БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 9, с. 1223 - 1231

УДК 577.22

ДЕЛЕЦИОННЫЕ ВАРИАНТЫ

АУТОТРАНСПОРТЕРА Psychrobacter cryohalolentis

ПОВЫШАЮТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСПОНИРОВАНИЯ ¹⁰FN3

НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК Escherichia coli

Е.Ф. Болдырева¹, Д.А. Долгих^1,2, М.П. Кирпичников^1,2

¹ ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия; электронная почта: lshingarova@gmail.com

² Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет,

119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 16.06.2022

После доработки 11.07.2022

Принята к публикации 11.07.2022

Аутотранспортер АТ877 Psychrobacter cryohalolentis относится к семейству белков внешней мембра-

ны, содержащих N-концевой пассажирский и С-концевой транслокаторный домены и составляющих

основу для конструирования систем дисплея на поверхности клеток бактерий. Ранее мы показали,

что пассажирский домен АТ877 может быть заменен холодоактивной эстеразой EstPc или 10-м доме-

ном фибронектина III-го типа (¹⁰Fn3). С целью повышения эффективности поверхностного дисплея

¹⁰Fn3 в клетках Escherichia coli получены 4 делеционных варианта гибридного аутотранспортера Fn877.

Установлено, что все варианты обнаруживаются в мембране бактериальных клеток и обеспечива-

ют связывание специфических к ¹⁰Fn3 антител на поверхности клетки. Наиболее высокий уровень

связывания обеспечивают варианты Δ239 и Δ310, содержащие 4 и 7 бета-тяжей из 12, составляющих

структуру транслокаторного домена. С помощью электрофореза в полунативных условиях продемон-

стрировано наличие тепловой модифицируемости полноразмерного Fn877 и его делеционных вари-

антов, что указывает на сохранение бета-структуры в их молекулах. Полученные результаты могут

быть использованы для оптимизации систем бактериального дисплея ¹⁰Fn3, а также других гетероло-

гичных пассажирских доменов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: секреция, аутотранспортер, делеционные варианты, 10-й домен фибронектина

человека III-го типа, бактериальный дисплей.

DOI: 10.31857/S0320972522090044, EDN: BALEXT

ВВЕДЕНИЕ

транслокаторных доменов АТ является наличие

структуры типа бета-бочонка, который включа-

Аутотранспортеры (АТ) представляют со-

ет в себя 12 амфипатических бета-тяжей [2, 3].

бой семейство белков внешней мембраны

Транспорт АТ в периплазматическое про-

грамотрицательных бактерий, использующих

странство осуществляется с участием Sec-ап-

в процессе экспорта систему секреции V-го

парата бактериальной клетки. АТ синтезиру-

типа [1]. Они играют важную роль в процес-

ются в виде предшественников, содержащих

сах вирулентности и выживания различных

N-концевую сигнальную последовательность,

микроорганизмов, включая патогенные. Мо-

которая отщепляется в процессе транспорта.

лекулы зрелых АТ состоят из N-концевого пас-

В процессе секреции компетентное состоя-

сажирского и С-концевого транслокаторного

ние АТ поддерживается благодаря взаимодей-

доменов, соединенных альфа-спиральным сег-

ствию с шаперонами (SurA, Skp и др.), а также

ментом (линкером). Общей чертой строения характерной для них низкой скорости сворачи-

вания [4, 5]. Встраивание АТ во внешнюю мем-

Принятые сокращения: АТ - аутотранспортер; ¹⁰Fn3 -10-й домен фибронектина человека III-го типа; IPTG - изо-

пропил-β-D-тиогалактопиранозид; PBS - фосфатно-солевой буфер.

* Адресат для корреспонденции.

1223

1224

ШИНГАРОВА и др.

брану происходит с участием белков Bam-ком-

пассажирского домена способствовало повы-

плекса, который включает в себя интегральный

шению эффективности поверхностного дис-

белок BamA и липопротеины BamB-E [6, 7].

плея ¹⁰Fn3 [15], что позволило провести отбор

Установлено, что природный пассажир-

библиотеки ФНО-связывающих вариантов

ский домен АТ в ряде случаев может быть за-

данного каркасного белка [20]. Однако при-

менен другим белком. Такой подход лежит в

сутствие EstPc в составе пассажирского домена

основе конструирования систем дисплея ре-

может оказаться нежелательным, например, в

комбинантных белков на поверхности клеток

случае терапевтического использования полу-

бактерий [8-10], которые могут быть исполь-

ченных конструкций.

зованы в ряде биотехнологических и промыш-

В данной работе нами получен и исследо-

ленных областей, включая разработку живых

ван ряд делеционных мутантов Fn877 и обна-

вакцин, конструирование и скрининг комбина-

ружены варианты, демонстрирующие повы-

торных библиотек, получение биоадсорбентов

шенную эффективность транспорта ¹⁰Fn3 на

для удаления из окружающей среды вредных

поверхности клетки.

химических веществ и тяжелых металлов, полу-

чение цельноклеточных биокатализаторов для

диагностических, промышленных приложений

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

и биоремедиации окружающей среды [11, 12].

