БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 1, с. 68 - 82

УДК 578.32;578.865;539.26

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА

ОБОЛОЧКИ Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ

И ВИРУСА МОЗАИКИ АЛЬТЕРНАНТЕРЫ НА СТРУКТУРУ

И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРИОНОВ

П.И. Семенюк¹, А.М. Арутюнян¹, Т.И. Манухова⁴, Е.А. Евтушенко⁴, Н.А. Никитин⁴,

О.В. Карпова⁴, Э.В. Штыкова²

¹ НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

119991 Москва, Россия; электронная почта: ksenofon@belozersky.msu.ru

² ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова,

119333 Москва, Россия

³ Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071 Москва, Россия

⁴ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 16.10.2022

После доработки 17.11.2022

Принята к публикации 19.11.2022

Аминокислотные последовательности белков оболочки (БО) таких потексвирусов, как Х-вирус

картофеля (ХВК) и вирус мозаики альтернантеры (ВМАльт), имеют около 40% идентичных ами-

нокислотных остатков. Однако N-концевые домены БО этих вирионов отличаются как по длине,

N-концевой домен БО ХВК длиннее на 28 остатков (ΔN = 28), так и по аминокислотной после-

довательности. В настоящей работе определено влияние N-концевого домена БО на структуру

и физико-химические свойства вирионов ХВК и ВМАльт. Было показано, что температура плав-

ления препаратов ХВК выше на 10-12 °С, чем у препаратов ВМАльт, спектры кругового дихроизма

этих вирусов значительно отличаются. Пространственное выравнивание имеющихся структур БО

потексвирусов высокого разрешения показало, что величина RMSD С_α-атомов была максимальна

именно для N-концевых доменов двух сравниваемых моделей. Согласно компьютерному моделиро-

ванию, ΔN-пептид N-домена БО ХВК полностью разупорядочен. По данным синхротронного ма-

лоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), структура БО в составе вирионов ХВК и ВМАльт от-

личается, в частности, БО ХВК имеет больший размер областей кристалличности, а значит и более

упорядочен. С помощью МУРР были рассчитаны диаметры вирионов и параметры спирали в рас-

творе. Выявлено влияние конформации и локализации N-концевого домена БО ХВК относительно

поверхности вириона на его структуру. Предположительно, повышенная в сравнении с ВМАльт тер-

мостабильность вирионов ХВК обеспечивается удлиненными N-концевыми доменами (ΔN = 28),

которые контактируют между соседними субъединицами БО в вирионе ХВК.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: потексвирусы, Х-вирус картофеля, вирус мозаики альтернантеры, белок оболочки,

N-концевой домен, круговой дихроизм, малоугловое рентгеновское рассеяние.

DOI: 10.31857/S0320972523010050, EDN: PBSOUZ

ВВЕДЕНИЕ

нию (структурному и функциональному) уде-

ляется существенное внимание. С помощью

Многие из нитевидных вирусов растений

непрямых методов структурного анализа проде-

являются опасными патогенами сельскохозяй-

монстрировано, что белки оболочки (БО) по-

ственных культур [1]. Поэтому их исследова- текс- и потивирусов частично неупорядоченны,

Принятые сокращения: АВК - А-вирус картофеля; БО - белок оболочки; ВМАльт - вирус мозаики альтернантеры;

ВТМ - вирус табачной мозаики; МУРР - малоугловое рентгеновское рассеяние; ПЭМ - просвечивающая электронная

микроскопия; РНП - рибонуклеопротеид; крио-ЭМ - криоэлектронная микроскопия; ХВК - Х-вирус картофеля.

* Адресат для корреспонденции.

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

вследствие чего их вирионы оказались значи-

ки (ВТМ). Мы показали, что профиль МУРР

тельно более лабильными, чем предполагалось

выявляет ряд особенностей структуры палоч-

ранее [2, 3]. Обнаружено, что БО некоторых

ковидной вирусной частицы: форму, диаметр,

вирусов растений имеют разупорядоченные

шаг спирали или периодичность структуры

N-концевые домены различной длины на по-

вирионов и реполимеров ВТМ [17], и полу-

верхности вирионов. С помощью рентгено-

ченные данные хорошо согласовывались с из-

структурного анализа удалось получить часть

вестными характеристиками ВТМ. Методом

структуры БО вируса мозаики папайи

[4],

МУРР были также исследованы особенности

по данным криоэлектронной микроскопии

строения нитевидных вирионов А-вируса кар-

(крио-ЭМ) получены фрагменты структур ви-

тофеля (АВК) [18].

руса мозаики бамбука, вируса мозаики пепи-

В настоящей работе МУРР и несколько

но [5, 6] и вириона Х-вируса картофеля (ХВК)

комплементарных физико-химических мето-

с разрешением 2,2 Å [7]. Оказалось, что цен-

дов были использованы для сравнительного

тральные части БО всех вышеперечисленных

анализа структуры нитевидных вирионов по-

потексвирусов имеют сходную структуру, об-

тексвирусов ХВК и ВМАльт в растворе. Ос-

разованы семью альфа-спиралями, располо-

новной задачей данного исследования было

женными в довольно сложной топологии, и

определение влияния структуры N-концевых

структурно гомологичны БО потивирусов. Не-

доменов на строение и физико-химические

смотря на сходство пространственных струк-

свойства вирионов ХВК и ВМАльт. С этой

тур, БО потексвирусов характеризуются раз-

целью по данным МУРР и доступным струк-

личными физико-химическими свойствами.

турам БО (PDB ID: 6R7G для ХВК и PDB ID:

Так, например, БО ХВК, выделенный из ви-

7OG6 для ВМАльт) было проведено моделиро-

русных частиц, не способен к полимеризации

вание структуры вирусных частиц в растворе с

и формированию вирусоподобных частиц при

учетом подвижных N-концевых доменов. При

отсутствии РНК, в отличие от капсидных бел-

этом для БО ХВК структура была дополнена

ков других потекс- [8-11] и потивирусов [12].

отсутствующим в атомной модели подвижным

Вирионы ХВК имеют специфические оптиче-

фрагментом N-концевого домена, состоящим

ские свойства, выявляемые спектроскопией

из дополнительных 28 а.о. - ΔN-пептидом.

кругового дихроизма (КД) в дальнем и ближ-

Для этого были использованы гибридные ме-

нем ультрафиолете (УФ) [3, 13]. Кроме того,

тоды моделирования и структурного анали-

была обнаружена функционально-структурная

за МУРР

[15,

16]. Полученные результаты

перестройка вирионов ХВК, «ремоделирова-

могут позволить объяснить отличия физи-

ние», в ходе которой нетранслируемые вирио-

ко-химических характеристик и свойств БО в

ны переходят в метастабильное состояние транс-

составе вирионов ХВК и ВМАльт.

ляционной активации, в которой участвуют

N-концевые домены БО [14].

Изучение структуры нитевидных виру-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

сов растений классическими методами имеет

ограничения в связи с длиной и гибкостью ви-

Выделение ВМАльт и ХВК. Препараты ви-

русных частиц. Вследствие этого выбор мето-

русов из коллекции кафедры вирусологии МГУ

дов структурного анализа приобретает особое

имени М.В. Ломоносова - ВМАльт (штамм

значение. Эффективным и информативным

AltMV-Moscow University, GenBank accession

является метод малоуглового рентгеновского

No. FJ822136)) и ХВК (Русский штамм, GenBank

рассеяния (МУРР), позволяющий проводить

accession No. AAA47171.1) - выделяли согласно

изучение структурных свойств биологических

протоколам, описанным ранее [8, 19].

