БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 5, с. 660 - 673

УДК 577.1

УВЕЛИЧЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НАТРИЯ

КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

Д.А. Федоров, С.В. Сидоренко, А.И. Юсипович, О.В. Букач,

А.М. Горбунов, О.Д. Лопина, Е.А. Климанова*

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет,

119234 Москва, Россия; электронная почта: klimanova.ea@yandex.ru

Поступила в редакцию 17.02.2022

После доработки 26.04.2022

Принята к публикации 26.04.2022

Гиперосмотическая стимуляция клеток эндотелия часто приводит к его дисфункции, сопровождающейся в

том числе возникновением провоспалительного ответа. Механизмы этого явления до конца не ясны. Оно

может возникать вследствие увеличения концентрации Na⁺ в плазме за счёт повышения осмолярности

внеклеточной среды, увеличения внутриклеточного соотношения Na₊/K_i+ и/или изменения «жёсткости»

клетки. В настоящей работе исследованы эффекты кратковременного повышения осмолярности внекле(

точной среды на количество мРНК некоторых генов, важных для функционирования эндотелия (включая

Na₊/K_i+(чувствительные), и эквивалентную константу упругости мембран клеток эндотелия пупочной вены

человека. Гиперосмотическая стимуляция этих клеток с помощью NaCl, но не маннитола приводила к на(

коплению ионов Na⁺ внутри клеток, несмотря на активацию Na,K(ATPазы, а также сопровождалась умень(

шением их эквивалентной константы упругости. Количество мРНК IL1α снижалось при увеличении осмо(

лярности внеклеточной среды, а количество мРНК ATF3, PAR2 и PTGS2 увеличивалось только в ответ на по(

вышение концентрации NaCl. При этом в условиях наших экспериментов мы не детектировали изменения

экспрессии осмопротекторного транскрипционного фактора NFAT5. Полученные данные свидетельствуют

о том, что увеличение внеклеточной концентрации Na⁺ в физиологическом диапазоне является независи(

мым фактором, который влияет на внутриклеточное соотношение Na₊/K_i+ и регулирует экспрессию неко(

торых генов (в частности, ATF3, PAR2, PTGS2) в клетках эндотелия.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: натрий, калий, Na,K(ATPаза, эндотелий, регуляция транскрипции.

DOI: 10.31857/S0320972522050062, EDN: ATKDKW

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в литературе представле(

но множество данных о том, что обработка раз(

Градиент ионов Na_i+ и K_i+ на плазматической

личных типов клеток высокими концентрация(

мембране является основой жизни любой клет(

ми NaCl приводит к приобретению ими провос(

ки животных. Он поддерживается работой

палительного фенотипа [1]. С этой точки зрения

Na,K(ATPазы, и его диссипация опосредует раз(

эндотелий представляет особый интерес, так

личные ответы клеток. Изменение внутрикле(

как он, выстилая стенки сосудов, находится в

точного соотношения Na_i+/K_i+ может возникать

непосредственном контакте с плазмой крови,

в ответ на такие стимулы, как гипоксия, воспа(

где концентрация ионов

[Na⁺]_o колеблется

ление, изменение осмолярности внеклеточной

обычно в пределе 128-140 мМ [2]. В то же время

жидкости. Это, в свою очередь, влияет на кле(

концентрация ионов [Na⁺]_o при некоторых сос(

точный метаболизм через процессы, регулирую(

тояниях организма (обезвоживание, старение,

щие экспрессию генов.

перенесённые инфекции, оперативное вмеша(

тельство), именуемых гипо( и гипернатриемией,

может быть меньше 128 мМ, а также превышать

Принятые сокращения: ОРХ - оптическая разность

хода; ТХУ - трихлоруксусная кислота; ФИ - фазовое

165 мМ соответственно [3-5]. Несмотря на то

изображение; ATF3 - транскрипционный фактор 3, зави(

что этот параметр строго контролируется и в

симый от циклического AMP; FOS - транскрипционный нормальных физиологических состояниях

фактор семейства AP(1; IL1α

- интерлейкин

1α; практически постоянен, концентрация ионов

NFAT5 - ядерный фактор активированных Т(клеток 5;

NOS3 - эндотелиальная синтаза оксида азота; PAR2 - ак(

Na⁺ в тканях варьирует. Так, в обширном иссле(

тивируемый протеазой рецептор 2; PTGS2 - простаглан(

довании Minegishi et al. [6] было показано, что

дин(эндопероксид синтаза 2.

при долговременном потреблении чрезмерного

* Адресат для корреспонденции.

количества NaCl (5 г/день) избыток Na⁺ не вы(

660

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

661

водится почками, а накапливается в тканях,

нения транскриптома в различных типах клеток

клетки которых имеют обширную сеть гликоза(

через Ca_i2+(независимые механизмы [11, 12]. Эти

миногликанов (в частности, в коже и мышцах).

эксперименты позволили нам идентифициро(

При некоторых патологических состояниях

вать Na_i+/K_i+(чувствительные гены. Среди них

(например, диабет 1(типа и хроническая почеч(

есть гены раннего ответа, многие из которых ко(

ная недостаточность) наблюдается нарушение

дируют белки, являющиеся транскрипционны(

целостности сети гликозаминогликанов, что

ми факторами (FOS, ATF3), а также гены про(

сопровождается высвобождением ионов Na⁺ и

воспалительного ответа (IL1α, PTGS2, PAR2).

изменением его локальной концентрации [7].

Ингибирование Na,K(ATPазы существенно

Для нормального функционирования эндоте(

увеличивает внутриклеточное соотношение

лия его клетки должны обладать определённой

Na_i+/K_i+, в связи с этим целью настоящей работы

поверхностной жёсткостью. Это физическая ха(

было определение характера и механизма воз(

рактеристика клеток, которая зависит в первую

действия кратковременных изменений концен(

очередь от состояния гликокаликса (у эндотели(

трации NaCl во внеклеточной среде в физиоло(

альных клеток эта структура хорошо развита и

гическом диапазоне на экспрессию отдельных

представляет собой обширную сеть прикреп(

транскрипционных факторов (FOS, ATF3,

лённых к мембране клетки гликозаминоглика(

NFAT5), провоспалительных генов (IL1α,

нов). Считается, что он выполняет роль своеоб(

PTGS2, PAR2), а также эндотелиальной NO син(

разного «натриевого буфера». Многочисленные

тазы (NOS3), которая необходима для нормаль(

экспериментальные данные свидетельствуют о

ного функционирования сердечно(сосудистой

том, что избыток ионов [Na⁺]_o нарушает целост(

системы.

ность эндотелиального гликокаликса, что вле(

чёт за собой вход Na⁺ внутрь клетки с последую(

щей полимеризацией примембранного G(акти(

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

на. Суммарно эти события приводят к увеличе(

нию жёсткости эндотелиальной клетки, сопро(

Материалы. В работе были использованы ре(

вождающейся нарушением барьерной функции

активы следующих фирм(производителей:

мембраны эндотелия и снижением продукции

RbCl («Chemimpex», США); ТХУ, набор для уси(

оксида азота [8].

