БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 4, с. 539 - 549

УДК 577.12

2 АМИНО ПИРРОЛ КАРБОКСИЛАТ ОСЛАБЛЯЕТ ПРОЦЕССЫ

ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ДНК И ВЫЗЫВАЕТ

СЕНСИТИЗАЦИЮ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

С.В. Бойчук^1,2*, Ф.Ф. Бикиниева¹, И.Г. Мустафин¹,

С.С. Зыкова³, С.А. Рыжкин², А.Р. Галембикова¹

¹ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России,

420012 Казань, Россия; электронная почта: boichuksergei@mail.ru

² Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного

профессионального образования «Российская медицинская академия непрерывного

профессионального образования» Минздрава России, 125993 Москва, Россия

³ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, 614990 Пермь, Россия

Поступила в редакцию 22.03.2022

После доработки 25.03.2022

Принята к публикации 25.03.2022

Несмотря на высокую эффективность химиотерапии в современной онкологии, быстрое развитие резистен

тности опухолей к большинству химиопрепаратов и высокая частота системных побочных эффектов от

проводимой химиотерапии являются основными факторами неблагоприятного прогноза для большинства

пациентов с неоперабельными, метастатическими и рецидивирующими формами злокачественных новооб

разований. Следовательно, поиск новых молекулярных мишеней в опухолях и разработка подходов к уси

лению действия уже имеющихся химиопрепаратов являются чрезвычайно актуальными для практической

онкологии. Целью исследования явилось изучение способности синтезированного нами пиррол содержа

щего гетероциклического соединения, именуемого в дальнейшем как 2 АПК, вызывать сенситизацию опу

холевых клеток к действию химиопрепарата доксорубицина, являющегося ингибитором ДНК топоизоме

разы типа II. Исследования проводились на опухолевых клеточных линиях, культивированных в присут

ствии 2 АПК, паклитаксела и доксорубицина. Уровень экспрессии белков репарации повреждений ДНК, а

также апоптоза оценивали методом иммуноблоттинга, а белковые взаимодействия - методом коиммуно

преципитации. Синергизм действия химиопрепаратов оценивался с помощью компьютерной программы

Synergy Finder. Было установлено, что доксорубицин оказывал умеренное цитотоксическое действие в от

ношении опухолевых клеток (например, остеосарком), в то время как его использование в комбинации с

2 АПК (в нетоксичных концентрациях) приводило к значимому усилению цитотоксического эффекта док

сорубицина и вызывало гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза. Молекулярным механизмом

2 АПК индуцированной сенситизации к доксорубицину явилось ослабление процессов репарации пов

реждений ДНК по механизму гомологичной рекомбинации, что подтверждалось снижением уровня

экспрессии рекомбиназы Rad51 за счёт усиления скорости её протеасом зависимой деградации. Помимо

2 АПК данная способность была также отмечена в отношении паклитаксела, также влияющего на процес

сы полимеризации тубулина. Таким образом, лекарственные химиопрепараты и химические соединения,

влияющие на динамическое состояние микротрубочек веретена деления, способны усиливать цитотокси

ческое действие ДНК повреждающих химиопрепаратов за счёт ослабления процессов репарации повреж

дений ДНК в опухолевых клетках.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пиррол содержащие гетероциклические соединения, полимеризация тубулина, пак

литаксел, доксорубицин, сенситизация, апоптоз.

DOI: 10.31857/S0320972522040066, EDN: AQSSMH

ВВЕДЕНИЕ

неуклонное развитие резистентности злокачест

венных новообразований к большинству совре

Несмотря на успехи химиотерапии в лечении

менных химиопрепаратов, а также большое ко

пациентов с онкологическими заболеваниями, личество системных побочных эффектов про

Принятые сокращения: 2 АПК - 2 амино пиррол карбоксилат; ДМСО - диметилсульфоксид; клетки линии

HeLa - клетки аденокарциномы шейки матки человека; клетки лини U 2 OS и U 2 OS DR GFP - клетки остеосаркомы

человека; ПАРП - поли (АДФ рибоза) полимеразa; GFP - зелёный флюоресцентный белок; MG 132 - ингибитор про

теасом.

* Адресат для корреспонденции.

539

540

БОЙЧУК и др.

должают оставаться одними из главных вызовов

лена доктором Maria Jasin из Ракового Центра

в современной онкологии [1-3]. Эти факторы

Memorial Sloan Kettering, Нью Йорк, США.

диктуют необходимость поиска новых терапев

Клеточные линии культивировали в среде

тических мишеней, направленных на увеличе

RPMI 1640 с добавлением 15% эмбриональной

ние терапевтического индекса химиопрепаратов

бычьей сыворотки, 1% L глутамина, 50 Ед/мл

и снижение токсичности от проводимой химио

пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и в

терапии [4-8]. Одним из таких подходов являет

стандартных условиях инкубатора (5% CO₂,

ся снижение способности опухолевых клеток ре

37 °C, «ЛамСистемс», Россия).

парировать повреждения ДНК, возникающие

Антитела. Первичные антитела (АТ), исполь

вследствие воздействия ДНК повреждающих

зуемые для вестерн блоттинга, были следующи

факторов (химиопрепараты и лучевая терапия).

