БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 9, с. 1246 - 1259

УДК 579.873.11: 579.66

РЕКОМБИНАНТНАЯ ВНЕКЛЕТОЧНАЯ

ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ Nocardioides simplex

Д.О. Эпиктетов¹, А.В. Свиридов¹, А.В. Казанцев², А.А. Шутов¹, М.В. Донова¹

¹ Федеральный исследовательский центр “Пущинский научный центр биологических исследований

Российской академии наук”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,

142290 Пущино, Московская обл., Россия; электронная почта: 2vvfokina@gmail.com

² Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет,

119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 05.07.2022

После доработки 01.08.2022

Принята к публикации 01.08.2022

Холестериноксидаза (ХО) - фермент, крайне востребованный в медицине, фармацевтике, сельском

хозяйстве, химии и биотехнологии. ХО катализирует окисление 3β-гидрокси-5-ен-фрагмента стеро-

идного ядра с формированием продукта с 3-кето-4-ен-структурой и образованием перекиси водо-

рода. Объектом исследования являлась внеклеточная ХО актинобактериального штамма Nocardioides

simplex ВКМ Ас-2033Д. Зрелая форма ХО N. simplex (55,6 кДа) с 6xHis-меткой была получена путём

экспрессии в клетках Escherichia coli соответствующей нуклеотидной последовательности. Выделение

и очистку рекомбинантной ХО N. simplex (ХО_Ns) проводили с помощью аффинной хроматографии.

Фермент проявлял активность по отношению к холестерину, холестанолу, фитостерину, прегненоло-

ну и дегидроэпиандростерону. Активность ХО зависела от структуры и длины алифатической боковой

цепи при С17 стероида и была ниже для прегненолона и дегидроэпиандростерона. ХО_Ns проявляла ак-

тивность в диапазоне рН 5,25÷6,5 с оптимумом рН 6,0. Анализ кинетических характеристик и тестов

на стабильность при хранении показал, что показатели ХО_Ns сравнимы или превосходят таковые для

коммерческой ХО из Streptomyces hygroscopicus (ХО_Sh). Результаты расширяют знания о микробных ХО

и свидетельствуют о том, что ХО из N. simplex ВКМ Ас-2033Д перспективна для дальнейшего практи-

ческого применения.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: холестерин, холестериноксидаза, актинобактерии, рекомбинантный фермент.

DOI: 10.31857/S0320972522090068, EDN: BAVZSL

ВВЕДЕНИЕ

или холестериноксидаза (ХО), которая запу-

скает каскад реакций, приводящих к разруше-

Холестерин (холест-5-ен-3β-ол) играет

нию стероидного ядра [1].

ключевую роль во множестве биохимических

ХО представляют собой флавопротеиновые

процессов у высших организмов, определе-

ферменты с двойственной функцией: окисле-

ние и регуляция уровня холестерина имеют

ния 3β-гидрокси-фрагмента до 3-оксо-группы и

большое значение в медицине. Одним из фер-

изомеризации двойной связи (Δ⁵⁽⁶⁾ → Δ⁴⁽⁵⁾) в коль-

ментов, катализирующих на начальном этапе

це А стероидного ядра. Реакция изомеризации

микробной деградации холестерина его пре-

протекает быстрее, чем высвобождение холест-

вращение в холест-4-ен-3-он, является холе-

5-ен-3-она из полости ХО, и почти с такой же

стерин:кислород-оксидоредуктаза (КФ 1.1.3.6) скоростью, как окисление холестерина [2]. Ко-

фактором фермента является FAD; FADH₂ реа-

Принятые сокращения: АБТС - 2,2-азинодиэтилбенз-

гирует с кислородом с образованием перекиси

тиазолинсульфонат; МЦД

- метил-β-циклодекстрин;

водорода (рис. 1). Цветная реакция с пероксида-

ХО - холестериноксидаза; ХОNs - рекомбинантная холе-

зой хрена и хромогеном лежит в основе опреде-

стериноксидаза N. simplex; ХОSh - коммерческая ХО из

Streptomyces hygroscopicus; SFCA - ацетат целлюлозы без

ления холестерина с помощью ХО (рис. 1) [3].

поверхностно-активных веществ.

Помимо количественного анализа холе-

* Адресат для корреспонденции.

стерина в биологических жидкостях, пищевых

1246

РЕКОМБИНАНТНАЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ N. simplex

1247

Рис. 1. Окисление холестерина до холест-4-ен-3-она с образованием перекиси водорода холестериноксидазой и цвет-

ная реакция перекиси водорода с пероксидазой хрена и хромогеном

продуктах и добавках, ХО широко применяет-

Секретируемая форма представляет собой

ся для биоконверсии стероидных 3β-спиртов в

растворимый белок, состоящий из двух сли-

органическом синтезе фармацевтических сте-

тых доменов: флавин-связывающего и суб-

роидов [4]. ХО способны к окислению нестеро-

страт-связывающего [8]. Наряду с ХО (или

идных аллильных спиртов [5], обладают инсек-

вместо ХО) окисление стеринов до соответ-

тицидной активностью [6]. Имеются сведения

ствующих стенонов у некоторых актинобак-

о противоопухолевой активности ХО, которая

терий, таких как Mycolicibacterium smegmatis

характеризуется как перспективное природное

mc²155 или Mycobacterium tuberculosis, обес-

противораковое средство [7]. Предполагаемый

печивают

3β-гидроксистероиддегидрогеназы

механизм действия ХО основан на превраще-

(3β-ГСД) [10].

нии холестерина в холестенон с последующим

В настоящей работе изучали ХО Nocardioides

изменением физической структуры клеточных

simplex ВКМ Ас-2033Д. Этот промышленно

мембран или их повреждением [8].

значимый штамм известен главным образом

Наличие ХО описано для аэробных бакте-

благодаря своей высокой 3-кетостероид-Δ¹-де-

рий различного таксономического положения,

гидрогеназной активности по отношению к

в основном актинобактерий родов Streptomyces,

различным 3-кето-стероидам [11], в то время

Rhodococcus, Mycolicibacterium, Mycobacterium [1].

как его активность по отношению к 3β-гидрок-

У патогенных видов ХО, предположительно,

систероидам является менее изученной. При

играют ключевую роль в инфицировании ма-

росте штамма на холестерине основной интер-

крофагов хозяина [9]. Ортологи ХО у млекопи-

медиат был идентифицирован как холестенон.

тающих не выявлены.

