БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 4, с. 523 - 538

УДК 577.122:615.357

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

БЕЛКА ТРАНСПОРТЁРА Р ГЛИКОПРОТЕИНА

ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОКСИДА АЗОТА

А.В. Щулькин*, Ю.В. Абаленихина, Е.А. Судакова,

П.Ю. Мыльников, Е.Н. Якушева

Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова,

390026 Рязань, Россия; электронная почта: alekseyshulkin@rambler.ru

Поступила в редакцию 01.02.2022

После доработки 21.03.2022

Принята к публикации 22.03.2022

В исследовании на клетках линии Сaco 2 изучены механизмы регуляции белка транспортёра Р гликопро

теина (Pgp) под действием оксида азота (NO). В качестве донора NO использовали S нитрозоглутатион

(GSNO), который добавляли к клеткам в концентрациях 1, 10, 50, 100 и 500 мкМ и инкубировали в течение

3, 24 или 72 ч. Относительное количество Pgp анализировали методом вестерн блот, активность - по транс

порту его субстрата фексофенадина. В ходе исследования было показано, что кратковременное воздействие

GSNO в течение 3 ч в концентрации 500 мкМ вызывало в клетках линии Caco 2 повышение уровня перок

синитрита, что снижало активность, но не относительное количество Pgp. Увеличение длительности экспо

зиции до 24 ч повышало уровень и активность Pgp при концентрации GSNO 10 и 50 мкМ, увеличивало от

носительное количество без роста активности при концентрации 100 мкМ и снижало содержание белка

транспортёра при концентрации 500 мкМ. При длительности воздействия 72 ч GSNO в концентрации

10 мкМ повышал относительное количество и активность Pgp, а в концентрациях 100 и 500 мкМ снижал со

держание белка транспортёра. С помощью применения специфических ингибиторов было показано, что

повышение относительного количества Pgp при воздействии низких концентраций GSNO реализовалось

через NO цГМФ сигнальный путь, а при повышении концентрации GSNO, развитии нитрозативного

стресса - через Nrf2 и конститутивный андростановый рецептор.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Р гликопротеин, АВСВ1 белок, оксид азота, гуанилатциклаза, клеточная линия

Сасо 2.

DOI: 10.31857/S0320972522040054, EDN: AQKXME

ВВЕДЕНИЕ

обеспечивающий выведение субстратов из кле

ток во внеклеточное пространство и биологи

Р гликопротеин (Pgp, ABCB1, MDR1) -

ческие жидкости. Pgp экспрессируется на апи

АТФ зависимый белок транспортёр, относя

кальной поверхности энтероцитов кишечника,

щийся к суперсемейству АВС транспортёров и

билиарной поверхности гепатоцитов, поверх

ности почечного эпителия, обращенной в про

Принятые сокращения: клетки линии Caco 2 -

свет канальцев, эндотелии гистогематических

клетки аденокарциномы ободочной кишки человека; барьеров, а также в опухолевых клетках [1]. Учи

МТТ - 3 (4,5 диметилтиазол 2 ил) 2,5 дифенил 2Н

тывая указанную локализацию, принято счи

тетразолий бромид; AEM1

- ингибитор транскрип

ционного фактора Nrf2 (N (1,3 бензодиоксол 5

тать, что основными функциями данного белка

илметил) 5 (4 фторфенил) тиено[2,3 d]пиримидин 4

транспортёра являются: участие в фармакоки

амин); CAR - конститутивный андростановый рецептор;

нетике (всасывании, распределении и выведе

CINPA1 - ингибитор CAR (5 [(диэтиламино)ацетил]

нии) лекарственных веществ и развитии резис

10,11 дигидро 5Н дибензо[b,f]азепин 3 ил]этиловый

тентности опухолей к химиотерапии [2].

эфир карбаминовой кислоты); GSNO

- S нитрозо

глутатион; NO - оксид азота (II); NOх - метаболиты

Активность Pgp может изменяться под воз

оксида азота; Nrf2 - транскрипционный фактор, NF E2

действием различных факторов и веществ. При

related factor 2; ODQ - ингибитор растворимой гуанил

этом индукторы (рифампицин, карбамазепин)

атциклазы (1H [1,2,4]оксадиазоло [4,3 а]хинокса лин 1

повышают активность белка транспортёра [3], а

он); Papp - коэффициент кажущейся проницаемости

ингибиторы (кетоконазол, верапамил) её сни

(apparent permeability coefficient); Pgp - P глико протеин;

PXR - прегнан Х рецептор; SNAP - S нитрозо N ацетил

жают [4].

пеницилламин.

Pgp обладает низкой субстратной специфич

* Адресат для корреспонденции.

ностью, то есть его субстратами является широ

523

524

ЩУЛЬКИН и др.

кий спектр лекарственных веществ: противо

личество белка транспортёра. В данном иссле

опухолевые препараты, новые пероральные ан

довании также было высказано предположение,

тикоагулянты, сердечные гликозиды, блокато

что повышение активности Pgp (количество при

ры кальциевых каналов и т.д. [5]. Изменение ак

этом не оценивалось) связано с влиянием NO на

тивности Pgp может повлиять на эффективность

протеинкиназу С (PKC), фосфоинозитид 3 ки

и безопасность терапии данными веществами.

назу/протеинкиназу В (PI3K/Akt), митоген ак

NO (оксид азота II) - сигнальная молекула,

тивируемую протеинкиназу p38 (p38 MAPK)

обладающая разнообразными физиологически

[11].

ми эффектами. В многочисленных исследова

Таким образом, на данный момент получен

ниях было показано, что NO играет важную

ные результаты о влиянии NO на количество и

роль в межклеточных коммуникациях, регуля

активность Pgp носят противоречивый характер

ции сосудистого тонуса, синаптической плас

и механизм данного влияния не установлен, что

тичности, в развитии воспаления и поврежде

и послужило целью настоящего исследования.

нии клеток [6].

Данные научной литературы показывают,

что NO также может влиять и на активность Pgp.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На изолированных мембранах клеток, содержа

щих Pgp, донор NO пропиламин пропиламина

Культивирование клеток. Исследование вы

ноноат (propylamine propylamine nonoate,

полнено на линии клеток аденокарциномы обо

PPNO) в концентрациях 0,02-200 мкМ при дли

дочной кишки человека Caco 2 (ЦКП «Коллек

тельности воздействия 30 мин снижал АТФаз

ция культур клеток позвоночных», Санкт Пе

ную активность Pgp. На клетках рака яичника

тербург, Россия). Клетки культивировали при

NCI/ADR RES, обладающих множественной

37 °С, в атмосфере 5% CO₂ в инкубаторе WS

лекарственной устойчивостью, PPNO в концен

189C («World Science», Корея), в модифициро

трациях 50, 100 и 200 мкМ и экспозиции 1 ч вы

ванной по способу Дульбекко среде Игла

зывал увеличение накопления в клетках

(DMEM) с высоким содержанием глюкозы

субстрата Pgp адриамицина (Adriamycin), что

(4500 мг/л), с добавлением L глутамина (4 мМ),

свидетельствует об ингибировании белка транс

15% эмбриональной бычьей сыворотки,

портёра [7]. Аналогичные результаты были по

100 Ед./мл и 100 мкг/мл пенициллина и стреп

лучены и с другим донором NO - [О2 (2,4 ди

томицина (все составляющие производства

нитрофенил) 1 [(4 этоксикарбонил) пипера

«Sigma Aldrich», Германия) соответственно.

зин 1ил] диазен 1 иум 1-2 диолат] (JS K) [8].