ленной хемилюминесценции SuperSignal™ West

Повышение внеклеточной концентра(

Femto Maximum Sensitivity Substrate, реагент

ции [Na⁺]_o, в свою очередь, будет приводить к

Trizol, коктейль ингибиторов фосфатаз 100X

увеличению осмолярности внеклеточной среды,

Halt™, буфер RIPA («Thermofisher Scientific»,

что повлечёт за собой уменьшение объёма клет(

США); коктейль ингибиторов протеаз

ки с последующим регуляторным его увеличе(

(«Amresco», США); тиорфан («Cayman Chemical»,

нием за счёт работы различных транспортёров,

США); NaCl и KCl («MP Biomedicals», США);

обеспечивающих внутриклеточный транспорт

маннитол

(«AppliChem», Германия); MgCl₂

ионов и воды. Вследствие этих событий проис(

(«Honeywell», США); вторичные антикроличьи

ходит увеличение внутриклеточной ионной си(

антитела, конъюгированные с пероксидазой

лы, что не может не сказаться на функциониро(

хрена («Millipore», США); антитела против

вании макромолекул [9]. Одним из самых извест(

NFAT5 («Thermofisher Scientific»); антитела про(

ных механизмов адаптации клетки к таким ус(

тив β(актина, ATF3 и PTGS2 («Cell Signaling

ловиям можно считать регуляцию экспрессии

Technology», США); колонки для выделения

генов с участием транскрипционного фактора

РНК Quick(RNA MicroPrep («Zymo Research»,

NFAT5, который, как считается, чувствителен к

США); набор для проведения обратной тран(

увеличению внутриклеточной ионной силы.

скрипции ImProm(IITM Reverse Transcription

NFAT5 впервые был идентифицирован в клет(

System («Promega», США); набор для выделе(

ках почечной медуллы как осмопротекторный

ния ДНК из гелей QIAquick Gel Extraction Kit

фактор, позже было показано, что он обеспечи(

(«Qiagen», США). Если не указано иное, все ре(

вает клеточный ответ на различные стимулы, не

активы были особо чистой квалификации.

связанные с увеличением осмолярности внекле(

Культура клеток. Эндотелиальные клетки пу(

точной среды, такие как ишемия, гипоксия, ме(

почной вены человека (HUVEC)

(«Cell

таболический стресс и др. [10].

Applications», США) культивировали до 4(го

Наши предыдущие исследования убедитель(

пассажа при 37 °С в атмосфере 5% CO₂, заменяя

но свидетельствуют о том, что дисбаланс Na_i+/K

ростовую среду («Cell Applications») каждые 48 ч.

вследствие ингибирования Na,K(ATPазы уабаи(

Затем клетки высевали в 6(луночные планшеты,

ном или за счёт инкубации клеток в бескалие(

содержащие среду для роста эндотелиальных

вой среде сам по себе вызывает обширные изме(

клеток при плотности 2 × 10⁴ клеток на лунку, и

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

662

ФЕДОРОВ и др.

выдерживали при 37 °С в атмосфере 5% CO₂, за(

В части экспериментов мы оценивали внут(

меняя ростовую среду каждые 48 ч. Через

риклеточный вход Rb⁺, который является ана(

5-7

дней после посева клетки достигали

логом K⁺. В отличие от K⁺, внутриклеточная

80-85%(ной конфлюентности и далее инкуби(

концентрация [Rb⁺]_i крайне низка, в связи с

ровались в присутствии нормальной (в стандарт(

этим зафиксировать незначительные изменения

ной среде для культивирования клеток, содер(

его входа в клетку легче. Кроме того, основная

жащей 125 мМ Na⁺) или повышенной концент(

часть транспорта Rb⁺ обеспечивается Na,K(

рации Na⁺ в течение 3 ч. С целью увеличения

ATPазой (которая связывает K⁺ и активируется

концентрации Na⁺ до 150, 160 и 170 мМ в конт(

им так же, как и ионами Rb⁺), а дополнитель(

рольную ростовую среду вносили дополнитель(

ный транспорт производится Na,K,2Cl(котранс(

но 25, 35 и 45 мМ NaCl соответственно. Так как

портёром и K(каналами [14]. Таким образом,

добавление NaCl в среду вызывает не только

вход Rb⁺ по большей мере отражает активность

увеличение концентрации Na⁺ и Cl^- в среде, но

Na,K(ATPазы. Клетки эндотелия пупочной ве(

и повышает её осмолярность, в качестве контро(

ны человека инкубировали при условиях, ука(

ля мы также использовали маннитол, который,

занных выше, после чего вносили в каждую лун(

в отличие от NaCl, является непроникающим в

ку 2,5 мМ RbCl и инкубировали в течение

клетку и недиссоциирующим осмолитом. В свя(

10 мин, поскольку область линейной зависи(

зи с этим контроль изоосмолярности осущест(

мости входа Rb⁺ внутрь клетки от времени со(

вляли путём внесения в лунки, содержащие рос(

ставляет ~10 мин [14]. После окончания инкуба(

товую среду, дополнительно 50, 70 и 90 мМ ман(

ции планшеты помещали в лёд, среду отбрасы(

нитола с последующей инкубацией клеток в те(

вали, а клетки промывали трижды 3 мл ледяно(

чение 3 ч. Для ингибирования Na,K(ATPазы и

го раствора 0,1 М MgCl₂, и далее проводили под(

увеличения внутриклеточной концентра(

готовку проб вышеописанным способом. Со(

ции Na⁺ к клеткам, содержащимся в контроль(

держание Na_i+, K_i+ и Rb_i+ в каждой лунке норми(

ной среде, добавляли 0,1 мкМ уабаина и инку(

ровали на количество белка в той же лунке.

бировали в течение 3 ч.

Измерение клеточного объема HUVEC прово(

Определение внутриклеточного содержа6

дили с помощью метода DISUR (Double Image

ния Na⁺, K⁺ и Rb⁺ методом атомно6абсорбцион6

Surface Reconstruction Technique), используя

ной спектрометрии. После окончания инкуба(

прикреплённые клетки, которые предваритель(

ции планшеты помещали в лёд, среду отбрасы(

но инкубировали в течение 1 ч в гиперосмоти(

вали, а клетки промывали трижды 3 мл ледяно(

ческих средах, содержащих

180

мМ Na⁺

го раствора 0,1 М MgCl₂. Затем в каждую лунку

или 125 мМ Na⁺ в присутствии 110 мМ манни(

вносили по 1,5 мл 5%(ной трихлоруксусной

тола. В качестве контрольных образцов исполь(

кислоты (ТХУ) и инкубировали в течение не(

зовали клетки, инкубированные в течение 1 ч в

скольких часов при 4 °С, после чего содержи(

среде, содержащей 125 мМ Na⁺. Метод DISUR

мое лунок соскребали и переносили под лами(

предполагает трёхмерную реконструкцию фор(

нарным воздушным потоком в пробирки типа

мы клеток на основе двух обычных микроско(

эппендорф. Полученные образцы центрифуги(

пических изображений клеток, полученных в

ровали в течение 20 мин при 18 000 g, суперна(

двух перпендикулярных направлениях

[15].