В геноме N. simplex не обнаружено гена, коди-

Бактериальные ХО, как правило, явля-

рующего (3β-ГСД), что позволило предполо-

ются внеклеточными и, в зависимости от ми-

жить, что эту реакцию катализирует ХО [12].

кроорганизма, встречаются в секретируемой

Настоящее исследование направлено на

и/или мембранно-ассоциированной форме. выявление и изучение активности внеклеточ-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1248

ФОКИНА и др.

ной ХО N. simplex Ас-2033Д, получение реком-

Биоконверсия 3β-стероидных спиртов бес-

бинантной ХО (ХО_Ns) и оценку её свойств в

клеточной культуральной жидкостью N. simplex.

сравнении с коммерческой ХО из Streptomyces

Клетки N. simplex, выращенные в течение

hygroscopicus (ХО_Sh).

20 ч до поглощения ОП₆₀₀~6, осаждали цен-

трифугированием (35 мин, 3000 g, 4 °C), да-

лее супернатант фильтровали с использова-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

нием шприцевого мембранного фильтра с

диаметром пор 0,20 мкм (SFCA, «Sartorius»,

Реактивы. Стероиды: холестерин, 5αН-хо-

Германия). Бесклеточный супернатант те-

лестанол, прегненолон, дегидроэпиандро-

стировали на способность к биоконверсии

стерон, холестенон, прогестерон, андростен-

дегидроэпиандростерона, холестерина, фи-

дион были получены от компании «Steraloids»

тостерина, прогестерона,

5αH-холестанола

(США); фитостерин (общее содержание сте-

при их концентрации 0,05 г/литр. Стероиды

ринов 95,47%) получен от компании «Jiangsu

идентифицировали методом ВЭЖХ, структу-

Spring Fruit Biological Products Co., Ltd.» (Ки-

ру 5αH-холестанола определяли с помощью

тай). Использовали бромистый этидий («Serva»,

¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР.

Германия); метил-β-циклодекстрин (МЦД)

Клонирование ДНК. Клонирование ДНК про-

(«Wacker Chemie», Германия); бактоагар, бак-

водили согласно стандартным протоколам [17]

топептон и дрожжевой экстракт («Panreac»,

и рекомендациям фирм-производителей.

Испания); пероксидазу хрена и ХО Streptomyces

Клетки N. simplex, выращенные в среде

hygroscopicus (ХО_Sh) («Sigma», США). Осталь-

Noc до поглощения ОП₆₀₀~ 4,5, осаждали цен-

ные использованные в работе реактивы были

трифугированием (20 мин, 8000 g, 4 °C), 50 мг

отечественного производства, квалификации

клеточного осадка использовали для выделе-

х.ч. или ч.д.а.

ния геномной ДНК с помощью набора AllPrep

Бактериальные штаммы и условия культи-

Bacterial DNA/RNA/Protein Kit

(«Qiagen»,

вирования. Штамм N. simplex ВКМ Ас-2033Д

США). Амплификацию целевой ДНК-после-

получен из Всероссийской коллекции микро-

довательности, кодирующей усечённую зрелую

организмов (ВКМ). Штамм культивировали

форму ХО N. simplex (42-541 АМК), осущест-

аэробно, как описано ранее [13]. В качестве

вляли с матрицы геномной ДНК N. simplex ме-

индукторов оценивали холестерин, фитосте-

тодом ПЦР с использованием ДНК-полиме-

рин, дегидроэпиандростерон, которые вноси-

разы Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB)

ли через 17 ч роста в концентрации 0,02 г/литр

в присутствии олигонуклеотидных праймеров

в виде метанольного раствора (2 мг/мл).

Cho-f (5′-CAGTACATATGgcgagcatcggcaacggcg-3′) и

Штаммы Escherichia coli DH5α и BL21(DE3)

Cho-r (5′-TCATCAAGCTTctagatgtcgttggccaggatg-3′),

выращивали при 37 °C в среде LB [14]. Для

несущих соответствующие сайты эндонуклеаз

селекции рекомбинантных штаммов и под-

рестрикции NdeI и HindIII (подчёркнуто) (рис. 2).

держания плазмид использовали канамицин

Для получения плазмиды pETCho ам-

(50 мкг/мл). Для приготовления плотных сред

плифицированную нуклеотидную последо-

использовали бактоагар (1,5%).

вательность клонировали в вектор pET-28a

Анализ ДНК- и белковых последователь-

(«MilliporeSigma», США).

ностей. В работе были использованы ДНК- и

Получение и очистка рекомбинантной ХО_Ns.

белковые последовательности ХО N. simplex

Плазмида pETCho была перенесена в компе-

(locus tag: KR76_09550; GenBank: AIY19828.2,

тентные клетки E. coli BL21(DE3) методом теп-

UniProt: A0A0A1DTF1). Сравнение идентич-

лового шока. Культуру рекомбинантных клеток

ности аминокислотных последовательностей

E. coli выращивали в двух литрах среды LB с ка-

ХО N. simplex с ХО других штаммов проводи-

намицином при 37 °C и 200 об./мин до погло-

ли с помощью программного обеспечения

щения ОП₆₀₀ ~ 0,5. Биосинтез усечённой зрелой

BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

формы ХО N. simplex индуцировали внесением

Построение филогенетических деревьев осу-

в среду ИПТГ (0,5 мМ), дальнейшее культиви-

ществляли в программе MEGA5 [15] с исполь-

рование вели при 25 °C в течение 6 ч. Биосинтез

зованием метода максимального правдоподо-

рекомбинантных белков контролировали мето-

бия. Для выравнивания последовательностей

дом электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ в

ХО использовали алгоритм ClustalW. Для пред-

соответствии с протоколом Лэммли [18].

сказания присутствия в белковой последова-

Клетки E. coli осаждали центрифугирова-

тельности ХО сигнального пептида и располо-

нием (20 мин, 5000 g, 4 °С), промывали и ресу-

жения протеолитического сайта расщепления

спендировали в 40 мл буфера (50 мМ Tris-HCl,

использовали сервис SignalP 6.0 [16].

pH 8,0). Клеточную суспензию гомогенизиро-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

РЕКОМБИНАНТНАЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ N. simplex

1249

Рис. 2. Последовательности белков и ДНК, использованные в работе: а - полноразмерная аминокислотная последо-

вательность ХО N. simplex. Вертикальная линия между остатками аланина A41 и A42 показывает сайт протеолитическо-

го расщепления ХО в процессе секреции. б - Нуклеотидная последовательность гена cho (KR76_09550), кодирующего

ХО N. simplex. Праймеры изображены стрелками. в - Генетическая конструкция, клонированная в плазмиде pETCho.

