БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 6, с. 691 - 706

УДК 612.017.1:612.112.31

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МЕТФОРМИНА

В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВАЦИИ ПЕРВИЧНЫХ АСТРОЦИТОВ КРЫСЫ

В СРЕДЕ С ПОВЫШЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ ГЛЮКОЗЫ

М.Г. Сергеева³, Д.В. Чистяков³*

¹ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

факультет биоинженерии и биоинформатики, 119234 Москва, Россия

² Российский университет дружбы народов, 117198 Москва, Россия

³ НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

119992 Москва, Россия; электронная почта: chistyakof@gmail.com

Поступила в редакцию 14.04.2022

После доработки 10.05.2022

Принята к публикации 10.05.2022

Установление взаимосвязи между воспалительными ответами и энергетическим метаболизмом важ-

но для понимания биологии хронических неинфекционных заболеваний. Использование метфор-

мина, препарата для лечения диабета, рассматривается как перспективное направление для терапии

нейродегенеративных заболеваний и других нейропатологий с воспалительной компонентой. Астро-

циты играют важную роль в регуляции энергетического метаболизма и нейровоспаления, поэтому

в работе исследовали влияние метформина на клеточные ответы первичных астроцитов крысы, куль-

тивируемых в среде с повышенной концентрацией глюкозы (22,5 мМ, инкубация в течение 48 ч).

Как воспалительный стимул использовали липополисахарид (LPS). Эффекты метформина оцени-

вали по изменению экспрессии провоспалительных цитокинов и синтеза оксилипинов, детекти-

руемых методом сверхэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии

(UPLC-MS/MS). Изменения на внутриклеточном уровне оценивались по анализу фосфорилиро-

вания ERK-киназы и транскрипционного фактора STAT3, ферментов синтеза оксилипинов цикло-

оксигеназы 1 и 2 (COX). Получено, что независимо от концентрации глюкозы метформин снижал

LPS-стимулированное высвобождение цитокинов IL-1β и IL-6, активность транскрипционного

фактора STAT3, киназы ERK, синтез производных циклооксигеназной ветви метаболизма оксилипи-

нов и анандамида и не влиял на образование АФК. Исследование энергетического фенотипа клеток

показало, что метформин активировал гликолиз и ингибировал митохондриальное дыхание и окис-

лительное фосфорилирование независимо от стимуляции LPS и культивирования клеток при повы-

шенной концентрации глюкозы. Таким образом, показано, что метформин обладает выраженными

антивоспалительными эффектами, а его влияние на синтез цитокинов, простагландинов и других ли-

пидных медиаторов может обуславливать полезные эффекты метформина в моделях нейропатологий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: астроциты, гипергликемия, цитокины, оксилипины, STAT3, ERK, АФК, полинена-

сыщенные жирные кислоты, анандамид, метформин.

DOI: 10.31857/S032097252206001X, EDN: ATTKWG

ВВЕДЕНИЕ

когда противовоспалительные или глюкозо-по-

нижающие препараты используют для лечения

Наличие взаимосвязей между энергетиче-

этих заболеваний. Бигуанид метформин явля-

ским метаболизмом, воспалением и различны-

ется препаратом первой линии (препаратом

ми хроническими неинфекционными заболе-

выбора) при лечении диабета 2го-типа. Глюко-

ваниями подтверждается в серии исследований, зоснижающий эффект метформина в первую

Принятые сокращения: АФК - активные формы кислорода; полиненасыщенные жирные кислоты: АА - арахидоно-

вая, DHA - докозагексаеновая, ЕРА - эйкозапентаеновая; АЕА - эндоканнабиноид анандамид; AMPK - AMP-активи-

рованная протеинкиназа; COX - циклооксигеназы; ECAR - скорость внеклеточного закисления; HG - высокая концен-

трация глюкозы; IL - интерлейкин; LPS - липополисахарид; NG - нормальная концентрация глюкозы; OCR - скорость

потребления кислорода; TNFα - фактор некроза опухолей; PG - простагландины.

* Адресат для корреспонденции.

691

692

ГОРБАТЕНКО и др.

очередь объясняется его способностью регули-

Однако оставались неизученными зависимость

ровать энергетический обмен, включая инги-

эффектов метформина от адаптации астроци-

бирование глюконеогенеза в печени, снижение

тов к разным концентрациям глюкозы и ключе-

всасывания глюкозы и повышение утилизации

вой вопрос: меняются ли при такой адаптации

глюкозы в периферических тканях [1]. На мо-

антивоспалительные свойства метформина. Ра-

лекулярном уровне основным механизмом

нее нами было показано, что получение астро-

действия метформина, как ингибитора глюко-

цитов и их длительное культивирование при

неогенеза, рассматривают ингибирование ком-

высокой концентрации глюкозы сдвигают от-

плекса I дыхательной цепи митохондрий, при-

веты в сторону проявления провоспалительных

водящее к активации AMP-активированной

характеристик [5]. С другой стороны, показано,

протеинкиназы (AMPK) и зависимых от этой

что ингибиторы окислительного фосфорилиро-

киназы процессов [2].

вания влияют на способность астроцитов син-

Исследования последних лет также пока-

тезировать цитокины и оксилипины в ответ на

зали, что метформин оказывает благоприятное

противовоспалительные стимулы [21]. Поэтому

воздействие при патологиях нервной систе-

данная работа была посвящена характеристике

мы [1, 3]. Все эти заболевания характеризуются

воздействия метформина на ответ астроцитов,

наличием хронических воспалительных про-

стимулированных липополисахаридом (LPS).

цессов, определяемых на молекулярном уровне

Астроциты перед стимуляцией культивирова-

системой врождённого иммунитета, а также из-

ли при нормальной (5 мМ, NG) или высокой

менением взаимосвязи воспалительных и энер-

(22,5 мМ, HG) концентрации глюкозы. Прове-

гетических процессов [4, 5]. Найденные на раз-

дена оценка изменения цитокинов и оксилипи-

ных моделях молекулярные механизмы действия

нов, дана характеристика энергетического ме-

метформина указывают на его противовоспали-

таболизма.

тельные свойства, поскольку наблюдали сниже-

ние экспрессии таких маркёров воспалительно-

го процесса, как циклооксигеназа 2 (СОХ-2) и

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

индуцибельная NO синтаза (iNOS), цитокинов

TNFα, IL-6 и IL-1β [6-9]. В то же время отсут-

Реагенты. В работе использовали следу-

ствуют данные по другому классу про- и анти-

ющие реактивы: липополисахарид

(«Sigma-

воспалительных веществ: полиненасыщенным

Aldrich»,

США); метформин гидрохло-

жирным кислотам и их метаболитам, оксилипи-

рид

(«Cayman Chemical Company», США);

нам. Остаётся также неясным, как проявляют-

стрептомицин/пенициллин, трипсин, ЭДТА,

ся антивоспалительные свойства метформина,

бычья сыворотка («ПанЭко», Россия). Культу-

когда наблюдаются и гипергликемия, и воздей-

ральная среда Dulbecco′s Modified Eagle Medium

ствие провоспалительных стимулов.

(DMEM) («Gibco», «Thermo Fisher Scientific»,

Астроциты - это глиальные клетки, кото-

США). Антитела против COX-2, COX-1, p44/42

рые имеют трофическую функцию и участвуют в

MAPK (Erk1/2), фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2,

поддержании гомеостаза [10, 11]. Показано так-

Thr202/Tyr204,), β-тубулина, β-актин, вторич-

же, что астроциты играют важную роль в ней-

ные антитела, конъюгированные с пероксида-

ровоспалении [4, 11]. В настоящее время клетки

зой хрена (кроличьи, мышиные) («Cell Signaling

рассматривают как объекты для создания новых

Technology», США); субстрат для вестерн-бло-

терапевтических подходов, дающих возмож-

та ECL

(«Thermo Fisher Scientific»). Дейте-

ность разработать методы лечения острых травм

рированные стандарты оксилипинов:

6-keto

и хронических заболеваний центральной нерв-

PGF1α-d4, TXB2-d4, PGF2α-d4, PGE2-d4,

ной системы [10, 12]. Помимо их особой роли в

PGD2-d4, LTC4-d5, LTB4-d4, 5(S)-HETE-d8,

нейровоспалении, астроциты вносят основной

12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, Oleoyl Ethanol-

вклад в метаболизм глюкозы в головном мозге и

amide-d4, EPA-d5, DHA-d5 и AA-d8 («Cayman

её запасание в виде гликогена [13]. Опыты in vivo

Chemical Company»). Картриджи Oasis® PRIME

на различных моделях заболеваний нервной си-

HLB (60 мг, 3 мл,) («Waters», Германия).