тант отбирали в отдельные пробирки под лами(

Изображения клеток с бокового и верхнего ра(

нарным потоком воздуха, остатки ТХУ аспири(

курсов получали с помощью двух независимых

ровали вакуумным насосом, после чего осадок

миниатюрных камер Moticam 350 с зарядовой

растворяли в 0,1 М NaOH при 65 °С в течение

связью («Motic Instruments Inc.», Канада) с

1 ч и определяли в нём концентрацию белка ме(

программным обеспечением Motic с интерва(

тодом Лоури [13].

лом 10-60 с, чтобы тщательно отслеживать

Содержание Na⁺ и K⁺ в экстрактах ТХУ изме(

быстрые изменения объёма. Изображения слу(

ряли методом пламенной атомно(абсорбционной

жили для создания набора топографических

спектрометрии на спектрометре «Квант(2м1»

кривых поверхности клетки из оцифрованного

(«Кортек», Россия) в пропано(воздушной смеси

профиля бокового вида и контура основания.

при длине волны 589 нм и 766,5 нм соответ(

Объём клетки рассчитывали по реконструиро(

ственно. Для калибровки использовали рас(

ванной топографической модели клетки с по(

творы KCl

(0,5-4

мг/литр K⁺) и NaCl

мощью программы MATLAB («Math Works, Inc.»,

(0,05-2 мг/литр Na⁺), содержащие 5% ТХУ. Со(

США).

держание Rb⁺ определяли тем же методом при

Оценка флуктуаций и определение эквивалент6

длине волны 780 нм, используя в качестве ка(

ной константы упругости мембран клеток эндоте6

либровки раствор RbCl (0,2-4 мг/литр Rb⁺), со(

лия с использованием лазерного интерференцион6

держащий 5% ТХУ.

ного микроскопа. Исследование проводилось с

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

663

помощью автоматизированного интерференци(

реносили на лёд, клетки HUVEC (10 × 10⁴ кле(

онного микроскопа МИА(Д, сконструирован(

ток) промывали 2 мл ледяного раствора Хэнкса

ного на основе интерферометра Линника

без солей Ca²⁺ и Mg²⁺, фенолового красного и

МИИ(4 («ЛОМО», Россия) во Всероссийском

добавляли 400 мкл реагента Trizol для выделения

научно(исследовательском институте оптико(

тотальной РНК. После выделения водной фазы,

физических измерений. Данная методика поз(

содержащей нуклеиновые кислоты, с помощью

воляет получить фазовое изображение (ФИ)

хлороформа и обработки 96%(ным этанолом

объекта (можно количественно оценить значе(

дальнейшие этапы выделения РНК и обработки

ние фазы или пропорциональное значение -

ДНКазой осуществляли на колонках Quick(

разность оптических путей в каждой точке ФИ).

RNA MicroPrep microkit. Для реакции обратной

Среднеквадратичная амплитуда колебаний тол(

транскрипции использовали набор ImProm(

щины клеточной мембраны, s_t, используется для

IITM Reverse Transcription System в соответствии

оценки величины колебаний мембраны живой

с инструкциями производителя. ПЦР в реаль(

клетки. Процедура измерения подробно описа(

ном времени проводили с помощью Bio(Rad

на в работе Yusipovich et al. [16]. Вкратце проце(

Real(Time PCR System

(«Bio(Rad», США).

дура измерений выглядит следующим образом:

Праймеры («Синтол», Россия, таблица) добав(

(а) запись серии ФИ (512 изображений с часто(

ляли до конечной концентрации 160 нМ.

той 25 Гц); (б) расчёт z(проекции серии ФИ,

Режимы амплификации: 95 °С - 5 мин;

представляющей собой проекцию сложенных

95 °С - 10 с, 58 °С - 17 с, 72 °С - 20 с, 40 цик(

изображений вдоль оси, перпендикулярной

лов; кривая плавления - от 72 до 95 °С, прира(

плоскости изображения, и содержащей сред(

щение 0,5 °С - 5 с. Подбор праймеров осущест(

неквадратичное значение амплитуды колебаний

вляли с помощью программы Beacon

временной разности оптических путей (ОРХ)

Designer 7, а также с использованием поиско(

каждого пикселя проекции; (в) вычисление

вых баз данных NCBI и BLAT. Уровень экспрес(

среднего значения среднеквадратичного коле(

сии каждого интересующего гена рассчитывали

бания амплитуды временного колебания ОРХ

по эталонному гену ГАФД (глицеральдегид(3(

для всей z(проекции клетки (без значений от

фосфатдегидрогеназа) и выражали в виде

границы клетки); (г) вычисление среднего зна(

ΔС_t = С_{t(тестируемый ген)} - С_t(ГАФД) [20]. Экспрессию

чения среднеквадратичного колебания ампли(

гена в контрольных образцах принимали

туды временного колебания ОРХ s_cell только для

за 100%. Для проверки продуктов ПЦР их сек(

клетки без шума; (д) вычисление значе(

венировали. Электрофорез проводили в 2%(ном

ния s_t [17]:

агарозном геле с использованием буфера TBE

(890

мМ Tris((гидроксиметил) аминометан,

s_t = s_cell/(n - n₀),

890 мМ борная кислота, 20 мМ ЭДТА, рН 8,3) в

присутствии бромистого этидия в течение ~1 ч

где n - показатель преломления клетки (1,404);

при напряжении 75 мВ. Продукты ПЦР извле(

n₀ - показатель преломления среды (1,335) [18].

кали из геля с помощью набора QIAquick Gel

Затем значение среднеквадратичной амплитуды

Extraction Kit в соответствии с протоколом про(

колебаний клеточной мембраны, s_t, использова(

изводителя. Секвенирование ДНК проводилось

ли для расчёта константы упругости мемб(

компанией «Геном», Россия. Последователь(

ран, k_e, по формуле [19]:

ности были выровнены с помощью программы

BLAST. Все последовательности ДНК соответ(

k_e = k_BT/s_t2,

ствовали заявленным.

Оценка экспрессии ATF3, PTGS2 и NFAT5 ме6

где k_B - константа Больцмана, T - температура

тодом Вестерн6блоттинга. После окончания ин(

(в Кельвинах). Вертикальное разрешение было

кубации клетки трижды промывали 2 мл ледя(

равно 1,9 нм; горизонтальное разрешение со(

ного фосфатно(солевого буфера. Затем в лунку

ставляло ~0,5 мкм; повторяемость результатов

вносили 200 мкл буфера RIPA, содержащего

измерений составляла менее 0,1 нм. По оконча(

0,2

мМ фенилметилсульфонилфторида и

нии инкубации клеток в гиперосмотических ус(

5 мкМ тиорфана, а также коктейль ингибиторов

ловиях (см. выше) измерения проводили при

протеаз. Полученную суспензию переносили в

37 °С, помещая покровное стекло с прикреплён(

пробирку типа эппендорф и подвергали её обра(

ными клетками на зеркальную поверхность

ботке ультразвуковом

(«Marshall Scientific»,

(клетки к зеркалу).