Клетки культивировали в течение 21 сут., по

На клетках аденокарциномы ободочной

скольку при данном сроке происходит их спон

кишки человека Caco 2 было показано, что до

танная дифференцировка в энтероцитоподоб

нор NO S нитрозо N ацетилпеницилламин

ные клетки, гиперэкспрессирующие Pgp [12].

(SNAP) в концентрациях 0,1-5 мМ с длитель

В качестве донора NO использовали S нит

ностью воздействия 6 ч снижал накопление

розоглутатион (GSNO, «Sigma Aldrich»), кото

циклоспорина А (субстрата Pgp) не менее чем

рый добавляли к клеткам до получения конеч

на 30% (р = 0,05), что свидетельствует о повыше

ной концентрации 1, 10, 50, 100 и 500 мкМ и ин

нии активности белка транспортёра. При кон

кубировали в течение 3, 24 или 72 ч (n = 3 для

центрации SNAP 1 мМ также отмечалось и по

каждой концентрации и временной точки).

вышение количества Pgp, оценённое методом

К контрольным клеткам в эквивалентном объё

вестерн блот [9].

ме прибавляли воду для инъекций (раствори

На клеточной линии GPNT, представляю

тель GSNO).

щей собой иммортализованную линию эндоте

При оценке механизма индукции Pgp под

лиальных клеток головного мозга крысы, было

действием GSNO в питательную среду за 30 мин

выявлено, что донор NO SNAP в концентрации

до добавления донора NO вносили: ингибитор

мМ повышал уровни мРНК генов mdr1a

растворимой гуанилатциклазы - 1H [1,2,4]ок

и mdr1b, кодирующих Pgp у грызунов, а также

садиазоло [4,3 а]хиноксалин 1 он

(ODQ,

количество самого белка через 24 ч воздей

«Sigma Aldrich») в концентрации 10 мкМ [13],

ствия [10].

ингибитор ядерного фактора эритроидного про

В исследовании на клетках линии Caco 2

исхождения 2 (Nrf2) - N (1,3 бензодиоксол 5

было выявлено, что нитропруссид натрия - до

илметил) 5 (4 фторфенил) тиено[2,3 d]пири

нор NO, в концентрациях 0,1 или 2 ммоль/литр

мидин 4 амин (AEM1, «Sigma Aldrich», Герма

при краткосрочном воздействии (4 ч) снижал

ния) в концентрации 5 мкМ [14], ингибитор

активность и количество Pgp, а 24 часовая экс

прегнан Х рецептора (PXR) - кетоконазол,

позиция, напротив, повышала активность и ко

10 мкМ («Sigma Aldrich») [15], ингибитор конс

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

525

титутивного андростанового рецептора (CAR) -

ченный лизат центрифугировали при

5 [(диэтиламино)ацетил] 10,11 дигидро 5Н

5000 g (CM 50, «Eppendorf», Германия). Супер

дибензо[b,f]азепин 3 ил]этиловый эфир карба

натант использовали для выполнения биохими

миновой кислоты (CINPA 1, «TOCRIS», Вели

ческих анализов.

кобритания) в концентрации

мкМ [16].

Количество белка в пробах анализировали

GSNO использовался в концентрациях, кото

методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus

рые вызывали повышение относительного ко

(Bradford)

Assay Kit,

«Thermo Fisher

личества Pgp.

Scientific») [19].

Для исследования цитотоксичности GSNO

Определение относительного количества Pgp в

клетки высевали в

96 луночный планшет

клетках линии Сасо 2 проводили методом вес

(«Сorning», США); для изучения влияния GSNO

терн блот. 20 мкг белков супернатанта подверга

на относительное количество Pgp, концентра

ли электрофорезу с использованием 7,5% ного

цию метаболитов оксида азота (суммарная кон

TGX Stain Free FastCast Acrylamide Kit («Bio Rad»,

центрация нитратов и нитритов, NOх), перок

США) в буферной системе Laemmli («BioRad»).

синитрита и битирозина клетки культивировали

Образцы смешивали с буфером Laemmli («Bio

в 6 луночных планшетах («Сorning»), а для

Rad»), содержащим 50 мМ β меркаптоэтанола

оценки действия донора NO на активность

(«Bio Rad») в соотношении 1 : 3, инкубировали

Pgp - в специальной трансвелл системе (12 mm

10 мин при температуре 70 °C. Гели прогоняли

Transwell® with

0,4

μm Pore Polycarbonate

при 100 В в течение 90 мин.

Membrane Insert, Sterile, «Сorning») [17].

Белки переносили на нитроцеллюлозную

Цитотоксический тест (МТТ тест). Клетки

мембрану «Trans Blot Turbo Mini Size nitrocellu

засевали в 96 луночный планшет из расчета

lose» («Bio Rad») с использованием Mini Trans

10⁴ клеток на каждую лунку и культивировали в

Blot («Bio Rad») в течение 10 мин при 25 В и 1,3 А.

течение 21 сут., затем добавляли питательную

Белки на мембране блокировали 1% ным

среду с GSNO. После окончания инкубации в

раствором Casein Blocker («Bio Rad»), содержа

каждую лунку добавляли по 20 мкл 0,5% ного

щим 0,1% (v/v) Tween 20 («Sigma Aldrich»), при

раствора 3 (4,5 диметилтиазол 2 ил) 2,5 дифе

инкубации в течение 1 ч и комнатной темпера

нил 2Н тетразолий бромида (МТТ) и инкуби

туре.

ровали в течение 2 ч, затем раствор МТТ удаля

Детекцию белка Pgp проводили с использо

ли и добавляли 200 мкл 1% ного раствора диме

ванием первичных мышиных моноклональных

тилсульфоксида («ПанЭко», Россия) [18]. По

антител (P Glycoprotein Antibody MA5 13854,

глощение измеряли через 10 мин при 530 нм на

«Invitrogen», США) в разведении 1 : 200 в блоки

спектрофотометре для планшетов Stat Fax 2100

рующем растворе Casein blocker («Bio Rad») в

(«Awareness Technology», США).

течение 2 ч при 37 °C. Визуализацию первичных

Жизнеспособность клеток Сасо 2 в присут

антител осуществляли с использованием вто

ствии GSNO рассчитывали по формуле:

ричных кроличьих антител (Rabbit anti Mouse

IgG (H

+ L) Secondary Antibody, HRP,

«Invitrogen») в разведении 1 : 4000 и инкубацией

, (1)

в течение 1 ч при комнатной температуре. Хеми

люминесценцию фиксировали с помощью

где ОП - оптическая плотность.

ChemiDocXRS+ («Bio Rad»). Интенсивность

Получение тотальных клеточных лизатов.

полученных полос (бэндов) анализировали ден

После окончания экспозиции с GSNO клетки

ситометрически с помощью программного

снимали с лунок 6 луночных планшетов раство

обеспечения ImageLab («Bio Rad»).

ром трипсин ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА,

Молекулярная масса Pgp была подтверждена

«Sigma Aldrich»), трижды промывали раствором

путём сравнения с маркёрами молекулярной

фосфатного буфера («BioRad», США) и лизиро

массы (Precision plus protein standards Dual Color,

вали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo («Thermo

«Bio Rad»).

