БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 5, с. 617 - 626

УДК 577.21

РАЦИОНАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО

ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО

ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МУТАЦИЙ

ПРИ ГЕНОМНОМ РЕДАКТИРОВАНИИ

О.В. Володина¹, А.А. Анучина¹, М.И. Зайнитдинова¹,

Н.А. Евтушенко², А.В. Лавров¹, С.А. Смирнихина¹*

¹ Медико генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова,

115522 Москва, Россия; электронная почта: smirnikhinas@gmail.com

² Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Российского

национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова, 117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 03.12.2021

После доработки 19.04.2022

Принята к публикации 19.04.2022

Геномное редактирование позволяет целенаправленно вносить разнообразные изменения в геном, что по

тенциально может быть использовано для лечения наследственных заболеваний человека. Несмотря на

многочисленные исследования в этой области, эффективность методов коррекции мутаций все еще остает

ся невысокой, что не позволяет использовать данные методы в рутинной практике. Показано, что рацио

нальный дизайн компонентов геномного редактирования может существенно повысить эффективность

исправления мутаций. В данной работе мы предлагаем дизайн одноцепочечных олигодезоксирибонуклео

тидов (оцОДН) для более эффективного редактирования генов. С использованием модельной системы с

восстановлением нокаутированного EGFP, интегрированного в геном клеточной культуры HEK293T, пока

зано, что лишь небольшая часть оцОДН (около 20 нуклеотидов - с 14 го нуклеотида с 5′ конца от двухце

почечного разрыва до 4 го нуклеотида в сторону 3′ конца), используемой в качестве донорной молекулы

для репарации двухцепочечного разрыва ДНК, интегрирует в место разрыва. На основе полученных данных

можно рационально подходить к дизайну оцОДН для исправления мутаций с помощью метода CRISPR

Cas9 для разработки генной терапии наследственных болезней человека.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: CRISPR Cas9, репарация с помощью однонитевой матрицы, одноцепочечные

олигодезоксирибонуклеотиды, EGFP, проточная цитофлуориметрия.

DOI: 10.31857/S0320972522050037, EDN: ASTYLE

ВВЕДЕНИЕ

наследственных заболеваний человека [1]. Эф

фективность коррекции мутаций при моноген

Одним из инструментов генной терапии яв

ных заболеваниях, несмотря на все прилагаемые

ляется геномное редактирование, которое поз

усилия, зачастую невысокая, что препятствует

воляет целенаправленно вносить изменения в

быстрому внедрению новых методов лечения на

геном: корректировать мутации, нокаутировать

основе геномного редактирования в клиничес

аллели, влиять на экспрессию генов, что потен

кую практику [2, 3]. Рациональный дизайн ком

циально может быть использовано для лечения

понентов геномного редактирования позволяет

существенно повысить эффективность коррек

Принятые сокращения: ДЦР - двухцепочечный

ции мутаций [4]. В данной работе мы предлага

разрыв; НГСК - негомологичное соединение концов; ем рациональный дизайн коротких одноцепо

НГР

- направленная гомологичная репарация;

чечных олигодезоксирибонуклеотидов для бо

оцОДН - одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид;

РОНМ - репарация с помощью однонитевой матрицы;

лее эффективного редактирования генов.

сгРНК - спейсер гидовой РНК, Cas - CRISPR ассоции

При лечении наследственных заболеваний с

рованный белок; CRISPR - система, основанная на корот

помощью геномного редактирования можно

ких палиндромных повторах, регулярно расположенных корректировать мутации, то есть вносить целе

группами; PAM - последовательность прилежащего к про

направленные изменения в последовательность

тоспейсеру мотива (protospacer adjacent motif);

TALENs - эффекторные нуклеазы, подобные активаторам

ДНК. При этом в молекуле ДНК сначала созда

транскрипции; ZNFs - нуклеазы цинковых пальцев.

ется двухцепочечный разрыв (ДЦР) с помощью

* Адресат для корреспонденции.

современных программируемых нуклеаз [5] -

617

618

ВОЛОДИНА и др.

нуклеаз цинковых пальцев (ZNFs) [6], эффек

разрыва укорачиваются 5′ концы, а одноцепо

торных нуклеаз, подобных активаторам тран

чечные 3′ концы участвуют в отжиге с экзоген

скрипции (TALENs) [7], или системы, основан

ным донором [11]. MRX связывается с молеку

ной на коротких палиндромных повторах, регу

лой ДНК и инициирует укорочение концов, бе

лярно расположенных группами (CRISPR) и

лок RAD52 позволяет экзогенному донору от

CRISPR ассоциированных белках (Cas) [8] - а

жигаться с доступными концами геномной

затем клетка с помощью собственных механиз

ДНК. RAD59 и Srs2 предотвращают взаимодей

мов репарации исправляет ДЦР.

