БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 7, с. 918 - 932

УДК 57.088

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ УГЛЕВОД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

Т.А. Горшкова³, Н.В. Бовин¹, Н.В. Шилова¹

¹ ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия; электронная почта: nikiforovaalica@gmail.com

² ИФ ФИЦ Коми НЦ УрО РАН,

167982 Сыктывкар, Россия

³ ФИЦ «Казанский научный центр РАН», Казанский институт биохимии и биофизики,

420111 Казань, Россия

Поступила в редакцию 02.06.2022

После доработки 20.06.2022

Принята к публикации 20.06.2022

Специфичность большинства углевод-связывающих белков растений либо не изучалась, либо оха-

рактеризована ограниченно, о многих из них известно лишь благодаря биоинформатическому ана-

лизу геномов. Задачу расшифровки углеводной специфичности белков позволяют решать глико-

эрреи - систематические наборы большого количества гликанов, как правило, иммобилизованных на

подложке (подложку с гликоэрреем называют гликочипом). Растительные углеводы являются наибо-

лее естественными лигандами для изучения растительных белков. В представленной работе показано,

что растительные полисахариды без дополнительной модификации иммобилизуются на поверхно-

сти, несущей активированные N-гидроксисукцинимидом карбоксильные группы. С использованием

этого подхода был сконструирован эррей, состоящий из 113 хорошо охарактеризованных раститель-

ных полисахаридов, выделенных из клеточных стенок различных растений, 23 олиго-моносахарида,

являющихся компонентами некоторых растительных полисахаридов и гликозилированных белков,

а также ряда лигандов широко известных растительных лектинов. При химической иммобилизации

полисахаридов их функциональная активность сохранялась, что следует из результатов взаимодей-

ствия с моноклональными и поликлональными антителами и растительным лектином - рицином.

С помощью гликоэррея была найдена ранее неизвестная способность рицина связывать полисахари-

ды клеточных стенок, что значительно расширяет представление о его специфичности. Также в пери-

ферической крови человека обнаружено наличие множества антител к пектинам и гемицеллюлозам.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: углевод-связывающие белки, растительные лектины, растительные полисахариды,

пектины, полисахаридный гликоэррей, гликочип, INRA-RU2, антигликановые антитела человека.

DOI: 10.31857/S0320972522070077, EDN: AVWMQS

ВВЕДЕНИЕ

ётся слабо изученной реальная специфичность

растительных УСБ, что связано в первую оче-

Углевод-связывающие белки (УСБ) и, в

редь с отсутствием подходящих методов её

частности, лектины, широко представлены

определения.

в растениях. Эти белки вовлечены во множе-

Гликоэррей (printed glycan array) явля-

ство процессов, включая иммунные и другие

ется одним из эффективных инструментов,

защитные реакции, а также играют ключевые

используемых для характеристики специ-

роли в развитии растений [1, 2]. Однако оста-

фичности УСБ [3-6]. Известные гликоэрреи

Принятые сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; ТФУ - трифторуксусная кислота; УСБ - угле-

вод-связывающие белки; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; AGA - апиогалактуронан; HG - гомогалактуронан; Mw и

Mn - средневесовая и среднечисловая относительные молекулярные массы соответственно; NHS - N-гидроксисукци-

нимид; RG-I - рамногалактуронан I-го типа; RG-II - рамногалактуронан II-го типа; XGA - ксилогалактуронан.

* Адресат для корреспонденции.

918

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

919

составлены из олигосахаридов разной приро-

белков, а именно: рицина - лектина, специ-

ды и размеров - как синтетических, так и вы-

фичность которого считается известной; пула

деленных из природных источников, а также

антител периферической крови человека, гли-

полисахаридов, в том числе и растительных [5,

кан-связывающий потенциал которого также

7-9]. Олигосахариды обычно иммобилизуют

известен [19, 20], а также моноклонального ан-

на активированную (как правило N-гидрокси-

титела INRA-RU2, узнающего остов рамнога-

сукцинимидом (NHS)) поверхность, для чего

лактуронана I (RG-I) [21].

их необходимо предварительно функционали-

зировать аминогруппой [5] либо превратить

в неогликоконъюгаты, например, с бычьим

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

сывороточным альбумином (БСА) [10]; под-

ложку с нанесённым на неё гликоэрреем на-

Создание библиотеки полисахаридов. Подго-

зывают гликочипом. Несмотря на то что оли-

товка полисахаридов из коммерческих источни-

госахариды - фрагменты полисахаридов - не

ков. Образцы полисахаридов (пектины карто-

сохраняют конформацию последних, олиго-

феля, люпина, цитрусовых, яблока, сахарной

сахаридный эррей оказался весьма полезным

свёклы, арабиногалактаны лиственницы и

для картирования эпитопов моноклональных

акации, гемицеллюлозы ячменя, пшеницы,

антител к полисахаридам [7].

тамаринда и кэроба, «Megazyme», Ирландия)

Растительные полисахариды можно им-

растворяли, согласно предоставляемым фир-

мобилизовать без функционализации, для

мой протоколам (основной растворитель -

чего используют слайды, покрытые нитроцел-

деионизованная вода). При очистке и анали-

люлозой [11]. Это позволяет избежать измене-

зе полисахаридов использовали 2 протокола.

ний в структуре, связанных с модификациями

По первому протоколу определяли молекуляр-

(порой критическими), с одной стороны, а с

но-массовое распределение, степень полидис-

другой - делает невозможным детектировать

персности и чистоты, затем образцы обессоли-

слабые сигналы из-за высокого фона авто-

вали, используя сефадекс G-25 и лиофильно

флуоресценции нитроцеллюлозы. Тем не ме-

высушивали. По второму протоколу образцы

нее такие эрреи стали основой для изучения

изначально трижды обессоливали на колонке

полисахаридов методом детального профили-

с сефадексом G-25, затем характеризовали по

рования полимеров на микрочипах (CoMPP,

аналогичным первому протоколу параметрам

comprehensive microarray polymer profiling).

и также лиофильно высушивали. Кроме того,

Данная технология заключается в том, что

в работе использованы образцы коммерческих

полисахариды клеточной стенки растений в

низко- и высокометилэтерифицированных

варьируемых условиях экстрагируют, затем

яблочных и цитрусовых пектинов («Herbstreith

иммобилизуют на подложке и исследуют их

& Fox KG», Германия), для которых предвари-

структурные особенности с помощью набо-

тельное обессоливание не проводилось.

ра моноклональных антител

[12]. Техноло-

Растительные полисахариды из природных

гия СоМРР позволяет изучать биологические

источников. Фракции пектиновых полисахари-

процессы, происходящие в клеточной стенке, в

дов получены последовательной экстракцией

частности на стадии роста клетки, а также при

водой (при рН 5,6; 4,0 и 2,0), 0,7%-ным водным

воздействии патогена [12-14]. По этой техно-

раствором оксалата аммония из листьев чеме-

логии структурная характеристика проводится

рицы Лобеля Veratrum lobelianum Bernh., бада-

лишь для некоторых фракций, выбранных бла-

на толстолистного Bergenia crassifolia L., берё-

годаря данным гликоэррея [12, 15]. В литерату-

зы пушистой Betula alba L., берёзы повислой

ре описан комбинированный вариант гликоэр-

Betula pendula Roth., капусты огородной Brassica

рея с одновременным присутствием различных

oleracea spp., борщевика Сосновского Heracleum

олигосахаридов млекопитающих и бактериаль-

sosnowskyi L., сабельника болотного Comarum

ных полисахаридов [16-18], однако аналога с

palustre L., солодки голой Glycyrrhiza glаbra L.,

растительными олиго- и полисахаридами в ли-

ревеня волнистого Rheum rhabarbarum L., лу-

тературе нами не было найдено.