стемы показали положительный эффект мет-

Первичная культура клеток астроцитов. Пер-

формина и указали на важную роль астроцитов

вичная, обогащённая астроцитами, клеточ-

в этом процессе [14-17]. Эти работы положили

ная культура была выделена из новорождён-

начало исследованиям влияния метформина

ных (одно-, двухдневных) крысят обоих полов

на различные функции астроцитов [12, 18-20].

по методике, описанной ранее [22]. Вкратце,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

693

Таблица 1. Последовательности праймеров к генам маркёров воспаления и конститутивного гена β-актина

Ген

Последовательности праймеров (5′→3′)

прямой

обратный

TNFα

CAAGGAGGAGAAGTTCCCAA

TGATCTGAGTGTGAGGGTCTG

IL-1β

CACCTCTCAAGCAGAGCACAG

GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC

IL-6

CTGGTCTTCTGGAGTTCCGT

TGGTCTTGGTCCTTAGCCAC

β-актин

AGATGACCCAGATCATGTTTGAG

GGCATACAGGGACAACACAG

крысят обезглавливали, вскрывали черепную

тометра NanoPhotometer N («Implen», США).

коробку и извлекали мозг по кусочкам, не за-

Синтез первой цепи проводили с помощью

хватывая соединительнотканные оболочки.

MMLV RT kit («Евроген», Россия) в соответствии

Извлечённый мозг промывали охлаждённым

с инструкцией производителя. Относительный

раствором Пакса (137,0 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl,

уровень экспрессии генов TNFα, IL-1β, IL-6 и

0,44 мМ KH₂PO₄, 0,3 мМ Na₂HPO₄, pH 7,4) и

β-актина (последовательности представлены в

последовательно перетирали через нейлоно-

табл. 1) определяли с помощью количественной

вые сита с порами 250 и 136 мкм. Полученные

ПЦР с SYBR GREEN, используя коммерческий

клетки помещали в культуральные флаконы

5× PCR-HS-SYBR микс, («Евроген»), на ампли-

площадью 75 см² с плотностью 6 × 10⁵ клеток

фикаторе DTlite 4 («DNATechnology», Россия).

на мл и культивировали в среде DMEM, со-

Иммуноблоттинг для оценки внутриклеточных

держащей глюкозу (1 г/литр), 10% бычьей сы-

изменений. Методом иммуноблоттинга оце-

воротки (FBS), стрептомицин (50 ед/мл) и пе-

нивалось изменение фосфорилирования ERK

нициллин (50 мкг/мл), при температуре 37 °C в

MAP-киназы и транскрипционного факто-

атмосфере 5% CO₂. По истечении 5 дней прово-

ра STAT3, а также изменение количества белков

дили первую смену среды с предварительным

циклооксигеназ 1 и 2 (COX-1, COX-2). Для это-

отделением клеток микроглии на орбитальном

го астроциты, прошедшие клеточный экспери-

шейкере OS-20 («Biosan», Латвия), 280 об./мин,

мент, лизировали в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl

90 мин. Получившуюся обогащённую астроци-

(pH 7,4), 1% NP-40 («Sigma Chemicals», США),

тами культуру выращивали следующие 4 дня с

0,25% дезоксихолата натрия, 150 мМ NaCl,

заменой среды каждые 2 дня. Затем клетки про-

1 мМ ЭДТА, 1 мМ Na₃VO₄, 1 мМ NaF) с инги-

мывали раствором Хенкса, отделяли трипсином

биторами протеаз/фосфатаз («Roche Molecular

от поверхности флакона и рассеивали по шести-

Biochemicals», Германия). Концентрацию белка

луночным планшетам с плотностью 750 000 кле-

выравнивали дополнительным разведением.

ток на лунку с добавлением среды DMEM того

По достижении одинаковых концентраций

же состава. За 48 ч до стимуляции клеток LPS

образцы подвергали стандартному SDS-

клеточную среду меняли на DMEM, содержа-

электрофорезу в

10%-ном ПААГ. Перенос

щий глюкозу 1 г/литр или 4,5 г/литр. За 24 ч до

белков на нитроцеллюлозную мембрану с раз-

стимуляции LPS к клеткам добавлялся метфор-

мером пор 0,2 мкм («Bio Rad», США) проводили

мин в концентрации 2,5 мМ. Для данной кон-

по методу полусухого переноса в приборе

центрации метформина был проведён LDH-тест

Trans Blot sd («Bio Rad»). Далее мембраны инку-

(набор для теста производства «Roсhe», США),

бировали в буфере TBS, содержащем 5% обез-

результат, который показал отсутствие цитоток-

жиренного молока и 0,05% (v/v) Tween 20, и

сичности в данной концентрации на клетках,

маркировали первичными антителами против

снимали с помощью планшетного спектрофо-

COX-1, COX-2, p-ERK, ERK, p-STAT3, STAT3

тометра Synergy H4 («BioTek», США) при длине

и β-тубулина. После инкубации мембран с

волны 490 нм (данные не приведены).

раствором вторичных антител анализировали

Оценка изменения экспрессии генов. Сум-

иммуномаркирование с использованием хеми-

марную мРНК выделяли с помощью набора

люминесцентного субстрата. Фотосъёмку мем-

для очистки РНК GeneJET («Thermo Scientific»,

бран проводили с применением камер фирмы

США) в соответствии с инструкцией произво-

«Bio Rad». Для количественного анализа экс-

дителя. Концентрацию РНК определяли спек-

прессии использовали приложение QuantityOne

трофотометрически с помощью спектрофо-

4.6.9 («Bio Rad»).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

694

ГОРБАТЕНКО и др.

Таблица 2. Методика расчёта параметров энергетического метаболизма по скорости потребления кислорода и скорости

внеклеточного закисления, измеряемых с помощью Seahorse XFp

Параметр

Формула расчёта

Базальный гликолиз

(среднее ECAR между добавлением глюкозы и олигомици-

на) - (среднее ECAR перед добавлением глюкозы)

Гликолитическая способность

(среднее ECAR после добавления олигомицина) - (среднее ECAR

перед добавлением глюкозы)

Негликолитическое закисление

среднее ECAR перед добавлением глюкозы

Максимальное дыхание

(среднее OCR после добавления СССР) - (немитохондриальное

потребление кислорода)

Олигомицин-чувствительное потребление

(среднее OCR перед добавлением олигомицина) - (среднее OCR

кислорода

после добавления олигомицина)

Дыхательная ёмкость

(максимальное дыхание) - (базальное дыхание)

UPLC-MS/MS для детекции липидов.

Анализ

энергетического

метаболизма

Для масс-спектрометрического анализа вы-

астроцитов. Энергетический метаболизм кле-

бросов кислот и оксилипинов в клеточную

ток (скорость потребления кислорода (OCR) и

среду к 700 мкл клеточной среды добавля-

скорость внеклеточного закисления (ECAR))

ли 1 мл охлаждённого метанола для осажде-

оценивали с помощью прибора Seahorse XFp

ния белков, после чего липидные компонен-

Analyzer («Seahorse Bioscience», США) в соот-

ты экстрагировали с использованием колонок

ветствии с рекомендациями производителя.