Fisher Scientific», США) c добавлением смеси

Содержание Pgp оценивали относительно

ингибиторов протеиназ: 2 мМ (4 (2 аминоэтил

уровня белка домашнего хозяйства GAPDH

бензенсульфонил флуорида гидрохлорида

(первичные антитела GAPDH Loading Control

(AEBSF), 0,3 мкМ апротинина, 130 мкМ беста

Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight

тина, 1 мМ ЭДТА, 14 мкМ транс эпоксисукци

(«Invitrogen»), разведение 1 : 1000, вторичные

нил L лейциламидо(4гуанидино)бутана (Е 64),

антитела - вторичные кроличьи антитела к пер

1 мкМ лейпептина, («Sigma Aldrich») в течение

вичным антителам GAPDH - Rabbit anti Mouse

30 мин при +4 °С и постоянном перемешивании

IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP

из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полу

(«Invitrogen»), разведение 1 : 4000).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

526

ЩУЛЬКИН и др.

Определение концентрации битирозина. Об

разование битирозина регистрировали по ин

(2)

тенсивности флуоресценции в фосфатном бу

фере (рН 7,4) при длине волны возбуждения

(λ_Ext)

325

нм и длине волны испускания

где Рарр - коэффициент кажущейся проницае

(λ_Em) 415 нм на спектрофлуориметре Shimadzu

мости (apparent permeability coefficient, см/с),

RF 6000 («Shimadzu Corporation», Япония)

dQ/dt - изменение количества субстрата в каме

[20].

ре реципиенте за время инкубации (мкМ × мл/с),

Определение концентрации пероксинитрита.

A - площадь полупроницаемой мембраны лунки

Уровень пероксинитрита анализировали по ин

в трансвелл системе (см²), C₀ - начальная кон

тенсивности светопоглощения при 302 нм (СФ

центрация субстрата в камере доноре (мкМ).

2000, «ОКБ Спектр», Россия). Концентрацию

Концентрации фексофенадина в транспорт

рассчитывали с использованием молярного ко

ной среде определяли методом высокоэффек

эффициента 1670 М^-1 × см^-1 [21].

тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с

Определение уровня метаболитов оксида азота

УФ детектированием при длине волны 220 нм.

(суммарная концентрация нитратов и нитри

Исследование выполняли на хроматографе

тов NOх) проводили спектрофотометрическим

«Стайер» («Аквилон», Россия) по оригинальной

методом по окраске в реакции диазотирования

методике [26]. Полученную пробу транспорт

нитритом сульфаниламида, входящего в состав

ной среды (50 мкл), содержащую фексофена

реактива Грисса («Нева Реактив», Россия). Ин

дин, разводили в 150 мкл подвижной фазы, и

тенсивность окраски определяли в видимой об

100 мкл полученного раствора вводили в хрома

ласти спектра на микропланшетном анализато

тограф.

ре Stat Fax 2100 («Awareness Technology», США)

При анализе использовали хроматографи

при длине волны 540 нм [22].

ческую колонку Phenomenex Synergi 4u Polar

Концентрацию битирозина, пероксинитри

RP 80A (250 × 4,6) («Phenomenex», США) с зер

та и NOх выражали в нмоль на мг белка.

нением 4 мкм. Температура разделения - 45 °С.

Оценка активности Pgp. Активность Pgp оце

Скорость потока - 1 мл/мин. Состав подвиж

нивали по транспорту субстрата белка транс

ной фазы: 128 мл ацетонитрила, 267,4 мл деио

портёра Н1 гистаминолитика - фексофенадина

низированной воды, 6,33 мл ледяной уксусной

(«Sigma Aldrich») через монослой клеток ли

кислоты, с добавлением триэтиламина до pH 6,7

нии Caco 2 в специальных трансвелл систе

(все составляющие производства

«PanReac

мах [23].

AppliChem», Испания). Время удерживания

Трансвелл система представлена двумя ка

фексофенадина в данных условиях составляло

мерами: апикальной и базолатеральной. Дно

12,8 мин. Количественное определение прово

апикальной камеры является полупроницаемой

дили методом абсолютной калибровки по пло

мембраной, на которую высевали клетки линии

щади пиков. Аналитический диапазон методики

Caco 2 с плотностью 10⁵/см² и культивировали в

составлял 1,2-57,4 мкМ.

течение 21 сут.

Статистический анализ. Полученные резуль

Целостность клеточного монослоя оценива

таты анализировали с помощью программ

ли по величине трансэпителиального сопротив

«StatSoft Statistica 13.0» и Microsoft Excel. Резуль

ления, которое определяли с помощью вольт

таты представлены в виде среднего значе

метра Millicell ERS 2 («Millipore», США). При

ния ± стандартное отклонение (M ± SD). Для

его значении выше 500 мОм × см² к клеткам до

оценки статистической значимости различий

бавляли тестируемые концентрации GSNO в

использовали дисперсионный анализ (ANOVA),

питательной среде. После окончания инкуба

попарные сравнения выполняли с помощью

ции питательную среду заменяли на транспорт

критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически

ную среду, представляющую собой раствор

значимыми считали различия при p < 0,05.

Хэнкса

(«Sigma Aldrich») с

мМ Hepes

(«Sigma Aldrich») и 1% диметилсульфоксида.

Затем добавляли субстрат Pgp - фексофенадин,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

в базолатеральную камеру в концентрации

150 мкМ [24]. Через 1, 2 и 3 ч забирали образцы

Развитие нитрозативного стресса под действи

из апикальной камеры реципиента для опреде

ем GSNO в клетках линии Caco 2. Уровень мета

ления концентрации субстрата (b-a транспорт,

болитов оксида азота возрастал при всех концен

обусловленный работой транспортёра).

трациях GSNO (1-500 мкМ) и всех сроках экс

Транспорт фексофенадина рассчитывали по

перимента, максимально - при концентрации

формуле, предложенной Elsby et al. [25]:

500 мкМ: на 51,8% (р = 0,0002) при инкубации

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

527

Рис. 1. Изменение концентрации метаболитов оксида азота (NOх, М ± SD, n = 3) при воздействии S нитрозоглутатиона

в течение 3 (1), 24 (2) и 72 (3) ч. Определение метаболитов оксида азота проводили в лизате клеток линии Сасо 2 фото

метрическим методом. * р < 0,05 (достоверное отличие от контроля)

3 ч; на 58,9% (р = 0,0002) при инкубации 24 ч и

при концентрации 500 мкМ - на 34,0% (р = 0,01)

на 68,5% (р = 0,0002) при инкубации 72 ч

и 53,6% (р = 0,001) соответственно.

(рис. 1).

При увеличении длительности экспозиции

Выраженность нитрозативного стресса оце

до 72 ч содержание пероксинитрита возрастало

нивали по уровню битирозина и пероксинитри

при концентрациях GSNO 1-500 мкМ, макси

та (рис. 2). Концентрация битирозина не изме

мально - на 84,4% (р = 0,0002) при концентра

нялась при воздействии GSNO в концентрациях

ции 500 мкМ (рис. 2, б).

1-500 мкМ в течение 3 ч, а также при концен

Цитотоксическое действие GSNO оценива

трации 1 мкМ и длительности экспозиции 24 и

лось по результатам МТТ теста. В контрольной

72 ч по сравнению с контролем.

группе жизнеспособность клеток состави

Содержание битирозина статистически зна

ла 100%. GSNO в концентрациях 1-500 мкМ и

чимо возрастало при действии GSNO в концен

длительности инкубации 3 ч достоверно не вли

трациях 10-500 мкМ и сроках инкубации 24

ял на жизнеспособность клеток. Данный пока

и 72 ч. При концентрации 10 мкМ увеличение

затель составил в среднем 102,4 ± 5,6%. При

отмечалось на

18,3% (р

= 0,006) и

30,3%

воздействии GSNO в концентрациях 1-50 мкМ

(р = 0,001); при 50 мкМ - на 22,1% (р = 0,003)

и длительности экспозиции 24 ч жизнеспособ

и 27,3% (р = 0,007), при 100 мкМ - на 29,4%

ность клеток также не изменялась, а при концен

(р = 0,001) и 32,6% (р = 0,005) по сравнению с

трациях

100 и

500

мкМ - снижалась до

контролем соответственно. При этом макси

79,9 ± 6,7% (р = 0,02) и 78,8 ± 7,2% (р = 0,03) со

мальное возрастание уровня битирозина отме

ответственно. Увеличение длительности экспо

чалось при концентрации 500 мкМ - на 34,9%

зиции до 72 ч приводило к снижению жизне

(р = 0,0002) при инкубации 24 ч и на 38,3%

способности клеток до 68,4 ± 11,4% (р =

(р = 0,0003) при инкубации 72 ч (рис. 2, а).