ковиц лука репчатого Allium cepa L., наземной

Целью данной работы было исследование

части хвоща лесного Equisetum sylvaticum L.,

потенциала использования гликочипа - акти-

смолёвки обыкновенной Oberna behen L., стеб-

вированного слайда с напечатанными на нём

лей и листьев рдеста плавающего Potamogeton

предварительно охарактеризованными рас-

natans L., побегов и листьев взморника мор-

тительными полисахаридами и олиго-моно-

ского Zostera marina L., целого растения ря-

сахаридами - в определении профиля специ-

ски малой Lemna minor L., древесной зелени

фичности некоторых гликан-связывающих

сосны сибирской кедровой (кедр сибирский)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

920

НИКИФОРОВА и др.

Pinus sibirica DuTour., лиственницы европей-

групп определяли по реакции с пентан-2,4-ди-

ской Larix decidua Mill., пихты сибирской

оном (калибровочный стандарт - метанол,

Abies sibirica Ldb., соцветий пижмы обыкно-

фотоколориметрирование - при 412 нм) [25].

венной Tanacetum vulgare L., плодов винограда

Стабильность полисахаридов в условиях печа-

культурного Vitis vinifera L., баобаба Adansonia

ти эррея оценивали следующим образом: об-

digitata L., корнеплодов моркови посевной

разцы растворяли в 300 мM Na₂HPO₄ (рН 8,5) и

Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Schübl. &

выдерживали в течение 1-3 суток при комнат-

Martens, каллусной культуры пижмы обыкно-

ной температуре либо при -20 °С. Появление

венной Tanacetum vulgare L., смолёвки обык-

продуктов β-элиминирования, поглощающих

новенной Oberna behen L., смолёвки татарской

при 235 нм, оценивали каждые 12 ч.

Silene tatarica (L.) Pers. и ряски малой Lemna

Измерение поглощения растворов про-

minor L. Для получения гомогенных образцов

водили на спектрофотометре Ultrospec 3000

пектиновых полисахаридов выделенные фрак-

(«Pharmacia Biotech», Великобритания) либо

ции разделяли последовательной ультрафиль-

на ПЭ-5300ВИ («Экросхим», Россия).

трацией на мембранах с различным размером

Моносахаридный состав полисахаридов

пор (300, 100, 50 (× 10³) г/моль), на ДЭАЭ-цел-

определяли методами газожидкостной и ио-

люлозе (ОН^-) и на сефарозе CL-4B. Рамно-

нообменной хроматографии. В первом случае

галактуронаны I (RG-I), несущие галактано-

2,5 мг образца полисахарида растворяли в 1 мл

вые боковые цепи различной длины, а также

2 М трифторуксусной кислоты (ТФУ), содер-

арабиногалактан были выделены из волокон

жащей в качестве внутреннего стандарта мио-

льна Linum usitatissimum L. на разных стадиях

инозит (0,5 мг/мл). Смесь термостатировали в

развития растений. Первый вариант RG-I и

запаянной ампуле (5 ч, 100 °С) и далее обраба-

арабиногалактан были получены из волокон

тывали, как описано ранее [26]. Полученные

на стадии быстрого роста растений путём экс-

ацетаты полиолов соответствующих моносаха-

тракции 10 мM NaOAc-буфером, содержащим

ридов анализировали на капиллярной колонке

0,02% NaN₃ (рН 5,0-5,2), и последующего раз-

VF-5ms размером 0,25 мм Ø × 30 м («Varian»,

деления полимеров с помощью гель-фильтра-

США), используя пламенно-ионизационный

ции на сефарозе CL-4B. Второй вариант RG-I

детектор

(«Varian»), газ-носитель

- гелий.

получен из зрелых волокон после растворения

Во втором случае 20-50 мкг полисахарида гид-

целлюлозы в обезвоженном N,N-диметилаце-

ролизовали в 400 мкл 2 М ТФУ (1 ч, 120 °С),

тамиде, содержащем 8% LiCl, последующего

избыток ТФУ удаляли упариванием, смесь по-

её гидролиза целлюлазой «Cellusoft-L» («Novo

лученных моносахаридов растворяли в деиони-

Nordisk Bioindustrrie S.A.», Франция) и очист-

зированной воде. Разделение моносахаридов

ки высвобождаемой фракции полимеров с по-

проводили на колонке CarboPac PA-1 размером

мощью диализа (MWCO 12 000) и гель-филь-

4 × 250 мм («Thermo Fisher Scientific», США),

трации на сефадексе G-25 и сефарозе CL-4B.

используя импульсный амперометрический

Гетероксиланы из семян ржи Secale cereale L.

детектор PAD («Thermo Fisher Scientific»). Ско-

(мука грубого помола) получали после обра-

рость элюирования - 1 мл/мин. Температура

ботки экстрагируемых водой и предваритель-

колонки 30 °С. Элюенты: А - 100 мM NaOH

но осаждённых 96%-ным спиртом полимеров

в 1 M NaOAc, В - 15 мM NaOH; элюирова-

лихеназой («Megazyme») и последующего раз-

ние по схеме: В - 100% (0-20 мин); В - 90%,

деления фрагментов на сефадексе G-25.

А - 10% (20-21 мин); В - 50%, А - 50% (22-

Конечная библиотека лигандов содержала

41 мин); А - 100% (42-55 мин); В - 100% (56-

113 полисахаридов (см. таблицу в Приложении).

85 мин). Результаты анализировали с помо-

Характеристика состава и свойств образ-

щью программного обеспечения PeakNet

цов полисахаридов. Общее содержание углево-

версия 4.1 («Dionex», США).

дов в образцах определяли фенол-сернокис-

Средневесовую (Mw), среднечисловую (Mn)

лотным методом [22]. Содержание уроновых

относительные молекулярные массы образ-

кислот в образцах полисахаридов определяли

цов полисахаридов определяли методом вы-

спектрофотометрическим методом с исполь-

сокоэффективной гель-проникающей хро-

зованием гидроксидифенила (калибровочный

матографии либо на колонке Shodex OHpak

стандарт - галактуроновая кислота, фотоко-

SB-806M HQ размером 8 × 300 мм («Showa

лориметрирование - при 400 и 450 нм) [23].

Denko», США), температура колонки - 50 °С,

Содержание белка в образцах полисахаридов

скорость потока - 0,3 мл/мин, элюент - де-

определяли по методу Лоури (калибровочный

ионизованная вода (термостатирование), либо

стандарт - БСА, фотоколориметрирование -

на колонке PSS SUPREMA 3000 Å размером

при 750 нм) [24]; содержание метоксильных

8 × 300 мм («PSS», Германия), температура ко-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

921

лонки - 40 °С, скорость потока - 0,4 мл/мин,

и повышенной влажности, после этого 2 раза

элюент - 0,15 М NaCl, используя рефракто-

промывали в ФСБ-0,05%. Затем наносили на

метрический детектор («Agilent», США или

гликочип 1 мл раствора биотинилированных

«Shimadzu», Япония соответственно). Резуль-

антител козы, узнающих иммуноглобулины

таты анализировали с помощью программного

мыши («Thermo Scientific», США), разведён-

обеспечения Agilent GPC/SEC или LCsolution

ных 1 : 200 в ФСБ-0,1%, и инкубировали в те-

версия 1.24 SP1.

чение 1 ч при 37 °С и повышенной влажности.

Растворы полисахаридов концентрировали

Далее 2 раза промывали в ФСБ-0,05%. Затем

на роторном испарителе Laborota 4002-control

наносили на чипы по 1 мл раствора стрепта-

(«Heidolph», Германия) при 40 °С, лиофилизи-

видина, меченного флуоресцентной меткой

ровали на приборе Freezemobile 3SL («VirTis»,

Аlexa 555 («Invitrogen», США), разведенного

США). рН растворов определяли на рН-метре

1 : 1000 в ФСБ-0,1%, и инкубировали в течение

MP 225 («Mettler Toledo», Швейцария).

