Z., and Ren, D. (2019) Target assisted

89.

Yan, X. M., Wang, Y. Q., Chen, Y., Chen, Z. P., and Yu,

FRET signal amplification for ultrasensitive detection of

R. Q. (2020) Detection of microRNAs by the combination

microRNA, Analyst, 144, 23042311, doi: 10.1039/

of exonuclease III assisted target recycling amplification

C8AN02266F.

and repeated fishing strategy, Anal. Chim. Acta, 1131, 1 8,

105. Ma, W., Situ, B., Lv, W., Li, B., Yin, X., et al. (2016)

doi: 10.1016/j.aca.2020.07.025.

Electrochemical determination of microRNAs based on

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ микроРНК

495

isothermal strand displacement polymerase reaction cou

and enzyme signal amplification, Biosens. Bioelectron., 86,

pled with multienzyme functionalized magnetic micro

337 345, doi: 10.1016/j.bios.2016.06.057.

carriers, Biosens. Bioelectron., 80, 344 351, doi: 10.1016/

119. Ji, D., Mou, X., and Kwok, C. K. (2019) Label free and

j.bios.2015.12.064.

ratiometric detection of microRNA based on target

106. Cai, S., Ye, J., Al Maskri, A. A. A., Sun, L., and Zeng, S.

induced catalytic hairpin assembly and two fluorescent

(2019) A conformational switch based aptasensor for the

dyes, Anal. Methods,

11,

48084813, doi:

10.1039/

chemiluminescence

detection

microRNA,

C9AY01891C.

Luminescence, 34, 823 829, doi: 10.1002/bio.3677.

120. Li, C., Huang, Y., and Yang, Y. (2021) Coupling of an

107. Solovjev, A. M., Galkin, I. I., Pletjushkina, O. Y.,

antifouling and reusable nanoplatform with catalytic hair

Medvedko, A. V., Zhao, S., et al. (2021) Isothermal chemi

pin assembly for highly sensitive detection of nucleic acids

luminescent assay based on circular stand displacement

using zeta potential as signal readout, Sens. Actuators

polymerization reaction amplification for cel miRNA 39

B Chem., 326, 128845, doi: 10.1016/j.snb.2020.128845.

3p determination in cell extracts, Int. J. Biol.

121. Jin, F., and Xu, D. (2021) A fluorescent microarray plat

Macromolecules, 182, 987 992, doi: 10.1016/j.ijbiomac.

form based on catalytic hairpin assembly for MicroRNAs

2021.04.101.

detection, Anal. Chim. Acta, 1173, 338666, doi: 10.1016/

108. Ang, Y. S., and Yung, L. Y. L. (2016) Rational design of

j.aca.2021.338666.

hybridization chain reaction monomers for robust signal

122. Jiang, Z., Wang, H., Zhang, X., Liu, C., and Li, Z. (2014)

amplification, Chem. Commun.,

52,

42194222,

An enzyme free signal amplification strategy for sensitive

doi: 10.1039/C5CC08907G.

detection of microRNA via catalyzed hairpin assembly,

109. Zhang, H., Liu, X., Zhang, C., Xu, Y., Su, J., et al. (2020)

Anal. Methods, 6, 9477 9482, doi: 10.1039/C4AY02142H.

A DNA tetrahedral structure mediated ultrasensitive fluo

123. Zhang, Y., Zhang, X., Situ, B., Wu, Y., Luo, S., et al.

rescent microarray platform for nucleic acid test, Sens.

(2021) Rapid electrochemical biosensor for sensitive pro

Actuators B Chem., 321, 128538, doi: 10.1016/j.snb.2020.

filing of exosomal microRNA based on multifunctional

128538.

DNA tetrahedron assisted catalytic hairpin assembly,

110. Miao, P., Tang, Y., and Yin, J. (2015) MicroRNA detection

Biosens. Bioelectron., 183, 113205, doi: 10.1016/j.bios.

based on analyte triggered nanoparticle localization on a

2021.113205.

tetrahedral DNA modified electrode followed by

124. Zhang, R. Y., Luo, S. H., Lin, X. M., Hu, X. M.,

hybridization chain reaction dual amplification, Chem.