США) для разрушения геномной ДНК. В полу(

Анализ транскрипции генов методом полиме6

ченных образцах измеряли концентрацию белка

разной цепной реакции (ПЦР) в реальном време6

методом Лоури [13]. Разделение белков прово(

ни. По окончании эксперимента планшеты пе(

дили методом электрофореза в ПААГ в денату(

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

664

ФЕДОРОВ и др.

Последовательности используемых в исследовании праймеров

Символьное

Название продукта гена

Последовательность олигонуклеотида

Длина ПЦР(продукта,

обозначение гена

п.н.

FOS

транскрипционный

For: 5′(GCAAGGTGGAACAGTTATCTC3′;

154

фактор семейства AP(1

Rev: 5′(GCAGACTTCTCATCTTCTAGTTG(3′

ATF3

фактор транскрипции 3,

For: 5′(GAGGCGACGAGAAAGAAATAAG(3′;

119

зависимый от

Rev: 5′(CCTTCAGTTCAGCATTCACAC(3′

циклического AMP

PAR2

рецептор, активируемый

For: 5′(CCATCCAAGGAACCAGTAGATC(3′;

136

протеазой 2

Rev: 5′(GTGAGGACAGATGCAGAAAAC(3′

NOS3

эндотелиальная синтаза

For: 5′(GCAACCACATCAAGTATGCC(3′;

102

оксида азота

Rev: 5′(TGTTCCAGATTCGGAAGTCTC(3′

PTGS2

простагландин(

For: 5′(GTATGTATGAGTGTGGGATTTGAC(3′;

156

эндопероксид синтаза 2

Rev: 5′(CTTGAAGTGGGTAAGTATGTAGTG(3′

IL1α

интерлейкин(1α

For: 5′(GAAGAAGACAGTTCCTCCATTG(3′;

120

Rev: 5′(TTCAGAGATACTCAGAGACACAG(3′

NFAT5

ядерный фактор

For: 5′(GCTTACCACGGACAACAAAG(3′;

220

активированных

Rev: 5′(GCCTTGCTGTGTTCTATCTTC(3′

Т(клеток 5

GAPDH

глицеральдегидфосфат(

For: 5′(CCTGGTATGACAACGAATTTG(3′;

131

дегидрогеназа

Rev: 5′(CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC(3′

рирующих условиях [21], используя 4%(ный

шивании и комнатной температуре. Визуализа(

концентрирующий и 10%(ный разделяющий ге(

цию комплексов антиген-антитело проводили

ли. Затем белки переносили на нитроцеллюлоз(

методом усиленной хемилюминесценции с по(

ную мембрану («Bio(Rad», США) методом полу(

мощью набора SuperSignal™ West Femto

сухого электропереноса (режим «Standard SD

Maximum Sensitivity Substrate ECL и прибора

mode» в течение 30 мин) в Tris(глициновом бу(

Endolab ChemiDoc XRSplus («Bio(Rad»). Отно(

фере (25 мМ Tris(HCl, 192 мМ глицин, 10% эта(

сительное содержание белка оценивали путём

нола, pH 8,3) на приборе Trans(blot Turbo («Bio(

денситометрии, используя программное обеспе(

Rad», США). По окончании электропереноса

чение ImageLab™ 3.0 («Bio(Rad»).

нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в

Статистический анализ данных, полученных с

фосфатно(солевом буфере, содержащем

использованием микроскопии, проводили с по(

0,1% (v/v) Tween(20 и 5% сухого молока, в тече(

мощью программного обеспечения Graphpad

ние 1 ч, после чего проводили инкубацию в со(

Prism 9.0 («GraphPad Software», США). Для про(

левом Tris(HCl(буфере, TBS (20 мМ Tris(HCl,

верки нормальности данных применяли обоб(

150 мМ NaCl, pH 7,6), содержащем 5% сухого

щённый тест Д’Агостино-Пирсона (p < 0,05).

молока и антитела против ATF3 (в разведении

Остальные статистические процедуры указаны в

1 : 500), PTGS2 (в разведении 1 : 500) или NFAT5

подписях к рисункам.

(в разведении 1 : 1000), при 4 °С и постоянном

перемешивании в течение ночи. Общее количе(

ство детектируемых белков нормировали на со(

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

держание β(актина. Для этого мембрану инку(

бировали, как описано выше, используя антите(

Поверхностная жёсткость клеток эндотелия

ла против β(актина (разведение 1 : 1000). После

пупочной вены человека зависит от концентра6

этого мембраны трижды промывали 15 мл буфе(

ции [Na⁺]_o, а не от осмолярности внеклеточной

ра TBS, содержащего 0,1% (v/v) Tween(20, и ин(

среды. Поддержание нормального объёма клет(

кубировали в растворе TBS в присутствии

ки является необходимым условием для её вы(

5% сухого молока и вторичных антител, конъю(

живания. Изменение этого параметра достига(

гированных с пероксидазой хрена (в разведении

ется за счёт регуляции транспорта воды через

1 : 25 000), в течение 1 ч при постоянном переме(

плазматическую мембрану, что, в свою очередь,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

665

Рис. 1. Изменение объёма клеток эндотелия пупочной вены человека в зависимости от осмолярности внеклеточной сре(

ды. Клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 125 мМ Na⁺ (1); в культуральной среде, содержащей

180 мМ Na⁺ (2); в культуральной среде, содержащей 125 мМ Na⁺ и 110 мМ маннитола (3) в течение 1 ч. Исходный объём

клеток принят за 100%. Представлены средние значения и стандартное отклонение (SD) четырёх независимых экспери(

ментов

опосредовано изменением активности различ(

мой клеточной мембраны, она зависит также от

ных переносчиков [22]. Увеличение или умень(

осмолярности, бокового поверхностного натя(

шение осмолярности внеклеточной среды при(

жения, клеточной адгезии [24]. Кроме того, ко(

водит к изменению объёма клеток, что влечёт за

лебания мембран могут быть обусловлены рабо(

собой изменение экспрессии ряда генов. Для

той ионных насосов и состоянием цитоскелета

создания гиперосмотических условий мы ис(

клетки [25]. Регистрируя колебания мембран,

пользовали два подхода: в первом случае в куль(

можно оценить эквивалентную константу упру(

туральную среду добавляли NaCl так, чтобы

гости клеточных мембран, k_e, которая зависит от

концентрация [Na⁺]_o была равной 180 мМ, во

модуля упругости, бокового поверхностного на(

втором - 110 мМ маннитола поверх 125 мМ

тяжения и в меньшей степени от других пара(

[Na⁺]_o для контроля изоосмолярности среды

метров [19]. Таким образом, получив значения

(см. «Материалы и методы»). В обоих случаях

констант упругости клеточных мембран в ответ

происходило одинаковое уменьшение объёма

на исследуемые стимулы, мы можем оценить из(

клеток (до 50% от исходного значения), которое

менения поверхностной жёсткости клетки. Ра(

достигало максимума через 10 мин после поме(

нее мы показали, что для изучения этого пара(

щения клеток в гиперосмотические условия. По

метра метод лазерной интерференционной мик(

мере увеличения времени инкубации мы регис(

роскопии также применим, как и метод силовых

трировали так называемое регуляторное увели(

кривых [26].

чение объёма (RVI) клеток (рис. 1).