ствие концов ДНК с RAD51 и останавливают

Есть несколько путей репарации ДНК в

отжиг, инициированный RAD52. Копирование

клетке после искусственного введения ДЦР. Их

последовательности одноцепочечного донора

можно разделить на RAD51 зависимые и

осуществляется предположительно ДНК поли

RAD51 независимые. К RAD51 зависимым пу

меразой δ, затем происходит отжиг на противо

тям репарации относятся генные конверсии -

положной стороне ДЦР. Несовпадения на

механизмы, основанные на рекомбинации с до

5′ конце создают облигатный гетеродуплекс,

норной молекулой. Они имеют низкую эффек

который затем исправляется системой репара

тивность и зависят от фазы клеточного цикла,

ции неспаренных оснований. Бреши, оставшие

однако обладают высокой точностью. Исполь

ся после РОНМ, заполняются полимера

зование донорной молекулы позволяет в конеч

зой ζ [12].

ном итоге изменить последовательность по же

Для оптимизации метода коррекции мута

ланию исследователя. Генные конверсии с ис

ций и повышения эффективности этого процес

пользованием двухцепочечной матрицы прохо

са необходимо понимание фундаментальных

дят по каноничному пути, при котором

основ репарации, которые в перспективе приве

RAD51 образует филаменты на 3′ концах нитей

дут к использованию наилучшей по своему

ДНК мишени, чтобы обеспечить инвазию до

строению донорной молекулы. На данный мо

норного дуплекса. При этом также необходимо

мент при геномном редактировании используют

наличие факторов, которые обеспечивают взаи

оцОДН, длинные одноцепочечные ДНК

модействие RAD51 с ДНК, включая BRCA2,

(lssDNA) [13, 14] и двухцепочечные донорные

PALB2 и DSS1. Эффективность генных конвер

молекулы - плазмиды и продукты амплифика

сий с использованием двухцепочечной матрицы

ции [15, 16].

снижается при истощении или инактивации

ОцОДН - небольшие одноцепочечные мо

этих факторов [9].

лекулы длиной до 200 нуклеотидов (нт), кото

К RAD51 независимым путям относятся не

рые состоят из последовательности для вставки

гомологичное соединение концов (НГСК,

и двух плеч гомологии. Длина плеча гомологии

NHEJ), отжиг одиночной цепи (SSA), репара

может варьировать от 30 до 60 нт [17]. ОцОДН в

ция с помощью однонитевой матрицы (РОНМ,

основном используются для исправления точеч

SSTR) и некоторые виды индуцируемой разры

ных мутаций [18]. Репарация двухцепочечного

вом репликации (BIR), механизм которых еще

разрыва с использованием матриц оцОДН мо

изучается. НГСК сопряжено с резекцией и ли

жет проходить по пути РОНМ. В этом случае ре

гированием концов ДНК. Этот механизм репа

парация не зависит от RAD51, но зависит от

рации приводит к возникновению множества

RAD52, RAD59, Srs2 и комплекса Mre11 Rad50

коротких инсерций и делеций, что ведет к сдви

Xrs2 (MRX) [19].

гу рамки считывания, в связи с этим этот путь

Проведенные ранее исследования [19, 20]

репарации используют для нокаутирования ге

показывают, что используемый для репарации

нов. НГСК не зависит от наличия донорной мо

двухцепочечных разрывов ДНК оцОДН не пол

лекулы и фазы клеточного цикла, поэтому явля

ностью встраивается в место разрыва. Концевые

ется доминирующим в эукариотической клетке

нуклеотиды оцОДН участвуют только в созда

[10]. При SSA разрыв фланкируется гомологич

нии гомологии с ДНК, тогда как центральная

ными последовательностями ДНК, что приво

часть - встраивается. Точные длины фрагмен

дит к делеции промежуточной последователь

тов оцОДН, участвующих в создании гомологии

ности.

и встраивании, были неизвестны. В результате

Еще один независимый от RAD51 путь репа

данного исследования было точно определено,

рации - РОНМ; он активируется при наличии

какая часть оцОДН участвует в создании гомо

одноцепочечной донорной молекулы ДНК, в

логии с целевой последовательностью ДНК, а

том числе в процессе редактирования генома с

какая - встраивается. Полученные результаты

использованием одноцепочечных олигодезок

позволят более эффективно подбирать оцОДН

сирибонуклеотидов (оцОДН, ssODN). В ходе

для дальнейшего развития подходов к лечению

РОНМ сразу после внедрения двухцепочечного

наследственных моногенных заболеваний.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

ДИЗАЙН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА

619

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

становления правильной последовательности

EGFP, содержащих синонимичные замены в

Плазмидные конструкции и олигонуклеотиды.