1 ч при 37 °С и повышенной влажности.

Печать растительного полисахаридного

2. 1 мл раствора стандартной плазмы кро-

чипа. Растительные полисахариды (получен-

ви («Sigma», США) в разведении 1 : 15 в ФСБ-

ные как описано выше) и олиго-моноса-

0,1% инкубировали в течение 1 ч при 37 °С и

хариды в аминоспейсерированной форме

повышенной влажности. Далее промывали

(«Синтавр», Россия) растворяли в буфере для

гликочип, как описано выше. Затем наносили

печати

(300 мМ Na₂HPO₄), отфильтрован-

раствор вторичных антител козы, узнающих

ном через

0,2 мкм-фильтр и содержащем

человеческие IgG и IgM, меченные Alexa 555 и

0,001% (v/v) Tween

20 или

0,005% CHAPS

Alexa 647 соответственно («Invitrogen»), разве-

(рН 8,5), и переносили в лунки 384-луночно-

дённых 1 : 250 в ФСБ-0,1%, и инкубировали в

го планшета для ПЦР («BIOPlastics», Нидер-

течение 1 ч при 37 °С и повышенной влажности.

ланды). С помощью робота SciFlexArrayer S5

3. 1 мл раствора биотинилированного ри-

(«Scienion», Германия) производили печать ли-

цина RCA120 («Vector Laboratories», США) с

гандов бесконтактным способом при относи-

концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ-0,1% инку-

тельной влажности 50%, объём капель - ~0,9 пл.

бировали 1 ч при 37 °С и повышенной влаж-

Использовали два типа подложек - эпоксид-ак-

ности. Далее промывали, как описано выше.

тивированные («Семиотик», Россия) и NHS-ак-

Затем наносили раствор стрептавидина, ме-

тивированные слайды Н («Schott Nexterion»,

ченного флуоресцентной меткой Аlexa

555

Германия). Концентрация олигосахаридов в

(«Invitrogen»), в разведении 1 : 1000 в ФСБ-

наносимых на подложку растворах составля-

0,1% и инкубировали 1 ч при 37 °С и повышен-

ла 20 мкМ, полисахариды наносили в концен-

ной влажности.

трации 100 мкг/мл. Каждый лиганд печатали в

Подготовленные гликочипы промывали

девяти повторах. После печати гликочипы ин-

2 раза ФСБ-0,05% и на конечном этапе - в би-

кубировали 1-3 ч при относительной влажно-

дистиллированной воде, а затем высушивали

сти 75% и упаковывали под вакуумом.

чипы центрифугированием и сканировали (раз-

Изучение взаимодействия УСБ с лигандами

решение - 10 мкм) с помощью флуоресцентного

полисахаридного эррея. Гликочипы выдержива-

ридера InnoScan 1100 AL («Innopsys», Франция).

ли в буфере для блокировки (25 мМ этанола-

Полученные изображения преобразовывали в

мина («Sigma-Aldrich», США), 100 мМ борной

таблицу Excel с помощью программного обе-

кислоты («Люми», Россия), 0,2% (v/v) Tween 20

спечения ридера ScanArray Express 4.0 с ис-

(«Sigma-Aldrich»), pH 8,5) в течение 90 мин

пользованием метода подстраивающихся колец

при постоянном помешивании при комнатной

(«PerkinElmer», США) и GAL-файла. Результа-

температуре, после чего 2 раза промывали фос-

ты представляли в виде медианы относительных

фатно-солевым буфером («Эко-Сервис», Рос-

единиц флуоресценции (RFU), отражающей

сия), содержащим 0,05% (v/v) Tween 20 (ФСБ-

аффинность и количество УСБ. Сигналы, вели-

0,05%). Далее исследуемые образцы наносили

чины которых были ниже 5% от максимального

на чип, как описано ниже.

значения RFU, считали незначимыми.

1 мл раствора моноклонального анти-

тела INRA-RU2 (любезно предоставленного

Мари-Кристин Рале и Фабьен Гийон (Фран-

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

цузский национальный институт сельско-

хозяйственных исследований, Нант, Фран-

Создание библиотеки олиго- и полисаха-

ция)) в разведении 1 : 10 в ФСБ, содержащем

ридов. Полисахариды выделяли из клеточных

0,1% (v/v) Tween 20 и 1% БСА (ФСБ-0,1%;

стенок растений и каллусных культур, а также

«Sigma», США), инкубировали 1 ч при 37 °С

использовали коммерчески доступные полиса-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

922

НИКИФОРОВА и др.

хариды («Megazyme» и «Herbstreith & Fox KG»),

HG образует основную углеводную цепь

дополнительно очищенные от низкомолеку-

в XGA и AGA. В XGA боковые цепи, образо-

лярных примесей и фракционированные с

ванные 1,2-, 1,3- и 1,4-связанными остатка-

помощью ультрафильтрации, ионообменной

ми Xyl, замещают остатки GalA по О-3 [31, 32].

и гель-проникающей хроматографий. Для по-

В AGA остатки GalA могут быть замещены по

лученных образцов полисахаридов определяли

O-2 и/или O-3 единичными , или несколькими

моносахаридный состав, степень этерифика-

1,3-связанными остатками апиозы (Api) [33].

ции (СМ), средневесовую (Mw) и среднечис-

Степень замещения остатков GalA в AGA

ловую (Mn) относительные молекулярные

и XGA мы характеризовали соотношени-

массы, индекс полидисперсности (Mw/Mn) и

ем Api(Xyl)/GalA.

содержание в них белковых примесей. Полная

По преобладанию тех или иных структур-

характеристика выделенных полисахаридов

ных элементов полисахариды для гликоэррея

представлена в таблице в Приложении; боль-

были разделены на несколько групп (табли-

шая часть из них относится к пектинам, ряд

ца). В группу 1 были объединены пектины с

образцов был представлен гемицеллюлоза-

высокой долей HG, в которых доля остатков

ми (рис. 1).

GalA, образующих его основную углеводную

В пектинах выделяют следующие струк-

цепь, составляет ≥86% от суммы всех моно-

турные домены: гомогалактуронан (HG), рам-

сахаридов, и невысоким содержанием участ-

ногалактуронан I-го типа (RG-I), замещённые

ков RG-I, а также цепей из остатков Ara и Gal.

галактуронаны, к которым относятся ксилога-

В группу 2 мы объединили пектины, в которых

лактуронан (XGA), апиогалактуронан (AGA) и

HG также является преобладающим доменом

рамногалактуронан II-го типа (RG-II) [27, 28].

(GalA ≥ 50%), но с бо льшим содержанием Ara

Для каждого из них характерно своё, специфи-

и Gal, чем в полисахаридах первой группы.

ческое соотношение моносахаридных остатков.

Группа 3, в отличие от первой и второй групп,

Все использованные пектины были охарак-

включает пектины, содержащие RG-I, в кото-

теризованы по содержанию HG и RG-I. В со-

рых доля остатков GalA и Rha, образующих его

ответствии с классическими представлениями

главную углеводную цепь, составляет 10-40%

остов RG-I сформирован повторяющимися

от суммы всех моносахаридов. Группа 4 вклю-

дисахаридными звеньями [→2)-α-L-Rhap-(1→4)-

чает пектины, в составе которых RG-I является

α-D-GalpA-(1→] и содержит эквивалентное ко-

доминирующим компонентом, доля остатков

личество Rha и GalA; цепи HG построены из

Gal и Ara в них составляет 10-40%. Группы 5-7

остатков GalA, связанных между собой 1,4-свя-

включают полисахариды, в составе которых

зями [25]. Исходя из этого, содержание HG в

преобладают остатки Ara и Gal (40-100%); в

пектинах мы оценивали по доле остатков GalA

группе 5 объединены полисахариды с высоким

от суммы всех моносахаридов с учётом вычета

содержанием и остатков Ara, и Gal; в группе 6 -

остатков GalA, входящих в состав RG-I (опре-

полисахариды с преобладанием остатков Ara; в

деляли как разность (GalA - Rha)). Для харак-

группе 7 - остатков Gal. Замещённые галакту-

теристики пектинов по содержанию RG-I оце-

ронаны (XGA и AGA) объединены в группу 8.