объектов в растворе при заданных температу-

Электрофоретический анализ белков в дена-

ре, pH, солевом составе и других параметрах

турирующем полиакриламидном геле (ПААГ).

среды. Следует отметить серьезный прогресс

Электрофорез проводили в пластинах ПААГ с

последних десятилетий в развитии МУРР: по-

градиентом акриламида 8-20% и N, N′-мети-

явились новые подходы анализа и интерпрета-

ленбисакриламида - 0,08-0,2% [20]. Для съем-

ции данных, были разработаны эффективные

ки окрашенных Coomassie G-250 ПААГ исполь-

программы компьютерного моделирования

зовали гель-документирующую систему Сhemi

структуры [15] для изучения строения биоло-

Doc XRS+ с программным обеспечением Image

гических макромолекул в растворе [16]. Ранее

Lab Software («Bio-Rad», CША).

с помощью этого метода нами был выполнен

Просвечивающая электронная микроскопия

структурный анализ вирионов и реполимеров

(ПЭМ). Исследуемый препарат сорбировали на

БО палочковидного вируса табачной мозаи-

медных сетках, покрытых коллодиевой пленкой

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

с углеродным напылением, и контрастировали

рассеяния и λ = 0,124 нм - длина волны рас-

2%-ным водным раствором уранилацетата. На-

сеяния. При моделировании четвертичной

блюдения проводили с помощью электронного

структуры вирионов использовались кривые

микроскопа «JEM-1400» («JEOL», Япония) при

МУРР до s = 2,7 нм^-1, поскольку данные на

напряжении 80 кВ с цифровой фотокамерой

более высоких углах соответствуют рассеянию

«Olympus Quemesa», используя программное

от атомной структуры, которая не менялась

обеспечение «Olympus Soft Imaging Solutions

в процессе моделирования. Кроме того, вы-

GmbH» («Olympus», Германия).

бранная область является наиболее информа-

Измерение спектров кругового дихроизма.

тивной вследствие меньшего уровня экспери-

Спектры КД измеряли в 5 мМ Tris-HCl-буфе-

ментального шума. Для каждого образца было

ре (pH 7,8) при 20 °С в 1-2-мм кюветах на

снято по 50 экспериментальных кривых рассея-

дихрографе Chirascan («Applied Photophysics»,

ния с целью контроля возможных радиацион-

Англия). Концентрация образцов составля-

ных повреждений. Также по 50 кривых рассея-

ла 50-100 мкг/мл. Спектры КД записывали

ния было получено для буферных растворов

на скорости 0,5-1,0 нм/с в дальнем диапазоне

перед каждой серией экспериментов на об-

УФ-спектра (185-250 нм) с вычетом базовой

разце и после. Первичная обработка данных,

линии. Измеренные спектры обрабатывали

включающая усреднение 50 кривых рассеяния

с использованием стандартного пакета про-

и вычет сигнала от буфера, а также определе-

граммного обеспечения, поставляемого с при-

ние структурных инвариантов проводились с

бором. Величины КД выражали в величинах

помощью программы PRIMUS [23]. Дальней-

молярной эллиптичности [Θ], как описано ра-

шая обработка полученных данных проводи-

нее [18]. Для термического анализа каждый пре-

лась с помощью программ специального паке-

парат нагревали в кюветном отделении дихро-

та ATSAS [24].

графа от 40 до 85 °С со скоростью 1 °С в минуту.

Характеристики внутренней структуры

Регистрацию каждого нового спектра начинали

упорядоченных или частично упорядоченных

после увеличения температуры на 3 °С.

полимерных образцов вычислялись с помощью

Биоинформатический анализ первичной и

интерактивной программы PEAK [23] путем

третичной структуры БО потексвирусов. Вырав-

приближения гауссовых профилей к выбран-

нивание аминокислотных последовательностей

ным брэгговским пикам на кривых рассеяния.

БО выполнено с помощью программы Clustal

Средний размер кристаллитов (L) и степень

Omega [21]. Количественную оценку сходства

разупорядоченности в системе Δ/d вычисля-

последовательностей проводили попарным

лись в соответствии с формулами (1) и (2) [25]:

выравниванием аминокислотной последова-

тельности БО без 28 N-концевых а.о. БО ХВК.

L = λ/β_s⋅cosθ,

(1)

Пространственное выравнивание выполня-

ли с использованием программы Swiss-Pdb

βs · d

Viewer 3.7 (http://www.genebee.msu.su/spdbv/).

Δ/d =

(2)

В качестве матрицы использовали структуру

БО ХВК в составе вириона, полученную мето-

где β_s - полуширина брэгговского пика (в ра-

дом крио-ЭМ [7]. Профиль RMSD по последо-

дианах) при угле рассеяния 2θ, d = 2π/s_max -

вательности определяли для пар C_α-атомов со-

характеристический размер упорядоченных

гласно пространственному выравниванию. Для

областей, соответствующий положению брэг-

анализа уровня структурной организации БО

говского пика s_max, а Δ - среднеквадратичное

использовали программу предсказания IUPred

отклонение расстояния между двумя ближай-

(http://iupred.enzim.hu/), основанную на алго-

шими периодическими мотивами структуры.

ритме оценки способности остатка образовы-

Для определения максимального разме-

вать выгодные парные контакты.

ра частиц (D_max) и построения функций рас-

Эксперимент и анализ данных МУРР. Экс-

пределения по расстояниям p(r) использова-

перимент по малоугловому рентгеновско-

лась программа GNOM [26]. Для получения

му рассеянию проводился на синхротроне

полноразмерных моделей вирионов ВМАльт

Petra III (DESY, Гамбург) на станции P12 [22],

и ХВК использовалась комбинация про-

которая оснащена оборудованием для автома-

грамм CHIMERA (https://www.cgl.ucsf.edu/

тической смены образцов и двумерным детек-

chimera/)

[27], SUPPDB и MASSHA

[28].

тором Pilatus 2M («DECTRIS», Швейцария).

CHIMERA позволяет задать правило для раз-

Интенсивность рассеяния I(s) была измере-

множения атомной модели мономера с тем,

на в области значений волновых векторов

чтобы сгенерировать спираль вириона и за-

0,07 < s < 7 нм^-1, где s = (4π⋅sinθ)/λ; 2θ - угол

тем сохранить всю получившуюся структуру.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

SUPPDB [29] находит матрицу трансформа-

жаются путем оптимизации расчетной кривой

ции одной субъединицы в другую для их опти-

рассеяния (I_calc), минимизируя расхождение χ²

мального наложения и может затем применить

между ними (3):

такую же трансформацию последовательно к

фрагменту, состоящему из нескольких субъ-

χ² =

(3)

Σ_j[^Iexp(^sj) - cIcalc(^sj)σ(s

]²,

N - 1

)

единиц, чтобы также получить целую спираль.

MASSHA реализует метод молекулярной тек-

где N - число экспериментальных точек, c -

тоники. Эта программа сочетает в себе ин-

шкалирующий множитель, σ - эксперимен-

терактивный и автоматизированный поиск

тальные ошибки.

взаимной ориентации мономеров комплекса,

оперируя ими как твердыми телами, и позво-

ляет сохранять объекты PDB в их текущих по-

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

зициях, что удобно для хранения результатов

интерактивного или автоматизированного по-

Физико-химическая характеристика вирио-

строения модели.