разных положениях. Спейсер гидовой РНК был

В работе были использованы следующие плазми

подобран таким образом, что имел гомологию

ды: pLVT_turboRFP635 eGFPmut, pCMV dR8.91,

(отжигался) со смысловой цепью ДНК,

pMD2.G и Cas9(1.1) sgGFP#2. Плазмида

оцОДН - с антисмысловой.

pLVT_turboRFP635 eGFPmut была получена пу

Клеточная культура. Клеточная культура

тем амплификации гена EGFP с мутацией

HEK293T GFPmut была получена в Центре вы

с.337delG, приводящей к сдвигу рамки считыва

сокоточного редактирования и генетических

ния с образованием стоп кодона, с плазмиды

технологий для биомедицины Российского на

pEGFP mut и клонирования в плазмиду

ционального исследовательского медицинского

pLVT_turboRFP635. Последовательность гена

университета имени Н.И. Пирогова путем лен

EGFP доступна по ссылке: https://www.addgene.org/

тивирусной трансдукции. Для получения ленти

browse/sequence_vdb/2487/. Мутация c.337delG

вирусных частиц использовалась стандартная

обозначает делецию нуклеотида G в 337 м поло

методика липофекции упаковочной линии кле

жении от начала открытой рамки считывания.

ток HEK293T. Клетки накануне высаживали в

Плазмида pLVT_turboRFP635 была получена на

количестве, достигающем 70% монослоя (60 мм

основе плазмиды pRRL.SIN.EF1.WPRE (в лабо

чашка). Для котрансфекции использовали смесь

ратории Didier Trono), в которую были внесены

из трех плазмид pCMV dR8.91 (2 мкг), pMD2.G

изменения в последовательность полилинкера с

(0,6 мкг) и pLVT_turboRFP635 eGFPmut (2 мкг),

введением сайтов для эндонуклеаз рестрикции

инкубировали в среде Opti MEM («Thermo

AgeI и SalI [21]. Карта плазмиды доступна в

Fisher Scientific», США) с Lipofectamine 2000

статье Серебровской с соавт. [21]. В дальнейшем

(«Thermo Fisher Scientific»). Через 6 ч после

в плазмиду были клонированы фрагменты

трансфекции указанных выше плазмид прово

TurboRFP T2A (по сайтам рестрикции BamHI и

дили замену среды на DMEM и накапливали

NheI) и EGFPmut (по сайтам рестрикции Nhe и

вирусные частицы в течение 48 ч. Ростовая сре

SalI). Таким образом, была получена плазмида

да с вирусными частицами была пропущена че

pLVT_turboRFP635 eGFPmut, верификацию

рез 0,45 мкм фильтр и использована для зараже

которой проводили секвенированием по Сэнге

ния клеток HEK293T. Для определения титра

ру. Упаковочные плазмиды pCMV dR8.91 и

вируса следовали протоколу «Евроген» (Россия,

pMD2.G были любезно предоставлены Didier

https://evrogen.ru/kit user manuals/Lenti_LP002.pdf).

Trono (https://www.epfl.ch/labs/tronolab/). Карты

Использовали 10 мкл вирусных частиц с титром

плазмид доступны по ссылкам: https://www.

0,5 × 10⁵ трансдуцирующих единиц/мл на 10⁴ кле

addgene.org/vector database/2221/ (pCMV dR8.91)

ток. После заражения клетки подращивали в

и https://www.addgene.org/12259/ (pMD2.G).

среде DMEM до состояния конфлуэнтности и

Подбор спейсера гидовой РНК (сгРНК) про

сортировали их по наличию флуоресценции

водили с помощью программного обеспечения с

turboRFP635. С целью коррекции мутации

открытым доступом Benchling (https://www.

c.337delG в гене EGFP проводили котрансфек

benchling.com/) на ген EGFP с мутацией с.337delG.

цию 7,4 мкг плазмиды Cas9(1.1) sgGFP#2 и

Последовательность сгРНК (TGTCGCCCTC

100

пмоль оцОДН на

200

тысяч клеток

GAACTTCACT) была синтезирована в виде двух

HEK293T GFPmut с помощью Lipofectamine

частично комплементарных олигонуклеотидов с

2000 по протоколу производителя.