Oasis® PRIME HLB для твердофазной экс-

Для анализа астроциты высевали в количе-

тракции («Waters», Германия), согласно реко-

стве 5000 клеток на лунку и культивировали

мендациям производителя. Концентрирование

на планшетах Seahorse XFp («Agilent», США)

образцов проводили в токе азота. Масс-спек-

в течение 24 ч. Далее среду в лунках планше-

трометрический анализ проводился с исполь-

та заменяли на реакционную, состоящую из

зованием квадрупольного масс-спектрометра

DMEM, 5 мМ HEPES, пирувата натрия (1 мМ),

Shimadzu 8040 («Shimadzu», Япония), который

глутамина (2 мМ), pH 7,4. В каждую лунку вно-

оборудован системой ультра-ВЭЖХ Nexera

сили по 180 мкл этой среды, её же добавляли в

с использованием колонки Phenomenex C8

контрольные лунки. Далее инкубировали клет-

(2,1мм × 150 мм × 2,6 мкм). Регистрацию

ки в реакционной среде в течение 40 мин в ин-

проводили методом мониторинга множе-

кубаторе без CO₂. К клеткам последовательно

ственных реакций по методике, описанной

добавляли 10 мМ глюкозы; 4,5 мкМ ингибито-

ранее [23]. Идентификацию липидов прово-

ра АТФ-синтазы - олигомицина; 10 мкМ ра-

дили с помощью программного обеспечения

зобщителя дыхания и окислительного фос-

LipidMediators 2.0 Shimadzu.

форилирования

- СССР (карбонилцианид

Определение цитокинов при помощи

м-хлорфенилгидразон);

2,5 мкМ ротенона

иммуноферментного анализа. Уровень высво-

и 4 мкМ антимицина А (ингибиторы комплек-

божденного IL-6 был определён с исполь-

сов I и III соответственно). Далее помещали

зованием

коммерческого

набора

для

планшет в прибор и проводили измерения.

детекции IL-6

(«BD Biosciences», США),

После каждой инъекции регистрировали 4 вре-

согласно

рекомендациям производителя.

менные точки с примерно 5-минутным интер-

Детекцию проводили при помощи планшетного

валом между каждой инъекцией. OCR и ECAR

спектрофотометра Synergy H4.

анализировали с помощью программного обес-

Анализ

выброса

активных

форм

печения Seahorse XFp. В соответствии с реко-

кислорода (АФК). Детектирование АФК про-

мендациями производителя рассчитывали ряд

водили с использованием коммерческого на-

параметров энергетического метаболизма и

бора CellROX® Deep Red Reagent («Thermo

функций митохондрий (табл. 2).

Scientific») в соответствии с рекомендациями

Полученные значения ECAR и OCR нор-

производителя. Измерения возбуждение/излу-

мировали на количество клеток в лунках, ко-

чение (640/665 нм) проводили на планшетном

торое определяли с помощью окрашивания

спектрофотометре Synergy H4.

ядер клеток с

4′,6-диамидино-2-фенилиндо-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

695

Рис. 1. Влияние метформина на LPS-стимулированную экспрессию генов цитокинов (TNFα, IL-1β, IL-6). Первичные

астроциты крыс предварительно обрабатывали в течение 24 ч метформином (Met, 2,5 мМ), а затем стимулировали липо-

полисахаридом (LPS, 100 нг/мл) в течение 4 ч. Экспрессию генов определяли методом qPCR, значения были нормализо-

ваны к уровням мРНК β-актина, за единицу принята экспрессия в контрольных клетках. Концентрацию IL-6 определяли

методом ИФА, данные представлены в виде пг/мг белка. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклоне-

ние среднего из трёх независимых экспериментов. * p < 0,05 по сравнению с клетками, культивируемыми в среде с NG;

#p < 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками

лом (DAPI) после метаболического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для этого культуры в планшетах фиксировали

4%-ным параформальдегидом в течение 15 мин

Влияние метформина на LPS-стимулиро-

при 4 °С. Зафиксированные клетки окрашива-

ванный синтез цитокинов в астроцитах,

ли раствором DAPI (300 нМ) в течение 20 мин,

культивируемых при разных концентрациях

после чего получали изображения на конфо-

глюкозы. Ранее было показано, что LPS дей-

кальном микроскопе («Carl Zeiss», Германия).

ствует на астроциты через активацию толл-по-

Далее проводили подсчёт ядер в пяти полях

добных рецепторов типа 4 (ТЛР4) [24], при

зрения для каждой лунки и, взяв среднее от по-

этом происходит активация синтеза провоспа-

лученных значений, получали нормировочный

лительных цитокинов и оксилипинов [23]. Для

коэффициент, в соответствии с которым кор-

оценки влияния метформина мы проанали-

ректировали полученные при анализе метабо-

зировали LPS-стимулированную экспрессию

лизма данные.

генов провоспалительных цитокинов TNFα,

Статистический анализ экспериментальных

IL-1β и IL-6 (рис. 1, а-в). Для IL-6 также были

данных. Данные выражены как сред-

проанализированы данные по высвобождению

нее ± стандартное отклонение. Статистическая

белка (рис. 1, г). Сравнивали клетки, культи-

значимость различий между группами

вируемые перед добавлением стимула 48 ч при

оценивалась с помощью однофакторного

5 мМ (NG, нормальная концентрация глюко-

теста ANOVA с уровнем значимости 0,05.

зы) и 22,5 мМ (HG, модель клеточной гипер-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

696

ГОРБАТЕНКО и др.

Рис. 2. Влияние метформина (Met) на высвобождение оксилипинов и полиненасыщенных жирных кислот в астроцитах,

стимулированных LPS, и экспрессию ферментов СОХ-1 и СОХ-2. Первичные астроциты крыс предварительно обраба-

тывали в течение 24 ч метформином (Met, 2,5 мМ), а затем стимулировали липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) в тече-

ние 4 ч. Концентрации липидов в супернатантах измеряли с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии

и тандемной масс-спектрометрии (UPLC-MS/MS). а - На тепловой карте показаны относительные количества каждого

липидного медиатора по сравнению с контролем NG. На вертикальной оси отмечены клеточные стимулы, а на гори-

зонтальной оси отложено относительное количество каждого липидного медиатора. Метаболиты были разделены на:

липоксигеназный (LOX), циклооксигеназный (COX) и цитохромный/неферментативный (CYP/NE) пути, участвующие

в их синтезе. б и в - Уровни белка COX-1 и COX-2 оценивали с помощью вестерн-блота и нормализовали по отно-

шению к уровню экспрессии β-тубулина; б - результаты денситометрии представлены по отношению к контрольным,

не стимулированным клеткам NG; в - приведены репрезентативные изображения вестерн-блота для соответствующих

белков. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение среднего из трёх независимых экспериментов.

* p < 0,05 по сравнению с нестимулированными клетками; # p < 0,05 при сравнении влияния глюкозы на идентичные

обработки; ^ p < 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками, культивируемыми в среде с соответствующей

концентрацией глюкозы

гликемии) глюкозы. Получено, что ответ на LPS

концентрации глюкозы. На уровне высвобо-

меняется после культивации в HG-глюкозе в

ждения IL-6 во внеклеточную среду также на-

сторону увеличения экспрессии TNFα, IL-6 и

блюдали влияние метформина независимо от

IL-1β. Сам метформин не влиял на экспрессию

концентрации глюкозы (рис. 1, г).

исследуемых веществ, однако снижал LPS-ин-

Зависимость

синтеза

оксилипинов

дуцируемую экспрессию IL-1β независимо от от концентрации глюкозы в астроцитах,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

697

Рис. 3. Влияние глюкозы на активность MAPK, ERK1/2 и транскрипционного фактора STAT3 в астроцитах, предобра-

ботанных метформином и стимулированных LPS. Первичные астроциты крыс предварительно обрабатывали в течение

24 ч метформином (Met, 2,5 мМ), а затем стимулировали липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) в течение 4 ч. Уровни

фосфорилированной формы белка (p-STAT3, p-ERK) и общей формы белка (t-STAT3, t-ERK) оценивали с помощью

вестерн-блота и нормализовали по отношению к уровню экспрессии β-тубулина. а - Результаты денситометрии пред-

ставлены по отношению к контрольным, нестимулированным клеткам. б - Приведены репрезентативные изображения

вестерн-блота для соответствующих белков. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение среднего

из трёх независимых экспериментов. * p < 0,05 по сравнению с контрольными клетками культивируемыми в среде с NG;

# p < 0,05 при сравнении влияния глюкозы на идентичные обработки; ^ p < 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными

клетками, культивируемыми в среде с соответствующей концентрацией глюкозы

стимулированных LPS. Известно, что профиль

лота),

13-HDoHE

(13-гидроксидокозагексае-

синтезируемых астроцитами оксилипинов

новая кислота); 4) оксилипины цитохромного

может быть как про-, так и антивоспалитель-

пути и неферментативного окисления (CYP/

ным по свойствам в зависимости от стимула и

NE) - дигидроксиэйкозатетраеновые кисло-

концентрации глюкозы в среде культивирова-

ты (DiHETE); 5) оксилипины липооксигеназ-

ния [5, 23, 25]. Поэтому мы оценили влияние

ного (LOX) пути - гидроксидокозагексаеновые

метформина на LPS-стимулированный синтез

кислоты (HdoHE), гидроксиоктадекадиеновые

оксилипинов. Данные по 24 анализируемым

кислоты (HODE).