нов ХВК и ВМАльт. Как было показано ранее [9],

Для создания различных конформаций

электрофоретическая подвижность вирионов

N-концевых фрагментов использовалась про-

ВМАльт (рис. 1, а; дорожки 2, 3) в денатурирую-

грамма RANCH [30], которая создает набор

щих условиях соответствует теоретической мо-

независимых моделей со случайной конфор-

лекулярной массе БО ВМАльт (M_теор. = 22,2 кДа,

мацией участка структуры, отсутствующего

М_экс. = 23 кДа). В тех же условиях БО ХВК про-

в модели высокого разрешения, с учетом ин-

являет аномально низкую подвижность, соот-

формации о полной аминокислотной после-

ветствующую примерно 31 кДа (рис. 1, а; до-

довательности белка и имеющейся структуре

рожка 1), в то время как его M_теор. равна 25 кДа.

жестких доменов.

Это явление согласуется с ранее опубликован-

Сравнение экспериментальных данных и

ными данными [32] и может быть объяснено

кривых МУРР, полученных от построенных

наличием в структуре белка неупорядоченных

моделей вирусов, осуществлялось программой

гидрофильных сегментов и дополнительных

CRYSOL [31]. Программа использует мульти-

химических групп, полученных в результате пост-

польное разложение амплитуд рассеяния для

трансляционной модификации [2].

расчета сферически усредненной картины рас-

Содержание вторичной структуры БО вирио-

сеяния и учитывает гидратную оболочку. Экс-

нов ВМАльт и ХВК оценивали по спектрам КД

периментальные данные МУРР (I_exp) прибли-

в дальнем диапазоне УФ-спектра (200-255 нм).

Рис. 1. Электрофоретический анализ вирионов (а). Дорожки: 1 - ХВК, 2 - ВМАльт, 3 - БО ВМАльт. Были исполь-

зованы аликвоты по 1 мкг на полосу. Молекулярная масса указана рядом с контрольными белками (дорожка 4).

б - Спектры кругового дихроизма вирионов ХВК (1) и ВМАльт (2)

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

Анализ данных ПЭМ показал (рис. 2, а и б),

что вирионы ВМАльт и ХВК представляют со-

бой сходные по морфологии, длинные и гибкие

нитевидные частицы с диаметром 12,5 ± 1,1 нм

и 13,6 ± 1,4 нм для вирионов ХВК и ВМАльт

соответственно.

Анализ термостабильности вирионов по

КД-спектрам. Степень термической денатура-

ции также различалась для вирионов ВМАльт

и ХВК (рис. 3, а и б). Методом сканирующей

калориметрии ранее было показано, что плав-

ление вирионов ХВК происходит при темпе-

ратуре (Т_пл.) 64-65 °C [2]. В настоящей рабо-

те при нагревании вирионов ВМАльт и ХВК

были проанализированы температурные зави-

симости интенсивности отрицательных макси-

мумов эллиптичности на 208 нм ([θ]²⁰⁸) (рис. 3,

кривые 1 на обоих панелях) и величины отно-

шения эллиптичностей [θ]²⁰⁸/[θ]²¹⁸ (рис. 3, кри-

вые 2 на обоих панелях), характеризующие из-

менения содержание α- и β-структур в белке.

Для вирионов ВМАльт и ХВК в диапазоне

50-75 °C наблюдали постепенный рост интен-

сивности [θ]²⁰⁸ до -8000 и -1500 ° соответствен-

но. Такая разница может указывать на более

крупные размеры образующихся частиц ХВК

и/или повышенное содержание в них β-структу-

ры. Плавление препаратов ВМАльт происходило

при ~56 °C, т.е. на 10-12 °C ниже, чем препара-

Рис.

Электронные микрофотографии вирионов

тов ХВК (Т_пл. ~ 68 °C). Таким образом, вирионы

ВМАльт (а) и ХВК (б). ПЭМ, контрастирование 2%-ным

ХВК оказались более термостабильными.

уранилацетатом. Масштаб - 200 нм

Сравнительный анализ структуры белков обо-

лочки ВМАльт и ХВК. БО ХВК и ВМАльт име-

Спектр КД вирионов ВМАльт показал отри-

ют некоторое сходство аминокислотной после-

цательный максимум на 208 нм ([θ]_max = -15 400 °)

довательности, но различаются по длине [33].

(рис. 1, б; кривая 2), характерный для альфа-спи-

Сравнение первичных структур БО ВМАльт

ральных белков

[13]. Препараты вирионов

и ХВК попарным выравниванием с помощью

ХВК имели необычные спектры КД (рис. 1, б;

программы Clustal Omega (рис. 4, а) подтверди-

кривая 1) с малой эллиптичностью на 208 нм

ло сходство в последовательности (68% подоб-

([θ]_max = -8900 ) и выраженным отрицательным

ных и 42% идентичных из 207 а.о.). Основное

максимумом на 228 нм.

отличие состоит в различной длине N-концевых

Рис. 3. Термическая денатурация препаратов ВМАльт (а) и ХВК (б) по данным КД-спектров. Приведена температур-

ная зависимость интенсивности отрицательных максимумов [θ]²⁰⁸ при 208 нм (1) и величины отношения [θ]²⁰⁸/[θ]²¹⁸ (2).

Кривая аппроксимации рассчитывалась по уравнению полинома 4 степени, и величину Тпл. определяли в месте пересе-

чения кривых (1) и (2)

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

Рис. 4. Выравнивание первичных структур БО ХВК и ВМАльт с помощью программы Clustal Omega (а). Отмечены

(*) - идентичные остатки; (:) и (.) - консервативные и полуконсервативные замены; подчеркнуты последовательно-

сти, отсутствующие в PDB ID: 6R7G и 7OG6. N-концевой (1-50 а.о.), центральный (51-185 а.о.) и C-концевой (186-

237 а.о.) домены выделены малиновым, зеленым и голубым соответственно [7]; б - предсказание упорядоченных/не-

упорядоченных структур с помощью вэб-сервиса IUPred для БО ХВК (1) и ВМАльт (2). Участки со значением ординаты

выше 0,5 на этом рисунке считались неупорядоченными

доменов: для БО ХВК N-концевой домен был

на (PDB ID: 6R7G, а.о. 29-235). Поскольку

длиннее на 28 а.о. (ΔN-пептид).

структуры БО в свободном состоянии и в соста-

Биоинформатический анализ потексвирусов

ве вирионов отличаются [34], в рамках данной

с помощью программы предсказания структу-

работы под структурой БО понимается струк-

ры IUPred (рис. 4, б), основанной на алгоритме

тура белка только в составе вириона. Трехмер-

оценки способности а.о. образовывать выгод-

ная структура БО ХВК включает три домена:

ные парные контакты, показал, что БО ХВК со-

N-концевой домен (I), 29-50 а.о.; централь-

держал полностью разупорядоченный N-конце-

ный домен (II), 551-185 а.о.; и С-концевой до-

вой домен из 28 а.о. (ΔN-пептид N-домена) [3].

мен (III), 186-237 а.о. (рис. 4, а). Домен I вы-

Короткие разупорядоченные участки (со значе-

ступает из центрального домена и в структуре,

нием ординаты выше 0,5) выявлялись в петлевых

полученной с помощью крио-ЭМ, охватывает

межспиральных (142-151 а.о.), междоменных

домен II соседнего БО. Атомные координаты

(175-185 а.о.) участках и в С-концевой области

1-28 а.о. (ΔN-пептид N-домена) не были опре-

(226-236 а.о.) БО обоих вирусов.