Для нормального функционирования эндо(

Известно, что для живых клеток характерны

телиальных клеток важна их

«пластич(

локальные колебания мембраны, называемые

ность» [27]. Исследование влияния повышен(

также динамическими флуктуациями [23]. Амп(

ной осмолярности внеклеточной среды на кон(

литуда колебаний определяется свойствами са(

станту упругости мембран клеток эндотелия пу(

6 БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

666

ФЕДОРОВ и др.

почной вены человека показало, что инкуба(

ции [Na⁺]_o, а не от осмолярности внеклеточной

ция HUVEC в среде, содержащей 150-170 мМ

среды.

[Na⁺]_o, приводит к уменьшению значения k_e.

Увеличение концентрации [Na⁺]_o активирует

В то же время увеличение осмолярности внекле(

Na,K6ATPазу в клетках эндотелия пупочной вены

точной среды посредством добавления манни(

человека. В предыдущих работах было показа(

тола не оказывало влияния на этот пара(

но, что диссипация градиента Na_i+/K_i+ за счёт

метр (рис. 2). Таким образом, несмотря на изме(

ингибирования Na,K(АТРазы приводит к тран(

нение клеточного объёма в результате увеличе(

скриптомным изменениям в различных типах

ния ионной силы внеклеточной среды, поверх(

клеток [11, 12]. Логично предположить, что в

ностная жёсткость эндотелиальных клеток зави(

ответ на увеличение [Na⁺]_o происходит усиле(

села именно от внеклеточной концентра(

ние входа этого иона внутрь клетки и увеличе(

Рис. 2. Влияние осмолярности внеклеточной среды на значение эквивалентной константы упругости клеточных мембран

клеток эндотелия пупочной вены человека. Данные представлены в виде экспериментальных значений (точки) и медиа(

ны с межквартильным размахом (черные линии). Значимые различия были рассчитаны с помощью теста Краскела-Уол(

лиса, p < 0,05. * p < 0,05 по сравнению с контрольными клетками, инкубированными в течение 3 ч

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

667

Рис. 3. Зависимость содержания ионов Na_i+ (а), K_i+ (б), Rb_i+ (в) в клетках эндотелия пупочной вены человека от концент(

рации Na⁺ во внеклеточной среде. Клетки инкубировали в среде, содержащей 150, 160 и 170 мМ Na⁺, в течение 3 ч. Зна(

чимые различия были рассчитаны с помощью теста Краскела-Уоллиса, p < 0,05. * p = 0,0192; ** p = 0,0017; *** p = 0,0003

по сравнению с контрольными образцами

ние внутриклеточного соотношения Na_i+/K_i+.

онов в присутствии дополнительно добавленно(

В настоящей работе исследовано влия(

го маннитола до концентрации 30-90 мМ (дан(

ние [Na⁺]_o в концентрации 150-170 мМ в тече(

ные не представлены). Таким образом, можно

ние 3 ч на содержание одновалентных катионов

заключить, что увеличение внеклеточной кон(

в клетках эндотелия пупочной вены челове(

центрации [Na⁺]_o (но не осмолярности) оказы(

ка (рис. 3). При выдерживании клеток в среде с

вает влияние на транспорт Na⁺ и K⁺ через плаз(

концентрацией натрия в диапазоне 150-160 мМ

матическую мембрану и сопровождается акти(

мы не обнаружили статистически достоверного

вацией Na,K(ATPазы.

изменения содержания этого иона в клетках.

Гиперосмотическая стимуляция клеток эндо6

Однако инкубация клеток в присутствии

телия пупочной вены человека в течение 3 ч изме6

170 мМ Na⁺ приводила к увеличению внутри(

няет количество мРНК некоторых Na_i+/K_i+(

клеточного содержания натрия примерно

чувствительных генов и не оказывает влияния на

на 20% (рис. 3, а). В то же время внутриклеточ(

экспрессию NFAT5. Задачей данного исследова(

ное содержание K⁺ в условиях наших экспери(

ния было изучение эффекта диссипации гради(

ментов практически не изменялось (рис. 3, б).

ента Na_i+/K_i+ на транскрипцию некоторых генов

Поскольку содержание этого иона в клетке ве(

в клетках эндотелия в ответ на гиперосмотичес(

лико, то небольшие изменения этого параметра

кую стимуляцию. Ранее мы показали, что коли(

сложно детектировать. Поэтому мы оценили

чество мРНК генов раннего ответа (EGR1, FOS,

вход Rb⁺ в клетки, так как Rb⁺ является анало(

ATF3, ZFP36, JUN) в клетках эндотелия, инку(

гом K⁺, и его используют для изучения транс(

бируемых в гиперосмотических условиях, воз(

порта K⁺ [14]. Инкубация HUVEC в присут(

растает за счёт увеличения [Na⁺]_i, а не уменьше(

ствии 150, 160 и 170 мМ [Na⁺]_o сопровождалась

ния клеточного объёма [28]. В этой работе мы

достоверным усилением входа Rb⁺ в клетки на

изучили, как инкубация клеток в присутствии

35, 39 и 27% соответственно (рис. 3, в). В сово(

[Na⁺]_o в концентрации 150-170 мМ в течение

купности эти данные свидетельствуют о том, что

3 ч влияет на транскрипцию генов FOS, ATF3,

при увеличении внеклеточной концентра(

PAR2, NOS3, PTGS2 и IL1α. В качестве контроля

ции [Na⁺]_o происходит его усиленный транспорт

влияния осмолярности внеклеточной среды на

внутрь клетки с последующей активацией Na,K(

транскрипцию этих генов использовали

ATPазы, что согласуется с нашими предыдущи(

50-90 мМ маннитол, который добавляли в сре(

ми наблюдениями [26].

ду инкубации. Положительным контролем слу(

В качестве контроля осмолярности внекле(

жили клетки, инкубированные в присутствии

точной среды мы использовали непроникаю(

0,1 мкМ уабаина в течение 3 ч. Такое воздей(

щий осмолит маннитол. Однако мы не обнару(

ствие приводит к ингибированию Na,K(

жили никаких изменений во внутриклеточном

ATPазы и увеличению внутриклеточного соот(

содержании и транспорте одновалентных кати(

ношения Na_i+/K_i+ [28].

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

668

ФЕДОРОВ и др.

В условиях наших экспериментов уабаин

ляется внеклеточной концентрацией Na⁺. В то

увеличивал количество мРНК FOS в 4 раза, а

же время количество белка ATF3 увеличивалось

ATF3, PTGS2 и IL1α - в 1,5-2 раза, при этом уро(

в присутствии 160 и 170 мМ Na⁺ (рис. 5, б), тогда

вень мРНК NOS3 и PAR2 не изменялся (рис. 4).

как существенного изменения экспрес(

Количество мРНК ATF3 и PAR2 увеличилось в 3

сии PTGS2 не наблюдалось (рис. 5, г).

и в 1,5 раза соответственно только в присутствии

Одним из участников сигнального каскада,

170

мМ [Na⁺]_o (рис.