Сайты узнавания NdeI и HindIII подчёркнуты

вали на ультразвуковом дезинтеграторе Q500

Спектрофотометрически активность ХО_Ns

(«Qsonica», США) согласно рекомендациям

определяли в 1 мл реакционной смеси следую-

производителя. Полученный гомогенат об-

щего состава: 50 мМ Na-фосфатный буфер

рабатывали препаратом ДНКазы I («Sigma-

(pH 7,0), 5 мМ МЦД, 0-1 мМ 3β-ОН-5-ен-сте-

Aldrich», США), дебрис осаждали (120 мин,

роид (холестерин, фитостерин, прегненолон,

25 000 g, 4 °С), супернатант фильтровали через

дегидроэпиандростерон,

5αН-холестанол),

мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм

5 Ед. пероксидазы хрена, 1,4 мМ 2,2-азиноди-

(SFCA, «Sartorius»).

этилбензтиазолинсульфонат (АБТС). Реак-

Очистку ХО_Ns проводили методом аффин-

цию инициировали добавлением 5 мкл ХО_Ns

ной хроматографии на колонке объёмом 5 мл

(35 мкг/мл) или ХО_Sh (35 мкг/мл). В качестве

EconoFit Profinity IMAC

(«Bio-Rad, США),

контроля использовали аналогичную смесь

уравновешенной связывающим буфером

без внесения препарата ХО. Оптическую плот-

(50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ NaCl, 20 мМ

ность регистрировали при длине волны 420 нм

имидазол). После нанесения пробы колонку

на спектрофотометре Shimadzu UV-1800

промывали шестью колоночными объемами

(«Shimadzu», Япония).

(КО) связывающего буфера; белок элюировали

Определение характеристик ХО_Ns. Спектр

десятью КО буфера для элюирования (50 мМ

поглощения препарата ХО_Ns записывали в диа-

Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ NaCl, 500 мМ ими-

пазоне длин волн 190-900 нм на спектрофото-

дазол). Фракции, содержащие основную долю

метре Shimadzu UV-1800 в кварцевых кюветах,

активности ХО_Ns, смешивали, диализовали про-

содержащих раствор ХО_Ns (1,5 мг/мл, 0,03 мМ)

тив 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и использовали в

в 50 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,5). Ана-

дальнейшей работе. Наличие и чистоту фермен-

логично записывали спектры поглощения

та в пробах контролировали электрофорезом в

эталонного раствора FAD (0,1 мМ) в указан-

12%-ном Ds-Na-ПААГ. Количество белка в ис-

ном буфере и препарата 0,03 мМ ХО_Ns, инку-

следуемых препаратах определяли с помощью

бированной в течение 10 мин в присутствии

реактива Брэдфорда («Sigma») в соответствии с

0,5% Ds-Na.

инструкцией производителя.

Зависимость активности ХО_Ns от концен-

Определение ферментативной активности

трации субстрата исследовали спектрофо-

ХО_Ns. Определение ферментативной актив-

тометрически в реакционных средах с холе-

ности проводили в 2 мл реакционной смеси

стерином, фитостерином, прегненолоном,

следующего состава: 50 мМ Na-фосфатный

дегидроэпиандростероном, 5αН-холестанолом

буфер (pH 7,0), 12% ДМСО, 0,6 г/литр 3β-ОН-

в диапазоне концентраций 0,05-1 мМ.

5-ен-стероид (холестерин, фитостерин, прег-

Скорость окисления холестерина ХО_Ns

ненолон, дегидроэпиандростерон, 5αН-холе-

определяли спектрофотометрически в диапа-

станол). Реакцию инициировали добавлением

зоне рН 5,0-9,0 с шагом 0,25 единиц в уни-

10 мкл ХО_Ns (0,7 мг/мл) или коммерческого пре-

версальном буфере Бриттона-Робинсона

парата ХО_Sh, используемого для сравнения.

(Britton-Robinson, [19]) и в диапазоне рН 6,0-

Смесь инкубировали в течение определённо-

8,0 с шагом 0,5 единиц - в Na-фосфатном бу-

го времени при 30 °С, реакцию останавливали

фере. Реакционная смесь конечным объёмом

кипячением в течение 3 мин. Стероидные про-

1 мл содержала 50 мМ буфер, ферментный пре-

дукты анализировали методом ВЭЖХ.

парат ХО_Ns, 5 мМ МЦД, 0,5 мМ холестерин,

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1250

ФОКИНА и др.

1,4 мМ АБТС и 15 Ед. пероксидазы хрена. Вне-

торностях; для каждой выборки вычислялись

сение трёхкратного количества пероксидазы

значения стандартного отклонения и довери-

выполнялось для компенсации снижения ак-

тельный интервал для нормального распреде-

тивности этого фермента при кислых и щелоч-

ления при уровне значимости 0,95.

ных значениях рН [20].

Для изучения стабильности ХО_Ns при дли-

тельном хранении препарата ХО_Ns инкубировали

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

в Na-фосфатном буфере (рН 7,0) при 4 и 25 °С.

Остаточную активность ХО_Ns по отношению к

Биоконверсия стероидных 3β-спиртов бескле-

холестерину измеряли спектрофотометриче-

точной культуральной жидкостью N. simplex. По-

ски через известные промежутки времени от

лученная при фильтрации супернатанта через

начала эксперимента и выражали в процентах

бактериальный фильтр культуральная жидкость

от исходной активности.

N. simplex, не содержащая клетки, осуществляла

Активность ХО_Ns определяли при различных

биоконверсию таких 3β-спиртов, как холесте-

температурах (20-50 °С) для определения опти-

рин, фитостерин и дегидроэпиандростерон с

мума активности рекомбинантного фермента.

образованием 3-кето-4-ен-продуктов: холесте-

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Стерои-

нона, фистостенонов и андростендиона соот-

ды экстрагировали этилацетатом, экстракты

ветственно (рис. 3, а). При этом было выявлено,

наносили на ТСХ-пластинки ALUGRAM SIL

что холестериноксидазная активность в культу-

G/UV254 («MACHEREY-NAGEL», Германия)

ральной жидкости присутствует вне зависимо-

и разделяли в системе бензол/ацетон (3/1,

сти от наличия стероидного индуктора.

(v/v)). 3-Кето-4-ен-стероиды визуализировали

На основании данных ВЭЖХ и ТСХ-ана-

в УФ свете при длине волны 254 нм в хемиско-

лиза было выявлено (рис. 3, б и в), что пред-

пе CN-15MC UV Darkroom («Vilber Lourmat»,

почтительными субстратами внеклеточной ХО

Франция).