липкими концами для клонирования в плазми

Сортировка клеток. Для получения клеточ

ду: sgGFP_2.f (5′ caccTGTCGCCCTCGAACTT

ной культуры HEK293T GFPmut после ленти

CACT 3′) и sgGFP_2.r (5′ aaacAGTGAAGTT

вирусной трансдукции при достижении клетка

CGAGGGCGACA 3′). Спейсер гидовой РНК

ми состояния конфлуэнтности проводили сор

клонировали в исходную плазмиду eSpCas9(1.1)

тировку клеток по наличию флуоресценции

(любезно предоставлена Feng Zhang; Addgene

turboRFP635 с помощью клеточного сортера S3

plasmid

#71814; http://n2t.net/addgene:71814;

Cell Sorter («BioRad», США) с фильтром эмис

RRID:Addgene_71814), которая содержит мутант

сии 615 ± 25 нм. Через 72 ч после трансфекции

ную форму SpCas9, по сайтам рестрикции для

Cas9(1.1) sgGFP#2 и оцОДН клетки культуры

BbsI. Верификацию полученной плазмиды

HEK293T GFPmut снимали с планшета. Коли

Cas9(1.1) sgGFP#2 проводили путем секвени

чество GFP положительных клеток (с успеш

рования по Сэнгеру и рестрикционным анали

ным редактированием) оценивали с помощью

зом.

того же клеточного сортера во время сортировки

С помощью той же программы Benchling бы

GFP положительных клеток (длина волны

ли подобраны четыре варианта оцОДН для вос

488 нм, фильтр эмиссии 525 ± 30 нм) для обога

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

620

ВОЛОДИНА и др.

Таблица 1. Протокол амплификации

тельно было валидировано с помощью програм

мы DECODR (https://decodr.org).

Первичная денатурация

95 °С

5 минут

Статистическая обработка. Для статистичес

кой обработки данных использовали критерий

Амплификация (37 циклов)

95 °С

30 секунд

61 °С

30 секунд

Манна-Уитни. Статистическую обработку про

72 °С

50 секунд

водили в программе STATISTICA, версия 10.0

(«StatSoft», США). Различие считали значимым

Финальная элонгация

72 °С

5 минут

при p < 0,05.

щения популяции клеток с успешным восста

РЕЗУЛЬТАТЫ

новлением правильной последовательности

EGFP. Оценку проводили в двух технических

Эффективность восстановления EGFP в ли?

повторностях.

нии клеток. На подготовительном этапе работы

Оценка эффективности редактирования. ДНК

была разработана модельная система для изуче

для амплификации и секвенирования фрагмен

ния параметров гомологичной репарации ДНК

та EGFP выделяли с помощью набора Quick

по матрице оцОДН. С помощью лентивирусной

gDNA Miniprep Kit («Zymo Research», США).

трансдукции была создана клеточная линия

Амплификацию проводили по протоколу,

HEK293T GFPmut с интегрированным геном

представленному в табл. 1. Последовательность

EGFPmut. Ген зеленого флуоресцентного белка,

праймеров: eGFP65_F - 5′ ACGTAAACGGC

EGFPmut, характеризуется однонуклеотидной

CACAAGTTCA 3′, eGFP527_R - 5′ CTGC

делецией с.337delG, приводящей к сдвигу рамки

CGTCCTCGATGTTGT 3′.

считывания с появлением преждевременного

После амплификации интересующего фраг

стоп кодона (рис. 1). При редактировании с по

мента EGFP образцы были секвенированы с

мощью CRISPR Cas9 и оцОДН происходит

обоих праймеров на приборе ABI Prism 3130XL

вставка нуклеотида G в положение с.337 и в

Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) по

клетках появляется флуоресценция eGFP.

протоколу производителя. Анализ хромато

Для оценки границ фрагментов оцОДН,

грамм проводили с помощью приложения

участвующих в создании плеч гомологии и не

Chromas и интернет ресурса Benchling для опре

посредственно репарации, были подобраны и

деления нуклеотидов, встроившихся во время

синтезированы оцОДН с синонимичными точ

репарации ДНК. Процентное соотношение ал

ковыми заменами через разные промежутки (с

лелей, восстановленных методом НГСК и

заменами каждые 9 и 15 нт, а также с заменами

РОНМ, оценивали с помощью программы

на концах) и без замен (табл. 2). Все оцОДН со

TIDER (http://shinyapps.datacurators.nl/tider/).

держали нуклеотид G, позволяющий восстанав

Оценку проводили в трех или четырех техничес

ливать корректную последовательность гена

ких повторностях. Наличие аллелей дополни

EGFP.