Нами была сконструирована система

В работе использовали реактивы фирм

клеточного дисплея на поверхности кле-

«Bio-Rad» США, «Merck» США, «Panreac» Ис-

ток Escherichia coli на основе аутотранспор-

пания; компоненты сред для культивирования

тера АТ877 грамотрицательной бактерии

бактерий («Difco», США); органические рас-

Psychrobacter cryohalolentis K5T [13]. Природ-

творители производства «Химмед» Россия. Рас-

ный пассажирский домен АТ877, представ-

творы готовили на деионизованной воде MilliQ.

ляющий собой липазу семейства GDSL, был

Клонирование рекомбинантных ДНК осу-

заменен холодоактивной эстеразой EstPc

ществляли стандартными методами в клетках

P. cryohalolentis [13, 14], а также доменом 10 фи-

E. coli XL-1 Blue («Stratagene», США). Исполь-

бронектина III-го типа человека (¹⁰Fn3) [15].

зовали ферменты производства «Thermo Fisher

¹⁰Fn3 является популярным каркасным белком,

Scientific», США. Олигонуклеотиды синтези-

на основе которого могут быть получены ис-

рованы фирмой «Евроген», Россия. Для кон-

кусственные связывающие молекулы - анало-

струирования делеционных вариантов Fn877

ги антител, обладающие небольшим размером

проводили ПЦР c праймерами, приведенными

и высокой стабильностью [16-18]. Установле-

в таблице.

но, что рекомбинантные пассажирские доме-

Фрагменты клонировали в вектор pET20b

ны экспонированы на поверхности клеток и

по сайтам NcoI и XhoI, аналогично гену исход-

демонстрируют характерные каталитические

ного белка, и подтверждали последователь-

свойства (в случае EstPc) или связывание специ-

ность вставки секвенированием («Евроген»).

фических антител (в случае ¹⁰Fn3).

Выделение мембранной фракции. Культуру

Следует отметить, что уровень экспрессии

клеток штамма E. coli С41(DE3) («Avidis SA»,

¹⁰Fn3 в качестве пассажирского домена АТ877

Франция), трансформированную одной из

на поверхности клеток E. coli оказался срав-

плазмид, выращивали в LB с ампициллином

нительно низким

[15], предположительно,

(100 мкг/мл) при 37 °С до значения ОП при

вследствие высокой скорости сворачивания

560 нм 0,5-0,7, индуцировали экспрессию бел-

белка в цитоплазме клеток [19]. Размещение

ка добавлением 0,2 мМ изопропил-β-D-тио-

холодоактивной эстеразы EstPc на N-конце

галактопиранозида (IPTG), после чего продол-

Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для конструирования делеционных вариантов Fn877

Название

5′→3′ последовательность праймеров

Длина, н.п.

D239rev

TTCTCCTCGAGCTGCACGCCGCCAAGCTT

D261rev

TTCTCCTCGAGGCCACCAAGTGTGACCGCA

D285rev

ACATCTCGAGCATCGGATATCCTGCCTGC

D310rev

TTCTCCTCGAGTTCTTTTAGCGCGTCCAATC

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

ДЕЛЕЦИОННЫЕ ВАРИАНТЫ АУТОТРАНСПОРТЕРА

1225

жали культивирование в течение 1,5 ч при 25 °С

Выделение рекомбинантных белков про-

в присутствии 5 мМ MgCl₂. Клетки осаждали

водили из культуры клеток E. coli С41(DE3),

при 2700 g 10 мин при 5 °С, после чего оса-

содержащей одну из полученных плазмид

док ресуспендировали в буфере, содержащем

и выращенной в присутствии 0,2 мМ IPTG

50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 5 мМ EDTA, 20% саха-

при 37 °С в LB c ампициллином в течение 3 ч.

розы, лизоцим (0,2 мг/мл), и разрушали обра-

Биомассу суспендировали в буфере, содержа-

боткой ультразвуком с использованием Branson

щем 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 200 мМ NaCl и

Digital Sonifier («Emerson», США). Суспензию

1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF),

центрифугировали 30 мин при 6000 g. Получен-

и разрушали клетки обработкой ультразвуком

ный супернатант центрифугировали 1 час при

на ледяной бане в течение 6 мин при 50% мощ-

100 000 g, и суспендировали осадок мембран-

ности. Осадок после центрифугирования рас-

ной фракции в 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0).

творяли в буфере, содержащем 8 М мочевину,

Для анализа при помощи Вестерн-блота

20 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 200 мМ NaCl в те-

разделенные гель-электрофорезом в 10%-ном

чение 2 ч при комнатной температуре. После

SDS-ПААГ по методу Лэммли белки пере-

отделения нерастворенного материала центри-

носили на нитроцеллюлозную мембрану

фугированием супернатант наносили на ко-

(«Bio-Rad»). После инкубации в растворе

лонку Ni-Sepharose FastFlow («GE Healthcare»,

1%-го BSA в TBS (20 мМ Tris-HCl (pH 8,0),

США), уравновешенную тем же буфером с

150 мМ NaCl) в течение 1 ч при 37 °C мембра-

6 М мочевиной, промывали этим буфером и

ну выдерживали в растворе конъюгата моно-

элюировали буфером с 6 М мочевиной в при-

клональных антител к His-тагу с пероксидазой

сутствии 250 мМ имидазола. Фракции, со-

(1 мкг/мл, «Invitrogen», США) в 1%-ном BSA в

держашие очищенный белок по результатам

TBS в течение 1 ч при комнатной температуре.