нивали суммарную долю остатков Rha и GalA

Остальные 13 полисахаридов, которые в ка-

(Rha × 2) от суммы всех моносахаридов.

честве доминирующего компонента содержат

Важными структурными компонентами

или галактоманнан, или арабиноксилан, или

пектиновых полисахаридов являются остатки

ксилан, или глюкан, или ксилоглюкан, были

Gal и Ara. Они могут как входить в состав от-

объединены в группу 9 и обозначены как геми-

дельных арабиногалактанов, так и формиро-

целлюлозы. Кроме перечисленных выше поли-

вать боковые углеводные цепи RG-I (рис. 1).

сахаридов, эррей содержал 14 моносахаридов и

В арабиногалактанах остатки Gal связаны

9 олигосахаридов - компонентов использован-

между собой 1,3- и 1,6-связями; остатки Ara,

ных полисахаридов и/или типичных лигандов

как правило, имеют терминальное расположе-

известных растительных лектинов (таблица).

ние; соотношение Ara/Gal варьирует от 30/70

Оптимизация условий иммобилизации глика-

до 40/60. Боковые цепи в RG-I формируют,

нов. Для иммобилизации полисахаридов было

арабинаны c 1,5-связанными остатками Ara,

использовано два типа активации поверхности

доля которых в боковых цепях больше 50%,

слайда - эпоксидом или NHS-эфиром. Иммо-

галактаны с 1,4-связанными остатками Gal, в

билизацию на эпоксид-активированном слай-

которых доля остатков Ara незначительна [30].

де проводили в 300 мМ Na₂HPO₄, содержащем

Различия в составе этих полисахаридов мы ха-

неионогенный детергент Tween 20 (эти условия

рактеризовали величиной суммы остатков Gal

были рекомендованы производителем слайдов

и Ara, а также соотношением Gal/Ara.

для иммобилизации олигосахаридов). Однако,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

924

НИКИФОРОВА и др.

Группы гликанов, составляющих гликоэррей

№ группы

Наименование группы полисахаридов

Гомогалактуронаны (HG)

Пектины с преобладанием HG

Пектины с преобладанием HG и значительной долей RG

Пектины с преобладанием RG

Полисахариды с преобладанием Ara и Gal

Полисахариды с преобладанием Ara

Полисахариды с преобладанием Gal

Замещённые галактуронаны (XGA, AGA)

Гемицеллюлозы: GAM, AX, XYL, GLC, XG

Моно- и олигосахариды

№

Структура

№

Структура

1-s

L-Fucα-sp*

39-s

Xylβ-sp

2-s

Galα-sp

40-s

Xylα-sp

3-s

Galβ-sp

97-s

Galβ1-4GlcNAcβ-sp

5-s

GalNAcα-sp

111-s

Glcβ1-4Glcβ-sp1

7-s

Glcα-sp

112-s

Glcβ1-6Glcβ-sp1

9-s

Glcβ-sp

116-s

GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp

16-s

Manα-sp

504-s

(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1)₂-3,6-Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp1

18-s

Manβ-sp

505-s

(GlcNAcβ1-2Manα1)₂-3,6-Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp1

20-s

L-Rhaα-sp1**

627-s

(Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1)₂-3,6-Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp1

28-s

Xylβ-sp1

831-s

Galβ1-4Glcβ-sp

29-s

Fucβ-sp1

844-s

Xylβ1-2Manα-sp

31-s

L-Araα-sp1

Примечание. Используемые сокращения: AGA - апиогалактуронан, AX - арабиноксиланы, GAM - галактоманнаны,

GLC - глюканы, HG - гомогалактуронан, RG-I - рамногалактуронан I, XG - ксилоглюканы, XGA - ксилогалакту-

ронан, XYL - ксиланы.

* sp - -OCH₂CH₂CH₂NH₂.

** sp1 - -NHCOCH₂NH₂. Все моносахариды являются D-пиранозами, если не указано иначе.

в отличие от олигосахаридов, для полисаха-

жее явление, описанное ранее [8], объясняется

ридов наблюдалось неравномерное распреде-

неудачным сочетанием нескольких факторов,

ление интенсивности флуоресценции (после

в частности скорости высыхания нанесённой

проявки, см. раздел «Материалы и методы»)

капли и особенностями структуры наносимых

внутри спота в виде «бубликов» (рис. 2). Похо-

на поверхность гликанов. Варьирование ус-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

925

Рис. 2. Морфология спотов при различных условиях печати. а - Эпоксидная химия (0,001% (v/v) Tween 20), б - NHS-хи-

мия (0,005% CHAPS), 27-105 - номера гликанов (см. таблицу в Приложении). Представлено взаимодействие поли-

клональных антител человека с гликанами эррея (в радужной цветовой шкале). RFU - относительные единицы флуо-

ресценции

ловий, в частности замена Tween 20 на цвит-

Взаимодействие моноклонального антитела

терионный детергент CHAPS, лишь отчасти

INRA-RU2 с полисахаридами эррея. Большин-

помогло исправить ситуацию (данные не при-

ство полисахаридов эррея содержит фрагменты

ведены). Поэтому была апробирована альтер-

RG-I, поэтому для проверки факта иммобили-

нативная химия иммобилизации - на NHS-ак-

зации полисахаридов, а также их функциональ-

тивированных слайдах Slide H) производства

ной активности было использовано монокло-

«Schott Nexterion», которые более реакционно-

нальное IgG-антитело INRA-RU2, узнающее

способны, чем эпоксидные, а также содержат,

неразветвлённые или частично разветвлённые

как заявлено производителем, 3D-поверхност-

области RG-I, а именно: два дисахаридных по-

ный слой полимера, который снижает скорость

втора остова; оно демонстрирует максималь-

высыхания капли. Морфология спотов (рис. 2)

ное связывание с полисахаридами, в структуре

при печати полисахаридов на этих слайдах ока-

которых есть семь таких повторов [21].

залась приемлемой, хотя споты не всегда были

На нашем эррее антитело INRA-RU2

одинакового диаметра, что пришлось нивели-

взаимодействовало с 68 из 113 напечатанных

ровать использованием метода подстраиваю-

полисахаридов, в то же время, не проявляя

щихся колец при обработке полученных изо-

активности по отношению к моно- и олигоса-

бражений.

харидам (рис. 3).

Поскольку процесс печати и иммобилиза-

Все пектины групп 3 и 4, отличающиеся

ции на NHS-активированные слайды прохо-

значительной долей RG-I (10-55% от суммы

дит при рН 8,5, была проверена устойчивость

всех моносахаридов в образцах), продемон-

полисахаридов, содержащих остатки уроновых

стрировали сильное взаимодействие с анти-

кислот, к деградации при таком значении pH.

телом. Исключением являлись два пектина из

Для этого полисахариды растворяли в буфере

картофеля (47 и 46, см. таблицу в Приложе-

для печати, выдерживали в течение 1-3 суток

нии), которые отличаются низкой молекуляр-

и оценивали содержание возможных продук-

ной массой (Mw = 14-16 кДа), что, вероятно,

тов распада спектрофотометрически. Значи-

и явилось причиной отсутствия взаимодей-

мой деградации полисахаридов обнаружено не

ствия. Более того, антитело взаимодействова-

было. Кроме того, из одних и тех же растворов,

ло с большинством пектинов из групп 1 и 2,

которые хранили при -20 °С, печать произво-

в которых RG-I идентифицирован в качестве

дили несколько раз в течение 6 месяцев, про-

минорного компонента (<10%); в то же время

веряя устойчивость полисахаридов в растворе

полисахариды из этих же групп, выделенные

при пониженной температуре за данный про-

из рдеста плавающего (11), хвоща лесного (12),

межуток времени. Во всех случаях коэффици-

древесной зелени сосны сибирской (15, 16, 87)

ент межслайдовой корреляции ССС (согла-

и каллусной культуры ряски малой (80, 86), в

сованный коэффициент корреляции Лина,

которых данный эпитоп низко представлен, с

рассчитанный как описано ранее [34]) между

антителом не взаимодействовали, рациональ-

ними превышал 0,85, что также свидетельству-

ного объяснения чему у нас пока нет.