5, а). Количество

приводящего к изменению транскрипции генов

мРНК PTGS2 возросло примерно в 2 раза в ответ

в клетках, подверженных осмотическому стрес(

на увеличение [Na⁺]_o в диапазоне 160-170 мМ.

су, является осмопротекторный транскрипцион(

Ни 150 мМ [Na⁺]_o, ни маннитол не оказывали

ный фактор NFAT5 [9, 29]. Его мишенью, в част(

никакого эффекта на транскрипцию этого ге(

ности, может являться PTGS2 [30]. Несмотря на

на (рис. 5, в). Количество мРНК IL1α уменьши(

то что мы детектировали увеличение мРНК это(

лось примерно в 2 раза как при действии

го гена в клетках, подверженных действию уаба(

150-170 мМ [Na⁺]_o, так и в присутствии допол(

ина и 160-170 мМ [Na⁺]_o, нам не удалось зафик(

нительно добавленного маннитола в концентра(

сировать достоверного изменения экспрес(

ции 50-90 мМ. Увеличение осмолярности вне(

сии NFAT5 как на уровне мРНК (рис. 6, а), так и

клеточной среды за счёт добавления NaCl или

на уровне содержания белка (рис. 6, б).

маннитола в среду инкубации не повлияло на

транскрипцию генов FOS и NOS3 (рис. 4). Таким

образом, мы можем заключить, что транскрип(

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ция PTGS2 и ATF3 имеет Na_i+(зависимый харак(

тер, тогда как транскрипция IL1α зависит от ос(

В настоящей работе были исследованы эф(

молярности внеклеточной среды. Регуляция

фекты кратковременного увеличения внекле(

транскрипции PAR2, по всей видимости, опреде(

точной концентрации [Na⁺]_o на экспрессию от(

Рис. 4. Влияние осмолярности и уабаина на уровень мРНК генов FOS, PAR2, NOS3 и IL1α в эндотелиальных клетках пу(

почной вены человека. Для повышения концентрации Na⁺ до 150, 160 и 170 мМ к контрольной ростовой среде, содержа(

щей 125 мМ Na⁺, добавляли 25, 35 и 45 мМ NaCl соответственно. Изоосмолярность контролировали путём добавления 50,

70 и 90 мМ маннитола в контрольную среду. Для ингибирования Na,K(АТРазы и увеличения внутриклеточной концен(

трации Na⁺ в клетки, содержащиеся в контрольной среде, добавляли 0,1 мкМ уабаина. Инкубацию проводили в течение

3 ч. Значимые различия рассчитывали с помощью One(way ANOVA, p < 0,05. * p < 0,05 по сравнению с контрольными об(

разцами

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

669

Рис. 5. Влияние осмолярности и уабаина уровень мРНК гена и количество белка ATF3 (а и б) и PTGS2 (в и г) в эндотели(

альных клетках пупочной вены человека. Для повышения концентрации Na⁺ до 150, 160 и 170 мМ к контрольной росто(

вой среде, содержащей 125 мМ Na⁺, добавляли 25, 35 и 45 мМ NaCl соответственно. Изоосмолярность контролировали

путём добавления 50, 70 и 90 мМ маннитола в контрольную среду. Для ингибирования Na,K(АТРазы и увеличения внут(

риклеточной концентрации Na⁺ в клетки, содержащиеся в контрольной среде, добавляли 0,1 мкМ уабаина. Инкубацию

проводили в течение 3 ч. Значимые различия рассчитывали с помощью One(way ANOVA, p < 0,05. * p < 0,05 по сравнению

с контрольными образцами

дельных транскрипционных факторов (FOS,

Мы показали, что гиперосмотическая сти(

ATF3, NFAT5), провоспалительных генов (IL1α,

муляция клеток эндотелия пупочной вены чело(

PTGS2, PAR2), а также эндотелиальной NO син(

века за счёт добавления во внеклеточную среду

тазы (NOS3) и эквивалентную константу упру(

дополнительного количества NaCl или манни(

гости мембран клеток эндотелия, характеризую(

тола приводит к уменьшению их объёма с по(

щую их жёсткость. Роль транскрипционного

следующим его регуляторным увеличением.

фактора NFAT5 в регуляции экспрессии генов в

В то же время мы детектировали увеличение по(

клетках, подверженных гиперосмотическому

верхностной жёсткости клеток в основном в от(

стрессу, хорошо описана в литературе [29]. Од(

вет на увеличение [Na⁺]_o, а не маннитола. Таким

нако стоит иметь в виду, что NFAT5(опосредо(

образом, мы можем заключить, что жёсткость

ванная регуляция не может рассматриваться как

эндотелиальных клеток зависит от концентра(

универсальный механизм адаптации клеток к

ции [Na⁺]_o, а не от осмолярности внеклеточной

гиперосмотическим условиям. Действительно,

среды. В пользу этого свидетельствуют также

сайленсинг NFAT5 в макрофагах мыши не вли(

экспериментальные данные, которые показыва(

ял на некоторые гены, транскрипция которых

ют, что увеличение концентрации [K⁺]_o во вне(

изменялась в условиях повышенной концентра(

клеточной среде оказывает противоположный

ции NaCl [31]. Кроме того, активация NFAT5

по сравнению с [Na⁺]_o эффект на поверхност(

может происходить независимо от изменений

ную жёсткость клеток эндотелия аорты быка

осмолярности среды, также как и ответ клеток

GM7373 [33].

на гиперосмотическую стимуляцию может про(

Инкубация HUVEC в среде, содержащей

исходить с участием других факторов, таких как

150-170 [Na⁺]_o, в течение 3 ч изменяла внутри(

NO, ангиотензин II, фактор некроза опухо(

клеточный ионный состав и сопровождалась

ли α (TNF(α), трансформирующий фактор рос(

усиленным входом Rb⁺ в клетки, т.е. активацией

та β (TGF(β) и др. [32].

Na,K(ATPазы, что мы показали и ранее [26].

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

671

ки, несмотря на активацию Na,K(ATPазы. По(

дила транслокация NFAT5 в ядро, но мы не изу(

скольку увеличение осмолярности внеклеточ(

чали этот аспект в данной работе. Можно пред(

ной среды за счёт маннитола не оказывало вли(

положить, что именно изменение жёсткости

яния на внутриклеточное содержание ио(

эндотелиальной клетки и активация механочув(

нов Na⁺ и K⁺, мы можем заключить, что измене(

ствительных сигнальных путей опосредует из(

ние транспорта одновалентных катионов через

менение транскрипции исследуемых генов [35].

плазматическую мембрану зависит, скорее, от

Однако ранее мы показали, что увеличе(

концентрации этих ионов во внеклеточной сре(

ние [Na⁺]_o от 125 до 140 мМ влияет на тран(

де, чем от её осмолярности.

скрипцию генов, но не оказывает никакого эф(

Поскольку поддержание градиента Na_i+/K_i+

фекта на поверхностную жёсткость эндотели(

является критически важным для функциони(

альных клеток [26]. В литературе описаны дан(

рования клетки животного, логично предполо(

ные о том, что представленность NFAT5 в клет(

жить, что даже незначительное его изменение

ках почечного эпителия увеличивается под

может затронуть процессы экспрессии генов.