0,0004), 69,5 ± 6,1% (р = 0,0004) и 50,9 ± 7,5%

При длительности эксперимента 3 и 24 ч и

(р = 0,0003) при концентрации GSNO 50, 100

концентрации GSNO 100 мкМ содержание пе

и 500 мкМ соответственно и не влияло на дан

роксинитрита увеличивалось на 68,1% (р = 0,001)

ный показатель при концентрациях GSNO

и 92,6% (р = 0,0002) по сравнению с контролем, а

1-10 мкМ (рис. 3).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

529

Влияние GSNO на относительное количест

При длительности эксперимента

во Pgp в клетках линии Caco 2. При воздействии

GSNO в концентрациях 10 и 50 мкМ повышал

GSNO во всех изученных концентрациях на

коэффициент кажущейся проницаемости Papp

клетки линии Сaco 2 в течение 3 ч относитель

b-a фексофенадина на 429,4% (p = 0,0009)

ное количество Pgp достоверно по сравнению с

и 266,9% (p = 0,02) соответственно по сравне

контролем не изменялось (рис. 4, а).

нию с показателями контроля (таблица). Дан

При увеличении длительности эксперимен

ные результаты свидетельствуют о повышении

та до 24 ч относительное количество Pgp увели

активности Pgp. Увеличение концентра

чивалось при концентрациях GSNO 10, 50

ции GSNO до 100 и 500 мкМ приводило к нор

и 100 мкМ на 46,2% (p = 0,01), 38,1% (p = 0,02)

мализации коэффициента кажущейся проница

и 25,8% (p = 0,045) соответственно по сравне

емости Papp b-a фексофенадина (он достоверно

нию с контролем. При повышении концентра

не отличался от значений контроля) (таблица).

ции GSNO до 500 мкМ отмечалось снижение

Инкубация клеток линии Caco 2 с GSNO в

уровня Pgp на 54,9% (p = 0,002) (рис. 4, б).

течение 72 ч приводила к повышению коэффи

При длительности воздействия 72 ч GSNO в

циента кажущейся проницаемости Papp b-a

концентрации 10 мкМ повышал относительное

фексофенадина при концентрации донора ок

количество Pgp на 23,1% (р = 0,0002), в концен

сида азота 10 мкМ на 138,9% (p = 0,014) по срав

трациях 1 и 50 мкМ - не влиял на его уровень, а

нению со значением контроля, а в остальных

в концентрациях 100 и 500 мкМ - вызывал его

концентрациях достоверного эффекта не оказы

снижение на

37,0% (р

= 0,0002) и

47,1%

вала.

(р = 0,0002) соответственно (рис. 4, в).

Изучение механизмов повышения относитель

Влияние GSNO на активность Pgp в клетках

ного количества Pgp под действием GSNO. Для

линии Caco 2. Активность Pgp оценивали по

изучения механизмов повышения содержания

транспорту его маркёрного субстрата через мо

Pgp под действием GSNO выполнены экспери

нослой клеток Caco 2.

менты с ингибитором растворимой гуанилат

GSNO при воздействии в течение 3 ч в кон

циклазы - ODQ, ингибитором транскрипцион

центрациях 1-100 мкМ достоверно не влиял на

ного фактора Nrf2 - AEM1, с ингибиторами

активность Pgp, а в концентрации 500 мкМ -

транскрипционных факторов PXR - кетокона

вызывал её уменьшение, о чем свидетельствует

золом и CAR

- CINPA1, стимулирующих

снижение коэффициента кажущейся проницае

экспрессию гена MDR1, кодирующего Pgp.

мости Papp b-a фексофенадина на

30,4%

Ингибитор растворимой гуанилатцикла

(р = 0,05) по сравнению с контролем.

зы ODQ при совместном инкубировании с

Рис. 3. Жизнеспособность клеток линии Сасо 2 (%) в зависимости от концентрации S нитрозоглутатиона при инкубации

3 (1), 24 (2) и 72 (3) ч. Определение жизнеспособности клеток проводили по МТТ тесту (n = 3). * р < 0,05 (достоверное от

личие от контроля)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

530

ЩУЛЬКИН и др.

Рис. 4. Относительное количество P гликопротеина в клетках линии Сасо 2 при воздействии S нитрозоглутатиона в те

чение 3 (а), 24 (б) и 72 (в) ч (M ± SD, n = 3). Относительное количество Pgp определяли методом вестерн блот с последу

ющим денситометрическим анализом с помощью программного обеспечения ImageLab. 1 - контроль, 2-6 - S нитрозо

глутатион в концентрациях 1, 10, 50, 100 и 500 мкМ; * р < 0,05 (достоверное отличие от контроля)

GSNO в течение 24 ч предотвращал повышение

В то же время AEM1 предотвращал повыше

относительного количества Pgp при концентра

ние относительного количества Pgp при воздей

ции донора NO 10-50 мкМ и не оказывал влия

ствии GSNO в концентрациях 50 и 100 мкМ и

ния при концентрации GSNO

100

мкМ

длительности инкубации 24 ч (рис. 6, а).

(рис. 5, а), относительное количество Pgp пре

Кетоконазол - ингибитор PXR, не предот

вышало показатели контроля на

24,9%,

вращал повышения относительного количества

(р = 0,03).

Pgp под действием GSNO во всех концентраци

При длительности эксперимента 72 ч ODQ

ях и длительности инкубации 24 ч (рис. 7, а) и

также предотвращал повышение уровня Pgp при

72 ч (рис. 7, б). Так, относительное количество

концентрации GSNO 10 мкМ, данный показа

Pgp при воздействии GSNO в концентрации 10,

тель не отличался от значений контро

50 и 100 мкМ при инкубации 24 ч возрастало

ля (рис. 5, б).

на 17,5% (р = 0,02), 22,9% (р = 0,009) и 25,6%

Ингибитор Nrf2 - AEM1, не оказывал влия

(р = 0,008) соответственно относительно значе

ния на уровень Pgp при воздействии GSNO в

ний контроля и на 22,9% - при инкубации 72 ч

концентрации

мкМ и экспозиции

и концентрации GSNO 10 мкМ (р = 0,03).

24 ч (рис. 6, а) и 72 ч (рис. 6, б), относительное

CINPA1 - ингибитор CAR, не влиял на из

количество Pgp превышало показатели контро

менение относительного количества Pgp при

ля на 41,5% (р = 0,001) и 19,5% (р = 0,0004) соот

воздействии GSNO в концентрациях

ветственно.

50-100 мкМ в течение 24 ч, которое превышало

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

531

Влияние GSNO на активность Pgp (Papp b-a, ×10^-6 см/с

значения контроля на

23,6% (р

0,03)

фексофенадина) в клетках линии Caco 2 (M ± SD, n = 3)

и на 25,4% (р = 0,03) соответственно (рис. 8, а).