ми: актин («Gene Script», США), Rad51 («Cell

Результаты настоящего исследования иллю

Signaling», США), γ H2AX (Ser139)

(«Cell

стрируют способность синтезированного нами

Signaling»),

убиквитин

(«Santa

Cruz

пиррол содержащего гетероциклического со

Biotechnology», США), расщеплённые формы

единения, 2 амино пиррол карбоксилата (2

каспазы 3 («Cell Signaling») и поли (АДФ рибо

АПК), повышать чувствительность опухолевых

за) полимеразы (ПАРП) («Life Technologies»,

клеток (например, остеосарком) к ингибитору

США). В качестве вторичных антител использо

ДНК топоизомеразы II типа, доксорубицину.

вали АТ, конъюгированные с

пероксида

Данный эффект был обусловлен способностью

зой (HRP) («Santa Cruz Biotechnology»).

2 АПК снижать уровень экспрессии рекомби

Вестерн блоттинг. Для вестерн блоттинга

назы Rad51 в опухолевых клетках путём усиле

клетки подвергали лизису с помощью буфера

ния процессов её протеасом зависимой деграда

RIPA (1% NP 40, 50 мМ Tris HCl (pH 8,0), с до

ции, что приводило к снижению эффективнос

бавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз).

ти репарации повреждений ДНК по механизму

Полученную суспензию инкубировали в течение

гомологичной рекомбинации. Полученные дан

ч при

°C, а затем центрифугировали

ные свидетельствуют о перспективности комби

(«Eppendorf», Германия) в течение 30 мин при

нированного использования ингибиторов ДНК

13 000 об./мин при 4 °C. Концентрацию белка в

топоизомеразы типа II в комбинации с лекар

суспензии измеряли с помощью BCA Protein

ственными препаратами, влияющими на про

Assay Kit («Thermo Fisher», США). В лунки

цессы репарации повреждений ДНК.

4-12% ного градиентного Tris ацетатного ге

ля NuPAGE («Invitrogen», США) добавляли по

30 мкг белковой суспензии, затем осуществляли

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

перенос разделённых электрофорезом белков на

нитроцеллюлозную мембрану

(«Bio Rad»,

Химические соединения. Синтез и цитостати

США). Далее мембрану последовательно инку

ческая активность (E) этил 2 амино 5 (3,3 ди

бировали с первичными, затем вторичными АТ в

метил 4 оксобутилиден) 4 оксо 1 (2 фенил

растворе 5% ного обезжиренного молока. Детек

аминобензамидо) 4,5 дигидро 1H пиррол 3

цию проводили с помощью усиленной хемилю

карбоксилата были описаны ранее [9, 10]. Ус

минесценции (реагент Western Lightning Plus

ловное обозначение данного соединения -

ECL, «Perkin Elmer», США) в гель документиру

2 АПК (2 амино пиррол карбоксилат). Для ис

ющей системе FUSION Solo («Vilber», Франция).

следований были также использованы химио

Программное обеспечение NIH ImageJ

препараты доксорубицин

(«Selleck Chem»,

(«Bethesda», США) использовали для денсито

США), паклитаксел («Sigma», CША), а также

метрического анализа полученных изображений.

ингибиторы белкового синтеза циклогексемид и

Для коиммунопреципитации клетки подвер

ингибитор протеасом MG 132 («Sigma»). Все

гали лизису в TEB буфере (50 мМ Tris HCl

исследуемые соединения и препараты растворя

(pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1% NP 40, 10% глицери

ли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соответ

на) в присутствии коктейля ингибиторов протеаз

ствии с рекомендациями производителя.

и фосфатаз («Sigma»). Лизаты были инкубирова

Клеточные линии и условия культивирования.

ны со специфическими АТ в течение 12 ч при

Исследования были проведены на опухолевых

4 °C на орбитальном шейкере («BioSan», Латвия).

клеточных линиях аденокарциномы шейки мат

Далее к исследуемым образцам добавляли сефа

ки HeLa и остеосаркомы U 2 OS, которые были

розу A/G («Santa Cruz Biotechnology») и инкуби

получены из Американской коллекции типовых

ровали в течение 1 ч при 4 °C на орбитальном

культур («ATCC», США). Клеточная линия

шейкере. После 5 кратного отмыва образцов

U 2 OS DR GFP, содержащая зелёный флюорес

TEB буфером осуществляли детекцию сигнала

центный белок (GFP), была любезно предостав

методом вестерн блоттинга, как указано выше.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ СЕНСИТИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

541

Анализ клеточной выживаемости. Опухоле

субтоксичных концентрациях ингибирует ско

вые клетки засевали в 96 луночные плоскодон

рость пролиферации опухолевых клеток линии

ные планшеты («Corning Inc.», США) и культи

остеосаркомы U 2 OS. Аналогичная способность

вировали в присутствие исследуемых соедине

была обнаружена у синтезированного нами пир

ний или ДМСО (контроль) в течение 72 ч. Для

рол содержащего гетероциклического соедине

оценки жизнеспособности клеточных культур

ния 2 АПК. Использование данных соединений

вносили реагент (MTS) 3 (4,5 диметилтиазол

в комбинации друг с другом приводило к выра

2 ил) 5 (3 карбоксиметоксифенил) 2 (4 суль

женному цитотоксическому эффекту и значи

фофенил) 2H тетразолий («Promega», США).

тельному снижению степени конфлюэнтности

Спустя 1 ч проводили анализ жизнеспособности

опухолевой культуры (рис. 1). Аналогичные дан

клеточных культур на планшетном спектрофо

ные были получены с использованием других

тометре MultiScan FC

(«Thermo Fisher

опухолевых клеточных линий, например HeLa.

Scientific», США) при длине волны 492 нм.