оксилипинам и полиненасыщенным жирным

Получено, что культивация клеток в среде

кислотам представлены на рисунке в Прило-

с HG снижает базовый уровень AA и EPA, при

жении и в виде тепловой карты (рис. 2, а). Де-

этом LPS не влияет на высвобождение кислот

тектируемые соединения можно разделить на

во внеклеточную среду. В среде с NG метфор-

следующие группы:

1) полиненасыщенные

мин стимулирует высвобождение всех кислот

жирные кислоты - арахидоновая (АА), эйкоза-

независимо от стимуляции клеток LPS, при

пентаеновая (ЕРА), докозагексаеновая (DHA);

гипергликемии метформин не влияет на этот

2) эндоканнабиноид анандамид (АЕА) и олеоил-

процесс. Из веществ, которые относят к эндо-

этаноламид (ОЕА);

3) оксилипины цик-

каннабиноидам, LPS стимулировал синтез АЕА

лооксигеназной (СОХ) ветви метаболизма -

вне зависимости от концентрации глюкозы, и

простагландины (PGE2, 6-keto-PGF1a, PGD2,

метформин снижал этот эффект; синтез OEA

PGF2a, PGA2), тромбоксан B2 (TXB2), 11-

оставался неизменным при всех обработках

HETE

(11-гидрокси-эйкозатетраеновая кис- (рис. 2, а и рисунок в Приложении).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

698

ГОРБАТЕНКО и др.

условиях NG без стимула метформин оказывает

стимулирующий эффект на экспрессию СОХ-

2. Данные по экспрессии СОХ-2 согласуются с

наблюдаемым снижением уровня оксилипинов,

которые образуются через циклооксигеназный

путь метаболизма жирных кислот.

Определение внутриклеточных молекулярных

механизмов, участвующих в реализации эффектов

метформина при разных концентрациях глюко-

зы. Известно, что стимуляция астроцитов LPS

приводит к активации митогенактивируемой

протеинкиназы (МАРК) ERK [26] и фактора

Рис. 4. Влияние метформина на продукцию АФК астроци-

транскрипции STAT3 [27]. На макрофагах было

тами, адаптированными к HG и NG при стимуляции LPS.

показано, что метформин снижает LPS-стиму-

Первичные астроциты крыс предварительно обрабатыва-

лированный рост фосфорилирования ERK [28],

ли в течение 24 ч метформином (Met, 2,5 мМ), стимулиро-

вали липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) в течение 24 ч.

а в модели in vivo повреждения спинного мозга

Уровень АФК измеряли с помощью реактива CellROX®

на крысах обнаружено, что метформин снижает

Deep Red Reagent, как описано в разделе «Материалы и

активацию STAT3 в астроцитах [16]. Поэтому в

методы». Значения представляют собой среднее ± стан-

дартное отклонение среднего из трёх независимых экспе-

поиске внутриклеточных сигнальных механиз-

риментов. * p < 0,05 по сравнению с нестимулированными

мов, реализующих эффект метформина при

клетками; # p < 0,05 при сравнении влияния глюкозы на

действии различной концентрации глюкозы,

идентичные обработки

мы использовали метод иммуноблоттинга для

При культивировании клеток в среде с HG

оценки активности ERK-киназы и транскрип-

для метаболитов, синтезируемых по COX-пу-

ционного фактора STAT3 (рис. 3). Получено,

ти, при действии LPS наблюдается снижение

что повышенная концентрация глюкозы снижа-

выброса производных арахидоновой кислоты:

ет активность киназы ERK (рис. 3, а) и не вли-

11-HETE, 6-keto-PGF1a, PGD2, TXB2, PGE2.

яет на STAT3 (рис. 3, б). Активность всех белков

Метформин снижает LPS-стимулированный

при стимуляции LPS не зависит от концентра-

синтез СОХ-производных оксилипинов незави-

ции глюкозы. Метформин снижает эффект

симо от концентрации глюкозы (рис. 2, а и ри-

LPS-стимулируемой активации ERK и STAT3,

сунок в Приложении).

причём этот эффект проявляется независимо от

Для CYP/NE-производных мы не наблю-

присутствия LPS (рис. 3, а и б). Выраженность

дали активации от действия LPS и влияния

клеточного ответа астроцитов при обработке

метформина на эту активацию вне зависимости

метформином меняется в зависимости от кон-

от концентрации глюкозы в среде (рис. 2, а и ри-

центрации глюкозы, при которой культивиру-

сунок в Приложении). Для группы LOX-про-

ются клетки.

изводных наблюдали повышение синтеза

Влияние метформина на LPS-стимулированное

DHA-метаболитов, синтезируемых по этому

образование АФК. Известно, что HG может

ферментативному пути - 8-HDoHE, 13-HDoHE

повышать уровень АФК в глиальных клет-

и 4-HDoHE под действием метформина, причём

ках [29, 30], и при стимуляции клеток LPS ин-

этот эффект наблюдался только в условиях NG.

дуцирует высвобождение АФК [31], поэтому мы

Синтез простагландинов определяет-

охарактеризовали индукцию АФК в наших экс-

ся циклооксигеназами (СОХ): конститутив-

периментальных условиях (рис. 4). Получено,

ной (СОХ-1) и индуцибельной (СОХ-2). Мы

что глюкоза не влияет на базовый уровень АФК,

проверили изменения этих изоформ в тестиру-

но HG увеличивает уровень АФК в ответ на LPS.

емых условиях (рис. 2, б и в). Получено, что в

Метформин не влияет на выброс АФК в данных

нестимулированных клетках экспрессия цикло-

экспериментальных условиях.

оксигеназ СОХ-1 и СОХ-2 не зависит от кон-

Анализ

влияния

метформина

на

центрации глюкозы. Экспрессия СОХ-1 не ме-

энергетический

метаболизм

астроцитов,

няется в ответ на стимулы. Экспрессия СОХ-2

культивируемых при различной концентрации

для HG меньше, по сравнению с условиями NG,

глюкозы при стимуляции LPS. Известно, что мет-

при этом метформин снижает LPS-индуциро-

формин при введении in vivo уменьшает уровень

ванную экспрессию СОХ-2 независимо от кон-

АТФ в гиппокампе и окислительное фосфори-

центрации глюкозы. Интересно отметить, что в

лирование в астроцитах in vitro [15]. Показано,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

699

Рис. 5. Влияние метформина на активность гликолиза астроцитов, адаптированных к HG и NG при стимуляции LPS.

а - Изменение скорости внеклеточного закисления культурами астроцитов при добавлении субстрата гликолиза (глю-

коза), ингибитора окислительного фосфорилирования (олигомицин), разобщителя (СССР) и ингибиторов дыхательной

цепи (ротенон + антимицин А). На диаграммах представлены рассчитываемые по ECAR базальный гликолиз (б), глико-

литическая способность (в) и негликолитическое закисление (г). Значения представляют собой среднее ± стандартное

отклонение среднего из трёх независимых экспериментов, за 100% взято значение ECAR в нестимулированных клет-

ках NG. * p < 0,05 по сравнению с нестимулированными клетками NG; # p < 0,05 при сравнении влияния глюкозы на

идентичные обработки; ^ p < 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками, культивируемыми в среде с соот-

ветствующей концентрацией глюкозы

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

701

что высокий уровень глюкозы в среде культи-

условиях и после последовательного добавле-

вирования влияет на энергетический метабо-

ния веществ, влияющих на перенос электронов

лизм астроцитов [29]. Однако ранее не было

в дыхательной цепи и окислительное фосфори-

проведено сравнения изменения LPS-стимули-

лирование (рис. 6).