ет о том, что полисахариды не претерпевают

Корреляции между наличием взаимодей-

значительных изменений при длительном хра-

ствия с INRA-RU2 и содержанием RG-I в по-

нении в описанных выше условиях.

лисахаридах групп 5-7 установлено не было.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

926

НИКИФОРОВА и др.

Несмотря на то что полисахариды этих групп

к группам 1 и 2, содержащим HG; группам 3

сравнимы по содержанию Rha с группой 2, взаи-

и 4, содержащим RG-I; группам 5-7 со значи-

модействие с антителом продемонстрировали

тельной долей остатков Ara и/или Gal (>45%),

лишь немногие из них. Наибольшее связыва-

а также группе 9, объединяющей непекти-

ние с антителом выявлено для полисахаридов

новые полисахариды. Из группы 8 антитела

солодки (26, 35), сахарной свёклы (48-50) и

обоих классов распознавали только пектин из

льна (69). Тогда как для полисахаридов хвой-

ряски малой (29), обладающий большей моле-

ных (104, 105) и смолёвки обыкновенной (109),

кулярной массой, чем пектин (28) из того же

сравнимых по содержанию RG-I и Mw с неко-

источника, связывания с которым не наблюда-

торыми полисахаридами солодки и сахарной

ли. В топ-список самых активных взаимодей-

свёклы (26, 48-50), взаимодействия с антите-

ствий с IgG человека попали полисахариды из

лом не установлено. Вероятно, это обуслов-

групп 5 и 7, выделенные из каллусных культур

лено недоступностью эпитопа из-за высокой

смолёвки и пижмы (108-112), а максимальное

плотности боковых углеводных цепей, обра-

связывание показал пектин (20, группа 3), вы-

зованных остатками Ara и Gal, что является

деленный из листьев сабельника болотного,

отличительной особенностью полисахаридов

со значительной долей RG-I. Максимальное

групп 5-7.

взаимодействие с IgM показали полисахари-

Из группы 8, объединяющей замещённые

ды (103, 104, 106 и 107; группа 5), выделенные

галактуронаны, доля RG-I в которых незна-

из древесной зелени пихты и лиственницы, со

чительна, только пектин баобаба (32) взаимо-

значительной долей остатков Ara и Gal, а так-

действовал с INRA-RU2, хотя среди пектинов

же пектины, содержащие RG-I (группа 3 и 4),

этой группы он отличается наименьшим со-

выделенные из листьев берёзы пушистой и бе-

держанием RG-I. Вероятно, это обусловлено

рёзы обыкновенной (23, 25, 90, 92-94). Струк-

низкой степенью замещения главной углевод-

турных особенностей, резко выделяющих эти

ной цепи боковыми цепями (таблица в Прило-

полисахариды на фоне родственных, мы не

жении). В пектинах из ряски и взморника (28,

идентифицировали.

30, 31) - других представителях этой группы -

Взаимодействие рицина с гликанами эр-

связывания с антителом INRA-RU2 не отмеча-

рея. В качестве представителя растительных

лось, хотя доля RG-I была существенно выше,

углевод-связывающих белков был взят ри-

чем в пектине баобаба, а суммарное замещение

цин, известный как β-галактозосвязывающий

остатков GalA главной углеводной цепи боко-

лектин, который активно используют в гли-

выми цепями, образованными остатками Xyl

кобиологии для характеристики гликозилиро-

и Api, достигало 75%.

вания в первую очередь в тканях млекопита-

С полисахаридами группы 9, представлен-

ющих. Он ожидаемо провзаимодействовал с

ной гемицеллюлозами, связывания ожидаемо

βGal-терминированными гликанами, а также

не наблюдалось.

с двухантенной N-цепью комплексного типа

Взаимодействие антител крови человека с

(Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1)₂-

гликанами эррея. Ещё одним способом под-

3,6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ), что было

тверждения факта иммобилизации моно- и

найдено ранее (http://functionalglycomics.

олигосахаридов было взаимодействие с антите-

com/). Рицин показал значимое связывание

лами крови человека. Образец сыворотки кро-

с 23 из 113 полисахаридов (рис. 3), самые ин-

ви условно здорового донора ожидаемо взаимо-

тенсивные сигналы относятся к ксилоглюка-

действовал с GalNAcα, L-Rhaα, дисахаридами

нам (60, 61; группа 9) из тамаринда, содержа-

Glcβ1-6Glcβ и GlcNAcβ1-4GlcNAcβ [19, 20],

щим остатки Gal (до 15%), входящие в состав

которые (кроме рамнозы) не являются компо-

боковых цепей (Galβ1-2Xylα1-), замещающие

нентами использованных полисахаридов. Изу-

остатки Glc глюканового остова по положению

чение взаимодействия антител крови человека

О-6 [35], а также полисахаридам со значитель-

с растительными полисахаридами, в том числе

ным содержанием остатков Ara и Gal группы 5

с пектинами, ранее систематически не прово-

из акации (58), лиственницы (55) и полиса-

дилось. Согласно полученным в нашем иссле-

хариду со значительным содержанием остат-

довании результатам, 74 полисахарида из 113

ков Gal группы 7 из льна (69). Интересно, что

продемонстрировали связывание при инкуба-

интенсивность взаимодействия этого лектина

ции образца сыворотки крови с эрреем (рис. 3).

с полисахаридами не коррелирует с содержа-

Профиль IgM был гораздо шире, чем IgG, од-

нием остатков Gal - у топовых ксилоглюканов

нако распознаваемые этими классами имму-

из тамаринда содержание остатков Gal было

ноглобулинов полисахариды принадлежат к

одним из самых низких среди 23 провзаимо-

одним и тем же группам пектинов, а именно:

действовавших полисахаридов, что свидетель-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

928

НИКИФОРОВА и др.

ствует в пользу того, что для специфического

ний опасаться, что «молчащие» полисахариды

связывания анализируемого лектина необхо-

не иммобилизовались. Тем не менее мы пока

димо не столько количественное преобладание

не можем утверждать, что в предложенных ус-

этого типа мономера, сколько структурные и

ловиях будет иммобилизоваться любой поли-

конформационные особенности содержащего

сахарид - в природе есть такие, в структуре

его гликотопа. Отметим, что остатки Gal пол-

которых полностью отсутствуют первичные

ностью отсутствовали только в структуре глю-

(наиболее реакционноспособные) гидрокси-

кана ячменя, взаимодействия с которым мы не

лы, а вторичные — слабо нуклеофильны или

наблюдали (116).

затруднены из-за экранирования соседними

молекулярными фрагментами; поэтому в даль-

нейшем мы будем уделять особенное внимание

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

такого рода молекулам.

Приведённые выше экспериментальные

Углеводы и взаимодействующие с ними

данные по связыванию изученных белков с

белки вовлечены в большинство протекающих

растительными полисахаридами важны не

в растительной клетке процессов. Выяснение

только как доказательство факта иммобилиза-

механизмов функционирования раститель-

ции последних, но, безусловно, имеют само-

ных УСБ напрямую сопряжено с необходимо-

стоятельное значение в плане характеристики

стью изучения их специфичности. Лидирую-

или более детального (чем раньше) изучения

щие позиции среди инструментов для оценки

этих белков. Ниже полученные результаты

взаимодействий УСБ со специфическими гли-

обсуждены именно с точки зрения изучения

канами занимают гликановые эрреи, успешно

специфичности этих УСБ.