Таблица 2. Последовательности оцОДН, используемые в работе

Название

Последовательность, 5′ → 3′

ssODN_sgGFP_9nt

TTCTTCAAAGACGACGGTAACTACAAAACCCGCGCTGAGGTGAAGTTCGAGGGTGACACCCT

CGTGAACCGTATCGAGCTCAAGGGCATCGACTTCAAAGAGGACGGTAACATCCTGGGG

ssODN_sgGFP_15nt

TTCTTCAAGGACGATGGCAACTACAAGACGCGCGCCGAGGTGAAATTCGAGGGCGA

CACGCTGGTGAACCGCATAGAGCTGAAGGGCATAGACTTCAAGGAGGATGGCAACATC

CTGGGG

ssODN_sgGFP_es

TTCTTTAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC

CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATTCTGGGG

ssODN_sgGFP_wt

TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC

CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGG

Примечание. Нижним подчеркиванием полужирным выделен нуклеотид, восстанавливающий правильную последова

тельность гена EGFP. Полужирным черным отмечены синонимичные замены в последовательности оцОДН (ssODN).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

ДИЗАЙН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА

621

Рис. 1. Схема исправления мутации в гене EGFP. Мутация c.337delG приводит к сдвигу рамки считывания; после успеш

ного редактирования наблюдается вставка нуклеотида G и восстановление рамки считывания, что приводит к синтезу

нормального белка eGFP и появлению зеленой флуоресценции. Оценить результат редактирования можно с помощью

проточной цитофлуориметрии и на хроматограммах. СгРНК - спейсер гидовой РНК, оцОДН - одноцепочечный олиго

дезоксирибонуклеотид, ДЦР - двухцепочечный разрыв

Далее клетки трансфицировали плазмидой

горитму TIDER. Частота инделов (коротких

Cas9(1.1) sgGFP#2 с одним из подобранных

вставок и делеций нуклеотидов) в целевом локу

оцОДН. Восстановление нормальной последо

се колебалась от 10,5% до 14,6% и составила в

вательности EGFP было зарегистрировано при

среднем 11,6%. Этот показатель отражает точ

использовании всех четырех оцОДН. Эффек

ность редактирования целевого локуса в общем

тивность восстановления EGFP оценивали пу

и обычно обусловлен случайными потерями или

тем проточной цитофлуориметрии (оценивали

вставками нуклеотидов в области ДЦР. Частота

долю GFP положительных клеток). ОцОДН с

вставки нуклеотида G в положение с.337 (вос

синонимичными заменами каждые 9 или 15 нт

становление правильной последовательности

обладают меньшей гомологией, поэтому ожида

гена EGFP) в GFP положительных клетках варьи

емо продемонстрировали меньшую эффектив

ровала от 55,6% до 65,7% в зависимости от ис

ность, чем оцОДН с двумя заменами на концах

пользованного оцОДН (рис. 2, б). Таким обра

или вовсе без замен: 1,8-2,1% против ~6,7%

зом, несмотря на различия в эффективности ре

(рис. 2, а).

парации разными оцОДН, были получены отре

GFP положительные клетки были сортиро

дактированные клетки с восстановленным

ваны для обогащения клеточной популяции с

eGFP с применением всех четырех типов

успешно отредактированной мутацией. Эффек

оцОДН, что позволило перейти к основному

тивность редактирования целевого локуса оце

этапу оценки границ оцОДН, участвующих в

нили с помощью секвенирования по Сэнгеру с

формировании плеч гомологии, и участка, ис

последующей обработкой хроматограмм по ал

пользуемого в качестве матрицы для репарации.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

622

ВОЛОДИНА и др.

Рис. 2. Коррекция мутации с.337delG в гене EGFP. а - Процент GFP положительных клеток в образцах, отредактирован

ных с добавлением различных матриц оцОДН. б - Доля отредактированных (восстановленных) различными оцОДН ал

лелей в GFP положительных клетках. ssODN_sgGFP_es - образцы с концевыми заменами, ssODN_sgGFP_9nt - образ

цы с заменами каждые 9 нт, ssODN_sgGFP_15nt - образцы с заменами каждые 15 нт, ssODN_sgGFP_wt - образцы без за

мен. Планки погрешностей по оси Y указывают 95% ный доверительный интервал. Число n отражает количество техни

ческих повторностей

Длины фрагментов оцОДН, участвующих в

донорной последовательности, участвующей во

создании плеч гомологии и встраивании. Целью

вставке, анализировали только клетки, прошед

работы была оценка границ частей оцОДН,

шие сортировку по зеленой флуоресценции. В

участвующих в формировании плеч гомологии и

образцах с добавлением оцОДН с заменами на

используемых как матрица для репарации в экс

концах соответствующие замены в геноме опре

периментах CRISPR Cas9. Для анализа границ

делены не были, и хроматограммы не отлича

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

ДИЗАЙН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА

623

лись от контрольных образцов, отредактирован

пиков нуклеотидов, начиная со встроенного

ных оцОДН_sgGFP_wt без замен (данные не

нуклеотида G, что свидетельствует о том, что в

представлены).