N. simplex являлись холестерин и 5αН-холеста-

Высокоэффективная жидкостная хромато-

нол, для которых за минимальное время ин-

графия (ВЭЖХ). Аликвоту реакционной сме-

кубирования достигалась максимальная пол-

си разводили в два раза смесью ацетонитрил/

нота конверсии; более низкую активность ХО

изопропанол (50/45, (v/v)), если в качестве

наблюдали по отношению к стероидам с более

субстратов использовали стерины, или ацето-

короткой боковой цепью при С17, либо не со-

нитрилом, если использовали прегненолон/

держащим алифатическую цепь.

ДГЭА. Суспензию центрифугировали (10 мин,

Анализ белковой последовательности ХО

12 100 g), надосадочную жидкость использова-

N. simplex. Анализ аминокислотной последова-

ли для анализа. Анализ проводили на хрома-

тельности ХО N. simplex (KR76_09550) позво-

тографической системе Agilent 1200 («Agilent

лил выявить высокое сходство с ХО Rhodococcus

Technologies», Германия), колонке Symmetry

equi (ChoE)

(63,2%), Rhodococcus erythropolis

C18 (5 мкм, 4,6 × 250 мм) с предколонкой

(ChoE) (59,8%) и Dietzia cinnamea P4 (ChoE)

Symmetry C18 (5 мкм, 3,9 × 20 мм) («Waters»,

(54,7%); умеренное сходство - c ХО Streptomyces

США) в следующих условиях: скорость пото-

(47-48%); низкое - с ХО микобактерий: Myco-

ка - 1 мл/мин, температура колонки - 50 °C,

bacterium leprae (ChoD), M. tuberculosis H37Rv

детекция при длине волны - 240 нм.

(ChoD), Mycobacterium marinum (ChoD) (15-23%)

Мобильная фаза: для стенонов

(рис. 4). Ближайшим гомологом ХО N. simplex

MeCN : iPr-OH : H₂O (50 : 45 : 5; v/v); для андростен-

(KR76_09550) является содержащая сигналь-

диона/прогестерона - MeCN : H₂O : CH₃COOH

ный пептид внеклеточная ХО R. equi (ChoE) [9,

(60 : 40 : 0,01; v/v). Калибровку проводили мето-

21, 22], в свою очередь, на 56% идентичная ХО

дом внешнего стандарта, основанным на срав-

представителей рода Streptomyces (рис. 4).

нении площадей пиков. Результаты обрабаты-

Анализ белковой последовательности ХО

вали с помощью программы ChemStation Rev. B.

N. simplex, осуществлённый с использованием

04.03 («Agilent Technologies»).

сервиса SignalP 6.0 [16], позволил предсказать

Спектры ¹H-ЯМР регистрировали на спек-

наличие в ХО N. simplex (KR76_09550) 41-ами-

трометре Bruker Avance 400 («Bruker», Герма-

нокислотного N-терминального сигнального

ния) на частоте 400 МГц. Химические сдвиги

пептида (с вероятностью 0,9), который отщеп-

измеряли относительно сигналов тетраметил-

ляется в процессе секреции фермента Tat-зави-

силана. Приведены только характеристические

симой системой белкового транспорта (с веро-

¹Н-ЯМР-сигналы стероидов.

ятностью 0,97).

Статистическая обработка данных. Все из-

Таким образом, исходя из полученных экс-

мерения проводились не менее чем в 3 пов-

периментальных и биоинформатических дан-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1252

ФОКИНА и др.

Рис. 4. Филогенетическая дендрограмма, иллюстрирующая положение ХО KR76_09550 актинобактерии N. simplex ВКМ

Ас-2033Д относительно некоторых бактериальных ХО

Рис. 5. Выделение и очистка рекомбинантной ХОNs. а - 10% Ds-Na-ПААГ-анализ клеточных лизатов рекомбинантных

штаммов E. coli BL21 (DE3), содержащих вектор pET28a (ET) и плазмиду pETCho (Cho). Индукция ИПТГ при 25 °C в те-

чение 6 ч. Указана молекулярная масса для зрелой формы ХО, маркированной 6xHis. б - Профиль элюции ХОNs при аф-

финной хроматографии. Заштрихована область активного пика, отобранная для исследований. Сплошная линия - оп-

тическое поглощение при 280 нм; штриховая линия - концентрация имидазола; штрих-пунктирная линия - границы

активного пика; стрелкой показано нанесение препарата ХОNs. в - Денатурирующий электрофорез препаратов, полу-

ченных при выделении и очистке ХОNs. Дорожки: 1 - маркеры; 2 - гомогенат; 3 - дебрис; 4 - бесклеточный экстракт;

5 - элюат при нанесении пробы на колонку; 6 - элюат при промывке связывающим буфером; 7 - часть активного пика,

отобранная для работы; 8 - плечи активного пика

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

РЕКОМБИНАНТНАЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ N. simplex

1253

Рис. 6. Спектры оптического поглощения ХОNs. Штриховая линия - FAD; штрих-пунктирная линия - ХОNs; сплошная

линия - ХОNs, обработанная 0,5%-ным Ds-Na

ных, нами сделан вывод о том, что ХО N. simplex

связанных с FAD (рис. 6). Обработка ХО_Ns Ds-

функционирует в виде внеклеточной зрелой

Na сдвигала максимумы поглощения к 370 и

формы, представляющей собой белковый про-

450 нм, что характерно для растворённого FAD

дукт гена cho без сигнальной лидерной после-

(рис. 6).

довательности, удаляемой в процессе белковой

Мы использовали в качестве фермента срав-

секреции.

нения препарат коммерческой ХО_Sh, поскольку

Выделение и очистка ХО_Ns. Трансформи-

известно, что ХО видов Streptomyces обладают

рованные плазмидой pETCho клетки E. coli

высокой активностью и стабильностью [6, 23].

BL21(DE3) продуцировали маркированную

Результаты измерения активности ХО_Ns в

6xHis-меткой зрелую форму ХО N. simplex

сравнении с коммерческой ХО_Sh представлены

(55,6 кДа) без сигнального пептида (рис. 5, а).

на рис. 7, а-г. Как следует из рис. 7, а и б, фер-

Применённый подход обеспечил высокий выход

менты ХО_Ns и ХО_Sh демонстрировали сходные

фермента на уровне гомогената (рис. 5, б и в).

зависимости от концентрации холестерина. На

Методом аффинной хроматографии был

основании полученных результатов в дальней-

получен препарат ХО_Ns с концентрацией ~5 мг

ших экспериментах использовали концентра-

белка в 1 мл, относящийся к центральной ча-

цию стероидного субстрата, равную 0,5 мМ.