зарекомендовавшие себя при исследовани-

Рицин состоит из двух полипептидных це-

ях УСБ животных и человека [5, 35-37], но до

пей, одна из которых является токсином, а вто-

сих пор практически не использовавшиеся при

рая — галактозосвязывающим лектином [38].

изучении УСБ растений. В представленной ра-

Биологические функции рицина как целого,

боте впервые был сконструирован гликочип,

так и его лектинового домена до сих пор лишь

одновременно содержащий охарактеризован-

предполагаются. В самом общем виде лекти-

ные растительные полисахариды нескольких

новому домену отводят функцию вектора, до-

классов, а также ряд моно- и олигосахаридов,

ставляющего токсиновую активность в нужное

и изучено его взаимодействие с несколькими

место, а в целом роль рицина связывают с за-

видами белков: 1) моноклональным антите-

щитой от насекомых и других патогенов [2, 38].

лом INRA-RU2, специфически распознающим

С другой стороны, для лектинового домена не

остов RG-I; 2) растительным лектином, рици-

исключена роль якоря для депонирования и

ном; 3) поликлональными антителами крови

транспорта всего белка за счёт взаимодействия

человека. Указанные белки значимо взаимо-

с собственными полисахаридами раститель-

действовали с 99 из 113 полисахаридов (88%).

ной клетки. До настоящего исследования такая

Гарантированная иммобилизация полисаха-

вспомогательная

(«технологическая») функ-

ридных компонентов принципиальна - отсут-

ция оставалась лишь гипотетической, однако

ствие сигнала изучаемого УСБ на эррее должно

теперь, когда показано связывание рицина с

однозначно интерпретироваться как отсут-

растительными полисахаридами, приобретает

ствие связывания. И если для тех гликанов, ко-

смысл развитие этой гипотезы.

торые иммобилизовали в этом формате рань-

Антитела крови человека. Известно, что

ше (то есть олигосахаридов и бактериальных

в крови человека детектируются антитела к

полисахаридов, имеющих аминогруппу), про-

полисахаридам бактериального происхожде-

блемы доказательства иммобилизации не сто-

ния, что можно объяснить двумя факторами.

яло, то для растительных полисахаридов оно

Во-первых, тем, что это адаптивные иммуно-

необходимо. К сожалению, универсального

глобулины, которые генерируются В2-лимфо-

реагента, взаимодействующего с любым расти-

цитами под действием попадающих в организм

тельным полисахаридом, не существует. Тем не

инфекционных бактерий, либо под действием

менее представленные данные подтверждают

вакцин [39, 40]. Во-вторых, тем, что это естес-

наличие большинства полисахаридов на по-

твенные (врождённые) антитела, имеющие

верхности использованного слайда. Каждый из

паратоп для узнавания комменсальной микро-

тех полисахаридов, связывание УСБ с которы-

биоты, необходимый для начала функциони-

ми мы не увидели, имеет близкого «родствен-

рования (прайминга) В1-лимфоцитов в первые

ника» с точки зрения химической структуры

месяцы жизни [41]. Обнаруженное в данной

среди связавшихся, поэтому у нас нет основа-

работе широко представленное (то есть, оче-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

929

видно, неслучайное) взаимодействие с расти-

Таким образом, гликоэррей, сочетающий

тельными полисахаридами не укладывается

в себе гликаны разного размера - от моно- до

ни в одно из этих двух объяснений; также, не

полисахаридов - позволяет шире взглянуть на

представляется убедительным и перекрёстное

специфичность УСБ из совершенно различных

взаимодействие бактериальных полисахаридов

источников, изучать потенциальные мишени

с пектинами растений, особенно в свете того,

уже известных лектинов, а также, как мы ожи-

что исследуемые антитела не способны взаимо-

даем, исследовать специфичность новых бел-

действовать даже с фрагментами использован-

ков, идентифицированных пока только in silico.

ных полисахаридов (также присутствующих в

эррее). В то же время в литературе описаны так

называемые пектин-полисахарид-реактивные

Вклад авторов. Т.А. Горшкова, Н.В. Бо-

антитела человека (принадлежащие к классам

вин - постановка проблемы и руководство ра-

M, G и А, особенно IgM и IgG) [42-44], спо-

ботой; Н.В. Шилова - разработка концепции

собные узнавать, например, арабинан свёклы,

статьи, формирование и обсуждение результа-

арабиногалактан из сои и гуммиарабика, по-

тов исследования; А.Н. Никифорова - прове-

лигалактуроновую кислоту из цитрусовых, а

дение экспериментов, описание и графическое

также некоторые разветвлённые рамногалак-

представление результатов, оформление ста-

туронаны I. С одной стороны, постоянный

тьи; В.В. Головченко, О.А. Патова, П.В. Мик-

контакт человека с растительными полисаха-

шина - получение, очиcтка, фракционирова-

ридами пищи предполагает возможность уз-

ние и характеристика образцов полисахаридов,

навания их как антигенов, с другой стороны,

оформление результатов в этой части исследо-

смысл формирования таких антител неясен.

вания, обсуждение и редактирование текста.

Отметим, однако, что пектины рассматривают

Финансирование. Работа выполнена при

как триггеры аллергических реакций на орехи

поддержке Российского научного фонда (гран-

и фрукты [45, 46]. Так или иначе, обнаружен-

ты № 20-63-47110 (печать и работа с гликоэррея-

ное взаимодействие антител крови человека с

ми) и № 20-64-47036 (очистка, разделение и

разнообразными пектинами требует дальней-

характеристика полисахаридов)), а также Гос-

шего изучения.

задания № АААА-А18-118022790083-9 (подбор

Моноклональное антитело INRA-RU2 узна-

базы коммерческих полисахаридов).

ёт остов RG-I, сформированный как минимум

Благодарности. Авторы выражают благо-

из двух повторяющихся дисахаридных звеньев

дарность за помощь в обсуждении результатов

Rha-GalA [21]. Полученное против RG-I сли-

и подготовке материалов статьи Л.В. Козловой

зи семян Arabidopsis thaliana антитело способ-

(Казанский институт биохимии и биофизики

но распознавать свой эпитоп и в других рас-

ФИЦ КазНЦ РАН), а также А.Ф. Ахметгалие-

тительных объектах. Полученные с помощью

вой (Казанский институт биохимии и биофи-

эррея результаты подтвердили эту способность.

зики ФИЦ КазНЦ РАН) за техническое со-

Кроме того, было обнаружено, что на взаимо-

провождение работ по подготовке отдельных

действие антитела с полисахаридами влияет не

коммерческих полисахаридов. Мы хотели бы

только количество доменов RG-I, но и присут-

выразить благодарность доктору Мари-Кристин

ствие в полисахаридах других структурных эле-

Рале и доктору Фабьен Гийон (Французский

ментов, таких как замещённые галактуронаны,

национальный институт сельскохозяйственных

а также присутствие полисахаридов с остатка-

исследований, Нант, Франция) за любезно пре-

ми Ara и Gal, характерными для боковых цепей

доставленный образец антитела INRA-RU2, а

RG-I (группы 5-8). Это может свидетельство-

также доктору Е.А. Гюнтер (ИФ ФИЦ Коми НЦ

вать о том, что для взаимодействия INRA-RU2

УрО РАН) за любезно предоставленные образ-

критичны тонкие нюансы в строении боковых

цы полисахаридов, выделенных из каллусных

цепей полисахаридов и/или их расположение,

культур.

а также, возможно, и пространственное рас-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

положение различных структурных элементов

отсутствии конфликта интересов.