электрофореза, объединяли. Для рефолдинга

Окрашивание мембраны проводили с исполь-

очищенных белков раствор белка порциями

зованием преципитирующего

3,3′,5,5′-тетра-

по 50 мкл добавляли в 0,5 мл буфера, содержа-

метилбензидина (TMB,

«Clinical Science

щего 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 200 мМ NaCl,

Products», США).

1% LDAO (оксид лаурилдиметиламина) и пе-

Для проведения ELISA на целых клет-

ремешивали 1 ч при комнатной температуре,

ках культуру выращивали, как описано выше.

затем диализовали 2 раза против 100 мл бу-

Клетки осаждали при 2700 g 6 мин при 5 °С,

фера, содержащего 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0),

дважды промывали фосфатно-солевым буфе-

200 мМ NaCl, 0,05% LDAO.

ром (PBS) в присутствии 5 мМ MgCl₂ и цен-

Белковый электрофорез в полунативных ус-

трифугировали в тех же условиях. Доводили

ловиях проводили, как описано ранее [21], с

мутность суспензии до ОП = 1 при 560 нм и на-

модификациями. Аликвоты очищенных белков

носили по 100 мкл в лунки планшета для ELISA

после рефолдинга прогревали при 37 °С или

(«Corning», США) в трех повторностях. Клет-

95 °С в течение 10 мин и наносили на гель в бу-

ки высушивали 20 ч в термостате при 37 °С,

фере для образцов, не содержащем SDS. Элек-

блокировали 2%-ным BSA и промывали PBST

трофорез проводили в системе MiniProtean

(PBS + 0,1% (v/v) Tween-20).

(«Bio-Rad») при 4 °С с использованием элект-

Моноклональные антитела к

¹⁰Fn3

родного буфера, не содержащего SDS.

(«Hybridoma Laboratories», Россия) добавляли

в соотношении 1/1000 в PBS + 1% BSA, вы-

держивали 1 ч при 37 °С и перемешивании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После удаления антител промывали лунки

3 раза по 5 мин PBST. Для визуализации им-

Конструирование и экспрессия делеционных

мунных комплексов использовали конъюгат

вариантов Fn877. Поскольку пространствен-

анти-мышь-HRP («Sigma», США) в соотно-

ная структура АТ877 в настоящее время неиз-

шении 1/10 000. После отмывки в лунки до-

вестна, для локализации элементов вторичной

бавляли по 100 мкл TMB, выдерживали 4 мин,

структуры данного белка мы провели вырав-

затем останавливали реакцию добавлением

нивание аминокислотной последовательно-

10%-ной H₂SO₄. Интенсивность окрашива-

сти его транслокаторного домена с последо-

ния измеряли при 450 нм с помощью ридера

вательностью АТ эстеразы EstA Pseudomonas

Model 680 («Bio-Rad»).

aeruginosa [22]. Мы запланировали получение

Для анализа экспонированности His-та-

четырех делеционных вариантов, содержащих,

га проводили ELISA в одну стадию, используя

соответственно, 4-7 бета-тяжей из 12, пред-

конъюгат моноклональных антител к His-тагу

положительно, имеющихся в полноразмерном

с пероксидазой («Invitrogen»).

белке АТ877 (рис. 1). Соответственно, в каче-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1226

ШИНГАРОВА и др.

Рис. 1. Строение делеционных вариантов Fn877. а - Выравнивание аминокислотных последовательностей трансло-

каторных доменов АТ877 и EstA P. aeruginosa с помощью Protein Blast. Расположение бета-тяжей в транслокаторном

домене EstA (PDB: 3KVN) обозначено стрелками. С-концевые остатки делеционных вариантов Fn877 (Δ239, Δ261, Δ285

и Δ310 соответственно) подчеркнуты. б - Схемы Fn877 и делеционных вариантов. ¹⁰Fn3 - 10-й домен фибронектина

человека III-го типа; α - альфа-спиральный линкер; β-barrel - транслокаторный домен AT877

Рис. 2. Белковый электрофорез в 10%-ном ПААГ-SDS (а) и Вестерн-блот с анти-His конъюгатом (б) образцов мембран-

ной фракции клеток С41(DE3), экспрессирующих делеционные варианты Fn877. Дорожки: 1 - Δ239; 2 - Δ261; 3 - Δ285;

4 - Δ310; 5 - Fn877; 6 - Fn877 без индукции (отрицательный контроль). М - маркеры молекулярного веса белков (кДа)

стве С-концевых были выбраны аминокислот-

E. coli штамма С41(DE3), оптимизированно-

ные остатки, находящиеся на границе бета-тя-

го для синтеза мембранных белков [23]. Для

жей - Q440, G462, M486 и E511.