сти активного пика (рис. 5, б). Ds-Na-ПААГ-

Анализ кинетических характеристик ХО_Ns

Электрофореграмма полученных фракций пред-

в отношении различных стероидов позволил

ставлена на рис. 5, в. Выход белка ХО_Ns соста-

заключить, что предпочтительным субстратом

вил 4 ± 0,4%.

рекомбинантной ХО N. simplex является хо-

Спектральные и кинетические свойства

лестерин по сравнению с фитостерином или

ХО_Ns. Фермент ХО_Ns имел максимумы поглоще-

прегненолоном, которые отличаются конфи-

ния при 385 и 470 нм, характерные для белков,

гурацией и длиной боковой цепи. Примеча-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1254

ФОКИНА и др.

Таблица 1. Кинетические характеристики: константа Михаэлиса (KM), каталитическая константа (kcat) и каталитическая

эффективность (kcat/KM) ХОNs, а также коммерческой ХОSh в отношении некоторых стероидных 3β-спиртов

Субстрат

Фермент

KM, мкM

kcat, с^-1

kcat/KM (с^-1 мM^-1)

Холестерин

ХОSh

310 ± 1

42,8 ± 0,02

138,53 ± 0,02

Холестерин

ХОNs

610 ± 5

40,1 ± 0,31

65,74 ± 0,32

5αН-Холестанол

ХОNs

590 ± 11

23,9 ± 0,04

40,50 ± 0,04

Прегненолон

ХОNs

1030 ± 10

20,9 ± 0,05

20,23 ± 0,06

Фитостерин

ХОNs

1080 ± 7

21,0 ± 0,13

19,47 ± 0,13

Примечание. Концентрация субстрата 0,5 мM, pH 7,0, температура 30 °C.

Таблица 2. Активность ХОNs в отношении стероидов с различной конфигурацией боковой цепи

Эффективность био-

Активность ХОNs,

Субстрат

Химическая структура

конверсии, мол. %

Ед. на 1 мг белка

(за 1 ч биоконверсии)

Холестерин

22 ± 2

84 ± 7

5αН-Холестанол

13 ± 2

н.о.

Прегненолон

9 ± 2

1 ± 0,3

Фитостерин (β-Ситостерин)

8 ± 1

20 ± 3

Дегидроэпиандростерон

2 ± 0,1

1 ± 0,1

Примечание. Концентрация субстрата 0,5 мM, pH 7,0, температура 30 °C.

мол. % - мольная доля выхода вещества, выраженная в процентах.

н/о - не определена.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1256

ФОКИНА и др.

тельно, что наличие насыщенной 5(6)-двойной

связи в 5αН-холестаноле оказывало меньшее

влияние на активность, чем наличие, длина и

конфигурация боковой цепи при С17 стероид-

ного субстрата (табл. 1, 2).

Результаты спектрофотометрического опре-

деления активности и эффективности биокон-

версии представлены в табл. 2. Фермент ХО_Ns

производил в 4 раза больше холестенона за

1 час биоконверсии по сравнению с коммер-

ческим ферментом ХО_Sh (84 ± 7 мол. % против

20 ± 3 мол. %).

Анализ температурного оптимума показал,

что активность ХО_Ns сохраняется в диапазоне

20-50 °С с максимумом при 30 °С (рис. 7, д).

Рис.

8. Стабильность препаратов ХОNs при хранении в

Na-фосфатном буфере (рН 7,0). Сплошная линия - при

Фермент ХО_Sh имел аналогичную температур-

температуре 4 °С; штриховая линия - при 25 °С

ную зависимость. Как ХО_Ns, так и ХО_Sh были

активны в диапазоне pH 5-8, но слегка разли-

чались по оптимуму pH, который составлял 6,0

рующего PimR (aj585085). У микобактерий де-

для ХО_Ns и 6,5 - для ХО_Sh (рис. 7, е).

градация холестерина регулируется транскрип-

Данные по стабильности при хранении для

ционными репрессорами TetR-типа: KstR и

ХО_Ns представлены на рис. 8. Фермент сохра-

KstR2. В геноме N. simplex ген KR76_09550, ко-

нял 10 и 50% активности при хранении более

дирующий ХО, находится вне кластеров ката-

месяца при 25 и 4 °С соответственно.

болизма стероидов, но имеет предполагаемый

сайт связывания KstR и, таким образом, может

регулироваться KstR-фактором. Другие регуля-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

торы катаболизма стероидов у актинобактерий

в настоящее время не известны [8, 12, 29].

Биотехнологически значимый штамм

Белок ХО N. simplex проявляет наиболь-

N. simplex ВКМ Ас-2033Д эффективно проводит

шее сходство с ХО из R. equi (ChoE) [9] и на-

1(2)-дегидрирование 3-кето-стероидов [8, 11] и

ходится в той же филогенетической кладе, что

способен окислять холестерин с образованием

и ХО Streptomyces, биохимические свойства

холестенона [24, 25]. В настоящем исследовании

и структура которых хорошо изучены [27].

продемонстрирован высокий уровень активно-

Меньшее сходство ХО N. simplex наблюда-

сти внеклеточной ХО этого штамма в отноше-

лось с микобактериальными ХО из M. leprae,

нии различных

3β-гидрокси-5-ен-стероидов.

M. tuberculosis H37Rv и M. marinum. О другом

Фермент ХО как индуцированных, так и неин-

ферменте N. simplex - KR76_06800 (AIY 16548.2,

дуцированных клеток N. simplex катализировал

ChoD) - сообщалось, что он не обладает ак-

модификацию 3β-гидрокси-5-ен-фрагмента в

тивностью ХО, но катализирует превращение

3-кето-4-ен-структуру. Эти результаты согласу-

холестерина в холестенон как дегидрогеназа в

ются с известными данными о повышении экс-

присутствии

2,6-дихлорфенолиндофенола и

прессии гена cho в присутствии стеринов [12] и

феназинметосульфата [30].

указывают на высокий базальный уровень ХО

В настоящей работе последовательность

в N. simplex. Индуцибельный характер бакте-

KR76_09550, кодирующая зрелую форму ХО

риальных ХО был отмечен для используемых в

N. simplex, была клонирована в клетках E. coli;

качестве продуцентов ХО штаммов Rhodococcus

6xHis-меченый рекомбинантный фермент ХО_Ns

и Streptomyces [2, 9, 21, 26, 27], в то время как вы-

был выделен и очищен. Насколько нам из-

сокая конститутивная активность ХО указыва-

вестно, это первое сообщение о рекомбинант-

лась для мутантов N. simplex [28].