Дальнейшие исследования показали, что основ

Анализ эффективности гомологичной рекомби

ным механизмом гибели опухолевых клеток при

нации ДНК. Оценку способности 2 AПК влиять

сочетанном влиянием доксорубицина и 2 АПК

на процессы гомологичной рекомбинации оце

являлся апоптоз. В пользу этого свидетельствова

нивали методом проточной цитофлюориметрии

ло значительное повышение уровней экспрессии

с использованием репортёрной клеточной ли

расщеплённых форм ПАРП и каспазы 3 (рис. 2).

нии остеосаркомы U 2 OS DR GFP. Трансфек

На основании вышеизложенного было вы

цию pCbA SceI содержащей плазмиды в «инди

двинуто предположение о синергизме действия

каторную» клеточную линию U 2 OS DR GFP

вышеуказанных соединений, для подтвержде

осуществляли с использованием набора для

ния которого были проведены расчёты показа

трансфекции Lipofectamine RNAiMAX Reagent

телей синергизма в опухолевых клетках линии

(«Invitrogen») в соответствии с протоколом про

U 2 OS, культивированных с различными кон

изводителя. Плазмида pCbA SceI была любезно

центрациями доксорубицина

(0,125;

0,25;

предоставлена Maria Jasin. Трансфекция в клет

0,5 мкМ) и 2 АПК (0,625; 1,25; 2,5; 5 мкМ). Ре

ки pCbA SceI содержащей плазмиды приводит к

зультаты исследования, представленные на

образованию двунитевых разрывов ДНК, репа

рис. 3, показывают наличие синергизма между

рация которых приводит к восстановлению

данными веществами (показатель синергии сос

функциональной активности гена GFP (green

тавлял 12,523 (>10)).

fluorescent protein). Соответственно, количество

Одним из механизмов, обусловливающих

GFP положительных клеток после трансфекции

способность 2 АПК усиливать цитотоксичес

отражает эффективность процессов гомологич

кую активность доксорубицина, могло явиться

ной рекомбинации ДНК. Количество GFP по

ослабление в опухолевых клетках процессов ре

ложительных клеток подсчитывали на проточ

парации повреждений ДНК, индуцируемых

ном цитофлюориметре («FACS Canto», США).

данным химиопрепаратом. Анализ уровня

Для каждой выборки было зарегистрировано не

экспрессии белков, участвующих в процессах

менее 10 000 событий.

репарации двунитевых разрывов ДНК, выявил

Статистический анализ проводили с исполь

значительное повышение уровня экспрессии

зованием t критерия Стьюдента. Результаты

рекомбиназы Rad51 в опухолевых клетках, под

представлены как среднее значение ± стандарт

вергнутых воздействию доксорубицина (рис. 2).

ное отклонение (M ± SD) для каждой группы.

Этот факт свидетельствовал об активации спа

Показатель синергизма оценивали количествен

сательных путей репарации повреждений ДНК,

но с помощью R пакета программы Synergy

что могло обусловливать низкую эффектив

Finder. Модель HSA (highest single agent) была ис

ность данного химиопрепарата. В то же время

пользована для расчёта синергизма [11]. Значе

культивирование опухолевых клеток с доксору

ния HSA > 10 свидетельствуют о синергизме

бицином в комбинации с 2 АПК приводило к

действия исследуемых препаратов, значения

значительному снижению уровня экспрес

HSA в диапазоне от -10 до 10 иллюстрируют их

сии Rad51. Данный факт коррелировал с повы

аддитивный эффект, а значения HSA < -10 ука

шением уровней экспрессии маркёров апопто

зывают на антагонизм исследуемых соединений.

за (рис. 2), что свидетельствовало о запуске про

цессов программированной клеточной гибели в

опухолевых клетках вследствие несостоятель

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ности процессов репарации повреждений ДНК,

индуцированных доксорубицином.

На начальном этапе исследований нами было

Данный факт мог быть обусловлен способ

показано, что химиопрепарат доксорубицин в

ностью 2 АПК влиять на уровень экспрес

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ СЕНСИТИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

543

Рис. 3. Двухмерный (а) и трёхмерный (б) графики (surface plots), отражающие оптимальные дозы доксорубицина и

2 АПК, которые обусловливают наибольший синергизм у клеток U 2 OS. Синергия доксорубицина и 2 АПК получена с

помощью программы Synergy Finder. Показатель синергии доксорубицина и 2 АПК составил 12,523

сии Rad51 как на транскрипционном, так и на

Способность 2 АПК усиливать процессы

посттрансляционном уровнях. Поэтому на пер

протеасом зависимой деградации в обоих опу

вом этапе исследований был проведён анализ

холевых клеточных линиях была подтверждена

уровня экспрессии Rad51 в опухолевых клетках,

результатами коиммунопреципитации реком

культивированных с 2 АПК в присутствии цик

биназы Rad51 c убиквитином (рис. 5). Важно от

логексимида, блокирующего синтез белка. Ре

метить, что химиопрепарат паклитаксел также

зультаты, представленные на рис. 4, а, не выяви

повышал уровень экспрессии убиквитиниро

ли различий в уровне экспрессии Rad51 в опухо

ванной формы Rad51, что свидетельствовало о

левых клетках U 2 OS в присутствии циклогек

способности препаратов, влияющих на динами

семида и без него. Аналогичные результаты бы

ческое состояние микротрубочек веретена деле

ли получены и на другой опухолевой клеточной

ния, влиять на уровень экспрессии Rad51 на

линии HeLa (рис. 4, б). Эти данные свидетель

посттрансляционном уровне, усиливая процес

ствовали об отсутствии способности 2 АПК

сы их протеасом зависимой деградации.