делены предположительно из-за низкой элек-

Недавно методом крио-ЭМ [7] была полу-

тронной плотности и разупорядоченности.

чена структура БО ХВК при отсутствии ΔN-

Для БО ВМАльт на сегодняшний день опре-

участка полипептидной цепи в составе вирио- делена структура (PDB ID: 7OG6, 5-203 а.о.)

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

Рис. 5. Пространственное выравнивание структур мономеров БО ХВК (1) и БО РНП ВМАльт (2) с помощью програм-

мы Swiss-Pdb Viewer 3.7 (а), PDB ID: 6R7G и 7OG6 соответственно, указаны N- и С-концы. Рисунок создан в PyMol.

б - Дистанция между Cα-атомами (Å) в соответствии с пространственным выравниванием. Нумерация остатков прове-

дена по БО ХВК. Схематично показаны отсутствующие в структуре PDB ID: 6R7G остатки, не приведенные в выравни-

вании: а.о. 1-28 (ΔN-пептид N-домена БО ХВК - пустые кружки) и а.о. 29-32 (синие кружки)

в составе «псевдовирионов» - гетерологичных

на рис. 6. Наличие брэгговского пика в рай-

рибонуклеопротеидов (РНП), для получения

оне 1,8-1,9 нм^-1 на кривых МУРР для обоих

которых использовали вирусный вектор на ос-

вирионов свидетельствует о наличии в образ-

нове ХВК, несущий ген БО ВМАльт [35].

цах упорядоченных, квазикристаллических

Чтобы детально оценить пространствен-

областей. Наличие таких пиков мы наблюда-

ное структурное сходство БО ХВК и ВМАльт

ли ранее для вирионов ВТМ и АВК и связыва-

мы провели выравнивание третичных структур

ли их положение с периодичностью, т.е. ша-

мономеров с помощью программы Swiss-Pdb

гом спирали вирионов [17, 18]. Эти величины

Viewer 3.7 (рис. 5, а). Отклонение координат

для вирионов ВМАльт и ХВК оказались равны

С_α-атомов двух сравниваемых моделей отражает

3,37 ± 0,01 и 3,40 ± 0,01 соответственно (табли-

величина RMSD. Средняя величина RMSD для

ца). Из рис. 6 видно, что положение и форма

центрального домена II и домена III были рав-

брэгговских пиков практически совпадают, что

ны 1,3 и 4,1 Å соответственно, что подтвержда-

говорит о схожести спиральных структур обоих

ло близкое сходство третичных структур этих

вирионов. В целом, показанные на рис. 6 кри-

доменов обоих вирусов. Однако для домена I

вые имеют много общих черт, однако имеются

(33-50 а.о.) эта величина равна 8,6 Å. Дистан-

и заметные различия: в области минимума на

ции между С_α-атомами сравниваемых молекул

0,64-0,67 нм^-1, в области широкого максимума

БО ХВК и ВМАльт показаны на гистограмме

в районе 0,7-1,2 нм^-1 и в области центрально-

(рис. 5, б). Основные отличия величин RMSD

го рассеяния < 0,5 нм^-1. Исходя из наблюдае-

выявляются в 13 а.о. N-концевого фрагмен-

мых различий - менее глубокий минимум, бо-

та (33-46), С-концевых а.о. (225-232), а также

лее размытый максимум в профиле МУРР для

в межспиральных районах центрального доме-

вирионов ВМАльт, можно предположить, что

на II (а.о. 101-106 и 139-141). Таким образом,

эти вирионы менее упорядочены и подвержены

несмотря на общее сходство в расположении

большему структурному полиморфизму. Анализ

спиралей, можно видеть значительные расхож-

брэгговских пиков, проведенный с помощью

дения в топологии петлевых областей и нали-

программы PEAK, подтверждает это предполо-

чии в структуре ХВК ΔN-пептида N-домена.

жение (таблица). Для вирионов ВМАльт наблю-

Структурный анализ вирионов ХВК и ВМАльт

дается заметно меньший размер областей крис-

методом МУРР. Экспериментальные кривые

талличности L и несколько большая степень

МУРР вирионов ВМАльт и ХВК приведены

разупорядочения Δ/d в образце.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

Структурные характеристики упорядоченных областей

ладает большим полиморфизмом в раство-

вирионов ВМАльт и ХВК

ре. Следует подчеркнуть, что имеются в виду

Образцы

smax, нм^-1

d, нм

L, нм

Δ/ d

усредненные формы, так как оба вируса явля-

ются в той или иной степени гибкими и мо-

ВМАльт

1,86 ± 0,01

3,37 ± 0,01

110 ± 10

0,06 ± 0,01

гут принимать в растворе различные формы,

а функции распределения по расстояниям p(r)

ХВК

1,85 ± 0,01

3,40 ± 0,01

140 ± 10

0,05 ± 0,01

являются прямым указанием на то, какие

формы преобладают для каждого из образцов.

Анализ структуры вирионов в растворе

Для анализа структуры вирионов ВМАльт

был проведен сначала для ВМАльт, посколь-

и ХВК в растворе были рассчитаны функции

ку PDB-модель мономера БО в составе РНП

распределения по расстояниям p(r) (рис. 6, б;

является полной и практически не содержит

вставка). Максимальные размеры D_max для ви-

отсутствующих фрагментов. Для моделирова-

рионов ВМАльт и ХВК, которые мы можем

ния строения этого вириона использовалась

наблюдать в растворе на доступном для МУРР

структурная модель БО с разрешением 3,3 Å

угловом диапазоне, равны 190 и 180 нм, а диа-

(PDB ID: 7OG6, а.о. 5-203) [35].

метры спиралей из позиции пика на p(r) вирио-

Атомная модель мономера БО ВМАльт с

нов оказались равны 12,7 ± 0,1 и 13,2 ± 0,1 нм

атомными координатами а.о. 5-203 и атом-

соответственно. Это различие может объяс-

ными координатами РНК (PDB ID: 7OG6)

няться более длинными N-концевыми доме-

была многократно воспроизведена с помо-

нами БО ХВК, которые поэтому занимают

щью программы CHIMERA вдоль винтовой

большую площадь на поверхности вириона,

оси, параметры которой соответствовали ра-

слегка увеличивая его диаметр по сравнению

боте Thuenemann et al. [35]. Для того чтобы

с короткими N-концевыми цепочками

определить влияние длины спирали вириона

БО ВМАльт. Обращает на себя внимание су-

на профиль кривых малоуглового рассеяния,

щественное различие профилей функций рас-

было сгенерировано несколько спиралей раз-

пределения по расстояниям p(r) для вирионов

ной длины, используя структуру мономе-

ВМАльт и ХВК. Форма функции p(r) для ви-

ра БО ВМАльт высокого разрешения. Затем

риона ХВК характерна для жесткой много-

рассеяние от полученных моделей сравнива-

гранной призмы или цилиндра, в то время как

ли с экспериментальными данными МУРР.

вирион ВМАльт имеет более гибкую и, следо-

Таким образом, были построены моде-

вательно, менее определенную форму, т.е. об-

ли различной длины, содержащие порядка

Рис. 6. Экспериментальные кривые МУРР (а) вирионов ХВК (1) и ВМАльт (2). б - Приближение к экспериментальным

кривым ХВК (1) и ВМАльт (3) от модельных кривых, рассчитанных из функций распределения по расстояниям p(r)

для ХВК (2) и ВМАльт (4). Экспериментальные и модельные кривые для лучшей визуализации разнесены по вертикали

на один логарифмический порядок. Вставка: функции распределения по расстояниям p(r) для ХВК (1) и ВМАльт (2)

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

300-350 субъединиц. Расчет соответствующих

Для проверки этой гипотезы мономер БО

кривых рассеяния и их приближение экспе-

ВМАльт (PDB ID: 7OG6) был последователь-

риментальных данных проводилось програм-

но совмещен с 13 субъединицами БО ХВК

мой CRYSOL.