При концентрации GSNO 10 мкМ и экспози

Серии

Papp b-a, ×10^-6

см/с фексофенадина

ции 24 и 72 ч CINPA1 предотвращал повышение

эксперимента

3 ч

24 ч

72 ч

уровня Pgp (рис. 8, а и б).

Контроль

1,25 ± 0,12

1,09 ± 0,08

1,18 ± 0,66

1 мкМ GSNO

0,98 ± 0,27

1,77 ± 0,38

1,07 ± 0,13

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

10 мкМ GSNO

1,19 ± 2,24

5,77 ± 0,69*

2,82 ± 0,91*

50 мкМ GSNO

1,27 ± 0,23

4,00 ± 0,21*

2,24 ± 0,48

В ходе настоящего исследования оценива

лось влияние NO на функционирование белка

100 мкМ GSNO

0,98 ± 0,15

2,43 ± 1,64

1,50 ± 0,20

транспортёра Pgp. В качестве источника NO ис

500 мкМ GSNO

0,87 ± 0,22*

2,55 ± 1,53

1,30 ± 0,19

пользовали GSNO, который представляет собой

Примечание: * p ≤ 0,05 по сравнению с контролем (крите

S нитрозированное производное глутатиона и

рий Ньюмена-Кейлса).

считается важным медиатором последующих

Рис. 5. Относительное количество P гликопротеина в клетках линии Сасо 2 при воздействии S нитрозоглутатиона в со

четании с ингибированием растворимой гуанилатциклазы (ODQ, 10 мкМ) в течение 24 (а) и 72 (б) ч. Относительное ко

личество Pgp определяли методом вестерн блот с последующим денситометрическим анализом с использованием прог

раммного обеспечения ImageLab. 1 - контроль (без добавления тестируемых веществ), 2, 3 и 4 - S нитрозоглутатион в

концентрациях 10, 50 и 100 мкМ соответственно в сочетании с ODQ в концентрации 10 мкМ; * р < 0,05 (достоверное от

личие от контроля)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

532

ЩУЛЬКИН и др.

Рис. 6. Относительное количество P гликопротеина в клетках линии Сасо 2 при воздействии нитрозоглутатиона в соче

тании с ингибированием транскрипционного фактора Nrf2 (AEM1, 5 мкМ) в течение 24 (а) и 72 (б) ч. Относительное ко

раммного обеспечения ImageLab. 1 - контроль (без добавления тестируемых веществ), 2, 3 и 4 - S нитрозоглутатион в

концентрациях 10, 50 и 100 мкМ соответственно в сочетании с AEM1 в концентрации 5 мкМ; * р < 0,05 (достоверное от

личие от контроля)

сигнальных эффектов оксида азота [27]. Сам

теин. Образующийся в ходе данной реакции

GSNO напрямую в клетки не проникает, однако

S нитрозо 1 цистеин проникает внутрь клеток

его добавление в культуральную среду вызывает

через систему транспортёра аминокислот [29].

повышение внутриклеточных уровней S нитро

S нитрозо 1 цистеин внутри клеток может либо

зотиолов. Предполагается, что GSNO разлагает

нитрозилировать глутатион с образованием

ся во внеклеточном пространстве с высвобожде

GSNO, либо непосредственно взаимодейство

нием NO, который затем может диффундиро

вать с сульфгидрильными группами белков и за

вать через клеточную мембрану и нитрозилиро

пускать сигнальные каскады.

вать белки мишени [28].

Нами было показано, что добавление GSNO

Кроме того, описан NO независимый меха

к клеткам линии Caco 2 вызывает повышение

низм проникновения GSNO внутрь клеток. При

содержания метаболитов оксида азота в лизате

этом нитрозогруппа от GSNO переносится на

клеток, что свидетельствует об адекватности ис

другую тиолсодержащую аминокислоту - цис

пользуемой модели.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

533

Концентрации GSNO 1-10 мкМ оказались

активных форм азота (АФА) нитрозилирование

безопасными для клеток, в то время как 100

тирозина представляет собой наиболее специ

и 500 мкМ при длительности экспозиции 24 ч и

фичную окислительную модификацию. Нитро

50, 100, 500 мкМ при экспозиции 72 ч снижали

тирозин частично диссоциирует до фенолята, но

выживаемость клеток, определяемую в ходе

основное его количество конденсируется до 3,3

МТТ теста.

дитирозина (битирозина) [31]. Доказано, что

Токсическое действие GSNO может быть

образование битирозина превалирует над нит

связано с образованием пероксинитрита в ре

ротирозином при длительном воздействии

зультате реакции между оксидом азота и супер

и/или более высоком уровне АФА, что позволя

оксидным анион радикалом (О₂ ), что было по

ет рассматривать его в качестве маркёра нитро

казано в данном исследовании. Пероксинитрит,

зативного стресса [32].

взаимодействуя с биомакромолекулами, может

Относительное количество и активность Pgp

вызывать их повреждение и развитие нитроза

под действием донора NO изменялись следую

тивного стресса [30], что подтверждалось увели

щим образом. При воздействии GSNO на клет

чением уровня битирозина. В условиях действия

ки линии Caco 2 в течение 3 ч относительное

Рис. 7. Относительное количество P гликопротеина в клетках линии Сасо 2 при воздействии S нитрозоглутатиона в со

четании с ингибированием прегнан Х рецептора (кетоконазол, 10 мкМ) в течение 24 (а) и 72 (б) ч. Относительное коли

чество Pgp определяли методом вестерн блот с последующим денситометрическим анализом с использованием програм

много обеспечения ImageLab. 1 - контроль (без добавления тестируемых веществ), 2, 3 и 4 - S нитрозоглутатион в кон

центрациях 10, 50 и 100 мкМ соответственно в сочетании с кетоконазолом в концентрации 10 мкМ; * р < 0,05 (достовер

ное отличие от контроля)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

534

ЩУЛЬКИН и др.

Рис. 8. Относительное количество P гликопротеина в клетках линии Сасо 2 при воздействии S нитрозоглутатиона в со

четании с ингибированием конститутивного андростанового рецептора (CINPA1, 10 мкМ) в течение 24 (а) и 72 (б) ч. От

носительное количество Pgp определяли методом вестерн блот с последующим денситометрическим анализом с исполь

зованием программного обеспечения ImageLab. 1 - контроль (без добавления тестируемых веществ), 2, 3 и 4 - S нитро

зоглутатион в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ соответственно в сочетании с CINPA1 в концентрации 10 мкМ; * р < 0,05

(достоверное отличие от контроля)

количество Pgp достоверно не изменялось, од

GSNO до 500 мкМ отмечалось снижение содер

нако в то же время отмечалось снижение его ак

жания Pgp.

тивности. Полученные результаты согласуются

При длительности воздействия 72 ч GSNO в

с данными литературы, в которых установлено,

концентрации 10 мкМ повышал относительное

что NO может снижать АТФазную активность

количество и активность Pgp, а в концентрациях

Pgp [7], что, в свою очередь, приводит к сниже

100 и 500 мкМ он вызывал снижение уровня

нию транспортной функции данного белка.

белка транспортёра. Уменьшение относитель

При повышении длительности эксперимен

ного количества Pgp наблюдалось при макси

та до 24 ч относительное количество и актив

мальных концентрациях GSNO и совпадало с

ность Pgp увеличивались при концентрациях

максимальной степенью выраженности нитро

GSNO 10 и 50 мкМ, при концентрации 100 мкМ

зативного стресса, поэтому можно предполо

рос уровень белка транспортёра, но активность

жить, что снижение уровня белка транспортёра

не изменялась, а при повышении концентрации

связано с повреждением его молекулы. Сниже

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

535

ние относительного количества Pgp, в свою оче

и концентрация 10 мкМ при экспозиции 72 ч)

редь, приводило к уменьшению его активности.