влиять на уровень экспрессии Rad51 на тран

На заключительном этапе исследований бы

скрипционном уровне.

ла изучена способность 2 АПК непосредствен

На следующем этапе исследований была

но влиять на процессы гомологичной рекомби

изучена способность данного соединения вли

нации ДНК в клетках остеосаркомы U 2 OS

ять на процессы протеасом зависимой деграда

(рис. 6). С этой целью нами была использована

ции рекомбиназы Rad51. С этой целью был ис

репортёрная клеточная линия, содержащая ин

пользован препарат MG 132, являющийся ин

тегрированную в геном единичную копию ге

гибитором протеасом. Результаты, представлен

на GFP. Важно отметить, что GFP приобретает

ные на рис. 4, в, убедительно показывают повы

свою функциональную активность только в ре

шение уровня экспрессии Rad51 в опухолевых

зультате успешной репарации двунитевых раз

клетках U 2 OS на фоне действия данного инги

рывов ДНК, индуцированных в результате

битора. Аналогичные данные были получены с

трансфекции в клетки pCbA SceI содержащей

использованием клеточной линии HeLa

плазмиды. Следовательно, уменьшение или уве

(рис. 4, г). Результаты денситометрического ана

личение количеств GFP положительных клеток

лиза полученных данных показывают способ

после образования в них SceI индуцированных

ность MG 132 статистически значимо повы

двунитевых разрывов ДНК являлось свидетель

шать уровень экспрессии Rad51 в данных опухо

ством ослабления или усиления процессов го

левых клеточных линиях практически на всех

мологичной рекомбинации ДНК. Трансфекция

сроках культивирования с 2 АПК (рис. 4, д и е).

в опухолевые клетки SceI содержащей плазми

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

544

БОЙЧУК и др.

ды приводила к появлению GFР положитель

ять на уровень экспрессии рекомбиназы Rad51,

ных клеток, что свидетельствовало о восстанов

снижая тем самым эффективность процессов

лении последовательности GFP в результате ак

гомологичной рекомбинации ДНК и запуская

тивации процессов гомологичной рекомбина

процессы апоптоза вследствие несостоятель

ции (рис. 6, б). Было обнаружено значитель

ности вышеуказанных репаративных процессов.

ное (почти 6 кратное) снижение количеств

GFP позитивных клеток, культивированных с

2 АПК в течение 24 ч после индукции двуните

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

вых разрывов ДНК в результате трансфекции в

данные клетки SceI содержащей плазми

Химиотерапия является одним из общеприз

ды (рис. 6, г).

нанных методом лечения пациентов со многими

Таким образом, основной механизм 2 АПК

злокачественными новообразованиями, в том

индуцированной сенситизации опухолевых кле

числе, остеосарком [12-14] и некоторых опухо

ток к химиопрепарату доксорубицину был обус

лей эпителиального происхождения [15, 16].

ловлен способностью данного соединения вли

Несмотря на эффективность большинства со

Рис. 4. Уровень экспрессии рекомбиназы Rad51 в клетках HeLa (а) и U 2 OS (б) под влиянием 2 АПК в сочетании с ин

гибитором белкового синтеза циклогексимида и без него в динамике (0, 6, 12 и 24 ч). Уровень экспрессии рекомбиназы

Rad51 в клетках HeLa (в) и U 2 OS (г) под влиянием 2 АПК в сочетании с MG 132 и без него в динамике (0, 6, 12 и 24 ч).

Актин использовали в качестве контроля белковой нагрузки в образцах. Денситометрический анализ уровня экспрессии

рекомбиназы Rad51 под влиянием 2 АПК в сочетании с MG 132 и без него в динамике (0, 6, 12 и 24 ч) в клеточных лини

ях HeLa (д) и U 2 OS (е). M ± SD, *** p < 0,001

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ СЕНСИТИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

545

Рис. 5. Лизаты клеток HeLa (а) и U 2 OS (б) иммунопреципитировали с помощью антител к Rad51 и детектировали убик

витин с помощью иммуноблоттинга, чтобы продемонстрировать образование эндогенного комплекса. Для эксперимен

тов по коиммунопреципитации клетки обрабатывали 2 АПК (10 мкМ) и паклитакселом (1 мкМ)

временных химиопрепаратов, наличие большо

рол содержащих гетероциклических соедине

го количества системных побочных эффектов от

ний [9, 10, 25-35]. Был установлен молекуляр

проводимой химиотерапии и быстрое развитие

ный механизм их действия, который обусловлен

химиорезистентности опухоли являются основ

способностью этих соединений влиять на про

ными факторами, оказывающими негативное

цессы полимеризации тубулина, что, в свою

влияние на прогноз заболевания у пациентов с

очередь, приводило к их гибели по механизму

неоперабельными, рецидивирующими и мета

апоптоза.

статическими формами заболевания [17-19].

Исходя из вышеизложенного, было пред

Разработка и внедрение в практическую онко

принято настоящее исследование, посвящённое

логию протоколов комбинированной химиоте

изучению способности ранее синтезированного

рапии, безусловно, повышает эффективность

нами пиррол содержащего гетероциклического

используемых химиопрепаратов, влияющих на

соединения 2 АПК [9, 10] влиять на чувстви

большее количество опухолевых клеток, разли

тельность опухолевых клеток к ДНК поврежда

чающихся друг от друга по своей способности

ющим агентам, например доксорубицину.