пектиновых макромолекул относительно друг

Соблюдение этических норм. Настоящая

друга. В то же время нельзя исключить и кон-

статья не содержит каких-либо исследований с

формационных изменений некоторых из пек-

участием людей и животных в качестве объек-

тиновых макромолекул при их иммобилизации.

тов исследований.

Обнаруженные факты предполагают необходи-

Дополнительные материалы. Приложение

мость более детального изучения структуры и

к статье опубликовано на сайте журнала

конформационных особенностей пектинов.

«Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

930

НИКИФОРОВА и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

De Coninck, T., and Van Damme, E. J. M. (2021)

13.

Kračun, S. K., Fangel, J. U., Rydahl, M. G., Pedersen,

Review: the multiple roles of plant lectins, Plant Sci.,

H. L., Vidal-Melgosa, S., et al. (2017) In High-

313, 111096, doi: 10.1016/j.plantsci.2021.111096.

Throughput Glycomics and Glycoproteomics (Lauc, G.,

Vandenborre, G., Smagghe, G., and Van Damme,

Wuhrer, M., eds) Humana Press, NY, pp. 147-165.

E. J. M. (2011) Plant lectins as defense proteins

14.

Sillo, F., Fangel, J. U., Henrissat, B., Faccio, A.,

against phytophagous insects, Phytochemistry,

72,

Bonfante, P., et al. (2016) Understanding plant cell-

1538-1550, doi: 10.1016/j.phytochem.2011.02.024.

wall remodelling during the symbiotic interaction

De Paz, J. L., and Seeberger, P. H.

(2012) In

between Tuber melanosporum and Corylus avellana

Carbohydrate Microarrays: Methods and Protocols

using a carbohydrate microarray, Planta, 244, 347-

(Chevolot, Y., eds) Humana Press, NJ, pp. 1-12.

359, doi: 10.1007/s00425-016-2507-5.

Ratner, D. M., Adams, E. W., Disney, M. D.,

15.

Salmeán, A. A., Guillouzo, A., Duffieux, D.,

and Seeberger, P. H. (2004) Tools for glycomics:

Jam, M., Matard-Mann, M., et al. (2018) Double

Mapping interactions of carbohydrates in biological

blind microarray-based polysaccharide profiling

systems, ChemBioChem, 5, 1375-1383, doi: 10.1002/

enables parallel identification of uncharacterized

cbic.200400106.

polysaccharides and carbohydrate-binding proteins

Blixt, O., Head, S., Mondala, T., Scanlan, C.,

with unknown specificities, Sci. Rep.,

2500,

Huflejt, M. E., Alvarez, R., et al. (2004) Printed

doi: 10.1038/s41598-018-20605-9.

covalent glycan array for ligand profiling of diverse

16.

García Caballero, G., Beckwith, D., Shilova, N. V.,

glycan binding proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

Gabba, A., Kutzner, T. J., et al. (2020) Influence

101, 17033-17038, doi: 10.1073/pnas.0407902101.

of protein (human galectin-3) design on aspects of

Shilova, N., Huflejt, M. E., Vuskovic, M., Obuk-

lectin activity, Histochem. Cell Biol., 154, 135-153,

hova, P., et al.

(2013) In SialoGlyco Chemistry

doi: 10.1007/s00418-020-01859-9.

and Biology I. Topics in Current Chemistry (Ge-

17.

Dobrochaeva, K., Khasbiullina, N., Shilova, N.,

rardy-Schahn, R., Philippe Delannoy, P., von

Knirel, Y., Obukhova, P., et al. (2021) Specificity pro-

Itzstein, M., eds) Springer Berlin, Heidelberg,

file of αGal antibodies in αGalT KO mice as probed

pp. 169-181.

with comprehensive printed glycan array: comparison

Ribeiro, D. O., Pinheiro, B. A., Carvalho, A. L.,

with human anti-Galili antibodies, Xenotransplanta-

and Palma, A. S. (2017) In Carbohydrate Chemistry:

tion, 28, e12672, doi: 10.1111/xen.12672.

Chemical and Biological Approaches (Rauter, A.,

18.

Dobrochaeva, K., Khasbiullina, N., Shilova, N.,

Lindhorst, T., Queneau, Y., eds) CPI Group Ltd, UK,

Antipova, N., Obukhova, P., et al. (2020) Human

pp. 159-176.

natural antibodies recognizing glycan Galβ1-3Glc-

Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D.,

NAc (LeC), Int. J. Mol. Sci., 21, 6511, doi: 10.3390/

and Smith, D. F. (2014) Chemistry of natural glycan

ĳ ms21186511.

microarrays, Curr. Opin. Chem. Biol.,

18,

70-77,

19.

Huflejt, M. E., Vuskovic, M., Vasiliu, D., Xu, H.,

doi: 10.1016/j.cbpa.2014.01.001.

Obukhova, P., et al. (2009) Anti-carbohydrate anti-

Sørensen, I., Pedersen, H. L., and Willats, W. G. T.

bodies of normal sera: findings, surprises and chal-

(2009) An array of possibilities for pectin, Carbohydr.

lenges, Mol. Immunol., 46, 3037-3049, doi: 10.1016/

Res., 344, 1872-1878, doi: 10.1016/j.carres.2008.12.008.

j.molimm.2009.06.010.

10.

Pedersen, H. L., Fangel, J. U., McCleary, B.,

20.

Bovin, N. V. (2013) Natural antibodies to glycans,

Ruzanski, C., Rydahl, M. G., et al. (2012) Versatile

Biochemistry (Moscow), 78, 786-797, doi: 10.1134/

high resolution oligosaccharide microarrays for plant

S0006297913070109.

glycobiology and cell wall research, J. Biol. Chem.,

21.

Ralet, M.-C., Tranquet, O., Poulain, D., Moïse, A.,

287, 39429-39438, doi: 10.1074/jbc.M112.396598.

and Guillon, F. (2010) Monoclonal antibodies to

11.

Øbro, J., Sørensen, I., Moller, I., Skjøt, M.,

rhamnogalacturonan I backbone, Planta, 231, 1373-

Mikkelsen, J. D., et al.

(2007) High-throughput

1383, doi: 10.1007/s00425-010-1116-y.

microarray analysis of pectic polymers by enzymatic

22.

DuBois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers,

epitope deletion, Carbohydr. Polymers,

70,

77-81,

P. A., Smith, F. (1956) Colorimetric method for

doi: 10.1016/j.carbpol.2007.03.008.

determination of sugars and related substances, Anal.

12.

Moore, J. P., Nguema-Ona, E., Fangel, J. U.,

Chem., 28, 350-356, doi: 10.1021/ac60111a017.

Willats, W. G. T., Hugo, A., et al. (2014) Profiling

23.

Usov, A. I., Bilan, M. I., and Klochkova, N. G.

the main cell wall polysaccharides of grapevine leaves

(1995) Polysaccharide composition of several calcare-

using high-throughput and fractionation methods,

ous red algae: isolation of alginate from Corallina pilu-

Carbohydr. Polymers,

99,

190-198, doi:

10.1016/

lifera P. et R. (Rhodophyta, Corallinaceae), Bot. Ma-

j.carbpol.2013.08.013.

rina, 38, 43-51, doi: 10.1515/botm.1995.38.1-6.43.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИДНЫЙ ЭРРЕЙ

931

24.

Lowry, O., Rosebrough, N., Farr, A. L., and

36.

Laurent, N., Voglmeir, J., and Flitsch, S. L. (2008)

Randall, R. (1951) Protein measurement with the

Glycoarrays

- tools for determining protein-

folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265-275,

carbohydrate interactions and glycoenzyme specificity,

doi: 10.1016/S0021-9258(19)52451-6.

Chem. Commun.,

37,

4400-4412, doi:

10.1039/

25.