определения локализации полученных гибрид-

Гены делеционных вариантов Fn877 Δ239,

ных АТ проведено исследование мембранных

Δ261, Δ285 и Δ310 (цифра обозначает число ами-

фракций клеток E. coli с помощью белкового

нокислотных остатков в рекомбинантном АТ

электрофореза и Вестерн-блота с антителами к

после отщепления сигнального пептида) были

гексагистидиновой последовательности. Уста-

получены с помощью ПЦР и клонированы в

новлено, что все укороченные варианты АТ

вектор pFn877, содержащий кодирующие по-

обнаруживаются в мембранной фракции, при

следовательности

¹⁰Fn3, альфа-спирального

этом уровень их мембранной локализации

линкера и транслокаторного домена АТ877

превышает таковой в случае полноразмерно-

под контролем промотора T7lac [15]. Экспрес-

го Fn877 (рис. 2). Необходимо отметить, что

сию полученных генов осуществляли в клетках

продолжительное культивирование приводило

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

ДЕЛЕЦИОННЫЕ ВАРИАНТЫ АУТОТРАНСПОРТЕРА

1227

к накоплению рекомбинантных АТ в нераство-

холодоактивную эстеразу EstPc на N-конце

римой фракции клеток в составе телец включе-

пассажирского домена [15], и изучили эффек-

ния, как ранее было описано для Fn877 [15] и

тивность экспонирования ¹⁰Fn3 на поверхно-

AT877 [24]. Это было использовано в дальней-

сти клеток с помощью аналогичного подхода.

шем для получения белков в очищенном виде и

Подобно 23Fn877, содержащему полноразмер-

рефолдинга (см. ниже).

ный транслокаторный домен, делеционные

Анализ экспонирования ¹⁰Fn3 на поверхности

варианты обеспечивали существенно более

клеток E. coli. Для доказательства экспониро-

высокий (в 4-6 раз выше) уровень сигнала по

вания пассажирского домена на поверхности

сравнению с Fn877. При этом, как выяснилось,

клеток E. coli, экспрессирующих различные

делеции оказывают незначительное влияние

варианты Fn877, был проведен их анализ ме-

на связывание антител к ¹⁰Fn3 клетками, экс-

тодом ELISA с использованием моноклональ-

прессирующими такие варианты, по сравне-

ных антител к ¹⁰Fn3. Продемонстрировано, что

нию с вариантом 23Fn877 (рис. 3, б).

все варианты обеспечивают связывание анти-

Исследование фолдинга делеционных вари-

тел на клеточной поверхности, при этом наи-

антов АТ877. Известно, что белки внешней мем-

более высокий уровень связывания и, со-

браны, обладающие нативной конформацией,

ответственно, экспонирования, в

3,3 раза

демонстрируют способность к так называемой

превышающий контрольный (для клеток, экс-

«тепловой модифицируемости» [20, 25]. При

прессирующих Fn877), демонстрирует вариант

соблюдении определенных условий наличие

Δ310 (рис. 3, а). Делеционные варианты Δ239 и

SDS в составе геля для электрофореза не при-

Δ285 обеспечивали в 2 раза более высокий уро-

водит к денатурации таких белков благодаря

вень связывания по сравнению с Fn877, а вари-

высокой стабильности бета-структуры, содер-

ант Δ261 практически не отличался от контроля.

жащей большое количество водородных свя-

Для того чтобы убедиться в целостности

зей. Однако инкубация при высокой темпера-

клеток в процессе выращивания и иммунофер-

туре разрушает эту структуру, в результате чего

ментного анализа, мы провели аналогичный

их электрофоретическая подвижность меняет-

эксперимент с использованием антител к гекса-

ся. Таким образом, определение тепловой мо-

гистидиновой последовательности. Поскольку

дифицируемости с помощью белкового элек-

С-конец АТ877, предположительно, ориентиро-

трофореза представляет собой стандартный

ван в периплазматическое пространство, в слу-

тест для оценки правильного фолдинга белков

чае сохранения интактной клеточной мембраны

внешней мембраны [25]. При этом в каждом

взаимодействие с антителами к His-тагу долж-

случае требуется индивидуальный подбор ме-

но быть гораздо ниже, чем при ее разрушении.

тодики подготовки образцов (состава буфера

Действительно, уровень сигнала, обеспечивае-

для нанесения, времени и температуры про-

мый клетками с экспрессией Δ239 и Δ310 после

грева и т.п.), позволяющей различать нативное

обработки лизоцимом, оказался примерно в

и денатурированное состояние.

4 раза выше, чем у клеток, не подвергавшихся

Для того чтобы проверить наличие натив-

такой обработке (данные не приведены), что

ной конформации у полученных делеционных

доказывает отсутствие существенного лизиса.

вариантов, мы провели очистку в денатуриру-

Мы также получили делеционные вариан-

ющих условиях и рефолдинг белков Δ239, Δ310

ты 23Δ239 и 23Δ310 гибридных АТ, содержащих

и Fn877 из телец включения (рис. 4, а), после

Рис. 3. Анализ методом ELISA с антителами к ¹⁰Fn3 экспонирования пассажирского домена на поверхности клеток

E. coli С41(DE3), экспрессирующих варианты Fn877 (а) и варианты 23Fn877 (б). -IPTG - клетки, выращенные в тех же

условиях без добавления IPTG (отрицательный контроль)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1228

ШИНГАРОВА и др.