(фрагмент спирали, содержащий 1,5 витка),

Рассеяние от сгенерированных модель-

присутствующими в структуре ХВК 6R7G,

ных вирионов различной длины практиче-

программой SUPPDB. Далее, данной про-

ски не отличалось друг от друга. Зато срав-

граммой была рассчитана матрица транс-

нение профилей экспериментальной кривой

формации первого мономера в последний

рассеяния и типичной кривой от модели,

и применена ко всему фрагменту 28 раз для

содержащей 320 субъединиц БО (рис. 7, а;

получения спирали, содержащей 336 субъеди-

кривые

1 и

2), демонстрирует расхожде-

ниц (порядка 40 витков). Такая модель, пред-

ние практически на всем диапазоне дан-

ставленная мономером БО ВМАльт в спира-

ных (за исключением самых малых углов

ли ХВК, дала значительно лучшее согласие

0,05 < s < 0,5 нм^-1, соответствующих грубой

экспериментальной и расчетной кривых рас-

форме вириона) и, что очень важно, вклю-

сеяния (рис. 7, а; кривые 1 и 3).

чает несовпадение положений брэгговских

Наблюдаемое расхождение между экспе-

пиков, т.е. у полученных нами моделей ви-

риментальной и модельной кривыми отража-

рионов другой характеристический размер

ет возможное отклонение параметров реаль-

d = 2π/s_max упорядоченных областей. Посколь-

ной структуры вириона ВМАльт в растворе в

ку в работе Thuenemann et al. [35] использо-

сравнении с его жесткой спиральной моделью

вался РНП, а не вирионы ВМАльт, а также

на атомном уровне.

принимая во внимание высокую гомологию

Для моделирования строения вириона

ВМАльт и ХВК и схожесть структур их субъ-

ХВК использовалась модель части структу-

единиц (рис. 5, а), было высказано предполо-

ры ХВК (PDB ID: 6R7G) с разрешением 2,2 Å.

жение, что спиральная организация ВМАльт

Данный участок спирали состоит из 13 белко-

более близка к параметрам спирали ХВК.

вых субъединиц, включающих в себя атомные

Рис. 7. Результаты моделирования строения вирионов ВМАльт с использованием структур высокого разрешения мо-

номера БО ВМАльт в составе РНП и с применением параметров спирали ХВК (PDB ID: 7OG6 и 6R7G соответствен-

но). а - Кривые МУРР: 1 - экспериментальные данные; 2 - теоретическое рассеяние от спиральной модели, согласно

данным PDB ID:7OG6 (χ² = 15,6); 3 - теоретическое рассеяние от мономера ВМАльт, уложенного в спиральную мо-

дель, согласно данным PDB ID: 6R7G (χ² = 13,0). б - Структурная модель вириона ВМАльт, построенного из мономера

PDB ID: 7OG6 с применением параметров спирали ХВК. Окраска а.о.: 5-31 - синий; 32-58 - голубой; 59-137 - зеле-

ный; 138-164 - желтый; 165-177 - оранжевый; 178-203 - красный. Увеличение на вставке: 10×

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

координаты аминокислот с 29 по 237 остаток,

Структурное моделирование вирионов ХВК

а также содержит РНК. Таким образом, ис-

с ΔN-пептидами. Для выяснения вклада ΔN-

ходно моделирование проводилось без учета

пептидов N-домена в рассеяние вирионов ХВК

ΔN-пептида белка. Аналогично моделиро-

в атомную модель исходного мономера добав-

ванию ВМАльт, имеющийся фрагмент ХВК

ляли случайную цепь из 28 виртуальных ами-

был также размножен вдоль винтовой оси с

нокислотных остатков с помощью програм-

использованием SUPPDB для построения

мы RANCH. Затем с помощью программы

спиральной модели, содержащей 336 субъеди-

SUPPDB структура мономера с ΔN-пептидом

ниц (порядка 40 витков). Сравнение профи-

поочередно совмещалась с каждым из 13 моно-

лей экспериментальной и модельной кривых

меров атомной модели ХВК (PDB ID: 6R7G).

(рис 8, а; кривые 1 и 2) демонстрирует не-

Таким образом, после объединения таких мо-

большие сдвиги в районе первого минимума

номеров был получен фрагмент спирали, со-

(s_min = 0,6 нм^-1) и брэгговского пика с макси-

держащий, помимо атомной структуры, также

мумом s_exp = 1,84 нм^-1 (d_exp = 3,41 нм). Пред-

ΔN-пептиды N-домена. Аналогично моделиро-

положительно, это связано с отсутствием 28

ванию ВМАльт, матрица трансформации перво-

N-концевых остатков в модели вириона ХВК

го мономера в 13-й последовательно применя-

(рис. 8, б), что дает ограниченное приближе-

лась к интактному фрагменту 28 раз. Полученная

ние экспериментальной кривой, и для по-

таким размножением гибридная модель спира-

строения корректной модели необходимо

ли (содержащая как атомы, так и виртуальные

дополнить исходный мономер этими амино-

остатки) состояла из 336 субъединиц, вклю-

кислотными остатками.

чая также и РНК, и соответствовала примерно

Рис. 8. Результаты приближения кривой МУРР от вириона ХВК. а - Экспериментальные данные рассеяния вирио-

ном ХВК (кривые 1, 3 и 5); рассеяние от исходной модели спирали (χ² = 70,2) (кривая 2); приближение моделью ХВК

ΔN-пептидами в сложенном состоянии (χ² = 59,7) (кривая 4); приближение моделью ХВК с ΔN-пептидами в развер-

нутом состоянии (χ² = 43,1) (кривая 6). б - Исходная модель вириона; в - модель спирали ХВК с ΔN-пептидами в

сложенном состоянии; г - модель спирали ХВК с ΔN-пептидами в развернутом состоянии. Окраска а.о.: 1-32 - си-

ний; 33-64 - голубой; 65-158 - зеленый; 159-190 - желтый; 191-222 - оранжевый; 223-237 - красный. Увеличение

на вставках: 10×

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

40 виткам спирали. Рассеяние от такой модели

модифицированные частицы сферической фор-

затем сравнивалось с экспериментальными дан-

мы [36, 38, 39]. Было показано, что структурный

ными с помощью программы CRYSOL. С по-

переход вирионов ХВК [38] и ВМАльт [39] в сфе-

мощью таких процедур вначале была построена

рические частицы происходит при различных

модель 1, в которой ΔN-пептиды в сложенном

условиях, что может быть связано с различием

состоянии и контактируют с соседними субъ-

их физико-химических свойств, которые требу-

единицами вириона (рис. 8, в). Такая модель дала

ют дополнительных исследований.