предотвращал повышение относительного ко

Помимо этого, активность Pgp может снижаться

личества Pgp.

в результате нитрозилирования его молекулы по

Nrf2 - редокс чувствительный транскрип

тиоловым группам в остатках цистеина. Указан

ционный фактор. Его экспрессия повышается

ные реакции обычно протекают при повыше

при развитии окислительного и нитрозативно

нии концентрации NO выше физиологичес

го стресса и направлена на защиту клетки от

ких [33]. По данным литературы, молекула Pgp

воздействия свободных радикалов [38]. В усло

богата SH группами [34].

виях нормы данный транскрипционный фак

На заключительном этапе исследования бы

тор находится в комплексе с белком репрессо

ли изучены механизмы повышения относитель

ром Keap 1 (их связывание регулируется рядом

ного количества и активности Pgp под действи

протеинкиназ), который, с одной стороны,

ем NO.

способствует убиквитированию и протеосо

На настоящий момент описаны следующие

мальной деградации Nrf2 (необходимым усло

механизмы регуляции функционирования Pgp:

вием для этого процесса является наличие двух

изменение экспрессии гена MDR1, кодирующе

остатков цистеина в молекуле Keap 1), а с дру

го белок транспортёр, посредством влияния на

гой - предотвращает его проникновение из ци

его промотор; полиморфизм гена MDR1; увели

топлазмы в ядро. После активации комплекс

чение дозы гена - амплификация участка гено

Keap 1-Nrf2 диссоциирует, и Nrf2 транслоциру

ма, содержащего ген MDR1; стабилизация

ется в ядро, где связывается с антиоксидантны

мРНК гена MDR1; влияние микроРНК на

ми элементами (antioxidant response elements,

экспрессию Pgp; передача Pgp между клетками;

ARE) и активирует транскрипцию защитных

изменение активности синтезированного бел

ферментов [39].

ка транспортёра; влияние на гидролиз АТФ; из

Ранее нами было показано, что Nrf2 прини

менение свойств цитоплазматических мембран.

мает участие в повышении активности и коли

При этом основную роль играет регуляция

чества Pgp при развитии окислительного стрес

экспрессии гена MDR1 [35].

са [40].

В ходе настоящего исследования с помощью

Для ингибирования Nrf2 применялся AEM1,

специфических ингибиторов был изучен вклад

блокирующий взаимодействие Nfr2 с ARE и по

NO цГМФ сигнального пути, транскрипцион

давляющий экспрессию генов, контролируемых

ных факторов Nrf2, PXR и CAR в повышение

данным транскрипционным фактором [14].

относительного количества Pgp под действи

Нами показано, что AEM1 предотвращал по

ем GSNO.

вышение относительного количества Pgp при

Ингибиторы использовались в дозах, в кото

воздействии GSNO в концентрации

рых они, согласно данным литературы, прояв

и 100 мкМ и длительности инкубации 24 ч.

ляли свою активность в аналогичных экспери

PXR (ядерный рецептор подсемейство 1,

ментах [13-16].

группа I, член 2) и CAR (ядерный рецептор под

NO цГМФ сигнальный путь является ос

семейство 1, группа I, член 3) - члены суперсе

новным механизмом реализации физиологичес

мейства ядерных рецепторов, которое в основ

ких эффектов NO. NO активирует растворимую

ном включает факторы транскрипции [41, 42].

гуанилатциклазу, которая превращает ГТФ

Данные рецепторы локализуются преиму

в цГМФ. цГМФ, в свою очередь, активирует ни

щественно в печени и кишечнике и регулируют

жестоящие элементы сигнального пути, вклю

экспрессию ферментов I фазы биотрансформа

чая протеинкиназу G (PKG I и II), цГМФ уп

ции, таких как изоферменты цитохрома P450

равляемые катионные каналы и фосфодиэсте

CYP3A и CYP2B, а также белков транспортёров,

разы, регулируемые цГМФ. Данный физиологи

в частности Pgp.

ческий путь реализуется при низких, наномо

Показано, что накопление продуктов окис

лярных концентрациях NO [36]. В качестве ин

лительного и нитрозативного стресса приводит

гибитора NO цГМФ сигнального пути приме

к повышению количества PXR

[43,

44]

нялся специфический блокатор растворимой

и CAR [45].

гуанилатциклазы - ODQ. Показано, что ODQ

Ингибирование PXR и CAR осуществляли с

окисляет молекулу гема в гуанилатциклазе без

помощью кетоконазола и CINPA1 соответ

влияния на каталитический домен, тем самым

ственно. Кетоконазол (противогрибковый пре

снижая её активность [37].

парат группы азолов) связывается с областью

В ходе исследования было установлено, что

AF 2 лиганд связывающего домена PXR и та

ODQ при совместном инкубировании с GSNO

ким образом подавляет его активацию [46].

(концентрации 10-50 мкМ при экспозиции 24 ч

CINPA1 блокирует лиганд связывающий до

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

536

ЩУЛЬКИН и др.

мен CAR, а также подавляет его взаимодействие

снижение относительного количества белка

с коактиваторами [16].

транспортёра.

В настоящей работе CINPA1 предотвращал

При этом повышение относительного коли

повышение уровня Pgp при концентра

чества Pgp при воздействии низких концентра

ции GSNO 10 мкМ и экспозиции 24 и 72 ч, а ке

ций GSNO реализуется через NO цГМФ сиг

токоназол - не влиял на действие GSNO.

нальный путь, а при увеличении концентрации

Полученные данные свидетельствуют о том,

GSNO, развитии и прогрессировании нитроза

что GSNO в низких концентрациях повышает

тивного стресса - через Nrf2 и конститутивный

относительное количество Pgp через NO

андростановый рецептор.

цГМФ сигнальный путь, при развитии нитроза

Полученные данные объясняют разнонап

тивного стресса - через Nrf2, при накоплении

равленные и потому противоречивые результа

продуктов нитрозативного стресса - через тран

ты предшествующих исследований других авто

скрипционный фактор (CAR).

ров и раскрывают механизмы регуляции Pgp под

Таким образом, нами показано, что кратко

действием NO.

временное воздействие донора NO GSNO в тече

ние 3 ч в концентрации 500 мкМ вызывает повы

шение в клетках линии Caco 2 метаболитов ок

Финансирование. Исследование выполнено

сида азота и пероксинитрита, что приводит к

при финансовой поддержке гранта Президента

снижению активности, но не содержания Pgp.

Российской Федерации для государственной

Увеличение длительности экспозиции до 24 ч

поддержки молодых российских учёных - кан

приводит к увеличению относительного количе

дидатов наук МК 1856.2020.7.

ства и активности Pgp при концентрации GSNO

Конфликт интересов. Авторы декларируют

10 и 50 мкМ, повышению содержания без увели

отсутствие явных и потенциальных конфликтов

чения активности транспортёра в концентрации

интересов, связанных с публикацией настоящей

100 мкМ и снижению относительного количест

статьи.

ва изучаемого белка при 500 мкМ. При длитель

Соблюдение этических норм. Настоящая

ности воздействия 72 ч GSNO в концентрации

статья не содержит описания каких либо иссле

10 мкМ повышает содержание и активность Pgp,

дований с участием людей или животных в каче

а в концентрациях 100 и 500 мкМ он вызывает стве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Fojo, A. T., Ueda, K., Slamon, D. J., Poplack, D. G.,

8. Sinha, B. K., Perera, L., and Cannon, R. E.

(2019)

Gottesman, M. M., et al. (1987) Expression of a mul

Reversal of drug resistance by JS K and nitric oxide in

tidrug resistance gene in human tumors and tissues, Proc.