Рис. 4. Анализ фолдинга делеционных вариантов АТ877. Белковый электрофорез в 10%-ном SDS-ПААГ в денатури-

рующих (а) и полунативных (б) условиях выделенных и рефолдированных белков Δ239 (дорожка 1), Δ310 (дорожка 2)

и Fn877 (дорожка 3). Перед нанесением на гель образцы были прогреты при 37 °С (F) или 95 °С (U)

чего разработали протокол их анализа мето-

на»), на клеточной поверхности предотвращает

дом полунативного белкового электрофореза.

обратный транспорт в периплазму, в результате

Электрофоретическая подвижность образцов

чего процесс приобретает необратимый харак-

выделенных белков, прогретых при 95 °С, ока-

тер [26, 27]. Эксперименты по фолдингу in vitro

залась существенно ниже, чем у выдержанных

ряда пассажирских доменов АТ показали, что

при 37 °С (рис. 4, б), что указывает на присут-

стабильность их С-концевых фрагментов пре-

ствие нативной бета-структуры в молекулах

вышает стабильность N-концевых [27, 28].

исследованных вариантов АТ.

Известно, что домен фибронектина обла-

дает высокой скоростью сворачивания и ста-

бильной структурой [20]. Мы предполагаем,

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

что быстрый фолдинг гибридных АТ, содержа-

щих ¹⁰Fn3 в качестве пассажирского домена,

Биогенез АТ включает ряд последователь-

является причиной низкого уровня его экспо-

ных стадий - синтез белка-предшественника в

нирования на клеточной поверхности. Ранее

цитоплазме клеток, транспорт в периплазмати-

нами был предложен оригинальный подход

ческое пространство с отщеплением сигнальной

для оптимизации системы дисплея ¹⁰Fn3, ко-

последовательности и встраивание во внеш-

торый фактически представляет собой созда-

нюю мембрану [1-4]. Структура природных АТ

ние искусственного градиента стабильности с

оптимизирована таким образом, чтобы обеспе-

повышением ее в направлении С-конца этого

чить координированное протекание различных

домена [15]. Полученные в данной работе ре-

этапов данного процесса с участием многочис-

зультаты открывают перспективы альтернатив-

ленных клеточных факторов (аппарата трансля-

ного подхода с использованием укороченных

ции, секреторного комплекса, шаперонов в ци-

вариантов АТ877. Мы показали, что наличие в

топлазме и периплазме, Bam-комплекса и др.).

составе транслокаторного домена 4 бета-тяжей

Важную роль в нем играют свойства пассажир-

из 12 достаточно для дисплея ¹⁰Fn3 в качестве

ского и транслокаторного доменов.

пассажирского домена на поверхности клетки.

Большинство пассажирских доменов АТ об-

При этом уровень экспонирования данного ва-

ладает β-спиральной пространственной струк-

рианта в 2 раза превышает уровень Fn877. Уве-

турой [2]. Согласно принятой в настоящее

личение числа бета-тяжей до 7 дополнительно

время модели секреции, пассажирский домен

повышает количество белка на поверхности

преодолевает внешнюю мембрану в разверну-

клеток (более чем в 3 раза по сравнению с пол-

той конформации. Сворачивание его С-кон-

норазмерным белком).

цевого фрагмента, обладающего повышенной

Необходимо отметить, что укорочение

стабильностью (так называемого «аутошаперо-

транслокаторных доменов АТ, содержащих

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

ДЕЛЕЦИОННЫЕ ВАРИАНТЫ АУТОТРАНСПОРТЕРА

1229

эстеразу EstPc в составе пассажирского доме-

образуется за счет взаимодействия 4 бета-тяжей

на, не сопровождалось увеличением экспони-

каждого из мономеров [34]. Мультимеризация

рованности ¹⁰Fn3 по сравнению с полнораз-

бета-тяжей, по-видимому, представляет собой

мерным белком 23Fn877. Таким образом, два

эволюционный механизм появления природ-

предложенных нами подхода повышения эф-

ных бета-структур [35] и может быть исполь-

фективности клеточного дисплея, вероятно,

зована для их конструирования in vitro. Так, на

опосредуются различными механизмами и не

основе белка внешней мембраны OmpX, содер-

дополняют друг друга.

жащего 8 бета-тяжей, были получены белки,

Механизм секреции АТ на клеточную по-

включающие до 16 бета-тяжей [36]. Показано,

верхность в настоящее время до конца не из-

что OmpA может быть восстановлен из отдель-

учен, поэтому можно лишь предполагать,

но экспрессированных фрагментов, которые

каким образом укорочение транслокаторно-

ассоциируются с образованием функциональ-

го домена АТ877 способствует повышению

ного белка в мембране [37] и in vitro [38]. Та-

эффективности клеточного дисплея

¹⁰Fn3 в

ким образом, точное установление механизма

E. coli. Известно, что размер центральной поры

секреции вариантов Fn877 требует проведения

транслокаторного домена составляет 1-2 нм,

дополнительных исследований.