Zhang, Y., et al. (2021) A novel electrochemical biosensor

Commun., 51, 15629 15632, doi: 10.1039/C5CC05499K.

for exosomal microRNA 181 detection based on a catalyt

111.

Ge, Z., Lin, M., Wang, P., Pei, H., Yan, J., et al. (2014)

ic hairpin assembly circuit, Anal. Chim. Acta, 1157,

Hybridization chain reaction amplification of microRNA

338396, doi: 10.1016/j.aca.2021.338396.

detection with a tetrahedral DNA nanostructure based

125. Jiang, Y. S., Bhadra, S., Li, B., and Ellington, A. D. (2014)

electrochemical biosensor, Anal. Chem., 86, 2124 2130,

Mismatches improve the performance of strand displace

doi: 10.1021/ac4037262.

ment nucleic acid circuits, Angew. Chem. Int. Ed., 126,

112. Liu, H., Bei, X., Xia, Q., Fu, Y., Zhang, S., et al. (2016)

1876 1879, doi: 10.1002/ange.201307418.

Enzyme free electrochemical detection of microRNA 21

126. Bodulev, O. L., Zhao, S., and Sakharov, I. Y. (2021)

using immobilized hairpin probes and a target triggered

Improving the sensitivity of the miRNA assay coupled with

hybridization chain reaction amplification strategy,

the mismatched catalytic hairpin assembly reaction by

Microchim. Acta, 183, 297 304, doi: 10.1007/s00604 015

optimization of hairpin annealing conditions, Anal. Chem.,

1636 z.

93, 6824 6830, doi: 10.1021/acs.analchem.1c00820.

113. Guo, Q., Yu, Y., Zhang, H., Cai, C., and Shen, Q. (2020)

127. Tian, W., Li, P., He, W., Liu, C., and Li, Z. (2019) Rolling

Electrochemical sensing of exosomal microRNA based on

circle extension actuated loop mediated isothermal

hybridization chain reaction signal amplification with

amplification (RCA LAMP) for ultrasensitive detection of

reduced false positive signals, Anal. Chem., 92, 5302 5310,

microRNAs, Biosens. Bioelectron.,

128,

1722,

doi: 10.1021/acs.analchem.9b05849.

doi: 10.1016/j.bios.2018.12.041.

114. Xiong, Z., Pan, R., Hu, Q., Yun, W., Li, N., et al. (2020)

128. Zhou, C., Huang, R., Zhou, X., and Xing, D. (2020)

One step triggered branched DNA nanostrucuture for

Sensitive and specific microRNA detection by RNA

ultra sensitive electrochemical detection of microRNA,

dependent DNA ligation and rolling circle optical signal

Microchem. J., 158, 105186, doi: 10.1016/j.microc.2020.

amplification, Talanta, 216, 120954, doi: 10.1016/j.talanta.

105186.

2020.120954.

115. Hosseinzadeh, E., Ravan, H., Mohammadi, A., and

129. Zhuang, J., Lai, W., Chen, G., and Tang, D. (2014)

Pourghadamyari, H. (2020) Colorimetric detection of

A rolling circle amplification based DNA machine for

miRNA 21 by DNAzyme coupled branched DNA con

miRNA screening coupling catalytic hairpin assembly with

structs, Talanta, 216, 120913, doi: 10.1016/j.talanta.

DNAzyme formation, Chem. Commun., 50, 2935 2938,

2020.120913.

doi: 10.1039/C3CC49873E.

116. Li, Y., Huang, C. Z., and Li, Y. F. (2019) Ultrasensitive

130. Fan, T., Mao, Y., Liu, F., Zhang, W., Lin, J. S., et al. (2019)

electrochemiluminescence detection of MicroRNA via

Label free fluorescence detection of circulating

one step introduction of a target triggered branched

microRNAs based on duplex specific nuclease assisted

hybridization chain reaction circuit, Anal. Chem., 91,

target recycling coupled with rolling circle amplification,

9308 9314, doi: 10.1021/acs.analchem.9b02580.