рованного энергетического метаболизма астро-

Сравнительный анализ дыхания астроци-

цитов, культивируемых при различных уровнях

тов, культивированных в средах с разным со-

глюкозы, не оценена возможность модуляции

держанием глюкозы, показал, что культуры

метформином этого процесса. Для характери-

значимо не отличались по таким параметрам,

стики изменений дыхания и гликолиза в куль-

как базальное дыхание, максимальное дыха-

тивируемых астроцитах мы использовали ана-

ние после добавления разобщителя и олигоми-

лизатор метаболических потоков Seahorse XFp:

цин-чувствительное потребление кислорода.

оценивали скорость внеклеточного закисления

Однако культивирование астроцитов в среде

(ECAR, мpH/мин) и скорость потребления кис-

с HG приводило к повышенному уровню па-

лорода (OCR, пмоль О₂/мин).

раметра дыхательной ёмкости, которая рас-

Влияние метформина на ECAR в LPS-

считывается как разница между максимальным

стимулированных астроцитах. Анализ скорости

разобщённым дыханием и базальным дыха-

внеклеточного закисления астроцитов, стиму-

нием (после добавления D-глюкозы) (рис. 6).

лированных LPS и предварительно обработан-

При этом метформин значительно снижал как

ных метформином по сравнению с клетками,

базальное дыхание, так и скорость максималь-

не обработанными LPS, представлен на рис. 5.

ного дыхания после разобщителя и олигоми-

Каждая кривая на рис. 5 описывает изменение

цин-чувствительное дыхание вне зависимости

ECAR в клетках в исходных условиях (при от-

от концентрации глюкозы в среде, повышая

сутствии глюкозы в реакционной среде), а так-

при этом свободную дыхательную способность

же после добавления D-глюкозы, олигомицина,

астроцитов. Важно отметить, что предобработ-

СССР и ротенона с антимицином А. Каждой

ка астроцитов метформином перед стимуляци-

точке соответствуют усреднённые значения из-

ей клеток LPS повышала дыхательную ёмкость,

мерений из трёх лунок для каждой из сравнива-

но только для астроцитов, культивируемых в

емых культур астроцитов (рис. 5, а).

среде с NG, не влияя на клетки, культивируе-

Анализ энергетического метаболизма куль-

мые в среде с HG.

тур астроцитов показал, что культивирование

астроцитов в среде с HG снижает уровень ба-

зального гликолиза и гликолитической способ-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ности как в нативных, так и в LPS-стимулиро-

ванных клетках, при этом увеличивая уровень

В настоящее время предложены различные

негликолитического закисления (рис. 5, г). LPS

экспериментальные клеточные модели гипер-

при описанном протоколе инкубаций не вли-

гликемии астроцитов (с различными концен-

ял на уровень базального гликолиза, гликоли-

трациями глюкозы и временем обработки), в

тическую способность или негликолитическое

которых сообщалось о сдвиге клеточного отве-

закисление. При этом культивирование кле-

та в сторону увеличения экспрессии и высвобо-

ток в среде с HG снижало уровень базального

ждения провоспалительных цитокинов [22, 30,

гликолиза как в контрольных клетках, так и в

31]. Полученные нами данные на модели 48 ч

LPS-стимулированных клетках. В то же время

предобработки клеток высокой концентрацией

предобработка астроцитов метформином перед

глюкозы также показывают, что ответ на LPS

стимуляцией LPS повышала уровень базально-

сдвигается в сторону увеличения синтеза

го гликолиза по сравнению с LPS-стимулиро-

TNFα, IL-6 и IL-1β. При этом метформин сни-

ванными клетками, но не влияла на гликолити-

жает высвобождение цитокинов независимо от

ческую способность.

концентрации глюкозы, снижая синтез интер-

Влияние метформина на OCR в LPS-

лейкинов IL-1β и IL-6. Ранее в литературе была

стимулированных астроцитах. Мы оценили вли-

показана антивоспалительная способность

яние метформина и LPS на астроциты, куль-

метформина, предобработка которым способна

тивируемые в среде с нормальной (5 мМ) и

снижать экспрессию IL-6 в LPS-стимулирован-

повышенной (22,5 мМ) концентрацией глюко-

ных макрофагах [32], а также снижает выброс

зы; на скорость потребления кислорода (OCR),

IL-1β в клеточной линии BV2 [33]. Интерес-

отражающую клеточное дыхание, в базальных

но, что в нашей модели не было влияния мет-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

702

ГОРБАТЕНКО и др.

формина на TNFα, что отмечалось и на линии

В контексте взаимосвязи энергетических

микроглии [33]. Можно заключить, что анти-

процессов клеток и их способностью отвечать

воспалительные эффекты метформина схожи

на действие провоспалительных стимулов наи-

для различных типов клеток, не зависят от кон-

менее изученной остаётся система метаболиз-

центрации глюкозы в среде, однако имеют мно-

ма оксилипинов. Ранее нами было проведе-

жественные точки воздействия на сигнальные

но сравнение LPS-стимулированного синтеза

пути, что может давать вариации для различных

оксилипинов на астроцитах, которые были с

цитокинов в контексте специфичности их регу-

самого начала выделения адаптированы к NG

ляции в разных типах клеток.

или HG в течение 12 дней [5]. Такая длитель-

В пользу предположения о непрямой связи

ная адаптация клеток к глюкозе приводила к

между антигликемическими и противовоспа-

сдвигу в сторону провоспалительного состо-

лительными эффектами метформина указыва-

яния у HG-культур: увеличение оксилипинов

ют и полученные нами данные о независимом

СОХ-ветви метаболизма, при этом проявлялась

от гипергликемии воздействии метформина

толерантность клеток к действию LPS, т.е. сни-

на активность транскрипционного факто-

жение индуцируемого синтеза в условиях ги-

ра STAT3. Ранее в модели in vivo повреждения

пергликемии. Сравнивая модели обработки

спинного мозга на крысах было показано, что

астроцитов глюкозой в течение 12 дней [5] и

метформин снижает активацию STAT3 в астро-

2 дней, можно отметить сходство по направле-

цитах [16]. Наши данные in vitro по снижению

нию эффекта глюкозы на синтез индуцируемых

активности STAT3 при действии метформина

СОХ-производных, хотя при 12 днях инкубации

согласуются с этим исследованием. Эффект

в среде с HG эффекты толерантности значи-

метформина проявляется независимо от

тельно более выраженные.

стимуляции LPS, хотя усиливается в его при-

Различия между моделями наблюдались

сутствии. Ранее также была показана взаимо-

по высвобождаемым кислотам. При гипергли-

связь LPS, STAT3 и IL-6 в клетках мозга и за-

кемии для 12-дневной культуры детектирова-

висимость синтеза IL-6 от уровня активности

ли увеличение высвобождаемых полиненасы-

STAT3 [34]. Наши данные также указывают на

щенных жирных кислот (АА, DHA, EPA), для

возможность существования такой взаимосвя-

2-дневной обработки детектировали снижение

зи, поскольку мы наблюдали снижение уровней

выброса АА и EPA. Метформин не оказывал

высвобождения IL-6 и активности STAT3 при

эффекта на высвобождение кислот в услови-

действии метформина. Интересно, что более

ях HG, однако значительно увеличивал концен-

выраженный эффект метформина, как анти-

трацию кислот в условиях NG. Механизм этого

воспалительного вещества, наблюдается при

не ясен, однако имеющиеся данные позволяют

культивации клеток в среде с NG.

сделать предположение о независимой регу-

Ранее было показано, что метформин сни-

ляции синтеза оксилипинов и высвобождения

жает LPS-стимулированный рост фосфорили-

полиненасыщенных жирных кислот во внекле-

рования ERK в макрофагах [28]. Известно, что

точную среду, высказанное нами ранее [5].