что не позволяет разместить в ней свернутые

белки [29]. Новейшие данные свидетельствуют

о том, что в процессе транспорта BamA ассоци-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ирует с транслокаторным доменом АТ с обра-

зованием гибридного бета-бочонка [30]. Таким

Полученные нами результаты свидетель-

образом, транслокация пассажирского домена

ствуют в пользу того, что укороченные вариан-

происходит через пору, образованную BamA,

ты Fn877 обладают нативной бета-структурой

что в результате может обеспечивать транспорт

и локализованы во внешней мембране E. coli,

пассажирских доменов, содержащих структури-

что обеспечивает экспонирование пассажир-

рованные элементы [2]. В этом случае решаю-

ского домена на поверхности клеток. Белки

щим фактором, определяющим эффективность

семейства АТ являются одними из наиболее

поверхностного дисплея, является взаимодей-

часто используемых для создания систем кле-

ствие транслокаторного домена с BamA, кото-

точного дисплея, однако его эффективность

рое может происходить с разной эффективно-

может варьировать в зависимости от природы

стью в случае различных вариантов Fn877.

пассажирского и транслокаторного доменов.

Узнавание субстратов BamA проис-

Предложенный в данной работе подход к по-

ходит благодаря С-концевому мотиву АТ,

вышению эффективности транспорта гибрид-

включающему ароматический остаток (бе-

ного АТ, включающего ¹⁰Fn3 в качестве пасса-

та-сигнал) [31]. Известно, что подавляющее

жирского домена, может быть использован для

большинство белков внешней мембраны грам-

оптимизации систем бактериального дисплея

отрицательных бактерий в качестве С-кон-

данного каркасного белка, а также других гете-

цевого аминокислотного остатка содержит

рологичных пассажирских доменов.

триптофан [32], в то время как аминокислот-

ная последовательность АТ877 заканчивается

Вклад авторов. Л.Н. Шингарова, Л.Е. Пе-

остатком тирозина. В то же время установлено

тровская, М.П. Кирпичников - концепция

наличие в последовательности АТ альтернатив-

и руководство работой; Л.Н. Шингарова,

ных бета-сигналов, например, в составе 8-го

Е.А. Крюкова, С.Ш. Гапизов, Е.Ф. Болдыре-

бета-тяжа в случае EstA [33]. Конфигурация

ва - проведение экспериментов; Л.Н. Шинга-

таких сигналов в составе транслокаторных до-

рова, Л.Е. Петровская, Д.А. Долгих - обсужде-

менов, полученных нами делеционных вариан-

ние результатов исследования; Л.Е. Петровская,

тов Fn877, может отличаться от полноразмер-

Л.Н. Шингарова - написание текста статьи.

ного, что, в свою очередь, должно оказывать

Финансирование. Работа выполнена при

влияние на их взаимодействие с BamA и эф-

финансовой поддержке Министерства науки и

фективность дисплея пассажирского домена.

высшего образования Российской Федерации

Нельзя исключить также существование

(соглашение № 075-15-2021-1354 от 07.10.2021).

механизма, включающего формирование оли-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

гомерных структур на основе укороченных

отсутствии конфликта интересов.

вариантов транслокаторного домена АТ877.

Соблюдение этических норм. Настоящая

Типичные транслокаторные домены содержат

статья не содержит описания каких-либо ис-

12 бета-тяжей, однако у представителей семей-

следований с участием людей или животных в

ства тримерных АТ структура бета-бочонка

качестве объектов.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1230

ШИНГАРОВА и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Dautin, N., and Bernstein, H. D. (2007) Protein se-

cation, and characterization of a cold adapted esterase

cretion in gram-negative bacteria via the autotrans-

produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from

porter pathway, Annu. Rev. Microbiol., 61, 89-112,

Siberian cryopeg, FEMS Microbiol. Ecol., 82, 367-375,

doi: 10.1146/annurev.micro.61.080706.093233.

doi: 10.1111/j.1574-6941.2012.01385.x.

Van Ulsen, P., ur Rahman, S., Jong, W. S., Daleke-

15.

Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Shingarova, L.,

Schermerhorn, M. H., and Luirink, J. (2014) Type V

Boldyreva, E., Gapizov, S. S., et al. (2018) Fusion

secretion: from biogenesis to biotechnology, Biochim.

with the cold-active esterase facilitates autotransport-

Biophys. Acta Mol. Cell Res.,

1843,

1592-1611,

er-based surface display of the 10th human fibronec-

doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.11.006.

tin domain in Escherichia coli, Extremophiles, 22, 141-

Grijpstra, J., Arenas, J., Rutten, L., and

150, doi: 10.1007/s00792-017-0990-7.

Tommassen, J.

(2013) Autotransporter secretion:

16.

Gebauer, M., and Skerra, A.

(2020) Engineered

varying on a theme, Res. Microbiol., 164, 562-582,

protein scaffolds as next-generation therapeutics, Ann.

doi: 10.1016/j.resmic.2013.03.010.

Rev. Pharmacol. Toxicol., 60, 391-415, doi: 10.1146/

Leyton, D. L., Rossiter, A. E., and Henderson, I. R.

annurev-pharmtox-010818-021118.

(2012) From self sufficiency to dependence: mech-

17.

Chandler, P. G., and Buckle, A. M.

(2020)

anisms and factors important for autotransport-

Development and differentiation in monobodies based

er biogenesis, Nat. Rev. Microbiol.,

10,

213-225,

on the fibronectin type 3 domain, Cells, 9, 610, doi:

doi: 10.1038/nrmicro2733.

10.3390/cells9030610.