ABCB1 and ABCG2 expressing multi drug resistant

Natl. Acad. Sci. USA, 84, 265 269.

human tumor cells, Biomed. Pharmacother., 120, 109468,

Borst, P., and Schinkel, A. H. (2013) P glycoprotein

doi: 10.1016/j.biopha.2019.109468.

ABCB1: A major player in drug handling by mammals,

9. Dixit, S. G., Zingarelli, B., Buckley, D. J., Buckley, A. R.,

Clin. Invest., 123, 4131 4133.

and Pauletti, G. M. (2005) Nitric oxide mediates

Brueck, S., Bruckmueller, H., Wegner, D., Busch, D.,

increased P glycoprotein activity in interferon {gamma}

Martin, P., et al. (2019) Transcriptional and post transcrip

stimulated human intestinal cells, Am. J. Physiol.

tional regulation of duodenal P glycoprotein and MRP2 in

Gastrointest. Liver Physiol., 288, 533 540, doi: 10.1152/

healthy human subjects after chronic treatment with

ajpgi.00248.2004.

rifampin and carbamazepine, Mol. Pharm., 16, 3823 3830,

10. Robertson, S. J., Mokgokong, R., Kania, K. D., Guedj, A.

doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.9b00458.

S., Hladky, S. B., et al. (2011) Nitric oxide contributes to

Mollazadeh, S., Sahebkar, A., Hadizadeh, F., Behravan, J.,

hypoxia reoxygenation induced P glycoprotein expres

and Arabzadeh, S. (2018) Structural and functional aspects

sion in rat brain endothelial cells, Cell. Mol. Neurobiol., 31,

of P glycoprotein and its inhibitors, Life Sci., 214, 118

1103 1111, doi: 10.1007/s10571 011 9711 4.

123, doi: 10.1016/j.lfs.2018.10.048.

11. Duan, R., Hu, N., Liu, H.Y., Li, J., Guo, H., et al. (2012)

Wessler, J. D., Grip, L. T., Mendell, J., and Giugliano, R.

Biphasic regulation of P glycoprotein function and expres

P. (2013) The P glycoprotein transport system and cardio

sion by NO donors in Caco 2 cells, Acta Pharmacol. Sin.,

vascular drugs, J. Am. Coll. Cardiol., 61, 24952502,

33, 767 774, doi: 10.1038/aps.2012.25.

doi: 10.1016/j.jacc.2013.02.058.

12. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., and Burton, P. S. (1990)

Socco, S., Bovee, R. C., Palczewski, M. B., Hickok, J. R.,

Caco 2 cell monolayers as a model for drug transport

and Thomas, D. D. (2017) Epigenetics: The third pillar of

across the intestinal mucosa, Pharm. Res., 7, 902 910,

nitric oxide signaling, Pharmacol. Res., 121, 5258,

doi: 10.1023/A:1015937605100.

doi: 10.1016/j.phrs.2017.04.011.

13. Hwang, T. L., Wu, C. C., and Teng, C. M. (1998)

Sinha, B. K., Bortner, C. D., Mason, R. P., and Cannon,

Comparison of two soluble guanylyl cyclase inhibitors,

R. E., (2018) Nitric oxide reverses drug resistance by

methylene blue and ODQ, on sodium nitroprusside

inhibiting ATPase activity of p glycoprotein in human

induced relaxation in guinea pig trachea, Br. J.

multi drug resistant cancer cells, Biochim. Biophys. Acta

Pharmacol., 125, 1158 1163, doi: 10.1038/sj.bjp. 0702181.

Gen. Subj., 1862, 2806 2814, doi: 10.1016/j.bbagen.2018.

14. Bollong, M.J., Yun, H., Sherwood, L., Woods, A. K.,

08.021.

Lairson, L. L., et al. (2015) A small molecule inhibits

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ PGP ПОД ДЕЙСТВИЕМ NO

537

deregulated NRF2 transcriptional activity in cancer, ACS

31.

Ferrer Sueta, G., Campolo, N., Trujillo, M., Bartesaghi,

Chem. Biol., 10, 2193 2198.

S., Carballal, S., et al. (2018) Biochemistry of peroxynitrite

15.

Kota, B. P., Tran, V. H., Allen, J., Bebawy, M., and

and protein tyrosine nitration, Chem. Rev., 118, 1338

Roufogalis, B. D. (2010) Characterization of PXR mediat

1408, doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00568.

ed P glycoprotein regulation in intestinal LS174T cells,

32.

Boer, T. R., Palomino, R. I., and Mascharak, P. K. (2019)

Pharm. Res., 62, 426 431, doi: 10.1016/j.phrs.2010.07.001.

Peroxynitrite mediated dimerization of 3 nitrotyrosine:

16.

Cherian, M. T., Lin, W., Wu, J., and Chen, T. (2015)

Unique chemistry along the spectrum of peroxynitrite

CINPA1 is an inhibitor of constitutive androstane receptor

mediated nitration of tyrosine, Med One, 4, e190003,

that does not activate pregnane X receptor, Mol.

doi: 10.20900/mo.20190003.

Pharmacol., 87, 878 889, doi: 10.1124/mol.115.097782.

33.

Heinrich, T. A., da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer,

17.

Якушева Е. Н., Щулькин А. В., Черных И. В., Попова Н.

C. H., Wink, D. A., et al. (2013) Biological nitric oxide sig

М., Котлярова А. А., и др. (2019) Метод анализа принад

nalling: chemistry and terminology, Br. J. Pharmacol., 169,

лежности лекарственных веществ к субстратам и инги

1417 1429, doi: 10.1111/bph.12217.

биторам белка транспортёра гликопротеина Р in vitro,

34.

Sim, H. M., Bhatnagar, J., Chufan, E. E., Kapoor, K., and

Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной

Ambudkar, S. V. (2013) Share conserved walker A cysteines

терапии, 17, 71 78, doi: 10.17816/RCF17171 78.

431 and 1074 in human P glycoprotein are accessible to

18.

Tolosa, L., Donato, M. T., and Gómez Lechón, M. J.

thiol specific agents in the apo and ADP vanadate trapped

(2015) General cytotoxicity assessment by means of the

conformations, Biochemistry, 52, 7327 7338, doi: 10.1021/

MTT assay, Methods Mol. Biol.,

1250,

333348,

bi4007786.

doi: 10.1007/978 1 4939 2074 7_26.

35.

Якушева Е. Н., Черных И. В., Щулькин А. В., Попова

19.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for

Н. М. (2014) Гликопротеин Р: структура, физиологи

the quantitation of microgram quantities of protein utiliz

ческая роль и молекулярные механизмы модуляции

ing the principle of protein dye binding, Anal. Biochem., 7,

функциональнои активности, Успехи Физиол. Наук,

248 254, doi: 10.1006/abio.1976.9999.

45, 89 98.

20.

Amado, R., Aeschbach, R., and Neukom, H. (1984)

36.

Gantner, B. N., LaFond, K. M., and Bonini, M. G. (2020)

Dytirosine: in vitro production and characterization,

Nitric oxide in cellular adaptation and disease, Redox Biol.,

Methods Enzymol., 107, 377 388.

34, 101550, doi: 10.1016/j.redox.2020.101550.

21.

Лобышева И. И., Сереженков В. А., Ванин А. Ф.

37.