приближение (рис. 8, а; кривые 3 и 4), которое

Результаты термического анализа показа-

оказалось ближе к экспериментальной кривой в

ли, что вирионы потексвирусов ХВК и ВМАльт

области брэгговского пика, чем кривая без уче-

по-разному реагировали на повышение темпе-

та ΔN-участка. С помощью описанных выше

ратуры (рис. 3). Температура плавления пре-

процедур была также построена модель 2 с раз-

паратов ХВК была выше ВМАльт на 10-12 °С,

вернутыми ΔN-пептидами (рис 8, г). Прибли-

что согласуется с результатами наших преды-

жение такой модели (рис. 8, а; кривые 5 и 6) в

дущих исследований [38, 39]. Причина такой

целом лучше согласуется с экспериментальны-

разницы между двумя вирусами, относящими-

ми данными, в том числе с точки зрения пози-

ся к одному семейству и имеющими близкую

ций первого минимума, однако дает немного

морфологию, вероятно, заключается в струк-

более острый брэгговский пик. Таким образом,

турных различиях БО в составе вирионов этих

достичь идеального приближения эксперимен-

вирусов. БО потексвирусов ХВК и ВМАльт

тальной кривой МУРР моделью с рассмотрен-

(рис. 4, а) имеют высокую гомологию в пер-

ными конформациями ΔN-участка не предста-

вичной структуре (68% подобных а.о.), малая

вилось возможным.

величина RMSD показывала близкое сходство

Остающиеся даже после добавления ΔN-

и третичных структур (рис. 5, б) для централь-

пептидов небольшие отклонения модельных

ной и С-концевой частей их БО. При этом в

кривых от экспериментальных данных МУРР

белке ХВК мы показали наличие разупорядо-

свидетельствуют о том, что отдельные субъ-

ченного ΔN-пептида из 28-30 а.о. в N-домене

единицы ХВК имеют разное строение гибких

(рис. 4, б) в отличие от БО ВМАльт. Этот уча-

участков, т.е. в растворе могут одновременно со-

сток в БО ХВК имел большое число гидрок-

существовать вирионы с разными конформация-

силсодержащих а.о. (14 Thr/Ser) и мало гидро-

ми ΔN-пептидов, как сложенных, так и развер-

фобных/алифатических остатков (1 Ile, 5 Ala),

нутых. В моделях с компактной конформацией

что могло быть причиной аномально медлен-

ΔN-пептиды частично прилегают к поверхности

ной электрофоретической подвижности ХВК

вириона, что предполагает их взаимодействие

в геле. Подобный феномен мы описали ранее

с соседними субъединицами. Это, в свою оче-

для белка потивируса АВК [2]. Наличие гидро-

редь, может увеличивать стабильность вириона

фильных а.о. и остатков фукозы/галактозы в

и приводить к повышению Т_пл. вирионов ХВК.

ΔN-пептиде БО ХВК [40] обеспечивает форми-

Отличия модельных и экспериментальных кри-

рование упорядоченного слоя связанной воды,

вых связаны с отклонением жесткой идеальной

как показано ранее методом ИК-спектроско-

формы модели от обладающих гибкостью и по-

пии [40], и могло быть причиной аномальных

лиморфностью рассеивающих объектов.

КД-спектров вируса. Модели, полученные в

результате анализа синхротронного МУРР, по-

казали возможность того, что гибкие ΔN-кон-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

цевые участки N-домена могут контактировать

с соседними субъединицами белка и/или скре-

Стабильность вирусных частиц почти пол-

плять витки спиральной структуры и тем са-

ностью определяется межмолекулярными акси-

мым стабилизировать структуру вириона. Об-

альными и латеральными белок-белковыми

наружено, что вирионы ХВК имеют больший

взаимодействиями, а также РНК-белковыми

размер областей кристалличности L в сравне-

взаимодействиями. Одним из показателей ста-

нии с ВМАльт, а значит и более упорядочены.

бильности является устойчивость к термической

Результаты наших предыдущих исследова-

обработке вирионов. Показано, что структур-

ний позволили предположить, что N-концевая

ный переход нитевидных вирионов при повыше-

область БО ХВК играет важную роль в фор-

нии температуры происходит через образование

мировании спиральной структуры вириона.

ряда интермедиатов [36-38] и высвобождение

Удаление или изменение состава N-концевого

денатурированного белка. Было обнаружено,

пептида влияло на его активность в качестве

что при нагревании некоторых фитовирусов в

трансляционного репрессора. Было показано,

определенных условиях образуются структурно

что БО подавляет трансляцию РНК в соста-

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

ве вирионов. При этом удаление N-концевого

Вклад авторов. А.Л. Ксенофонтов, Э.В. Шты-

пептида не приводило к потере этой активно-

кова

- концепция и руководство работой;

сти. Однако при фосфорилировании N-конце-

А.Л. Ксенофонтов, М.В. Петухов, В.В. Матвеев,

вого пептида или замене в его составе фосфо-

Н.В. Федорова, А.М. Арутюнян, Т.И. Манухова,

рилируемых (Thr/Ser) на нефосфорилируемые

Е.А. Евтушенко - проведение экспериментов;

(Ala/Gly) аминокислоты БО ХВК терял способ-

М.В. Петухов, О.В. Карпова, П.И. Семенюк - об-

ность подавлять трансляцию РНК ХВК в со-

суждение результатов исследования; А.Л. Ксено-

ставе частиц, полученных при сборке с этими

фонтов, М.В. Петухов, Э.В. Штыкова - написа-

белками, что подтверждает выводы о том, что

ние текста; Н.А. Никитин, О.В. Карпова - редак-

N-концевой пептид БО ХВК оказывает влия-

тирование текста статьи.

ние на конформацию участков БО, которые

Благодарности. Эксперименты по выделе-

вовлечены в белок-белковые и/или РНК-бел-

нию и характеристике вирусных частиц были

ковые взаимодействия в составе вириона [41].

проведены при поддержке междисциплинар-

Впервые структура низкого разрешения ни-

ной научно-образовательной школы Москов-

тевидных потексвирусов ВМАльт и ХВК была

ского университета «Молекулярные техноло-

получена в растворе методом МУРР. Рассчита-

гии живых систем и синтетическая биология»

ны диаметры (12,7 ± 0,1 и 13,2 ± 0,1 нм соответ-

с использованием оборудования, приобре-

ственно). По данным крио-ЭМ, диаметр РНП

тенного по Программе развития МГУ имени

ВМАльт равен 12,0 нм [35], вирионов ВМАльт -

М.В. Ломоносова.

13,5 нм [8], вирионов ХВК - около 13,0 нм [7].

Финансирование. Работа выполнена при

Определен шаг спирали вирионов ВМАльт и

поддержке Министерства науки и высшего

ХВК (3,37 ± 0,01 и 3,40 ± 0,01 соответственно), ве-

образования в рамках выполнения работ по

личины оказались близкими к данным крио-ЭМ

Государственному заданию ФНИЦ «Кристал-

(3,57 [8] и 3,52 [7] соответственно). Результаты

лография и фотоника» РАН в части проведе-

малоуглового рассеяния показали повышенную

ния экспериментов МУРР.

плотность упаковки белков в вирионах ХВК,

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

которая, вероятно, обеспечивается стабилизи-

отсутствии конфликта интересов.

рующими структуру вириона - ΔN-пептидами,

Соблюдение этических норм. Настоящая

контактирующими с соседними субъединицами,

статья не содержит описания каких-либо ис-

и определяет повышенную термостабильность

следований с участием людей или использова-

вирионов ХВК в сравнении с ВМАльт.

нием животных в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Stubbs, G., and Kendall, A. (2012) Helical viruses,

for flexibility in the flexible filamentous plant viruses, Nat.

Adv. Exp. Med. Biol., 726, 631-658, doi: 10.1007/

Struct. Mol. Biol., 22, 642-644, doi: 10.1038/nsmb.3054.