Selkrig, J., Leyton, D. L., Webb, C. T., and

18.

Akkapeddi, P., Teng, K. W., and Koide, S. (2021)

Lithgow, T. (2014) Assembly of β-barrel proteins

Monobodies as tool biologics for accelerating target

into bacterial outer membranes, Biochim. Biophys.

validation and druggable site discovery, RSC Med.

Acta Mol. Cell Res., 1843, 1542-1550, doi: 10.1016/

Chem., 12, 1839-1853, doi: 10.1039/d1md00188d.

j.bbamcr.2013.10.009.

19.

Plaxco, K. W., Spitzfaden, C., Campbell, I. D., and

Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., and Bernstein,

Dobson, C. M. (1997) A comparison of the folding

H. D. (2011) Sequential and spatially restricted inter-

kinetics and thermodynamics of two homologous

actions of assembly factors with an autotransporter

fibronectin type III modules, J. Mol. Biol., 270, 763-

β domain, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 108, E383-E391,

770, doi: 10.1006/jmbi.1997.1148.

doi: 10.1073/pnas.1103827108.

20.

Shingarova, L., Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Gapi-

Kim, K. H., Aulakh, S., and Paetzel, M.

(2012)

zov, S. S., Kryukova, E., et al. (2018) Construc-

The bacterial outer membrane beta-barrel assembly

tion of artificial TNF-binding proteins based on the

machinery, Prot. Sci., 21, 751-768, doi: 10.1002/

10th human fibronectin type III domain using bac-

pro.2069.

terial display, Biochemistry (Moscow), 83, 708-716,

Lee, S. Y., Choi, J. H., and Xu, Z. (2003) Microbial

doi: 10.1134/S0006297918060081.

cell-surface display, Trends Biotechnol., 21, 45-52,

21.

Noinaj, N., Kuszak, A. J., and Buchanan, S. K.

doi: 10.1016/s0167-7799(02)00006-9.

(2015) Heat modifiability of outer membrane pro-

Nicolay, T., Vanderleyden, J., and Spaepen, S. (2015)

teins from Gram-negative bacteria, Methods Mol.

Autotransporter-based cell surface display in Gram-

Biol. (Clifton, N.J.),

1329,

51-56, doi:

10.1007/

negative bacteria, Crit. Rev. Microbiol., 41, 109-123,

978-1-4939-2871-2_4.

doi: 10.3109/1040841X.2013.804032.

22.

Van den Berg, B. (2010) Crystal structure of a full-

10.

Van Ulsen, P., Zinner, K. M., Jong, W. S. P., and

length autotransporter, J. Mol. Biol., 396, 627-633,

Luirink, J.

(2018) On display: autotransporter

doi: 10.1016/j.jmb.2009.12.061.

secretion and application, FEMS Microbiol. Lett., 365,

23.

Miroux, B., and Walker, J. E. (1996) Over-production

fny165, doi: 10.1093/femsle/fny165.

of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow

11.

Jose, J., Maas, R. M., and Teese, M. G. (2012) Au-

synthesis of some membrane proteins and globular

todisplay of enzymes - molecular basis and per-

proteins at high levels, J. Mol. Biol., 260, 289-298,

spectives, J. Biotechnol., 161, 92-103, doi: 10.1016/

doi: 10.1006/jmbi.1996.0399.

j.jbiotec.2012.04.001.

24.

Petrovskaya, L. E., Ziganshin, R. H., Kryukova,

12.

Wu, C. H., Mulchandani, A., and Chen, W.

E. A., Zlobinov, A. V., Gapizov, S. S., et al. (2021)

(2008) Versatile microbial surface-display for en-

Increased synthesis of a magnesium transporter

vironmental remediation and biofuels produc-

MgtA during recombinant autotransporter expression

tion, Trends Microbiol., 16, 181-188, doi: 10.1016/

in Escherichia coli, Appl. Biochem. Biotechnol., 193,

j.tim.2008.01.003.

3672-3703, doi: 10.1007/s12010-021-03634-5.

13.

Petrovskaya, L., Novototskaya-Vlasova, K., Kryuko-

25.

Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., and Flem-

va, E., Rivkina, E., Dolgikh, D., et al. (2015) Cell sur-

ing, K. G. (2008) β-Barrel proteins that reside in the

face display of cold-active esterase EstPc with the use

Escherichia coli outer membrane in vivo demonstrate

of a new autotransporter from Psychrobacter cryohalo-

varied folding behavior in vitro, J. Biol. Chem., 283,

lentis K5T, Extremophiles, 19, 161-170, doi: 10.1007/

26748-26758, doi: 10.1074/jbc.M802754200.

s00792-014-0695-0.

26.

Peterson, J. H., Tian, P., Ieva, R., Dautin, N., and

14.

Novototskaya-Vlasova, K., Petrovskaya, L., Yaki-

Bernstein, H. D. (2010) Secretion of a bacterial vir-

mov, S., and Gilichinsky, D. (2012) Cloning, purifi-

ulence factor is driven by the folding of a C-terminal

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

ДЕЛЕЦИОННЫЕ ВАРИАНТЫ АУТОТРАНСПОРТЕРА

1231

segment, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107, 17739-17744,

for the correct assembly of a bacterial outer

doi: 10.1073/pnas.1009491107.

membrane protein, J. Mol. Biol.,

218,

141-148,

27. Renn, J. P., Junker, M., Besingi, R. N., Braselmann,

doi: 10.1016/0022-2836(91)90880-f.