ной ХО из N. simplex Ас-2033Д. Опубликована

Интересно, что у стрептомицетов, не отно-

только одна работа, в которой сообщалось о

сящихся к стерин-катаболизирующим организ-

генно-инженерной ХО из N. simplex и указы-

мам, ген, кодирующий ХО, находится в центре

валось, что изучалась зрелая форма ХО, уко-

кластера генов, кодирующих ферменты био-

роченная на 10 и 5 аминокислотных остатков с

синтеза полиеновых антибиотиков, и регули-

N- и С-концов фермента соответственно [31].

руется транскрипционным активатором PimR

С помощью аффинной хроматографии нами

(в случае Streptomyces natalensis) [8]. В геноме

получен электрофоретически гомогенный пре-

N. simplex не обнаружено ортологов гена, коди-

парат зрелой формы ХО N. simplex (55,6 кДа),

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

РЕКОМБИНАНТНАЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ N. simplex

1257

меченный

6xHis-фрагментом. Концентрация

стерина и уменьшаясь в порядке холестерин >

белка в очищенном препарате ХО_Ns составляла

> 5αН-холестанол > прегненолон > фитостерин >

~3,7 мг в 1 мл, что соответствует 4 ± 0,4% от ис-

> дегидроэпиандростерон (табл. 2). Результаты,

ходного количества белка.

полученные для ХО_Ns, соответствуют результа-

Являясь мономерными белками, бактери-

там, полученным для фильтрата культуральной

альные ХО содержат в качестве простетиче-

жидкости N. simplex, и характерны для ХО дру-

ской группы одну молекулу FAD. Белок ХО_Ns

гих бактерий [9, 33]. Примечательно, что самая

в окисленном состоянии имел максимумы по-

низкая скорость образования 3-кето-4-ен-сте-

глощения при 385 и 470 нм, которые практи-

роидов наблюдалась при использовании дегид-

чески совпали с максимумами поглощения для

роэпиандростерона и прегненолона.

ХО_Sh [32]. Сравнительный анализ спектральных

Образование

3-кето-4-ен-стероидов из

свойств ХО_Ns и ХО_Sh позволил предположить, что

соответствующих

3β-гидрокси-5-ен-субстра-

в ХО_Ns флавин находится в анионной форме как

тов является подтверждением двойственной

в восстановленном, так и в переходном состоя-

функции ХО_Ns, обеспечивающей как дегид-

ниях. Природа связывания FAD у ХО_Ns и ХО_Sh

рирование 3β-гидроксильной группы, так и

аналогична и определяется как нековалентное

изомеризацию двойной связи из положения

связывание. Известно, что высвобождение не-

С5(6) в С4(5). Фермент также окислял субстрат

ковалентно связанного кофактора возможно,

5αН-холестанол с насыщенной связью С5(6),

например, при нагревании белка до 90 °C [32].

но с вдвое меньшей активностью.

Особенностью флавиновых белков, спо-

Скорость окисления АБТС пероксидазой

собствующей правильному связыванию кофак-

хрена в сопряжённой реакции с ХО_Ns зависе-

тора, является наличие консенсусной после-

ла от рН и была максимальной в диапазоне

довательности, состоящей из повторяющихся

рН 5,75-6,25 (рис. 7, е). Аналогичные резуль-

остатков глицина (GXGXXG) и остатка аспа-

таты были получены в Na-фосфатном буфере и

рагиновой или глутаминовой кислоты, отсто-

буфере Бриттона-Робинсона. Такой слабокис-

ящих друг от друга примерно на 20 аминокис-

лый оптимум рН не характерен для бактериаль-

лотных остатков [32]. В случае нековалентной

ных ХО, но подтверждён в наших эксперимен-

формы ХО_Sh - это последовательность остатков

тах и для ХО_Sh (рис. 7, е). Данные отличаются

глицина (G17-X-G19-X-G21-G/A22), за кото-

от результатов, полученных для генно-инже-

рыми следует E40, что предполагает нуклео-

нерной ХО из Pimelobacter simplex [31], однако

тид-связывающую укладку белка; в случае ко-

согласуются с данными, описанными для вне-

валентно связанной формы ХО этот консенсус

клеточных и некоторых внутриклеточных ХО

отсутствует, что указывает на вероятное отсут-

из актинобактерий, относящихся к семейству

ствие у этой формы фермента нуклеотид-свя-

Nocardiaceae [34]. Фермент ХОNs продемон-

зывающей складки [32]. В структуре белка ХО

стрировал высокую стабильность при хране-

N. simplex мы обнаружили последовательность

нии, что важно для его возможного практиче-

G15-X-G17-X-G19-G20, за которой следовал

ского применения.

Е38, что укладывается в теорию строения неко-

валентно связанной формы флавина у этой ХО.

Кинетические характеристики ХО_Ns были

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

сходны или незначительно отличались от тако-

вых для ХО_Sh по максимальной скорости реак-

В настоящей работе получен электрофоре-

ции V_max и величине каталитической констан-

тически гомогенный препарат рекомбинантной

ты k_cat по отношению к холестерину (табл. 1).

ХО N. simplex (55,6 кДа). Фермент ХО N. simplex

Однако K_M для ХО_Ns была в два раза выше, чем

относится к оксидазам глюкозо-метанол-холи-

K_M для ХО_Sh и, соответственно, каталитиче-

нового семейства и содержит нековалентно свя-

ская эффективность (k_cat/K_M) для ХО_Ns была в 2

занный кофактор FAD. Сходство ХО N. simplex

раза ниже, чем у ХО_Sh. Измерения активности

по аминокислотным остаткам с ХО из R. equi

двух ферментов при высоких концентрациях

(ChoE) составляет 63,2%. Показатели рекомби-

субстрата (≥1 мМ) показали возможное инги-

нантного фермента ХО_Ns из N. simplex ВКМ Ас-

бирование субстратом. Помимо холестерина,

2033Д сопоставимы с таковыми для коммерче-

фермент ХО_Ns проявлял активность в отноше-

ского препарата ХО штамма Streptomyces даже в

нии 5αН-холестанола, фитостерина, прегне-

неоптимизированных условиях.

нолона и дегидроэпиандростерона, причём

Полученные результаты расширяют знания

уровень активности зависел от структуры и

о разнообразии бактериальных ХО и указыва-

длины алифатической боковой цепи в поло-

ют на биотехнологический потенциал внекле-

жении C17, будучи самым высоким для холе-

точной ХО из N. simplex ВКМ Ас-2033Д.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

1258

ФОКИНА и др.