978-1-4614-0980-9_28.

6. Agirrezabala, X., Mendez-Lopez, E., Lasso, G.,

2. Ksenofontov, A. L., Paalme, V., Arutyunyan, A. M.,

Sanchez-Pina, M. A., Aranda, M., and Valle, M.

Semenyuk, P. I., Fedorova, N. V., Rumvolt, R.,

(2015) The near-atomic cryoEM structure of a flexible

Baratova, L. A., Jarvekulg, L., and Dobrov, E. N.

filamentous plant virus shows homology of its coat

(2013) Partially disordered structure in intravirus coat

protein with nucleoproteins of animal viruses, eLife, 4,

protein of potyvirus potato virus A, PLoS One, 8,

e11795, doi: 10.7554/eLife.11795.

e67830, doi: 10.1371/journal.pone.0067830.

7. Grinzato, A., Kandiah, E., Lico, C., Betti, C.,

3. Semenyuk, P. I., Karpova, O. V., Ksenofontov, A. L.,

Baschieri, S., and Zanotti, G. (2020) Atomic structure

Kalinina, N. O., Dobrov, E. N., and Makarov, V. V.

of potato virus X, the prototype of the Alphaflexiviridae

(2016) Structural properties of potexvirus coat proteins

family, Nat. Chem. Biol., 16, 564-569, doi: 10.1038/

detected by optical methods, Biochemistry (Moscow),

s41589-020-0502-4.

81, 1522-1530, doi: 10.1134/S0006297916120130.

8. Donchenko, E. K., Pechnikova, E. V., Mishyna, M. Y.,

4. Yang, S., Wang, T., Bohon, J., Gagne, M. E.,

Manukhova, T. I., Sokolova, O. S., Nikitin, N. A.,

Bolduc, M., Leclerc, D., and Li, H. (2012) Crystal

Atabekov, J. G., and Karpova, O. V. (2017) Structure and

structure of the coat protein of the flexible filamentous

properties of virions and virus-like particles derived from

papaya mosaic virus, J. Mol. Biol., 422, 263-273,

the coat protein of Alternanthera mosaic virus, PLoS

doi: 10.1016/j.jmb.2012.05.032.

One, 12, e0183824, doi: 10.1371/journal.pone.0183824.

5. DiMaio, F., Chen, C. C., Yu, X., Frenz, B., Hsu, Y. H.,

9. Mukhamedzhanova, A. A., Smirnov, A. A., Arkhi-

Lin, N. S., and Egelman, E. H. (2015) The molecular basis

penko, M. V., Ivanov, P. A., Chirkov, S. N., Rodio-

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

КСЕНОФОНТОВ и др.

nova, N. P., Karpova, O. V., and Atabekov, J. G.

20.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins

(2011) Characterization of Alternanthera mosaic

during the assembly of the head of bacteriophage T4,

virus and its Coat Protein, Open Virol. J., 5, 136-140,

Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

doi: 10.2174/1874357901105010136.

21.

Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Kar-

10.

Hammond, J., Kim, Ik.-H., and Lim, H.-S. (2017)

plus, K., Li, W., Lopez, R., McWilliam, H., Remmert,

Alternanthera mosaic virus - an alternative ‘model’

M., Soding, J., Thompson, J. D., and Higgins, D. G.

potexvirus of broad relevance, Kor. J. Agricult. Sci., 44,

(2011) Fast, scalable generation of high-quality protein

145-180, doi: 10.7744/kjoas.20170016.

multiple sequence alignments using Clustal Omega,

11.

Erickson, J. W., Bancroft, J. B., and Horne, R. W.

Mol. Syst. Biol., 7, 539, doi: 10.1038/msb.2011.75.

(1976) The assembly of papaya mosaic virus protein,

22.

Blanchet, C. E., Spilotros, A., Schwemmer, F.,

Virology,

72,

514-517, doi:

10.1016/0042-6822

Graewert, M. A., Kikhney, A., Jeffries, C. M., Franke,

(76)90180-x.

D., Mark, D., Zengerle, R., Cipriani, F., Fiedler,

12.

Ksenofontov, A. L., Dobrov, E. N., Fedorova, N.

S., Roessle, M., and Svergun, D. I. (2015) Versatile

V., Serebryakova, M. V., Prusov, A. N., Baratova, L.

sample environments and automation for biological

A., Paalme, V., Jarvekulg, L., and Shtykova, E. V.

solution X-ray scattering experiments at the P12

(2018) Isolated Potato Virus A coat protein possesses

beamline (PETRA III, DESY), J. Appl. Crystallogr.,

unusual properties and forms different short virus-

48, 431-443, doi: 10.1107/S160057671500254X.

like particles, J. Biomol. Struct. Dyn., 36, 1728-1738,

23.

Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch,

doi: 10.1080/07391102.2017.1333457.

M. H. J., and Svergun, D. I. (2003) PRIMUS: a

13.

Homer, R. B., and Goodman, R. M. (1975) Circular

Windows PC-based system for small-angle scattering

dichroism and fluorescence studies on potato virus X

data analysis, J. Appl. Crystallogr., 36, 1277-1282,

and its structural components, Biochim. Biophys. Acta,

doi: 10.1107/S0021889803012779.

378, 296-304, doi: 10.1016/0005-2787(75)90117-3.

24.

Manalastas-Cantos, K., Konarev, P. V., Hajizadeh, N.

14.

Atabekov, J., Dobrov, E., Karpova, O., and

R., Kikhney, A. G., Petoukhov, M. V., Molodenskiy,

Rodionova, N.

(2007) Potato virus X: structure,

D. S., Panjkovich, A., Mertens, H. D. T., Gruzinov,

disassembly and reconstitution, Mol. Plant Pathol., 8,

A., Borges, C., Jeffries, C. M., Svergun, D. I., and

667-675, doi: 10.1111/j.1364-3703.2007.00420.x.

Franke, D. (2021) ATSAS 3.0: expanded functionality

15.

Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Pan-

and new tools for small-angle scattering data analysis,

jkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T., Kikh-

J. Appl. Crystallogr.,

54,

343-355, doi:

10.1107/

ney, A. G., Hajizadeh, N. R., Franklin, J. M., Jeffries,

S1600576720013412.

C. M., and Svergun, D. I. (2017) ATSAS 2.8: a com-

25.

Вайнштейн Б. (1963) Дифракция рентгеновских

prehensive data analysis suite for small-angle scatter-

лучей на цепных молекулах, АН СССР, Москва.

ing from macromolecular solutions, J. Appl. Crystal-

26.

Svergun, D. I. (1992) Determination of the regular-

logr., 50, 1212-1225, doi: 10.1107/S1600576717007786.

ization parameter in indirect-transform methods us-

16.

Svergun, D. I., Koch, M. H. J., Timmins, P. A., and

ing perceptual criteria, J. Appl. Cryst., 25, 495-503,

May, R. P. (2013) Small Angle X-Ray and Neutron

doi: 10.1107/S0021889892001663.

Scattering from Solutions of Biological Macromolecules,

27.

Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C.,

First Edn., Oxford University Press, Oxford.

Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., and

17.

Ksenofontov, A. L., Petoukhov, M. V., Prusov, A. N.,

Ferrin, T. E. (2004) UCSF Chimera - a visualization

Fedorova, N. V., and Shtykova, E. V. (2020) Char-

system for exploratory research and analysis, J. Comput.

acterization of tobacco mosaic virus virions and re-

Chem., 25, 1605-1612, doi: 10.1002/jcc.20084.

polymerized coat protein aggregates in solution by

28.