стимуляция астроцитов LPS приводит к акти-

При действии LPS наблюдалось значитель-

вации ERK [26]. Наши результаты показывают,

ное увеличение синтеза производных СОХ-вет-

что метформин снижает LPS-стимулированную

ви метаболизма оксилипинов как в услови-

активность ERK вне зависимости от концен-

ях NG, так и в HG, при этом в условиях HG

трации глюкозы. Интересно, что активность

ответ был менее выраженным по сравнению

ERK в клетках, культивируемых при высокой

с NG. Это соответствует данным, полученным

концентрации глюкозы, значительно ингибиру-

с 12-дневной моделью. Данные по экспрессии

ется в присутствии метформина и без стимуля-

СОХ-2 согласуются с наблюдаемым снижени-

ции LPS. Хотя сложно сопоставлять первичные

ем уровня оксилипинов, синтезируемых по

клетки и линии клеток, следует отметить, что

СОХ-ветви метаболизма, при этом метформин

на линии SH-SY5Y (нейробластома) снижение

ингибировал синтез этих соединений.

активности ERK наблюдали при дефиците глю-

Из детектируемых оксилипинов значимое

козы в среде культивирования [35]. Заманчиво

различие проявлял эндогенный каннабиноид

предположить, что есть система, которая регу-

анандамид (АЕА), синтез которого при стиму-

лирует гомеостаз клеток относительно откло-

ляции LPS был увеличен при HG. В литера-

нения концентрации внеклеточной глюкозы от

туре практически отсутствуют исследования

нормы, и ERK относится к этой системе.

в этой области, не понятна до конца роль са-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

703

мого анандамида. В модели диабета на крысах

количества дыхательных комплексов в мито-

было показано, что терапия животных ананда-

хондриях). Ранее показано, что метформин на

мидом снижала депрессивно-подобное пове-

астроцитах усиливал потребление глюкозы и

дение и параметры окислительного стресса у

выделение лактата, блокировал цикл трикар-

животных [36], т.е. можно предположить, что

боновых кислот и дыхание митохондрий [20].

анандамид, скорее, можно отнести к антивос-

Следует отметить, что стимуляция 4 ч LPS не

палительным соединениям. Однако в нашей

приводит к значимым изменениям в энергети-

экспериментальной модели метформин инги-

ческом метаболизме клеток, культивируемых в

бировал синтез АЕА, что соответствует данным

нормальных условиях. Некоторые изменения

на других тканях, где АЕА в крови был маркё-

видны для клеток, культивируемых в условиях

ром заболевания, а введение метформина сни-

гипергликемии, но неясно, оказывают ли эти

жало концентрацию АЕА и выраженность син-

изменения влияние на синтез цитокинов и ок-

дрома поликистоза яичников [37].

силипинов при воспалительном ответе.

Известно, что условия гипергликемии вы-

Интересно наблюдаемое явление - повы-

зывают в глиальных клетках увеличение про-

шение базального гликолиза и снижение ба-

дукции АФК [38, 31]. На кардиомиоцитах было

зального митохондриального дыхания, окисли-

показано, что LPS стимулирует АФК и эффект

тельного фосфорилирования и максимального

усиливается при повышении концентрации

дыхания под действием метформина, что ха-

глюкозы [39]. Мы наблюдали увеличение вы-

рактеризует метаболическое перепрограммиро-

броса АФК астроцитами при стимуляции

вание астроцитов, ведущее к изменению типа

клеток LPS, при этом повышение концен-

биоэнергетики с преимущественно аэробного

трации глюкозы усиливало выброс цитоплаз-

дыхания на гликолиз. Данное явление впер-

матических АФК. Интересно, что метформин

вые было описано Варбургом для опухолевых

не оказывал эффекта на LPS-стимулируемый

клеток, однако к настоящему времени Вар-

синтез АФК независимо от концентрации глю-

бург-подобный сдвиг энергетического метабо-

козы, что совпадает с ранее полученными дан-

лизма известен для множества типов клеток, в

ными для макрофагов [40].

том числе и для клеток мозга [41]. Механизмы,

Мы наблюдали независимость гликоли-

лежащие в основе переключения метаболиз-

тической способности астроцитов от всех об-

ма с митохондриального дыхания на преиму-

работок (концентрации глюкозы, стимуляция

щественно гликолитические, включают в себя

LPS, добавление метформина или метформина

активацию транспорта глюкозы (в том числе

с LPS), повышение при гипергликемии негли-

через усиление экспрессии GLUT1) и фермен-

колитического закисления при всех обработ-

тов гликолиза (например, гексокиназы). Также

ках. Метформин оказывал влияние только на

регуляторным звеном в снижении митохон-

базальный гликолиз, причём независимо от

дриального дыхания и параллельном увеличе-

того, при какой концентрации глюкозы активи-

нии гликолитического метаболизма является

ровали клетки. Интересно, что такое же, толь-

пируватдегидрогеназный комплекс, который

ко с обратным знаком, влияние метформин

направляет продукт гликолиза (пируват) на

оказывал на базальное дыхание митохондрий

окисление в митохондрии [42], при его инги-

и окислительное фосфорилирование. Ранее в

бировании происходит снижение дыхания и

работе Li et al. [15] на астроцитах мыши было

усиление гликолиза. Для раковых клеток уже

показано, что миллимолярная доза метформи-

было показано, что метформин способствует

на снижает окислительное фосфорилирование

метаболическому сдвигу в сторону гликолиза, в

в клетках. При этом в проведённых нами экс-

частности через активацию GLUT1 [43]. Анало-

периментах метформин значительно снижал

гичные изменения известны для лимфоцитов,

как базальное дыхание, так и максимальное

где усиление потребления глюкозы также свя-

(стимулированное разобщителем) дыхание, и

зано с инсулиновым сигналингом и усилением

олигомицин-чувствительное дыхание (отража-

экспрессии GLUT1 [44]. Мы впервые в данной

ет активность окислительного фосфорилиро-

работе показываем Варбург-подобный эф-

вания) независимо от концентрации глюкозы в

фект у астроцитов, который может иметь очень

среде, при этом повышая дыхательную ёмкость

важное значение для работы мозга. Известно,

астроцитов, т.е. возможность увеличивать по-

что одним из наиболее активно используемых

требление кислорода при действии разобщи-

энергетических субстратов для нейронов яв-

теля (что косвенно указывает на возрастание

ляется лактат, причём производят его в основ-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

704

ГОРБАТЕНКО и др.

ном астроциты, выбрасывая во внеклеточное

лительные эффекты метформина не связаны

пространство, откуда его поглощают близлежа-

напрямую с его влиянием на энергетический

щие нейроны [45]. То есть астроглия выполня-

метаболизм. Такая разобщённость между двумя

ет роль производителя основного топлива для

эффектами (влияние на энергетический обмен

работы нейронов. При действии метформина

и антивоспалительный эффект), обнаруженная

основной наблюдаемый нами эффект - увели-

нами при применении метформина, должна

чение закисления внеклеточной среды в резуль-

быть учтена при разработке терапевтических

тате выброса лактата. Таким образом, усиление

подходов, сфокусированных на модуляции

гликолиза может обуславливать увеличение

функций астроцитов в различных патологиях

трофических функций астроцитов. Отметим

нервной системы.

также, что митохондрии являются одним из ос-

новных потребителей жирных кислот, которые

Финансирование. Работа выполнена при

выполняют функцию энергетического субстра-

финансовой поддержке Российского научного

та, поэтому уменьшение митохондриального

фонда (грант № 20-74-00068).

дыхания при действии метформина может при-

Благодарности. Мы благодарны Програм-

водить и к модуляциям синтеза оксилипинов.

ме развития МГУ за предоставленный доступ к

В настоящее время метформин считается

конфокальному микроскопу Zeiss LSM900.

привлекательным препаратом для терапии ней-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

ровоспаления, однако в ряде случаев отмечают-

отсутствии конфликта интересов.

ся и побочные эффекты его применения [14].