образце присутствовало минимум два вида алле

При редактировании с помощью оцОДН с

лей - редактированный (содержащий дополни

заменами каждые 9 нт обнаружены замены нук

тельный G) и исходный (с мутацией). Полные

леотидов в 5 м и 14 м положениях от ДЦР в сто

хроматограммы, фрагменты которых изображе

рону 5′ конца оцОДН матрицы (рис. 3, а). Под

ны на рис. 3, представлены в Приложении

черкнём, что оцОДН были подобраны компле

(рис. S1 и S2). Также в Приложении приведены

ментарными к сгРНК; здесь и далее направле

таблицы с частотами аллелей EGFP после редак

ния указаны относительно матрицы оцОДН, ес

тирования разными оцОДН (рис. S3).

ли не указано иначе. После редактирования кле

Таким образом, результаты проведенной ра

ток с использованием оцОДН с заменами каж

боты свидетельствуют о том, что со стороны

дые 15 нт замена нуклеотидов произошла в 4 м

5′ конца от ДЦР были заменены -14 и -5 нуклео

положении в сторону 3′ конца (рис. 3, б). При

тиды, а со стороны 3′ конца от ДЦР - нуклео

этом на хроматограммах наблюдали наложение

тид в позиции +4 (рис. 4).

Рис. 3. Замены нуклеотидов в редактированном фрагменте EGFP. а - Хроматограмма образца после редактирования с по

мощью ssODN_sgGFP_9nt. Стрелками указаны замены нуклеотидов G на А и C на T. Красной стрелкой указано место

введения ДЦР. б - Хроматограмма образца после редактирования с помощью ssODN_sgGFP_15nt. Стрелкой указана за

мена нуклеотида G на А. Красной стрелкой указано место введения ДЦР. Красным выделена вставка нуклеотида G в по

зиции с.337. Наложение последовательностей, прочитанных с прямого праймера вправо от вставки G (панель а), и пос

ледовательностей, прочитанных с обратного праймера влево от вставки G (панель б), обусловлено тем, что не все аллели

EGFP в клеточной культуре подвергаются редактированию, что, однако, не затрудняет чтение синонимичных замен до

вставки с соответствующего праймера. Ref - исходная последовательность, mod - измененная в результате геномного ре

дактирования последовательность

Рис. 4. Расположение заменяемых нуклеотидов при редактировании мутации с.337delG в гене EGFP с помощью оцОДН.

Голубым указан фрагмент оцОДН, зеленым - последовательность сгРНК, рамкой выделен прилежащий к протоспейсеру

мотив (PAM). Красным полужирным в последовательности оцОДН выделены нуклеотиды, встроенные в последователь

ность ДНК, полужирным черным - не встроенные. Цифрами указаны анализируемые нуклеотиды от ДЦР

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

624

ВОЛОДИНА и др.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

концом на месте разрыва геномной ДНК, а

5′ плечо не способно на отжиг с выступающим

ОцОДН широко используют в качестве мат

концом. Также возможно влияние активности

риц для репарации при CRISPR Cas9 опосредо

ДНК полимеразы Polδ(3′ 5′), которая может

ванном редактировании. Однако до сих пор нет

устранить несовпадения нуклеотидов близко к

единого мнения насчёт оптимальной длины оли

3′ концу матрицы [19]. В нашей работе мы так

гонуклеотидов, их расположения относительно

же можем отметить, что процент успешно ре

места разрыва и величины плеч гомологии и, со

дактированных клеток имел тенденцию к увели

ответственно, размеров внутренней части, слу

чению в тех образцах, где были использованы

жащей непосредственно матрицей для восста

оцОДН с меньшим количеством замен

новления. В данном исследовании мы примени

(рис. 2, а). Вероятнее всего, это обусловлено

ли оцОДН длиной 120 нт с асимметричным рас

тем, что плечи гомологии не являются строго

положением вокруг места разреза ДНК - 5′ ко

комплементарными геномной ДНК, из за чего

нец длиной в 41 нт и 3′ конец - 79 нт. Для опре

эффективность геномного редактирования пос

деления размеров и границ области, являющейся

ле инициации ДЦР могла заметно снизиться.

матрицей для гомологичной репарации, были

Перекрывающиеся пики на хроматограммах,

использованы оцОДН с синонимичными заме

полученных в данной работе, обусловлены сек

нами каждые 9 и каждые 15 нт. Такие оцОДН поз

венированием смеси аллелей, часть из которых

волили определить, что для репарации использу

редактировалась, а часть - нет. Современные

ется небольшой фрагмент длиной около 20 нт (от

методы анализа хроматограмм, один из кото

положения -15 с 5′ конца от ДЦР до положения

рых - TIDER [22] - использованный нами, поз

+4 в сторону 3′ конца от ДЦР). Таким образом, с

воляют разложить сложную хроматограмму на

помощью оцОДН можно скорректировать пос

составляющие. Этот метод широко используется

ледовательность в 20 нт, асимметрично располо

в подобных работах [23, 24], т.к. он позволяет по

женных вокруг точки разрыва ДНК. Данное утве

лучать точные и воспроизводимые данные по ре

рждение справедливо для оцОДН, подобранных

зультатам анализа сложных хроматограмм.