Talanta, 200, 480486, doi: 10.1016/j.talanta.2019.01.

117. Shen, Z., He, L., Wang, W., Tan, L., and Gan, N. (2020)

038.

Highly sensitive and simultaneous detection of

131. Wang, S., Lu, S., Zhao, J., Ye, J., Huang, J., and Yang, X.

microRNAs in serum using stir bar assisted magnetic DNA

(2019) An electric potential modulated cascade of cat

nanospheres encoded probes, Biosens. Bioelectron., 148,

alyzed hairpin assembly and rolling chain amplification for

111831, doi: 10.1016/j.bios.2019.111831.

microRNA detection, Biosens. Bioelectron., 126, 565 571,

118. Shuai, H. L., Huang, K. J., Xing, L. L., and Chen, Y. X.

doi: 10.1016/j.bios.2018.09.088.

(2016) Ultrasensitive electrochemical sensing platform for

132. Huang, M., Huang, R., Yue, H., Shan, Y., and Xing, D.

microRNA based on tungsten oxide graphene composites

(2020) Ultrasensitive and high specific microRNA detec

coupling with catalyzed hairpin assembly target recycling

tion using hyper branching rolling circle amplified

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

496

БОДУЛЕВ, САХАРОВ

CRISPR/Cas13a biosensor, Sens. Actuators B Chem., 325,

136. Yuan, Y. H., Chi, B. Z., Wen, S. H., Liang, R. P., Li, Z. M.,

128799, doi: 10.1016/j.snb.2020.128799.

et al. (2018) Ratiometric electrochemical assay for sensitive

133. Liu, H., Tian, T., Zhang, Y., Ding, L., Yu, J., et al. (2017)

detecting microRNA based on dual amplification mecha

Sensitive and rapid detection of microRNAs using hairpin

nism of duplex specific nuclease and hybridization chain

probes mediated exponential isothermal amplification,

reaction, Biosens. Bioelectron., 102, 211 216, doi: 10.1016/

Biosens. Bioelectron., 89, 710 714, doi: 10.1016/j.bios.

j.bios.2017.11.030.

2016.10.099.

137. Bodulev, O. L., Burkin, K. M., Efremov, E. E., and

134. Fu, P., Xu, M., Xing, S., Zhao, Y., and Zhao, C. (2021)

Sakharov, I. Y. (2020) One pot microplate based chemi

Dual cascade isothermal amplification reaction based glu

luminescent assay coupled with catalytic hairpin assem

cometer sensors for point of care diagnostics of cancer

bly amplification for DNA detection, Anal. Bioanal.

related microRNAs, Analyst, 146, 3242 3250, doi: 10.1039/

Chem.,

412,

5105 5111, doi:

10.1007/s00216 020

D1AN00037C.

02438 6.

135. Song, W., Zhang, F., Song, P., Zhang, Z., He, P., et al.

138. Kolosova, A. Y., and Sakharov, I. Y. (2019) Triple amplifi

(2021) Untrasensitive photoelectrochemical sensor for

cation strategy for the improved efficiency of a microplate

microRNA detection with DNA walker amplification and

based assay for the chemiluminescent detection of DNA,

cation exchange reaction, Sens. Actuators B Chem., 327,

Anal. Lett., 52, 1352 1362, doi: 10.1080/00032719.2018.

128900, doi: 10.1016/j.snb.2020.128900.

1539091.

MODERN METHODS FOR DETERMINATION OF microRNAs

Review

O. L. Bodulev and I. Y. Sakharov*

Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University,

119991 Moscow, Russia; E(mail: sakharovivan@gmail.com

This review discusses modern methods for the quantitative and semi quantitative determination of miRNAs, small

non coding RNAs that affect many biological processes such as development, differentiation, metabolism and the

formation of an immunological response and are considered promising biomarkers in the diagnosis of a number of

diseases.

Keywords: bioanalysis, microRNA, nucleic acids, amplification, polymerases

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022