репарировать повреждения ДНК, индуцируе

Было показано, что использование 2 АПК в

мые химиопрепаратами. Очевидно, что эффек

комбинации с доксорубицином приводило к

тивность комбинированной химиотерапии мо

выраженному цитотоксическому эффекту и

жет быть обусловлена как синергическими, так

значительному снижению степени конфлюэнт

и аддитивными эффектами противоопухолевых

ности опухолевой культуры (рис. 1). Уровень

препаратов [20, 21]. Используемые в настоящее

экспрессии маркёров апоптоза (расщеплённых

время схемы полихимиотерапии довольно часто

форм ПАРП и каспазы 3) в опухолевых клетках

включают в себя химиопрепараты антрацикли

был значительно выше при сочетанном приме

нового ряда, алкилирующие агенты, препараты

нении доксорубицина и 2 АПК по сравнению с

платины, а также митотические препара

использованием этих соединений по отдель

ты [20-24]. Несмотря на очевидные клиничес

ности (рис. 2). На следующем этапе было обна

кие преимущества современных схем комбини

ружено, что данный эффект обусловлен синер

рованной химиотерапии по сравнению со схе

гическим влиянием 2 АПК и доксорубици

мами терапии, основанными на использовании

на (рис. 3).

этих же химиопрепаратов в монорежиме, моле

Способность пиррол содержащего гетеро

кулярные механизмы их комбинированного

циклического соединения усиливать цитоток

взаимодействия являются не изученными.

сичность ДНК повреждающего агента могла

Предыдущие исследования нашей научной

быть обусловлена влиянием 2 АПК на репара

группы были посвящены синтезу и изучению

цию двунитевых повреждений ДНК, вызванных

механизма противоопухолевого действия пир

доксорубицином. Это предположение основы

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

546

БОЙЧУК и др.

валось на результатах иммуноблоттинга, иллю

данных повреждений ДНК, проявлявшейся в

стрировавших значительные колебания уровня

усилении уровня экспрессии рекомбина

экспрессии рекомбиназы Rad51 в опухолевых

зы Rad51. Тем не менее мы наблюдали значи

клетках (рис. 2). Действительно, доксорубицин

тельное снижение экспрессии данного фактора

индуцировал повреждения ДНК в опухолевых

репарации повреждений ДНК в опухолевых

клетках, о чём свидетельствовало повышение

клетках, культивированных с доксорубицином в

уровня экспрессии маркёра двунитевых разры

присутствии 2 АПК (рис. 2).

вов - γ H2AX (Ser139). Это, в свою очередь, соп

Способность 2 АПК ингибировать экспрес

ровождалось активацией процессов репарации сию Rad51 могла быть реализована как на тран

Рис. 6. Точечная (dot plot) гистограмма клеточной линии U 2 OS DR GFP. По вертикали отображен параметр бокового

светорассеяния (side scattering или SSC А); по горизонтали - интенсивность флюоресценции GFP (Fluorescein isothio

cyanate или FITC А), которая отражает долю GFP положительных клеток в процентах (выделено прямоугольником - Р8).

Клетки подвергали трансфекции контрольной (а и в) и SceI содержащей (б и г) плазмидой и по истечении 12 ч инкуби

ровали с 2 АПК (в и г) в течение 72 ч

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ СЕНСИТИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

547

скрипционном, так и на посттрансляционном

вов ДНК в клетках, культивированных с ДМСО

уровнях. В уровнях экспрессии Rad51 опухоле

(рис. 6, б).

выми клетками, культивированных в присут

ствии ингибитора белкового синтеза - цикло

Таким образом, результаты проведённого ис

гексемида и без него, не было обнаружено раз

следования свидетельствуют о способности

личий (рис. 4, а), что свидетельствовало об от

пиррол содержащего гетероциклического сое

сутствии способности данного соединения

динения - 2 АПК, ослаблять процессы гомоло

влиять на экспрессию Rad51 на транскрипци

гичной рекомбинации ДНК и вызывать сенси

онном уровне. В свою очередь, результаты, по

тизацию опухолевых клеток к ингибитору ДНК

лученные при сочетанном использовании ин

топоизомеразы типа II, доксорубицину. Эти

гибитора протеасом - MG 132 и 2 АПК (рис. 4,

данные коррелируют с результатами исследова

в-е), а также коиммунопреципитации реком

ний, показавших способность ингибиторов по

биназы Rad51 c убиквитином (рис. 5) свиде

лимеризации тубулина влиять на транспорт бел

тельствовали о способности 2 АПК влиять на

ков репарации повреждений ДНК к месту по

уровень экспрессии Rad51 на посттрансляци

вреждений, вызванных как ДНК повреждаю

онном уровне, усиливая процессы протеасом

щими химиопрепаратами [36], так и ионизиру

зависимой деградации рекомбиназы Rad51.

ющим излучением [37], что раскрывает меха

На заключительном этапе исследований бы

низмы химио и радиосенситизации опухоле

ла подтверждена способность 2 АПК ингибиро

вых клеток под действием уже известных хими

вать эффективность процессов гомологичной

опрепаратов, а также соединений, обладающих

рекомбинации ДНК с помощью репортёрной

способностью влиять на динамическое состоя

клеточной линии U 2 OS DR, имеющую еди

ние микротрубочек веретена деления посред

ничную копию гена GFP. Данная клеточная ли

ством нарушения процессов полимериза

ния могла экспрессировать GFP (зелёный флюо

ции/деполимеризации тубулина.