Вклад авторов. В.В. Фокина, М.В. Карпов,

Финансирование. Работа выполнена при

В.В. Коллеров - концепция и проведение экс-

финансовой поддержке Российского научного

периментов; Д.О. Эпиктетов, А.В. Свиридов -

фонда (грант № 21-64-00024).

проведение экспериментов; Е.Ю. Брагин - био-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

информатический анализ; А.В. Казанцев - МС-

отсутствии конфликта интересов.

и ЯМР-анализ; А.А. Шутов - ВЭЖХ-анализ;

Соблюдение этических норм. Настоящая

В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.В. Коллеров,

статья не содержит описания каких-либо ис-

А.В. Свиридов - обсуждение результатов иссле-

следований с участием людей или животных в

дования и написание текста; М.В. Донова - ру-

качестве объектов.

ководство работой и редактирование текста статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Kreit, J. (2017) Microbial catabolism of sterols: focus

11.

Fokina, V. V., Sukhodol’skaya, G. V., Gulevskaya,

on the enzymes that transform the sterol 3β-hydroxy-

S. A., Gavrish, E. Y., Evtushenko, L. I., et al. (2003)

5-en into 3-keto-4-en, FEMS Microbiol. Lett., 364,

The 1(2)-dehydrogenation of steroid substrates by

fnx007, doi: 10.1093/femsle/fnx007.

Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Mikrobiologiia,

Lario, P. I., Sampson, N., and Vrielink, A. (2003)

72, 24-29, doi: 10.1023/A:1022265720470.

Sub-atomic resolution crystal structure of cholesterol

12.

Shtratnikova, V. Y., Schelkunov, M. I., Fokina, V. V.,

oxidase: What atomic resolution crystallography reveals

Bragin, E. Y., Lobastova, T. G., et al. (2020) Genome-

about enzyme mechanism and the role of the FAD

wide transcriptome profiling provides insight on

cofactor in redox activity, J. Mol. Biol., 326, 1635-1650,

cholesterol and lithocholate degradation mechanisms

doi: 10.1016/S0022-2836(03)00054-8.

in Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Genes, 11,

Salè, F. O., Marchesini, S., Fishman, P. H., and Ber-

1229, doi: 10.3390/genes11101229.

ra, B. (1984) A sensitive enzymatic assay for determi-

13.

Текучева Д. Н., Фокина В. В., Николаева В. М.,

nation of cholesterol in lipid extracts, Anal. Biochem.,

Шутов А. А., Карпов М. В., и др. (2022) Каскадная

142, 347-350, doi: 10.1016/0003-2697(84)90475-5.

биоконверсия фитостерина в тестостерон штам-

Doukyu, N. (2009) Characteristics and biotechno-

мами Mycolicibacterium neoaurum ВКМ Ас-1815Д и

logical applications of microbial cholesterol oxidases,

Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, Микробиология,

Appl. Microbiol. Biotechnol., 83, 825-837, doi: 10.1007/

91, 353-363, doi: 10.31857/S0026365622300097.

s00253-009-2059-8.

14.

Bertani, G. (1951) Studies on lysogenesis. I. The mode

Heath, R. S., Sangster, J. J., and Turner, N. J. (2022) An

of phage liberation by lysogenic Escherichia coli, J. Bac-

engineered cholesterol oxidase catalyses enantioselective

teriol., 62, 293-300, doi: 10.1128/jb.62.3.293-300.1951.

oxidation of non-steroidal secondary alcohols, Chembio-

15.

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G.,

chem., 23, e202200075, doi: 10.1002/cbic.202200075.

Nei, M., et al. (2011) MEGA5: molecular evolutionary

Corbin, D. R., Greenplate, J. T., Wong, E. Y., Purcell,

genetics analysis using maximum likelihood, evolu-

J. P. (1994) Cloning of an insecticidal cholesterol

tionary distance, and maximum parsimony methods,

oxidase gene and its expression in bacteria and in plant

Mol. Biol. Evol., 28, 2731-2739, doi: 10.1093/molbev/

protoplasts, Appl. Environ. Microbiol., 60, 4239-4244,

msr121.

doi: 10.1128/aem.60.12.4239-4244.1994.

16.

Teufel, F., Almagro Armenteros, J. J., Johansen A. R.,

El-Naggar, N. El.-A., Soliman, H. M., and El-Shweihy,

Gíslason, M. H., Pihl, S. I., et al. (2022) SignalP 6.0

N. M. (2018) Extracellular cholesterol oxidase produc-

predicts all five types of signal peptides using protein

tion by Streptomyces aegyptia, in vitro anticancer activi-

language models, Nat. Biotechnol., 03, doi: 10.1038/

ties against rhabdomyosarcoma, breast cancer cell-lines

s41587-021-01156-3.

and in vivo apoptosis, Sci. Rep., 8, 2706, doi: 10.1038/

17.

Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular

s41598-018-20786-3.

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,

Kreit, J., and Sampson, N. S. (2009) Cholesterol

Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.

oxidase: physiological functions, FEBS J., 276, 6844-

18.

Laеmmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins

6856, doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.07378.x.

during the assembly of the head of bacteriophage T4,

Navas, J., González-Zorn, B., Ladrón, N., Garrido,

Naturе, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

P., and Vázquez-Boland, J. A. (2001) Identification and

19.

Britton, H. T. K., Robinson, R. A. (1931) CXCVIII.

mutagenesis by allelic exchange of choE, encoding a cho-

Universal buffer solutions and the dissociation constant

lesterol oxidase from the intracellular pathogen Rhodo-

of veronal, J. Chem. Soc., 1456-1462, doi: 10.1039/

coccus equi, J. Bacteriol., 183, 4796-4805, doi: 10.1128/

JR9310001456.

JB.183.16.4796-4805.2001.

20.

Alshawafi, W. M., Aldhahri, M., Almulaiky, Y. Q., Salah,

10.

García, J. L., Uhía, I., and Galán, B. (2012) Catabo-

N., Moselhy, S. S. et al. (2018) Immobilization of horse-

lism and biotechnological applications of cholesterol

radish peroxidase on nonwoven polyester fabric coat-

degrading bacteria, Microb. Biotechnol., 5, 679-699,

ed with chitosan. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol., 46

doi: 10.1111/j.1751-7915.2012.00331.x.