Wood, P. J., and Siddiqui, I. R. (1971) Determina-

b806983m.

tion of methanol and its application to measurement

37.

Puvirajesinghe, T., and Turnbull, J. (2016) Glycoarray

of pectin ester content and pectin methyl esterase

technologies: deciphering interactions from proteins

activity, Anal. Biochem., 39, 418-428, doi: 10.1016/

to live cell responses, Microarrays, 5, 3, doi: 10.3390/

0003-2697(71)90432-5.

microarrays5010003.

26.

Golovchenko, V. V., Khramova, D. S., Shashkov,

38.

Polito, L., Bortolotti, M., Battelli, M., Calafato, G.,

A. S., Otgonbayar, D., Chimidsogzol, A., et al. (2012)

and Bolognesi, A. (2019) Ricin: an ancient story for

Structural characterisation of the polysaccharides

a timeless plant toxin, Toxins, 11, 324, doi: 10.3390/

from endemic Mongolian desert plants and their effect

toxins11060324.

on the intestinal absorption of ovalbumin, Carbohydr.

39.

Janssen, L. M. A., Heron, M., Murk, J.-L., Leenders,

Res., 356, 265-272, doi: 10.1016/j.carres.2012.03.023.

A. C. A. P., Rĳ kers, G. T., et al. (2021) The clinical

27.

Ridley, B. L., O’Neill, M. A., and Mohnen, D.

relevance of IgM and IgA anti-pneumococcal

(2001)

Pectins: structure,

biosynthesis, and

polysaccharide ELISA assays in patients with

oligogalacturonide-related signaling, Phytochemistry,

suspected antibody deficiency, Clin. Exp. Immunol.,

57, 929-967, doi: 10.1016/S0031-9422(01)00113-3.

205, 213-221, doi: 10.1111/cei.13605.

28.

Voragen, A. G. J., Coenen, G. J., Verhoef, R. P., and

40.

Campanero-Rhodes, M. A., Palma, A. S.,

Schols, H. A. (2009) Pectin, a versatile polysaccharide

Menéndez, M., and Solís, D. (2020) Microarray

present in plant cell walls, Struct. Chem., 20, 263,

strategies for exploring bacterial surface glycans and

doi: 10.1007/s11224-009-9442-z.

their interactions with glycan-binding proteins, Front.

29.

Cheng, K., Zhou, Y., and Neelamegham, S. (2016)

Microbiol., 10, 2909, doi: 10.3389/fmicb.2019.02909.

DrawGlycan-SNFG: a robust tool to render glycans

41.

Khasbiullina, N. R., Shilova, N. V., Navakouski,

and glycopeptides with fragmentation information, Gly-

M. J., Nokel, A. Y., Blixt, O., et al.

(2019)

cobiology, 27, 200-205, doi: 10.1093/glycob/cww115.

The repertoire of human antiglycan antibodies

30.

Горшкова Т. А. (2007) Растительная клеточная

and its dynamics in the first year of life,

стенка как динамичная система, Наука, Москва.

Biochemistry (Moscow), 84, 608-616, doi: 10.1134/

31.

Zandleven, J., Beldman, G., Bosveld, M., Schols,

S0006297919060038.

H. A., and Voragen, A. G. J. (2006) Enzymatic

42.

Yamada, H., Kiyohara, H., and Matsumoto, T.

degradation studies of xylogalacturonans from apple

(2003) In Advances in Pectin and Pectinase Research

and potato, using xylogalacturonan hydrolase,

(Voragen, F., Schols, H., Visser, R., eds) Springer

Carbohydr. Polymers,

65,

495-503, doi:

10.1016/

Netherlands, Dordrecht, pp. 481-490.

j.carbpol.2006.02.015.

43.

Paulsen, B. S., and Barsett, H.

(2005) In

32.

Patova, O. A., Luаnda, A., Paderin, N. M.,

Polysaccharides I (Heinze, T., eds) Springer Berlin,

Popov, S. V., Makangara, J. J., et al.

(2021)

Heidelberg, pp. 69-101.

Xylogalacturonan-enriched pectin from the fruit pulp

44.

Kiyohara, H., Matsumoto, T., Nagai, T., Kim, S.-J.,

of Adansonia digitata: structural characterization and

and Yamada, H. (2006) The presence of natural hu-

antidepressant-like effect, Carbohydr. Polymers, 262,

man antibodies reactive against pharmacological-

117946, doi: 10.1016/j.carbpol.2021.117946.

ly active pectic polysaccharides from herbal med-

33.

Golovchenko, V. V., Ovodova, R. G., Shashkov,

icines, Phytomedicine,

13,

494-500, doi:

10.1016/

A. S., and Ovodov, Y. S. (2002) Structural studies

j.phymed.2005.09.004.

of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna

45.

Washio, K., Nakamura, M., Sato, N., Hori, M.,

minor L., Phytochemistry, 60, 89-97, doi: 10.1016/

Matsubara, K., et al.

(2022) Anaphylaxis in a

S0031-9422(02)00040-7.

pectin- and cashew nut-allergic child caused by a

34.

Lin, L. I.-K.

(1989) A concordance correlation

citrus bath, Allergol. Int., 71, 155-157, doi: 10.1016/

coefficient to evaluate reproducibility, Biometrics, 45,

j.alit.2021.07.006.

255-268, doi: 10.2307/2532051.

46.

Capucilli, P., Kennedy, K., Kazatsky, A. M.,

35.

Flannery, A., Gerlach, J., Joshi, L., and Kilcoyne, M.

Cianferoni, A., and Spergel, J. M. (2019) Fruit for

(2015)

Assessing bacterial interactions using

thought: anaphylaxis to fruit pectin in foods, J. Allergy

carbohydrate-based microarrays, Microarrays, 4, 690-

Clin. Immunol. Pract.,

719-720, doi:

10.1016/

713, doi: 10.3390/microarrays4040690.

j.jaip.2018.11.047.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022

932

НИКИФОРОВА и др.

PLANT POLYSACCHARIDE ARRAY FOR STUDYING

OF CARBOHYDRATE-BINDING PROTEINS

A. V. Nikiforova¹*, V. V. Golovchenko², P. V. Mikshina³, O. A. Patova²,

T. A. Gorshkova³, N. V. Bovin¹, and N. V. Shilova¹

¹ Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,

117997 Moscow, Russia; e-mail: nikiforovaalica@gmail.com

² Institute of Physiology, Komi Science Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences,

167982 Syktyvkar, Russia

³ Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics,

Federal Research Center Kazan Scientific Center of Russian Academy of Sciences,

420111 Kazan, Russia

The specificity of the most plant carbohydrate-binding proteins has either not been studied or characterized

to a limited extent, many of which are known only through bioinformatic analysis of the genome. The task

of deciphering the carbohydrate specificity of proteins can be solved by glycoarrays composed of many tens

or even hundreds of glycans deposited on a surface the size of an microscope glass. Plant polysaccharides

are the most natural ligands for studying plant proteins; the present work shows that plant polysaccharides

without additional modification are immobilized on the surface, the carboxyl groups of which are activated

with N-hydroxysuccinimide. As a result, an array was constructed consisting of 113 well-characterized

polysaccharides isolated from the cell walls of various plants, 23 mono- and oligosaccharides - components

of the studied polysaccharides, as well as glycans - ligands of widely known plant lectins. Upon chemical

immobilization of polysaccharides, their functional activity was preserved, which follows from the results of

interaction with antibodies and the plant lectin ricin. Using the proposed array, a previously unknown ability of

ricin to bind polysaccharides was found, which significantly expands the idea of its specificity, and it was also

found that antibodies to plant polysaccharides are present in human peripheral blood.

Keywords: carbohydrate-binding proteins, plant lectins, plant polysaccharides, pectins, polysaccharide chip,

glycoarray, INRA-RU2, anti-glycan human antibodies

БИОХИМИЯ том 87 вып. 7 2022