E., and Clark, P. L.

(2012) ATP-independent

33. Celik, N., Webb, C. T., Leyton, D. L., Holt, K. E.,

control of autotransporter virulence protein

Heinz, E., et al. (2012) A bioinformatic strategy for

transport via the folding properties of the secreted

the detection, classification and analysis of bacterial

protein, Chem. Biol.,

19,

287-296, doi:

10.1016/

autotransporters, PLoS One, 7, e43245, doi: 10.1371/

j.chembiol.2011.11.009.

journal.pone.0043245.

28. Junker, M., Besingi, R. N., and Clark, P. L. (2009)

34. Meng, G., Surana, N. K., St. Geme III, J. W., and

Vectorial transport and folding of an autotransport-

Waksman, G. (2006) Structure of the outer membrane

er virulence protein during outer membrane secre-

translocator domain of the Haemophilus influenzae

tion, Mol. Microbiol., 71, 1323-1332, doi: 10.1111/

Hia trimeric autotransporter, EMBO J., 25, 2297-

j.1365-2958.2009.06607.x.

2304, doi: 10.1038/sj.emboj.7601132.

29. Oomen, C. J., van Ulsen, P., Van Gelder, P., Fei-

35. Dhar, R., and Slusky, J. S. (2021) Outer membrane

jen, M., Tommassen, J., et al. (2004) Structure of

protein evolution, Curr. Opin. Str. Biol., 68, 122-128,

the translocator domain of a bacterial autotrans-

doi: 10.1016/j.sbi.2021.01.002.

porter, EMBO J.,

23,

1257-1266, doi:

10.1038/

36. Arnold, T., Poynor, M., Nussberger, S., Lupas,

sj.emboj.7600148.

A. N., and Linke, D. (2007) Gene duplication of the

30. Doyle, M. T., and Bernstein, H. D. (2021) BamA

eight-stranded β-barrel OmpX produces a functional

forms a translocation channel for polypeptide export

pore: a scenario for the evolution of transmembrane

across the bacterial outer membrane, Mol. Cell, 81,

β-barrels, J. Mol. Biol., 366, 1174-1184, doi: 10.1016/

2000-2012.e2003, doi: 10.1016/j.molcel.2021.02.023.

j.jmb.2006.12.029.

31. Robert, V., Volokhina, E. B., Senf, F., Bos, M. P.,

37. Koebnik, R. (1996) In vivo membrane assembly of

Gelder, P. V., et al. (2006) Assembly factor Omp85

split variants of the E. coli outer membrane protein

recognizes its outer membrane protein substrates by a

OmpA, EMBO J., 15, 3529-3537.

species-specific C-terminal motif, PLoS Biol., 4, e377,

38. Debnath, D., Nielsen, K. L., and Otzen, D. (2010)

doi: 10.1371/journal.pbio.0040377.

In vitro association of fragments of a β-sheet mem-

32. Struyvé, M., Moons, M., and Tommassen, J.

brane protein, Biophys. Chem.,

148,

112-120,

(1991) Carboxy-terminal phenylalanine is essential

doi: 10.1016/j.bpc.2010.03.004.

DELETION VARIANTS OF AUTOTRANSPORTER

FROM Psychrobacter cryohalolentis INCREASE THE EFFICIENCY

OF ¹⁰FN3 EXPOSURE ON THE SURFACE OF Escherichia coli CELLS

L. N. Shingarova¹*, L. E. Petrovskaya¹, E. A. Kryukova¹, S. S. Gapizov^1,2,

E. F. Boldyreva¹, D. A. Dolgikh^1,2, and M. P. Kirpichnikov^1,2

¹ Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,

117997 Moscow, Russia; e-mail: lshingarova@gmail.com

² Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 119234 Moscow, Russia

The autotransporter AT877 from Psychrobacter cryohalolentis belongs to the family of outer membrane proteins

containing the N-terminal passenger and C-terminal translocator domains and forming the basis for the design

of display systems on the surface of bacterial cells. Earlier we showed that the passenger domain of AT877 can

be replaced by the cold-active esterase EstPc or the tenth domain of fibronectin type III (¹⁰Fn3). In order to

increase the efficiency of the ¹⁰Fn3 surface display in Escherichia coli cells, four deletion variants of the Fn877

hybrid autotransporter were obtained. It was found that all variants are detected in the membrane of bacterial

cells and provide binding of specific antibodies to ¹⁰Fn3 on the cell surface. The highest level of binding is

provided by variants Δ239 and Δ310, containing four and seven beta-strands out of twelve that comprise

the structure of the translocator domain. Using electrophoresis under semi-native conditions, the presence

of thermal modifiability in full-size Fn877 and its deletion variants was demonstrated which indicates the

preservation of the beta structure in their molecules. The results obtained can be used to optimize the bacterial

display systems of ¹⁰Fn3, as well as other heterologous passenger domains.

Keywords: secretion, autotransporter, deletion variants, 10th human fibronectin type III domain, bacterial display

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022