Соблюдение этических норм. Работу с ла-

Эффекты метформина связывают в первую

бораторными животными проводили в соот-

очередь с его способностью регулировать энер-

ветствии с требованиями Комиссии по био-

гетические процессы в клетках. Астроциты яв-

этике НИИ физико-химической биологии

ляются глиальными клетками, которые играют

им. А.Н. Белозерского. Все манипуляции вы-

ключевую роль в обмене глюкозы и в поддержа-

полняли в соответствии с руководством Феде-

нии гомеостаза нервной системы, в том числе

рации европейских научных ассоциаций по ла-

регуляции ответов врождённого иммунитета

бораторным животным.

при различных воздействиях. В нашей работе

Дополнительные материалы. Приложе-

выявлено, что на астроцитах, отвечающих на

ние к статье опубликовано на сайте журнала

провоспалительный стимул LPS, антивоспа-

«Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bai, B., and Chen, H. (2021) Metformin: A novel

its inflammatory response via AMPK-PTEN pathway

weapon against inflammation, Front. Pharmacol., 12,

in vascular smooth muscle cells, Biochem. Biophys. Res.

622262, doi: 10.3389/fphar.2021.622262.

Commun., 425, 866-872.

2. Foretz, M., Guigas, B., and Viollet, B. (2019) Un-

7. Jing, Y., Wu, F., Li, D., Yang, L., Li, Q., and Li, R.

derstanding the glucoregulatory mechanisms of met-

(2018) Metformin improves obesity-associated inflam-

formin in type 2 diabetes mellitus, Nat. Rev. Endocri-

mation by altering macrophages polarization, Mol.

nol., 15, 569-589, doi: 10.1038/s41574-019-0242-2.

Cell. Endocrinol., 461, 256-264.

3. Markowicz-Piasecka, M., Sikora, J., Szydłows-

8. Qi, T., Chen, Y., Li, H., Pei, Y., Woo, S. L., et al.

ka, A., Skupień, A., Mikiciuk-Olasik, E., et al. (2017)

(2017) A role for PFKFB3/iPFK2 in metformin sup-

Metformin - a future therapy for neurodegenerative

pression of adipocyte inflammatory responses, J. Mol.

diseases, Pharm. Res., 34, 2614-2627, doi: 10.1007/

Endocrinol., 59, 49-59.

s11095-017-2199-y.

9. Zhou, J., Massey, S., Story, D., and Li, L. (2018) Met-

4. Chistyakov, D. V., Astakhova, A. A., and Sergee-

formin: An old drug with new applications, Int. J. Mol.

va, M. G. (2018) Resolution of inflammation and

Sci., 19, 2863, doi: 10.3390/ĳ ms19102863.

mood disorders, Exp. Mol. Pathol., 105, 190-201,

10. Escartin, C., Galea, E., Lakatos, A., O’Callaghan,

doi: 10.1016/j.yexmp.2018.08.002.

J. P., Petzold, G. C., et al. (2021) Reactive astrocyte

5. Chistyakov, D. V., Goriainov, S. V., Astakhova, A. A.,

nomenclature, definitions, and future directions, Nat.

and Sergeeva, M. G. (2021) High glucose shifts the

Neurosci., 24, 312-325.

oxylipin profiles in the astrocytes towards pro-inflam-

11. Linnerbauer, M., Wheeler, M. A., and Quintana, F. J.

matory statesm, Metabolites, 11, 311, doi: 10.3390/

(2020) Astrocyte crosstalk in CNS inflammation, Neu-

metabo11050311.

ron, 108, 608-622.

6. Kim, S. A., and Choi, H. C. (2012) Metformin inhib- 12. Lalo, U., and Pankratov, Y. (2021) Astrocytes as per-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕТФОРМИНА В АСТРОЦИТАХ

705

spective targets of exercise- and caloric restriction-mi-

ulation of the primary astrocyte-enriched cultures’ ox-

metics, Neurochem. Res., 46, 2746-2759.

ylipin profiles reduces neurotoxicity, Metabolites, 11,

13.

Bélanger, M., Allaman, I., and Magistretti, P. J. (2011)

498, doi: 10.3390/metabo11080498.

Brain energy metabolism: Focus on Astrocyte-neuron

26.

Gong, P., Xu, X., Shi, J., Ni, L., Huang, Q., et al.

metabolic cooperation, Cell Metab., 14, 724-738.

(2013) Phosphorylation of mitogen- and stress-activat-

14.

Rotermund, C., Machetanz, G., and Fitzgerald, J. C.

ed protein kinase-1 in astrocytic inflammation: A pos-

(2018) The therapeutic potential of metformin in neu-

sible role in inhibiting production of inflammatory

rodegenerative diseases, Front. Endocrinol. (Lausanne),

cytokines, PLoS One, 8, e81747, doi: 10.1371/journal.

9, 400, doi: 10.3389/fendo.2018.00400.

pone.0081747.

15.

Li, W., Chaudhari, K., Shetty, R., Winters, A.,

27.

Liu, X., Tian, Y., Lu, N., Gin, T., Cheng, C. H. K.,

Gao, X., et al. (2019) Metformin alters locomotor and

et al. (2013) Stat3 inhibition attenuates mechanical al-

cognitive function and brain metabolism in normogly-

lodynia through transcriptional regulation of chemo-

cemic mice, Aging Dis., 10, 949-963.

kine expression in spinal astrocytes, PLoS One, 8,

16.

Ge, A., Wang, S., Miao, B., and Yan, M. (2018) Ef-

e75804, doi: 10.1371/journal.pone.0075804.

fects of metformin on the expression of AMPK and

28.

Kim, J., Kwak, H. J., Cha, J. Y., Jeong, Y. S., Rhee,

STAT3 in the spinal dorsal horn of rats with neuro-

S. D., et al. (2014) Metformin suppresses lipopoly-

pathic pain, Mol. Med. Rep., 17, 5229-5237.

saccharide (LPS)-induced inflammatory response in

17.

Ou, Z., Kong, X., Sun, X., He, X., Zhang, L., et al.

murine macrophages via Activating Transcription Fac-

(2018) Metformin treatment prevents amyloid plaque

tor-3 (ATF-3) induction, J. Biol. Chem., 289, 23246-

deposition and memory impairment in APP/PS1

23255.

mice, Brain. Behav. Immun., 69, 351-363.

29.

Li, W., Choudhury, G. R., Winters, A., Prah, J.,

18.

Wang, G., Cui, W., Chen, S., Shao, Z., Li, Y., et al.

Lin, W., et al. (2018) Hyperglycemia alters astrocyte

(2021) Metformin alleviates high glucose-induced ER

metabolism and inhibits astrocyte proliferation, Aging

stress and inflammation by inhibiting the interaction

Dis., 9, 674-684.

between caveolin1 and AMPKα in rat astrocytes, Bio-

30.

Quincozes-Santos, A., Bobermin, L. D., de Assis,

chem. Biophys. Res. Commun., 534, 908-913.

A. M., Gonçalves, C. A., and Souza, D. O. (2017)

19.

Hohnholt, M. C., Blumrich, E. M., Waagepetersen,

Fluctuations in glucose levels induce glial toxicity

H. S., and Dringen, R. (2017) The antidiabetic drug

with glutamatergic, oxidative and inflammatory impli-

metformin decreases mitochondrial respiration and

cations, Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis., 1863,

tricarboxylic acid cycle activity in cultured primary rat

1-14.

astrocytes, J. Neurosci. Res., 95, 2307-2320.

31.

Wang, J., Li, G., Wang, Z., Zhang, X., Yao, L., et al.

20.

Westhaus, A., Blumrich, E. M., and Dringen, R.

(2012) High glucose-induced expression of inflamma-

(2017) The antidiabetic drug metformin stimulates gly-

tory cytokines and reactive oxygen species in cultured

colytic lactate production in cultured primary rat as-

astrocytes, Neuroscience, 202, 58-68.

trocytes, Neurochem. Res., 42, 294-305.

32.

Xian, H., Liu, Y., Rundberg Nilsson, A.,

21.