(sup3), S973-S981, doi: 10.1080/21691401.2018.1522321.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022

РЕКОМБИНАНТНАЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗА ИЗ N. simplex

1259

21. Ladrón, N., Fernández, M., Agüero, J., González

27. Yue, Q. K., Kass, I. J., Sampson, N. S., and

Zörn, B., Vázquez-Boland, J. A., et al. (2003) Rapid

Vrielink, A. (1999) Crystal structure determination

identification of Rhodococcus equi by a PCR assay

of cholesterol oxidase from Streptomyces and

targeting the choE gene, J. Clin. Microbiol., 41, 3241-

structural characterization of key active site mutants,

3245, doi: 10.1128/JCM.41.7.3241-3245.2003.

Biochemistry, 38, 4277-4286, doi: 10.1021/bi982497j.

22. Kämpfer, P., Dott, W., Martin, K., and Glaeser, S. P.

28. Jeong, J. M., and Young-Sun, J. (2008) A simple and

(2014) Rhodococcus defluvii sp. nov., isolated from

rapid method for screening of Nocardioides simplex

wastewater of a bioreactor and formal proposal to

mutant with high cholesterol oxidase activity, Appl.

reclassify [Corynebacterium hoagii] and Rhodococcus

Biol. Chem., 51, 338-341 doi: 10.3839/jksabc.2008.058

equi as Rhodococcus hoagii comb. nov., Int. J. Syst. Evol.

29. Shtratnikova, V. Y., Schelkunov, M. I., Fokina, V. V.,

Microbiol., 64, 755-761, doi: 10.1099/ijs.0.053322-0.

Pekov, Y. A., Ivashina, T., et al. (2017) Genome-wide

23. Lolekha, P. H., Srisawasdi, P., Jearanaikoon,

bioinformatics analysis of steroid metabolism-associat-

P., Wetprasit, N., Sriwanthana, B., et al.

(2004)

ed genes in Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Curr.

Performance of four sources of cholesterol oxidase

Genet., 62, 643-656, doi:10.1007/s00294-016-0568-4.

for serum cholesterol determination by the enzymatic

30. Qin, H. M., Wang, J. W., Guo, Q., Li, S., Xu, P., et al.

endpoint method, Clin. Chim. Acta, 339, 135-145,

(2017) Refolding of a novel cholesterol oxidase from Pi-

doi: 10.1016/j.cccn.2003.10.005.

melobacter simplex reveals dehydrogenation activity, Pro-

24. Fokina, V. V., Sukhodolskaya, G. V., Baskunov,

tein Expr. Purif., 139, 1-7, doi: 10.1016/j.pep.2017.07.008.

B. P., Turchin, K. F., Grinenko, G. S., et al. (2003)

31. Qin, H. M., Zhu, Z., Ma, Z., Xu, P., Guo, Q., et al.

Microbial conversion of pregna-4,9(11)-diene-17α,21-

(2017) Rational design of cholesterol oxidase for

diol-3,20-dione acetates by Nocardioides simplex VKM

efficient bioresolution of cholestane skeleton substrates,

Ac-2033D, Steroids, 68, 415-421. doi: 10.1016/S00039-

Sci. Rep., 7, 16375, doi: 10.1038/s41598-017-16768-6.

128X(03)00043-6.

32. Devi, S., and Kanwar, S. S. (2017) Cholesterol oxidase:

25. Sukhodolskaya, G., Fokina, V., Shutov, A., Nikolayeva,

source, properties and applications, Insights Enzyme

V., Savinova, T., et al.

(2017) Bioconversion of

Res., 1, 1, doi: 10.21767/2573-4466.100005.

6-(N-methyl-N-phenyl) aminomethyl androstane

33. Srisawasdi, P., Jearanaikoon, P., Kroll, M. H., and

steroids by Nocardioides simplex, Steroids, 118, 9-16,

Lolekha, P. H.

(2005) Performance characteris-

doi: 10.1016/j.steroids.2016.11.001.

tics of cholesterol oxidase for kinetic determination

26. Gadda, G., Wels, G., Pollegioni, L., Zucchelli, S.,

of total cholesterol, J. Clin. Lab. Anal., 19, 247-252,

Ambrosius, D., et al.

(1997) Characterization of

doi: 10.1002/jcla.20086.

cholesterol oxidase from Streptomyces hygroscopicus and

34. Kumari, L., and Kanwar, S. S. (2012) Cholesterol ox-

Brevibacterium sterolicum, Eur. J. Biochem., 250, 369-

idase and its applications, Adv. Microbiol., 2, 49-65,

376, doi: 10.1111/j.1432-1033.1997.0369a.x.

doi: 10.4236/aim.2012.22007.

RECOMBINANT EXTRACELLULAR CHOLESTEROL OXIDASE

FROM Nocardioides simplex

V. V. Fokina¹*, M. V. Karpov¹, V. V. Kollerov¹, E. Y. Bragin¹, D. O. Epiktetov¹,

A. V. Sviridov¹, A. V. Kazantsev², A. A. Shutov¹, and M. V. Donova¹

¹ Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences;

Federal Research Center “Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”,

142290 Pushchino, Moscow Region, Russia; e-mail: 2vvfokina@gmail.com

² Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, 119991 Moscow, Russia

Cholesterol oxidase is a highly demanded enzyme that is used in medicine, pharmacy, agriculture, chemistry,

and biotechnology. The enzyme catalyzes oxidation of 3β-hydroxy-5-ene to 3-keto-4-ene steroids with the

formation of hydrogen peroxide. Extracellular cholesterol oxidase (ChO) of Nocardioides simplex VKM

Ac-2033D was the focus of this study. A 6xHis-tagged mature form of N. simplex ChO (55.6 kDa) was expressed

in an Escherichia coli host. The recombinant N. simplex ChO (ChO_Ns) was isolated and purified using affinity

chromatography. The enzyme proved functional towards cholesterol, cholestanol, phytosterol, pregnenolone,

and dehydroepiandrosterone. Its activity depended on the structure and length of the aliphatic side chain at C17

of the steroid nucleus, being lower with pregnenolone and dehydroepiandrosterone. The enzyme was active in

a pH range of 5.25÷6.5 with a pH optimum at 6.0. Kinetic assays and storage stability tests demonstrated that

ChO_Ns characteristics are generally comparable with or superior to those of commercial ChO from Streptomyces

hygroscopicus (ChO_Sh). The results contribute to the knowledge on microbial ChOs and evidence that ChO from

N. simplex VKM Ac-2033D is promising for further applications.

Keywords: cholesterol, cholesterol oxidase, actinobacteria, recombinant enzyme

БИОХИМИЯ том 87 вып. 9 2022