действием механочувствительной нерецептор(

Действительно, из шести тестируемых генов

ной тирозинкиназы FAK (Focal adhesion kinase)

(FOS, ATF3, PAR2, NOS3, PTGS2 и IL1α) четыре

в ответ на осмотический стресс [36]. Однако мы

оказались чувствительны к увеличению осмо(

не детектировали достоверное увеличение

лярности внеклеточной среды (ATF3, PAR2,

экспрессии NFAT5 как в присутствии

PTGS2 и IL1α). Нашего особого внимания за(

150-170 мМ [Na⁺]_o, так и в присутствии допол(

служивают гены ATF3 и PTGS2, поскольку уро(

нительного 50-90 мМ маннитола, несмотря на

вень их мРНК увеличивался как в ответ на уве(

то что жёсткость клеток увеличивалась в присут(

личение внутриклеточного соотношения

ствии 150-170 мМ [Na⁺]_o.

Na_i+/K_i+ при ингибировании Na,K(ATPазы уаба(

Все эти данные демонстрируют, что увеличе(

ином, так и в ответ на увеличение осмолярнос(

ние [Na⁺]_o (и, как следствие, дисбаланс Na_i+/K_i+)

ти внеклеточной среды с помощью NaCl, но не

само по себе, а не только увеличение осмоляр(

маннитола. Эти результаты совпадают с наши(

ности внеклеточной среды и/или изменение по(

ми предыдущими наблюдениями того, что регу(

верхностной жёсткости клетки может независи(

ляция транскрипции упомянутых выше генов

мо регулировать экспрессию некоторых генов в

опосредована Na_i+/K_i+(зависимыми механизма(

эндотелиальных клетках.

ми [11, 28]. Любопытным является тот факт, что

транскрипция IL1α увеличивается при ингиби(

ровании Na,K(ATPазы, но уменьшается в ответ

Финансирование. Работа выполнена при фи(

на увеличение осмолярности внеклеточной

нансовой поддержке Российского научного

среды. При этом мы не регистрировали измене(

фонда (грант № 19(75(10009).

ние экспрессии NFAT5 как на уровне тран(

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от(

скрипции, так и на уровне белка. Тогда как в ра(

сутствии конфликта интересов.

боте Kim et al. [34] показано, что NFAT5 инги(

Соблюдение этических норм. Настоящая

бирует транскрипцию IL1α в эпителиальных

статья не содержит описания каких(либо иссле(

клетках хрусталика человека. Не исключено,

дований с участием людей или животных в каче(

что в условиях наших экспериментов происхо(

стве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Wenzel, U. O., Bode, M., Kurts, C., and Ehmke, H.

Staiger, R. D., Sarnthein, J., Wiesli, P., Schmid, C., and

(2019) Salt, inflammation, IL(17 and hypertension,

Bernays, R. L. (2013) Prognostic factors for impaired plas(

Br. J. Pharmacol., 176, 1853(1863, doi: 10.1111/bph. 14359.

ma sodium homeostasis after transsphenoidal surgery,

Aramburu, J., and López Rodr guez, C. (2019) Regulation

Br. J. Neurosurg., 27, 63(68, doi: 10.3109/02688697.2012.

of inflammatory functions of macrophages and T lympho(

714013.

cytes by NFAT5, Front.Immunol., 10, 535, doi: 10.3389/

Minegishi, S., Luft, F.C., Titze, J., and Kitada, K. (2020)

fimmu.2019.00535.

Sodium handling and interaction in numerous organs,

Zimmer, M. A., Zink, A. K., Weißer, C. W., Vogt, U.,

Am. J. Hypertens.,

33,

687(694, doi:

10.1093/ajh/

Michelsen, A., et al. (2020) Hypernatremia - a manifesta(

hpaa049.

tion of COVID(19: A case series, A A Pract., 14, e01295,

Olde Engberink, R. H. G., Rorije, N. M. G., van den

doi: 10.1213/XAA.0000000000001295.

Born, B.(J. H., and Vogt, L. (2017) Quantification of

Hawkins, R. C. (2003) Age and gender as risk factors for

nonosmotic sodium storage capacity following acute

hyponatremia and hypernatremia, Clin. Chim. Acta, 337,

hypertonic saline infusion in healthy individuals, Kidney

169(172, doi: 10.1016/j.cccn.2003.08.001.

Int., 91, 738(745, doi: 10.1016/j.kint.2016.12.004.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

672

ФЕДОРОВ и др.

Oberleithner, H., and Wilhelmi, M. (2015) Vascular glyco(

22.

Lang, F. (2007) Mechanisms and significance of cell vol(

calyx sodium store - determinant of salt sensitivity? Blood

ume regulation, J. Am. College Nutr., 26, 613S(623S,

Purif., 39, 7(10, doi: 10.1159/000368922.

doi: 10.1080/07315724.2007.10719667.

Burg, M. B., Ferraris, J. D., and Dmitrieva, N. I. (2007)

23.

Brochard, F., and Lennon, J. F. (1975) Frequency spectrum

Cellular response to hyperosmotic stresses, Physiol. Rev.,

of the flicker phenomenon in erythrocytes, J. Phys. France,

87, 1441(1474, doi: 10.1152/physrev.00056.2006.

36, 1035(1047, doi: 10.1051/jphys:0197500360110103500.

10.

Choi, S. Y., Lee(Kwon, W., and Kwon, H. M. (2020)

24.

Kononenko, V. L. (2009) Flicker in erythrocytes. II.

The evolving role of TonEBP as an immunometabolic

Results of experimental studies, Biochem. Moscow Suppl.

stress protein, Nat. Rev. Nephrol.,

16,

352(364,

Ser. A, 3, 372(387, doi: 10.1134/S1990747809040035.

doi: 10.1038/s41581(020(0261(1.

25.

Turlier, H., and Betz, T. (2018) Fluctuations in active

11.

Koltsova, S. V., Trushina, Y., Haloui, M., Akimova, O.A.,

membranes, ArXiv: 1801.00176.

Tremblay, J., et al. (2012) Ubiquitous [Na⁺]_i/[K⁺]_i(sensi(

26.

Fedorov, D. A., Sidorenko, S. V., Yusipovich, A. I.,

tive transcriptome in mammalian cells: Evidence for

Parshina, E. Y., Tverskoi, A. M., et al. (2021) Na_i+

/Ki

Ca₂₊(independent excitation(transcription coupling,

imbalance contributes to gene expression in endothelial

PLoS One,

7, e38032, doi:

10.1371/journal.pone.

cells exposed to elevated NaCl, Heliyon, 7, e08088,

0038032.

doi: 10.1016/j.heliyon.2021.e08088.

12.

Klimanova, E. A., Sidorenko, S. V., Smolyaninova, L. V.,

27.

Lang, F. (2011) Stiff endothelial cell syndrome in vascular

Kapilevich, L. V., Gusakova, S. V., et al. (2019) Current

inflammation and mineralocorticoid excess, Hypertension,

Topics in Membranes, Academic Press.

57, 146(147, doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.

13.

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall,

164558.

R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol

28.