Konarev, P. V., Petoukhov, M. V., and Svergun, D. I.

small-angle X-ray scattering, Biochemistry (Moscow),

(2001) MASSHA - a graphics system for rigid-body

85, 310-317, doi: 10.1134/S0006297920030062.

modelling of macromolecular complexes against

18.

Shtykova, E. V., Petoukhov, M. V., Fedorova, N. V.,

solution scattering data, J. Appl. Cryst., 34, 527-532,

Arutyunyan, A. M., Skurat, E. V., Kordyukova, L. V.,

doi: 10.1107/S0021889801006100.

Moiseenko, A. V., and Ksenofontov, A. L. (2021) The

29.

Kozin, M. B., and Svergun, D. I. (2000) A software

structure of the potato virus a particles elucidated

system for rigid-body modelling of solution scattering

by small angle X-ray scattering and complementary

data, J. Appl. Cryst.,

33,

775-777, doi:

10.1107/

techniques, Biochemistry (Moscow),

86,

230-240,

S0021889800001382.

doi: 10.1134/S0006297921020115.

30.

Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V.,

19.

Miroshnichenko, N. A., Karpova, O. V., Morozov, S.,

Blackledge, M., and Svergun, D. I. (2007) Structural

Rodionova, N. P., and Atabekov, J. G. (1988) Transla-

characterization of flexible proteins using small-angle

tion arrest of potato virus X RNA in Krebs-2 cell-free

X-ray scattering, J. Am. Chem. Soc., 129, 5656-5664,

system: RNase H cleavage promoted by complemen-

doi: 10.1021/ja069124n.

tary oligodeoxynucleotides, FEBS Lett., 234, 65-68,

31.

Svergun, D., Barberato, C., and Koch, M. H. J. (1995)

doi: 10.1016/0014-5793(88)81304-8.

CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

СТРУКТУРА ВИРИОНОВ ПОТЕКСВИРУСОВ

scattering of biological macromolecules from atomic

L. A., Jarvekulg, L., and Dobrov, E. N. (2016) Heating-

coordinates, J. Appl. Cryst., 28, 768-773, doi: 10.1107/

induced transition of Potyvirus Potato Virus A coat

S0021889895007047.

protein into beta-structure, J. Biomol. Struct. Dyn., 34,

32.

Tozzini, A. C., Ek, B., Palva, E. T., and Hopp, H.

250-258, doi: 10.1080/07391102.2015.1022604.

E. (1994) Potato virus X coat protein: a glycoprotein,

38. Nikitin, N., Ksenofontov, A., Trifonova, E., Arkh-

Virology, 202, 651-658, doi: 10.1006/viro.1994.1386.

ipenko, M., Petrova, E., Kondakova, O., Kirpich-

33.

Ivanov, P. A., Mukhamedzhanova, A. A., Smirnov, A. A.,

nikov, M., Atabekov, J., Dobrov, E., and Karpova, O.

Rodionova, N. P., Karpova, O. V., and Atabekov, J. G.

(2016) Thermal conversion of filamentous potato virus

(2011) The complete nucleotide sequence of Alternan-

X into spherical particles with different properties from

thera mosaic virus infecting Portulaca grandiflora rep-

virions, FEBS Lett., 590, 1543-1551, doi: 10.1002/

resents a new strain distinct from phlox isolates, Virus

1873-3468.12184.

Genes, 42, 268-271, doi: 10.1007/s11262-010-0556-6.

39. Manukhova, T. I., Evtushenko, E. A., Ksenofontov,

34.

Nemykh, M. A., Novikov, V. K., Arutiunian, A. M.,

A. L., Arutyunyan, A. M., Kovalenko, A. O., Nikitin,

Kalmykov, P. V., Drachev, V. A., and Dobrov, E. N.

N. A., and Karpova, O. V. (2021) Thermal remodelling

(2007) Comparative study of structural stabylity of

of Alternanthera mosaic virus virions and virus-like

potato virus X coat protein molecules in solution and

particles into protein spherical particles, PLoS One,

in the virus particles [in Russian], Mol. Biol., 41, 697-

16, e0255378, doi: 10.1371/journal.pone.0255378.

705, doi: 10.1134/S0026893307040164.

40. Baratova, L. A., Fedorova, N. V., Dobrov, E. N.,

35.

Thuenemann, E. C., Byrne, M. J., Peyret, H., Saun-

Lukashina, E. V., Kharlanov, A. N., Nasonov, V. V.,

ders, K., Castells-Graells, R., Ferriol, I., Santoni, M.,

Serebryakova, M. V., Kozlovsky, S. V., Zayakina, O. V.,

Steele, J. F. C., Ranson, N. A., Avesani, L., Lopez-

and Rodionova, N. P. (2004) N-Terminal segment

Moya, J. J., and Lomonossoff, G. P. (2021) A repli-

of potato virus X coat protein subunits is glycosylated

cating viral vector greatly enhances accumulation of

and mediates formation of a bound water shell on

helical virus-like particles in plants, Viruses, 13, 885,

the virion surface, Eur. J. Biochem., 271, 3136-3145,

doi: 10.3390/v13050885.

doi: 10.1111/j.1432-1033.2004.04243.x.

36.

Atabekov, J., Nikitin, N., Arkhipenko, M., Chirkov, S.,

41. Karpova, O. V., Arkhipenko, M. V., Zaiakina, O.

and Karpova, O. (2011) Thermal transition of native

V., Nikitin, N. A., Kiseleva, O. I., Kozlovskii, S.

tobacco mosaic virus and RNA-free viral proteins into

V., Rodionova, N. P., and Atabekov, I. G. (2006)

spherical nanoparticles, J. Gen. Virol., 92, 453-456,

Translational regulation of potato virus X RNA-

doi: 10.1099/vir.0.024356-0.

coat protein complexes: the key role of a coat protein

37.

Ksenofontov, A. L., Parshina, E. Y., Fedorova, N. V.,

N-terminal peptide [in Russian], Mol. Biol., 40, 703-

Arutyunyan, A. M., Rumvolt, R., Paalme, V., Baratova,

710, doi: 10.1134/S0026893306040157.

INFLUENCE OF THE STRUCTURE

OF THE COAT PROTEIN N-TERMINAL SEGMENT IN POTATO VIRUS X

AND ALTERNANTHERA MOSAIC VIRUS ON THE STRUCTURE

AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF VIRIONS

A. L. Ksenofontov¹*, M. V. Petoukhov^2,3, V. V. Matveev², N. V. Fedorova¹, P. I. Semenyuk¹,

A. M. Arutyunyan¹, T. I. Manukhova⁴, E. A. Evtushenko⁴, N. A. Nikitin⁴,

O. V. Karpova⁴, and E. V. Shtykova²

¹ Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119991 Moscow, Russia; E-mail: ksenofon@belozersky.msu.ru

² Shubnikov Institute of Crystallography of Federal Scientific Research Centre “Crystallography and Photonics”,

Russian Academy of Sciences, 119333 Moscow, Russia

³ A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences,

119071 Moscow, Russia

⁴ Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 119234 Moscow, Russia

The amino acid sequences of coat proteins (CPs) of potexviruses such as potato virus X (PVX) and

alternanthera mosaic virus (AltMV) share about 40% sequence identity. However, the N-terminal CP

domains of these virions differ both in length (the N-terminal CP domain of PVX is longer by 28 residues,

ΔN = 28), and in amino acid sequence. In this work, we determined the effect of the N-terminal CP domain

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023