Zhao, Y., Brandish, P. E., Di Valentin, M., Schelvis, J. P.,

(1999) Взаимодействие динитрозильных тиолсодер

Babcock, G. T., et al. (2000) Inhibition of soluble guany

жащих комплексов железа с пероксинитритом и пере

late cyclase by ODQ, Biochemistry, 39, 10848 10854,

кисью водорода in vitro, Биохимия, 64, 194 200.

doi: 10.1021/bi9929296.

22.

Метельская В. А., Гуманова Н. Г. (2005) Скри

38.

Moldogazieva, N. T., Mokhosoev, I. M., Feldman, N. B.,

нинг - метод определения уровня метаболитов окси

and Lutsenko, S. V. (2018) ROS and RNS signalling: adap

да азота сыворотке человека, Клиническая лаборатор)

tive redox switches through oxidative/nitrosative protein

ная диагностика, 6, 15 18.

modifications, Free Radic. Res.,

52,

507543,

23.

Bronsky, E. A., Falliers, C. J., Kaiser, H. B., Ahlbrandt, R.,

doi: 10.1080/10715762.2018.1457217.

and Mason, J. M. (1998) Effectiveness and safety of fex

39.

Wen, Zh., Liu, W., Li, X., Chen, W., Liu, J., et al. (2019)

ofenadine, a new nonsedating H1 receptor antagonist in

A protective role of the NRF2 Keap1 pathway in main

the treatment of fall allergies, Allergy Asthma Proc., 19,

taining intestinal barrier function, Oxid. Med. Cell Longev.,

135 141, doi: 10.2500/108854198778604112.

2019, е1759149, doi: 10.1155/2019/1759149.

24.

Petri, N., Tannergren, C., Rungstad, D., and Lennernäs,

40.

Shchul’kin, A. V., Abalenikhina, Y. V., Erokhina, P.D.,

H. (2004) Transport characteristics of fexofenadine in the

Chernykh, I. V., and Yakusheva, E. N. (2021) The role of

Caco 2 cell model, Pharm. Res.,

21,

13981404,

P glycoprotein in decreasing cell membranes permeability

doi: 10.1023/B:PHAM.0000036913.90332.b1.

during oxidative stress, Biochemistry (Moscow), 86, 197

25.

Elsby, R., Surry, D. D., Smith, V. N., and Gray, A. J. (2008)

206, doi: 10.1134/S0006297921020085.

Validation and application of Caco 2 assays for the in vitro

41.

Inouye, Y. (2016) Structure and function of the nuclear

evaluation of development candidate drugs as substrates or

receptor constitutive androstane receptor, Yakugaku

inhibitors of P glycoprotein to support regulatory submis

Zasshi, 136, 297 308, doi: 10.1248/yakushi.15 00215.

sions, Xenobiotica,

38,

11401164, doi:

10.1080/

42.

Yan, J., and Xie, W. (2016) A brief history of the discovery

00498250802050880.

of PXR and CAR as xenobiotic receptors, Acta Pharm.

26.

Ерохина П. Д., Абаленихина Ю. В., Щулькин А. В.,

Sin. B, 6, 450 452, doi: 10.1016/j.apsb.2016.06.011.

Черных И. В., Попова Н. М., и др. (2020) Изучение

43.

Абаленихина Ю. В., Судакова Е. А., Слепнев А. А., Се

влияния прогестерона на активность гликопротеина Р

идкулиева А. А., Ерохина П. Д., и др. (2022) Функцио

in vitro, Росс. Мед. Биол. Вестник им. Акад. И.П. Павло)

нирование прегнан Х рецептора в условиях окисли

ва, 28, 135 142, doi: 10.23888/PAVLOVJ2020282135 142.

тельного стресса, Биол. Мембр., 39, 1 9, doi: 10.31857/

27.

Broniowska, K. A., Diers, A. R., and Hogg, N. (2013) S

S0233475522010030.

Nitrosoglutathione, Biochim. Biophys. Acta, 1830, 3173

44.

Abalenikhina, Y. V., Sudakova, E. A., Seidkulieva, A. A.,

3181, doi: 10.1016/j.bbagen.2013.02.004.

Shchul’kin, A. V., and Yakusheva, E. N.

(2021)

28.

Ramachandran, N., Root, P., Jiang, X. M., Hogg, P. J.,

Functioning of pregnan X receptor under conditions of

and Mutus, B. (2001) Mechanism of transfer of NO from

nitrosative stress, Biomed Khim.,

67,

394401,

extracellular S nitrosothiols into the cytosol by cell surface

doi: 10.18097/PBMC20216705394.

protein disulfide isomerase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98,

45.

Shchul’kin, A. V., Abalenikhina, Y. V., Seidkulieva, A. A.,

9539 9544, doi: 10.1073/pnas.171180998.

Ryabkov, A. N., and Yakusheva, E. N. (2021) Induction of

29.

Zhang, Y., and Hogg, N. (2004) The mechanism of trans

constitutive androstane receptor during the development of

membrane S nitrosothiol transport, Proc. Natl. Acad. Sci.

oxidative stress, Bull. Exp. Biol. Med., 171, 615 618,

USA, 101, 7891 7896, doi: 10.1073/pnas.0401167101.

doi: 10.1007/s10517 021 05280 7.

30.

Abalenikhina, Yu. V., Kosmachevskaya, O. V., and

46.

Wang, H., Huang, H., Li, H., Teotico, D. G., Sinz, M.,

Topunov, A. F. (2020) Peroxynitrite: Toxic agent and sig

et al. (2007) Activated pregnenolone X receptor is a target

naling molecule (review), Appl. Biochem. Microbiol., 56,

for ketoconazole and its analogs, Clin. Cancer Res., 13,

611 623, doi: 10.1134/S0003683820060022.

2488 2495, doi: 10.1158/1078 0432.CCR 06 1592.

6 БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

538

ЩУЛЬКИН и др.

MECHANISMS OF REGULATION OF THE FUNCTIONING

OF THE P GLYCOPROTEIN TRANSPORTER PROTEIN

UNDER THE ACTION OF NITRIC OXIDE

A. V. Shchulkin*, Yu. V. Abalenikhina, E. A. Sudakova, P. Yu. Mylnikov, and E. N. Yakusheva

Ryazan State Medical University, 390026 Ryazan, Russia; e)mail: alekseyshulkin@rambler.ru

In a study on Caco 2 cells, the mechanisms of regulation of the transport protein P glycoprotein (Pgp) under the

action of nitric oxide (NO) were studied. The NO donor was S nitrosoglutathione (GSNO), which was added to cells

at concentrations of 1; 10; 50; 100 and 500 μM and incubated for 3, 24, or 72 h. The amount of Pgp was analyzed by

Western blot, activity was determined by the transport of its substrate fexofenadine. The study showed that a short

term exposure to GSNO for 3 hours at a concentration of 500 μM caused an increase in the concentration of perox

ynitrite in Caco 2 cells, which reduced the activity, but not the amount of Pgp. An increase in the duration of expo

sure to 24 h increased the amount and activity of Pgp at GSNO concentrations of 10 and 50 μM, increased the

amount without increasing activity at a concentration of 100 μM, and decreased the amount of the transporter pro

tein at 500 μM. At an exposure duration of 72 h, GSNO at a concentration of 10 μM increased the amount and activ

ity of Pgp, while at a concentration of 100 and 500 μM, it decreased the amount of the transporter protein. At the

same time, using specific inhibitors, it was shown that an increase in the amount of Pgp under the influence of low

concentrations of GSNO was realized through the NO cGMP signaling pathway, and with an increase in the con

centration of GSNO, the development of nitrosative stress, through Nrf2 and the constitutive androstane receptor.

Keywords: P glycoprotein, ABCB1 protein, nitric oxide, guanylate cyclase, Caco 2 cell line

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022