комплементарными сгРНК, т.е. являющимися

Таким образом, в результате работы были

идентичными той цепи ДНК, на которую отжи

четко установлены длины фрагментов оцОДН,

гается сгРНК (рис. 4), что важно учитывать при

участвующие в создании гомологии и интегра

дизайне соответствующих экспериментов.

ции в локус ДЦР. На основе этих данных можно

Попытки изучить детально, какая часть

рационально подходить к дизайну оцОДН для

оцОДН интегрируется в место двухцепочечного

коррекции мутаций с целью разработки генной

разрыва предпринимались ранее [19, 20]. В ра

терапии наследственных болезней человека на

боте Gallagher et al. [17] анализировали только

основе метода CRISPR Cas9.

область из восьми нуклеотидов вокруг разрыва

(по четыре с каждой стороны), а в работе

Финансирование. Работа выполнена в рамках

Harmsen et al. [19] изучали влияние факторов ре

государственного задания Министерства науки

парации неспаренных оснований на эффектив

и высшего образования Российской Федерации

ность редактирования с помощью оцОДН. Та

для ФГБНУ «МГНЦ». Создание клеточной

ким образом, насколько нам известно, наша ра

культуры HEK293T GFPmut выполнено за счет

бота является единственной направленной

средств гранта РФФИ № 19 29 04044.

именно на определение длин фрагментов

Благодарности. Коллектив выражает благо

оцОДН, интегрируемых в локусы ДЦР.

дарность к.б.н. Н.Г. Гурской из Центра высоко

В целом, полученные нами данные о длинах

точного редактирования и генетических техно

фрагментов оцОДН, участвующих в создании

логий для биомедицины Российского нацио

гомологии и встраивании, хорошо коррелируют

нального исследовательского медицинского

с процитированными выше работами [19, 20].

университета имени Н.И. Пирогова (Москва) за

Со стороны 5′ плеча оцОДН встроилось больше

помощь в получении клеточной культуры

нуклеотидов, чем со стороны 3′ плеча. По дан

HEK293T GFPmut.

ным исследования системы репарации не

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

спаренных оснований эффективность вставки

сутствии конфликта интересов.

на расстоянии более 9 нт от разрыва сильно за

Соблюдение этических норм. Настоящая статья

висит от того, на какой стороне была замена. За

не содержит описания каких либо исследований с

мена со стороны 5′ плеча происходила в 6-10%

участием людей или животных в качестве объектов.

случаев, со стороны 3′ плеча - не происходила

Дополнительные материалы. Приложение к

совсем [20]. Предположительно, причина в том,

статье опубликовано на сайте журнала «Биохи

что 3′ плечо может отжигаться с выступающим

мия» (https://biochemistrymoscow.com).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

ДИЗАЙН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА

625

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Fellmann, C., Gowen, B. G., and Lin, P. C. (2017) Corner

restores FVIII function in hemophilia A patient derived

stones of CRISPR Cas in drug discovery and therapy, Nat

iPSCs and ECs, Mol. Ther. Nucleic Acids, 17, 198 209,

Rev Drug Discov., 16, 89 100, doi: 10.1038/nrd. 2016.238.

doi: 10.1016/j.omtn.2019.05.019.

Peters Hall, J. R., Coquelin, M. L., Torres, M. J.,

14.

Bennett, H., Aguilar Martinez, E., and Adamson, A. D.

LaRanger, R., Alabi, B. R., et al. (2018) Long term culture

(2021) CRISPR mediated knock in in the mouse embryo

and cloning of primary human bronchial basal cells that

using long single stranded DNA donors synthesised by

maintain multipotent differentiation capacity and CFTR

biotinylated PCR, Methods, 191, 3 14, doi: 10.1016/

channel function, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.,

j.ymeth.2020.10.012.

315, L313 L327, doi: 10.1152/ajplung.00355.2017.

15.

Cristea, S., Freyvert, Y., and Santiago, Y. (2013) In vivo

Smirnikhina, S. A., Kondrateva, E. V., Adilgereeva, E. P.,

cleavage of transgene donors promotes nuclease mediated

Anuchina, A. A., Zaynitdinova, M. I., et al.

(2020)

targeted integration, Biotechnol. Bioeng., 110, 871 880,

P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients, PLoS

doi: 10.1002/bit.24733.

One, 15, e0242094, doi: 10.1371/journal.pone.0242094.

16.

Fueller, J., Herbst, K., Meurer, M., Gubicza, K.,

Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L.,

Kurtulmus, B., et al. (2020) CRISPR Cas12a assisted PCR

and Corn, J. E. (2016) Enhancing homology directed

tagging of mammalian genes, J. Cell Biol., 219, e201910210,

genome editing by catalytically active and inactive

doi: 10.1083/jcb.201910210.