Shiyan, A. A., Sidorenko, S. V., Fedorov, D., Klimanova,

reagent, J. Biol. Chem., 193, 265(275, doi: 10.1016/0304(

E. A., Smolyaninova, L. V., et al. (2019) Elevation of intra(

3894(92)87011(4.

cellular Na⁺ contributes to expression of early response

14.

Vereninov, A., Rubashkin, A., Goryachaya, T.,

genes triggered by endothelial cell shrinkage | cell physiol

Moshkov, A., Rozanov, Y., et al. (2008) Pump and channel

biochem, Cell. Physiol. Biochem., 53, 638(647.

K⁺ (Rb⁺) fluxes in apoptosis of human lymphoid cell line

29.

Neuhofer, W. (2010) Role of NFAT5 in inflammatory dis(

U937, CPB, 22, 187(194, doi: 10.1159/000149796.

orders associated with osmotic stress, Curr. Genomics, 11,

15.

Ponomarchuk, O. O., Boudreault, F., Shiyan, A. A.,

584(590, doi: 10.2174/138920210793360961.

Maksimov, G. V., Grygorczyk, R., et al. (2018) A method

30.

Favale, N. O., Casali, C. I., Lepera, L. G., Pescio, L. G.,

to simultaneously detect changes in intracellular Ca²⁺ con(

and Fernández(Tome, M. C. (2009) Hypertonic induction

centration and cell volume, Biophysics, 63, 369(374,

of COX2 expression requires TonEBP/NFAT5 in renal

doi: 10.1134/S000635091803020X.

epithelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 381, 301(

16.

Yusipovich, A. I., Parshina, E. Yu., Baizhumanov, A. A.,

305, doi: 10.1016/j.bbrc.2008.12.189.

Pirutin, S. K., Ivanov, A. D., et al. (2021) Use of a laser

31.

Neubert, P., Weichselbaum, A., Reitinger, C., Schatz, V.,

interference microscope for estimating fluctuations and the

Schröder, A., et al. (2019) HIF1A and NFAT5 coordinate

equivalent elastic constant of cell membranes, Instr. Exp.

Na⁺(boosted antibacterial defense via enhanced autophagy

Tech., 64, 877(885, doi: 10.1134/S0020441221060129.

and autolysosomal targeting, Autophagy, 15, 1899(1916,

17.

Rappaz, B., Barbul, A., Hoffmann, A., Boss, D.,

doi: 10.1080/15548627.2019.1596483.

Korenstein, R., et al. (2009) Spatial analysis of erythrocyte

32.

Halterman, J. A., Kwon, H. M., and Wamhoff, B. R. (2011)

membrane fluctuations by digital holographic microscopy,

Tonicity(independent regulation of the osmosensitive tran(

Blood Cells Mol. Dis., 42, 228(232, doi: 10.1016/j.bcmd.

scription factor TonEBP (NFAT5), Am. J. Physiol. Cell

2009.01.018.

Physiol., 302, C1(C8, doi: 10.1152/ajpcell.00327.2011.

18.

Yusipovich, A. I., Parshina, E. Yu., Brysgalova, N. Yu.,

33.

Oberleithner, H., Callies, C., Kusche(Vihrog, K.,

Brazhe, A. R., Brazhe, N. A., et al. (2009) Laser interfer(

Schillers, H., Shahin, V., et al. (2009) Potassium softens

ence microscopy in erythrocyte study, J. Appl. Phys., 105,

vascular endothelium and increases nitric oxide release,

102037, doi: 10.1063/1.3116609.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 2829(2834, doi: 10.1073/

19.

Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best(Popescu, C. A.,

pnas.0813069106.

Laposata, M., et al. (2006) Optical measurement of cell

34.

Kim, G.(N., Hah, Y.(S., Seong, H., Yoo, W.(S., Choi, M.(Y.,

membrane tension, Phys. Rev. Lett.,

97,

218101,

et al. (2021) The role of nuclear factor of activated T cells 5

doi: 10.1103/PhysRevLett.97.218101.

in hyperosmotic stress(exposed human lens epithelial cells,

20.

Chandra, S., Narang, R., Sreenivas, V., Bhatia, J.,

Int. J. Mol. Sci., 22, 6296, doi: 10.3390/ijms22126296.

Saluja, D., et al. (2014) Association of angiotensin II

35.

Chien, S. (2007) Mechanotransduction and endothelial

type 1 receptor (A1166C) gene polymorphism and its

cell homeostasis: the wisdom of the cell, Am. J. Physiol.

increased expression in essential hypertension: A case(

Heart Circ. Physiol., 292, H1209(H1224, doi: 10.1152/

control study, PloS one, 9, e101502, doi: 10.1371/journal.

ajpheart.01047.2006.

pone.0101502.

36.

Neuhofer, W. (2014) Focal adhesion kinase regulates the

21.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins dur(

activity of the osmosensitive transcription factor TonEBP/

ing the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature,

NFAT5 under hypertonic conditions, Front. Physiol., 5,

227, 680(685, doi: 10.1038/227680a0.

123, doi: 10.3389/fphys.2014.00123.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022

НАТРИЙ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В ЭНДОТЕЛИИ

673

INCREASED EXTRACELLULAR SODIUM CONCENTRATION

AS A FACTOR REGULATING GENE EXPRESSION IN ENDOTHELIUM

D. A. Fedorov, S. V. Sidorenko, A. I. Yusipovich, O. V. Bukach,

A. M. Gorbunov, O. D. Lopina, and E. A. Klimanova*

Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 119234 Moscow, Russia; E'mail: klimanova.ea@yandex.ru

There is a positive correlation between high table salt intake and endothelial dysfunction, as well as with the develop(

ment of many socially significant diseases. Despite the obvious pathophysiological consequences, the early responses

of the endothelium to increased NaCl in the extracellular medium remain poorly understood. Consumption of exces(

sive amounts of salt may contribute to pathologies through signals induced by increases in extracellular sodium

[Na⁺]_o, chloride [Cl^-]_i and/or increases in the osmolarity of the extracellular fluids determined by combined increas(

es in [Na⁺]_o and [Cl^-]_i. In the present study we investigated the effects of a short(term increase in the osmolarity of

the extracellular medium on gene transcription and mechanical properties of human umbilical vein endothelial cells.

Hyperosmotic stimulation of these cells with NaCl but not mannitol led to the accumulation of Na⁺ ions inside the

cells and Na,K(ATPase activation and was accompanied by an increase in cell stiffness. Transcription of IL1α

decreased with increasing osmolarity of the extracellular medium, while transcription of ATF3, PAR2, and PTGS2

increased only in response to increasing NaCl concentration. At the same time, the amount of ATF3, PTGS2, and

IL1α mRNA increased upon Na,K(ATPase inhibition by ouabain. However, under the conditions of our experi(

ments, we did not detect significant changes in the expression of the osmoprotective transcription factor NFAT5. The

data obtained allow us to conclude that an increase in [Na⁺]_o can regulate gene expression in endothelial cells inde(

pendently of the osmolarity of the extracellular medium and/or an increase in cell stiffness.

Keywords: sodium, potassium, Na,K(ATPase, endothelium, transcription regulation

БИОХИМИЯ том 87 вып. 5 2022