ресцентный белок) только при успешной репа

рации двунитевых разрывов ДНК, вызванных

Финансирование. Работа выполнена при фи

трансфекцией в клетки SceI содержащей плаз

нансовой поддержке Российского научного

миды. Таким образом, количество GFP поло

фонда (грант № 20 15 00001).

жительных клеток отражало эффективность го

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

мологичной рекомбинации ДНК, в частности,

сутствии конфликта интересов.

2 АПК почти 6 кратно снижало количество

Соблюдение этических норм. Настоящая

клеток, позитивных по уровню экспрессии GFP

статья не содержит описания каких либо иссле

(рис. 6, г), относительно положительного конт

дований с участием людей или животных в каче

роля - индукция SceI индуцированных разры стве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Benjamin, R. S.

(2020) Adjuvant and neoadjuvant

Boichuk, S., Bikinieva, F., Nurgatina, I., Dunaev, P.,

chemotherapy for osteosarcoma: a historical perspective,

Valeeva, E., et al. (2020) Inhibition of AKT signaling sen

Adv. Exp. Med. Biol., 1257, 1 10, doi: 10.1007/978 3 030

sitizes soft tissue sarcomas (STS) and gastrointestinal stro

43032 0_1.

mal tumors (GIST) to doxorubicin via targeting of homol

Marina, N. M., Smeland, S., Bielack, S. S., Bernstein, M.,

ogy mediated DNA repair, Int. J. Mol. Sci., 21, 8842,

Jovic, G., et al. (2016) Comparison of MAPIE versus MAP

doi: 10.3390/ijms21228842.

in patients with a poor response to preoperative

Galembikova, A., and Boichuk, S. (2021) Targeting of

chemotherapy for newly diagnosed high grade osteosarco

AKT signaling pathway potentiates the anti cancer effica

ma (EURAMOS 1): an open label, international, ran

cy of doxorubicin in A673 Ewing sarcoma cell line,

domised controlled trial, Lancet Oncol., 17, 1396 1408,

BioNanoSci., 11, 1070 1082, doi: 10.1007/s12668 021

doi: 10.1016/S1470 2045(16)30214 5.

00901 x.

Li, H., Wu, X., and Cheng, X. (2016) Advances in diagno

Бойчук С. В., Дунаев П. Д., Галембикова А. Р. (2021)

sis and treatment of metastatic cervical cancer, J. Gynecol.

Ингибирование AKT сигнального пути в саркомах

Oncol., 27, e43, doi: 10.3802/jgo.2016.27.e43.

мягких тканей - новый подход к их сенситизации к

Xu, J., Pan, Q., and Ju, W. (2019) Ras inhibition by zole

ингибиторам ДНК топоизомеразы II типа, Клин. Па-

dronic acid effectively sensitizes cervical cancer to

тофизиол., 27, 75 87.

chemotherapy, Anticancer Drugs,

30,

821827,

Зыкова С. С., Кизимова И. А., Сюткина А. И., Токса

doi: 10.1097/CAD.0000000000000779.

рова Ю. С., Игидов Н. М., и др. (2019) Cинтез и цитос

Galembikova, A., and Boichuk, S. V. (2021) Tyrosine

татическая активность (E) этил 2 амино 5 (3,3 ди

kinase signaling profile in osteosarcomas: A potential

метил 4 оксобутилиден) 4 оксо 1 (2 фениламино

therapeutic target for sensitization to doxorubicin,

бензамидо) 4,5 дигидро 1H пиррол 3 карбоксилата,

Ann. Oncol., 32 (Suppl 6), S1365, doi: 10.1016/j.annonc.

Хим. Фармацевт. Журн., 53, 15 18, doi: 10.30906/0023

2021.08.2060.

1134 2019 53 10 15 18.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

548

БОЙЧУК и др.

10.

Boichuk, S., Galembikova, A., Bikinieva, F., Dunaev, P.,

ma treatment cyclophosphamide compared with ifos

Aukhadieva, A., et al. (2021) 2 APCAs, the novel micro

famide in standard risk patients and assessment of benefit

tubule targeting agents active against distinct cancer cell

of etoposide added to standard treatment in high risk

lines, Molecules, 26, 616, doi: 10.3390/molecules26030616.

patients, J. Clin. Oncol., 26, 4385 4393, doi: 10.1200/JCO.

11.

Tomita, Y., Morooka, T., Hoshida, Y., Zhang, B., Qiu, Y.,

2008.16.5720.

et al. (2006) Prognostic significance of activated AKT

24.

Le Chevalier, T., Pujol, J. L., Douillard, J. Y., Alberola, V.,

expression in soft tissue sarcoma, Clin. Cancer Res., 12,

Monnier, A., et al. (1994) A three arm trial of vinorelbine

3070 3077, doi: 10.1158/1078 0432.CCR 05 1732.

(Navelbine) plus cisplatin, vindesine plus cisplatin, and

12.

Verschoor, A. J., Speetjens, F. M., Dijkstra, P. D. S.,

single agent vinorelbine in the treatment of non small cell

Fiocco, M., van de Sande, M. A. J., et al. (2020) Single

lung cancer: an expanded analysis, Semin. Oncol.,

center experience with ifosfamide monotherapy as second

21 (Suppl 10), 28 34.

line treatment of recurrent/metastatic osteosarcoma,

25.