CRISPR Cas9 using asymmetric donor DNA, Nat.

17.

Bai, H., Liu, L., An, K., Lu, X., Harrison, M., et al. (2020)

Biotechnol., 34, 339 344, doi: 10.1038/nbt.3481.

CRISPR/Cas9 mediated precise genome modification by a

Guha, T. K., Wai, A., and Hausner, G. (2017) Program

long ssDNA template in zebrafish, BMC Genomics, 21, 67,

mable genome editing tools and their regulation for efficient

doi: 10.1186/s12864 020 6493 4.

genome engineering, Comput. Struct. Biotechnol. J., 15, 146

18.

Lim, D., Sreekanth, V., Cox, K. J., Law, B. K., Wagner,

160, doi: 10.1016/j.csbj.2016.12.006.

B. K., et al. (2020) Engineering designer beta cells with a

Durai, S., Mani, M., Kandavelou, K., Wu, J.,

CRISPR Cas9 conjugation platform, Nat. Commun., 11,

Porteus, W. H., and Chandrasegaran, S. (2005) Zinc finger

4043, doi: 10.1038/s41467 020 17725 0.

nucleases: Custom designed molecular scissors for genome

19.

Harmsen, T., Klaasen, S., van de Vrugt, H., Riele, H. T.

engineering of plant and mammalian cells, Nucleic Acids

(2018) DNA mismatch repair and oligonucleotide end pro

Res., 33, 5978 5990, doi: 10.1093/nar/gki912.

tection promote base pair substitution distal from a

Cermak, T., Doyle, E. L., Christian, M., Wang, Li,

CRISPR/Cas9 induced DNA break, Nucleic Acids Res., 46,

Zhang, Y., et al. (2011) Efficient design and assembly of

2945 2955, doi: 10.1093/nar/gky076.

custom TALEN and other TAL effector based constructs

20.

Galagher, D. N., Pham, N., Tsai, A. M., Janto, N. V.,

for DNA targeting, Nucleic Acids Res.,

39, e82,

Choi, J., et al. (2020) A Rad51 independent pathway

doi: 10.1093/nar/gkr218.

promotes single strand template repair in gene editing,

Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna,

PLoS Genet., 16, e1008689, doi: 10.1371/journal.pgen.

J. A., et al. (2012) A programmable dual RNA guided

1008689.

DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science,

21.

Serebrovskaya, E. O., Podvalnaya, N. M., Dudenkova,

337, 816 821, doi: 10.1126/science.1225829.

V. V., Efremova, A. S., Gurskaya, N. G., et al. (2020)

Liu, M., Rehman, S., Tang, X., Gu, K., Fan, Q., et al.

Genetically encoded fluorescent sensor for poly ADP

(2019) Methodologies for improving HDR Efficiency,

ribose, Int. J. Mol. Sci.,

21,

5004, doi:

10.3390/

Front. Genet., 9, doi: 10.3389/fgene.2018.00691.

ijms21145004.

10.

Seol, J. H., Shim, E. Y., and Lee, S. E. (2018) Microho

22.

Brinkman, E. K., Kousholt, A. N., Harmsen, T.,

mology mediated end joining: Good, bad and ugly, Mutat.

Leemans, C., Chen, T., et al. (2018) Easy quantification of

Res., 809, 81 87, doi: 10.1016/j.mrfmmm.2017.07.002.

template directed CRISPR/Cas9 editing, Nucleic Acids

11.

Davis, L., Zhang, Y., Maizels, N. (2018) Assaying repair at

Res., 46, e58, doi: 10.1093/nar/gky164.

DNA nicks, Methods Enzymol., 601, 71 89, doi: 10.1016/

23.

Etard, C., Joshi, S., and Stegmaier, J., (2017) Tracking of

bs.mie.2017.12.001.

indels by DEcomposition is a Simple and effective method

12.

Gallagher, D. N., and Haber, J. E. (2021) Single strand

to assess efficiency of guide RNAs in zebrafish, Zebrafish,

template repair: Key insights to increase the efficiency of

14, 586 588, doi: 10.1089/zeb.2017.1454.

gene editing, Curr. Genet., 67, 747 753, doi: 10.1007/

24.

Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P.,

s00294 021 01186 z.

Connelly, J. P., and Pruett Miller, S. M. (2018) A survey of

13.

Hu, Z., Zhou, M., Wu, Y., Li, Z., Liu, X., et al. (2019)

validation strategies for CRISPR Cas9 editing, Sci. Rep., 8,

ssODN mediated in frame deletion with CRISPR/Cas9

888, doi: 10.1038/s41598 018 19441 8.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022