Astakhova, A., Chistyakov, D., Thomas, D.,

Gatchalian, R., Crother, T. R., et al. (2021) Metformin

Geisslinger, G., Brüne, B., et al. (2019) Inhibitors of

inhibition of mitochondrial ATP and DNA synthesis

oxidative phosphorylation modulate astrocyte inflam-

abrogates NLRP3 inflammasome activation and pul-

matory responses through AMPK-dependent Ptgs2

monary inflammation, Immunity, 54, 1463-1477.e11.

mRNA stabilization, Cells, 8, 1185.

33.

Tayara, K., Espinosa-Oliva, A. M., García-Domín-

22.

Chistyakov, D. V, Azbukina, N. V, Astakhova, A. A.,

guez, I., Ismaiel, A. A., Boza-Serrano, A., et al. (2018)

Polozhintsev, A. I., Sergeeva, M. G., et al. (2019) Toll-

Divergent effects of metformin on an inflammatory

like receptors control p38 and JNK MAPK signaling

model of Parkinson’s disease, Front. Cell. Neurosci.,

pathways in rat astrocytes differently, when cultured

12.

in normal or high glucose concentrations, Neurochem.

34.

Beurel, E., and Jope, R. S. (2009) Lipopolysaccha-

Int., 131, 104513, doi 10.1016/j.neuint.2019.104513.

ride-induced interleukin-6 production is controlled by

23.

Chistyakov, D. V., Gavrish, G. E., Goriainov, S. V.,

glycogen synthase kinase-3 and STAT3 in the brain,

Chistyakov, V. V., Astakhova, A. A., et al. (2020) Ox-

J. Neuroinflamm., 6, 9, doi: 10.1186/1742-2094-6-9.

ylipin profiles as functional characteristics of acute

35.

Lamichhane, S., Bastola, T., Pariyar, R., Lee, E. S.,

inflammatory responses in astrocytes pre-treated with

Lee, H. S., et al. (2017) ROS production and ERK

IL-4, IL-10, or LPS, Int. J. Mol. Sci., 21, 1780.

activity are involved in the effects of D-β-hydroxybu-

24.

Chistyakov, D. V., Aleshin, S. E., Astakhova, A. A..,

tyrate and metformin in a glucose deficient condition,

Sergeeva, M. G., and Reiser, G. (2015) Regulation of

Int. J. Mol. Sci., 18, 674, doi: 10.3390/ĳ ms18030674.

peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) α

36.

De Morais, H., de Souza, C. P., da Silva, L. M., Fer-

and -γ of rat brain astrocytes in the course of activation

reira, D. M., Baggio, C. H., et al. (2016) Anandamide

by toll-like receptor agonists, J. Neurochem., 134, 113-

reverses depressive-like behavior, neurochemical ab-

124.

normalities and oxidative-stress parameters in strepto-

25.

Guryleva, M. V., Chistyakov, D. V., Lopachev, A. V.,

zotocin-diabetic rats: role of CB1 receptors, Eur. Neu-

Goriainov, S. V., Astakhova, A. A., et al. (2021) Mod-

ropsychopharmacol., 26, 1590-1600.

2 БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022

706

ГОРБАТЕНКО и др.

37. Cui, N., Feng, X., Zhao, Z., Zhang, J., Xu, Y., et al.

41. Barros, L. F., Ruminot, I., San Martín, A.,

(2017) Restored plasma anandamide and endometrial

Lerchundi, R., Fernández-Moncada, I., et al. (2021)

expression of fatty acid amide hydrolase in women with

Aerobic glycolysis in the brain: Warburg and Crabtree

polycystic ovary syndrome by the combination use of

Contra Pasteur, Neurochem. Res., 46, 15-22.

Diane-35 and metformin, Clin. Ther., 39, 751-758.

42. Zhang, J., Zhang, L., Nie, J., Lin, Y., Li, Y., et al.

38. Quan, Y., Jiang, C. T., Xue, B., Zhu, S. G., and

(2021). Calcineurin inactivation inhibits pyruvate

Wang, X. (2011) High glucose stimulates TNFα and

dehydrogenase complex activity and induces the

MCP-1 expression in rat microglia via ROS and NF-

Warburg effect, Oncogene, 40, 6692-6702.

κB pathways, Acta Pharmacol. Sin., 32, 188-193.

43. Alhourani, A. H., Tidwell, T. R., Bokil, A. A.,

39. Qiu, Z., He, Y., Ming, H., Lei, S., Leng, Y., et al.

Røsland, G. V., Tronstad, K. J., et al.

(2021).

(2019) Lipopolysaccharide (LPS) aggravates high

Metformin treatment response is dependent on

glucose- and hypoxia/reoxygenation-induced in-

glucose growth conditions and metabolic phenotype

jury through activating ROS-Dependent NLRP3

in colorectal cancer cells, Sci. Rep., 11, 1-10.

inflammasome-mediated pyroptosis in H9C2 car-

44. Frauwirth, K. A., Riley, J. L., Harris, M. H., Parry,

diomyocytes, J. Diabetes Res.,

2019,

8151836,

R. V., Rathmell, J. C., et al. (2002). The CD28

doi: 10.1155/2019/8151836.

signaling pathway regulates glucose metabolism,

40. Kajiwara, C., Kusaka, Y., Kimura, S., Yamaguchi, T.,

Immunity,

16,

769-777, doi:

10.1016/s1074-

Nanjo, Y., et al. (2018) Metformin mediates protec-

7613(02)00323-0.

tion against legionella pneumonia through activation

45. Mason, S. (2017). Lactate shuttles in neuroenergetics-

of AMPK and mitochondrial reactive oxygen species,

homeostasis, allostasis and beyond, Front. Neurosci.,

J. Immunol., 200, 623-631.

11, 43, doi: 10.3389/fnins.2017.00043.

ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES OF METFORMIN

DURING CULTIVATION OF PRIMARY RAT ASTROCYTES

IN A MEDIUM WITH HIGH GLUCOSE CONCENTRATION

V. O. Gorbatenko¹, S. V. Goriainov², V. A. Babenko³,

E. Yu. Plotnikov³, M. G. Sergeeva³, and D. V. Chistyakov³*

¹ Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University,

119234 Moscow, Russia

² Peoples’ Friendship University of Russia (RUDN University),

117198 Moscow, Russia

³ Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119992 Moscow, Russia; e-mail chistyakof@gmail.com

Investigation of the relationship between inflammation and energy metabolism is important for understanding

the biology of chronic noncommunicable diseases. The use of metformin, a drug for the treatment of diabetes,

is considered as a promising direction for the treatment of neurodegenerative diseases and other neuropathol-

ogy’s with an inflammatory component. Astrocytes play an important role in the regulation of energy metabo-

lism and neuroinflammation; therefore, we studied the effect of metformin on the cellular responses of primary

rat astrocytes cultured in a medium with high glucose concentration (incubation for 48 h, 22.5 mM). Lipopoly-

saccharide (LPS) was used as an inflammatory stimulus. The effects of metformin were assessed by changes

in the expression of proinflammatory cytokines and the synthesis of oxylipins, detected by ultra-high-perfor-

mance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Changes at the intracellular

level were assessed by analyzing the phosphorylation of ERK kinase and the transcription factor STAT3, cyclo-

oxygenase 1 and 2 (COX) oxylipin synthesis enzymes. It was found that, regardless of glucose concentration,

metformin reduces the LPS-stimulated release of cytokines IL-1β and IL-6, the activity of the transcription

factor STAT3, ERK kinase, the synthesis of derivatives of the cyclooxygenase branch of metabolism of oxylipins

and anandamide, and did not affect the formation of ROS. The study of the energy phenotype of cells showed

that metformin activated glycolysis and inhibited mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation,

regardless of LPS stimulation and cell cultivation in high glucose concentration. Thus, it has been shown that

metformin has anti-inflammatory effects, and its effect on the synthesis of cytokines, prostaglandins, and other

lipid mediators can determine the beneficial effects of metformin in models of neuropathology.

Keywords: astrocytes, hyperglycemia, cytokines, oxylipins, STAT3, ERK, ROS, polyunsaturated fatty acids, anan-

damide, metformin

БИОХИМИЯ том 87 вып. 6 2022