Зыкова C. C., Бойчук С. В., Галембикова А. Р., Рамаза

Oncologist, 25, e716 e721, doi: 10.1634/theoncologist.

нов Б. Р., Мустафин И. Г., и др. (2014) 3 Гидрокси 1,5

2019 0528.

диарил 4 пивалоил 2,5 дигидро 2 пирролоны нару

13.

Amoroso, L., Castel, V., Bisogno, G., Casanova, M.,

шают процессы митоза и индуцируют гибель опухоле

Marquez Vega, C., et al. (2020) Phase II results from a

вых клеток in vitro, Цитология, 56, 439 442.

phase I/II study to assess the safety and efficacy of weekly

26.

Зыкова C. C., Одегова Т. Ф., Бойчук С. В. Галембикова

nab paclitaxel in paediatric patients with recurrent or

А. Р. (2014) Синтез и фармако токсикологические ха

refractory solid tumours: A collaboration with the

рактеристики 3 замещенных 3 гидрокси 6 фенил 3,4

European Innovative Therapies for Children with Cancer

дигидро 2Н 1,3 оксазинов, Хим. Фарм. Журн., 11, 10 14.

Network, Eur. J. Cancer, 135, 8997, doi: 10.1016/

27.

Бойчук С. В., Галембикова А. Р., Зыкова С. С., Хуснут

j.ejca.2020.04.031.

динов Р. Р. (2015) Нарушения регуляции клеточного

14.

Breithaupt, H., and Küenzlen, E. (1983) High dose

цикла и репарации повреждений ДНК в опухолевых

methotrexate for osteosarcoma: toxicity and clinical

клетках под действием замещенного этилового эфира

results, Oncology, 40, 85 89.

2 амино 1Н пиррол 3 карбоновой кислоты, Совр.

15.

Wiseman, L. R., and Spencer, C. M. (1998) Paclitaxel. An

Пробл. Науки Образ., 5, 116.

update of its use in the treatment of metastatic breast can

28.

Зыкова С. С., Галембикова А. Р., Рамазанов Б. Р., Оде

cer and ovarian and other gynaecological cancers, Drugs

гова Т. Ф., Игидов Н. М., и др. (2015) Цитотоксичес

Aging, 12, 305 334, doi: 10.2165/00002512 199812040

кая активность этиловых эфиров 2 амино 1 бензоил

00005.

амино 4 оксо 5 (2 оксо 2 арилэтилиден) 4,5 дигид

16.

Goa, K. L., and Faulds, D. (1994) Vinorelbine. A review of

ро 1Н пиррол 3 карбоновых кислот, Хим. Фарм.

its pharmacological properties and clinical use in cancer

Журн., 12, 19 23.

chemotherapy, Drugs Aging, 5, 200 234, doi: 10.2165/

29.

Boichuk, S., Galembikova, A., Zykova, S., Ramazanov, B.,

00002512 199405030 00006.

Khusnutdinov, R., et al. (2016) Ethyl 2 amino pyrrole 3

17.

Qin, S. Y., Cheng, Y. J., Lei, Q., Zhang, A. Q., and Zhang,

carboxylates are novel potent anticancer agents that affect

X. Z. (2018) Combinational strategy for high performance

tubulin polymerization, induce G2/M cell cycle arrest,

cancer chemotherapy, Biomaterials,

171,

178197,

and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro,

doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.04.027.

AntiCancer Drugs,

27,

620634, doi:

10.1097/CAD.

18.

Partridge, A. H., Burstein, H. J., and Winer, E. P. (2001)

0000000000000372.

Side effects of chemotherapy and combined chemohor

30.

Зыкова С. С., Игидов Н. М., Киселев М. А., Бойчук

monal therapy in women with early stage breast cancer,

С. В., Галембикова А. Р., и др. (2016) Эксперименталь

J. Natl. Cancer Inst. Monogr., 30, 135 142, doi: 10.1093/

ное обоснование создания противоопухолевых

oxfordjournals.jncimonographs.a003451.

средств на основе пирролсодержащих гетероциклов,

19.

LeBaron, S., Zeltzer, L. K., LeBaron, C., Scott, S. E.,

Журн. Науч. Статей «Здоровье и образование в XXI ве-

Zeltzer, P. M., et al. (1988) Chemotherapy side effects in

ке», 7, 121 127.

pediatric oncology patients: drugs, age, and sex as risk fac

31.

Галембикова А. Р., Бойчук С. В., Зыкова С. С., Хуснут

tors, Med. Pediatr. Oncol., 16, 263 268, doi: 10.1002/mpo.

динов Р. Р., Дунаев П. Д. (2017) Пивалоил замещен

2950160408.

ные 2 пирролоны индуцируют гибель гастроинтести

20.

Albain, K. S., Nag, S. M., Calderillo Ruiz, G., Jordaan, J.

нальных стромальных опухолей, резистентных к има

P., Llombart, A. C., et al. (2008) Gemcitabine plus

тинибу и химиопрепаратам, Вопр. Онкол., 1, 135 140.

Paclitaxel versus Paclitaxel monotherapy in patients with

32.

Галембикова А. Р., Бойчук С. В., Дунаев П. Д., Хуснут

metastatic breast cancer and prior anthracycline treatment,

динов Р. Р., Зыкова С. С. (2018) Влияние пивалоил за

J. Clin. Oncol., 26, 3950 3957, doi: 10.1200/JCO.2007.11.

мещённых пиррол содержащих гетероциклических

9362.

соединений на механизмы репарации повреждений

21.

Mokhtari, R. B., Kumar, S., Islam, S. S., Yazdanpanah,

ДНК клеток саркомы Юинга, Казан. Мед. Журн., 2,

M., Adeli, K., et al. (2013) Combination of carbonic anhy

245 248, doi: 10.17816/KMJ2018 245.

drase inhibitor, acetazolamide, and sulforaphane, reduces

33.

Зыкова С. С., Игидов Н. М., Захматов А. В., Kиселев

the viability and growth of bronchial carcinoid cell lines,

М. А., Галембикова А. Р., и др. (2018) Синтез и биоло

BMC Cancer, 13, 378, doi: 10.1186/1471 2407 13 378.

гическая активность 2 амино 1 арил 5 (3,3 диметил

22.

Juergens, C., Weston, C., Lewis, I., Whelan, J.,

2 оксобутилиден) 4 оксо N (тиазол 5 ил) 4,5 ди

Paulussen, M., et al. (2006) Safety assessment of intensive

гидро 1Н пиррол 3 карбоксамидов, Хим. Фарм.

induction with vincristine, ifosfamide, doxorubicin, and

Журн., 3, 10 16.

etoposide (VIDE) in the treatment of Ewing tumors in the

34.

Boichuk, S., Galembikova, A., Dunaev, P., Micheeva, E.,

EURO E.W.I.N.G. 99 clinical trial, Pediatr. Blood Cancer,

Novikova, M., et al. (2019) Ethyl amino pyrrole 3 car

47, 22 29.

boxylates are active against imatinib resistant gastrointesti

23.

Paulussen, M., Craft, A. W., Lewis, I., Hackshaw, A.,

nal stromal tumors in vitro, AntiCancer Drugs, 30, 475 484,

Douglas, C., et al.

(2008) European Intergroup

doi: 10.1097/CAD.0000000000000753.

Cooperative Ewing’s Sarcoma Study 92. Results of the

35.

Boichuk, S., Galembikova, A., Syuzov, K., Dunaev, P.,

EICESS 92 Study: two randomized trials of Ewing’s sarco

Bikinieva, F., et al. (2021) The design, synthesis, and bio

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022

МЕХАНИЗМЫ СЕНСИТИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ

549

logical activities of pyrrole based carboxamides: the novel

proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 1571 1576,

tubulin inhibitors targeting the colchicine binding site,

doi: 10.1073/pnas.1416418112.

Molecules, 26, 5780, doi: 10.3390/molecules26195780.

37. Markowitz, D., Ha, G., Ruggieri, R., and Symons, M.

36. Poruchynsky, M. S., Komlodi Pasztor, E., Trostel, S.,

(2017) Microtubule targeting agents can sensitize cancer

Wilkerson, J., Regairaz, M., et al. (2015) Microtubule tar

cells to ionizing radiation by an interphase based mecha

geting agents augment the toxicity of DNA damaging

nism, Onco Targets Ther., 10, 5633 5642, doi: 10.2147/

agents by disrupting intracellular trafficking of DNA repair

OTT.S143096.

2 APC ATTENUATES HOMOLOGY MEDIATED DNA REPAIR

AND SENSITIZES CANCER CELLS TO DOXORUBICIN

S. V. Boichuk^1,2*, F. F. Bikinieva¹, I. G. Mustafin¹,

S. S. Zykova³, S. A. Ryzkin², and A. R. Galembikova¹

¹ Kazan State Medical University, 420012 Kazan, Russia; E-mail: boichuksergei@mail.ru

² Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, 125993 Moscow, Russia

³ Perm State Academy of Pharmacy, 614990 Perm, Russia

Besides high efficiency of the chemotherapeutic agents in cancer therapy, rapid development of tumor resistance and

systemic adverse effects are considered as the major negative prognostic factors, especially for the patients with

metastatic, unresectable and recurrent malignancies. Thus, identification of the novel molecular targets and develop

ment of the approaches to sensitize the tumors to the current chemotherapeutic regimens are important. The study

was aimed to determine the ability of the pyrrole based heterocyclic compound 2 APC that was synthesized in our

lab, to synthesize cancer cells to the chemotherapeutic agent doxorubicin, a well known topoisomerase II inhibitor.

The experiments were performed on tumor cell lines, cultured with 2 APC, doxorubicin and paclitaxel. Expression

of DNA repair proteins and markers of apoptosis was examined by western blotting. Protein protein interactions were

examined by co immunoprecipitation. Synergism between the chemotherapeutic agents was assessed by using the

computer program Synergy Finder. Results. Doxorubicin (Dox) exhibited the moderate cytotoxic activities against

tumor cells in vitro, whereas combination of Dox and 2 APC significantly potentiated cytotoxic activity of Dox and

induced apoptosis of cancer cells. This was due to 2 APC’s ability to impair DNA damage repair mechanisms in can

cer cells, which was evidenced by decreased expression of Rad51 recombinase as an outcome of its proteasome based

degradation. Besides 2 APC, similar activity was observed for paclitaxel, a well known tubulin binding agent.

Chemotherapeutic agents and chemical compounds interfering with the microtubules dynamic state might potenti

ate cytotoxic activity of DNA damaging chemotherapeutic agents in cancer cells due to the impairment of DNA

repair mechanisms.

Keywords: pyrrole based heterocycles compounds, tubulin polymerization, paclitaxel, doxorubicin, sensitization,

apoptosis

БИОХИМИЯ том 87 вып. 4 2022